Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів
На основі запропонованих способів зберігання ферментних біосенсорів відпрацьовано технологічний процес, який дозволяє швидко й зручно проводити процедури заморожування, зберігання й відігрівання цих пристроїв. Для цього було розроблено й виготовлено зразки низькотемпературних контейнерів, холдер-кас...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2013 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68765 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів / О.А. Нардід, Д.О. Мангасаров, М.І. Щетинський // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 4. — С. 338-346. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859625728316801024 |
|---|---|
| author | Нардід, О.А. Мангасаров, Д.О. Щетинський, М.І. |
| author_facet | Нардід, О.А. Мангасаров, Д.О. Щетинський, М.І. |
| citation_txt | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів / О.А. Нардід, Д.О. Мангасаров, М.І. Щетинський // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 4. — С. 338-346. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | На основі запропонованих способів зберігання ферментних біосенсорів відпрацьовано технологічний процес, який дозволяє швидко й зручно проводити процедури заморожування, зберігання й відігрівання цих пристроїв. Для цього було розроблено й виготовлено зразки низькотемпературних контейнерів, холдер-касет, обладнання для заморожування згідно з необхідними режимами. З урахуванням виготовленого устаткування створено технологію довгострокового зберігання мініатюрних електрохімічних біосенсорів на основі глюкозооксидази.
На основе предложенных способов хранения ферментных биосенсоров отработан технологический процесс, который позволяет быстро и удобно проводить процедуры замораживания, хранения и отогрева этих устройств. Для этого были разработаны и изготовлены образцы контейнеров, холдер-кассет, оборудования для замораживания согласно необходимых режимов. С учетом изготовленного оборудования создана технология долгосрочного хранения миниатюрных электрохимических биосенсоров на основе глюкозооксидазы.
Basing on the proposed approaches for storage of enzyme-based biosensors a technological process was developed, which allowed rapid and easy freezing, storage and warming of these devices. To do this we designed and produced the samples of containers, holder-cassettes, equipment for freezing according to the needed regimens. The produced equipment was involved to creation of technology for long-term storage of miniature glucose oxidase-based electrochemical biosensors.
|
| first_indexed | 2025-11-29T11:36:29Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 57.043:577.15:543.15
О.А. Нардід*, Д.О. Мангасаров, М.І. Щетинський
Технологічні підходи до кріоконсервування
біосенсорів на основі ферментів
UDC 57.043:611.013:57.043
O.A. Nardid*, D.O. Mangasarov, M.I. Schetinskiy
Technological Aspects for Cryopreservation
of Enzyme-Based Biosensors
Реферат: На основі запропонованих способів зберігання ферментних біосенсорів відпрацьовано технологічний процес,
який дозволяє швидко й зручно проводити процедури заморожування, зберігання й відігрівання цих пристроїв. Для цього
було розроблено й виготовлено зразки низькотемпературних контейнерів, холдер-касет, обладнання для заморожування
згідно з необхідними режимами. З урахуванням виготовленого устаткування створено технологію довгострокового зберігання
мініатюрних електрохімічних біосенсорів на основі глюкозооксидази.
Ключові слова: довгострокове зберігання, ферментний біосенсор, пристрій для заморожування, холдер-касети,
низькотемпературні контейнери.
Реферат: На основе предложенных способов хранения ферментных биосенсоров отработан технологический процесс,
который позволяет быстро и удобно проводить процедуры замораживания, хранения и отогрева этих устройств. Для
этого были разработаны и изготовлены образцы контейнеров, холдер-кассет, оборудования для замораживания согласно
необходимых режимов. С учетом изготовленного оборудования создана технология долгосрочного хранения миниатюрных
электрохимических биосенсоров на основе глюкозооксидазы.
Ключевые слова: долгосрочное хранение, ферментный биосенсор, устройство для замораживания, холдер-кассеты,
низкотемпературные контейнеры.
Abstract: Basing on the proposed approaches for storage of enzyme-based biosensors a technological process was developed,
which allowed rapid and easy freezing, storage and warming of these devices. To do this we designed and produced the samples
of containers, holder-cassettes, equipment for freezing according to the needed regimens. The produced equipment was involved to
creation of technology for long-term storage of miniature glucose oxidase-based electrochemical biosensors.
Key words: long-term storage, enzyme biosensor, device for freezing, cassette holder, low temperature containers.
*Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію:
вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015;
тел.: (+38 057) 373-31-41, факс: (+38 057) 373-30-84,
електронна пошта: olnard@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3141, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: olnard@mail.ru
Department of Cryobiophysics, Institute for Problems of Cryobio-
logy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
Відділ кріобіофізики, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України, м. Харків
Надійшла 03.06.2013
Прийнята до друку 26.06.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №4. – С. 338–346.
© 2013 Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Received June, 03, 2013
Accepted June, 26, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 4. – P. 338–346.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригінальне дослідження research article
Біосенсор – аналітичний пристрій, який скла-
дається з біологічного перетворювача (чутливий
шар біоматеріалу, біоселективна мембрана) та
фізико-хімічного перетворювача (трансдьюсера) [1,
3]. Останній перетворює біохімічний сигнал на
електронний та забезпечує якісний чи кількісний
аналіз певної речовини або класу речовин. Біохіміч-
ний сигнал – результат реакції біоселективного еле-
мента з аналізованою речовиною, наприклад це
поглинання або генерування певного типу молекул
(кисню, перекису водню), іонів (протонів, іонів
амонію), виділення тепла тощо. Ферменти, антитіла,
рецептори, клітинні органели та мікроорганізми є
тим біологічним матеріалом, який використовуєть-
ся у біосенсорах залежно від мети та умов їхнього
застосування [1].
Найважливіші характеристики біосенсорних
пристроїв – висока чутливість і селективність, прос-
Biosensor is analytical device consisting of biological
(sensitive layer of biomaterial, bioselective membrane)
and physico-chemical transducers [1, 3]. The latter
transforms biochemical signal into electric one and pro-
vides qualitative and quantitative analysis of certain
substance or class of those. Biochemical signal is the
result of reaction of bioselective element with the sub-
stance to be analyzed, i. e. absorption or generating of
certain type of molecules (oxygen, hydrogen peroxide),
ions (protons, ammonium ions), heat release and etc.
Enzymes, antibodies, receptors, cell organelles and mic-
roorganisms are the biological materials used in biosen-
sors, depending on the purpose and conditions of their
application [1].
The most important characteristics of biosensor de-
vices are sensitivity and selectivity, usability and speed
of an environment analysis, as well as a breadth of
substances range which can be detected by means of
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
339
тота у використанні та швидкість аналізу середови-
ща, а також широкий діапазон речовин, що можуть
бути детектовані. Це визначає можливість їхнього
застосування в медицині, фармацевтичному, хар-
човому, біотехнічному та хімічному виробництвах,
сільському господарстві, охороні навколишнього
середовища тощо.
Ферментні біосенсори у порівнянні з іншими
видами сенсорів, наприклад виготовленими на
основі біологічних тканин [15] і клітин [14], мають
більшу селективність і чутливість, які найчастіше
є визначальними показниками. У той же час вико-
ристання ферментів обмежене їхньою порівняно
низькою стійкістю за кімнатної температури. В за-
лежності від природи біологічного перетворювача
він зберігає активність в іммобілізованому стані
за помірно низьких температур (4°С, побутовий
холодильник) протягом 12 діб (дріжджові клітини)
[12], 37 діб (поліфенолоксидаза) [11] або близько
3-х місяців (алкоголь-дегідрогеназа) [16]. Після
швидкого заморожування такі ферменти, як ліпаза,
амілаза, трипсин і хімотрипсин, можуть зберігатися
деякий час в ізольованому стані при –20...–25°С
під захистом гліцерину [4, 8, 17]. Однак інактивація
більшості ферментів відбувається саме в цьому
діапазоні температур у результаті дії концентро-
ваних розчинів солей після виморожування більшої
частини води [5, 6]. При заморожуванні водних
розчинів складних білків з четвертинною структу-
рою характер кріопошкоджень змінюється. Так,
після заморожування-відігріву розчину лактатде-
гідрогенази спостерігалась гібридизація ізофер-
ментних форм. Виявлено три додаткові ізофер-
ментні фракції, які мали проміжну електрофоре-
тичну рухливість відносно початкових форм [13].
Такі внутрішньомолекулярні перебудови ферменту
спостерігали після застосування повільних або
багаторазових режимів заморожування до –30 або
–70°С, коли «ефекти розчину» виявляють макси-
мальну пошкоджуючу дію на біомакромолекули.
Разом з тим, якщо лактат-дегідрогеназу заморо-
жувати швидко до –196°С у безсольовому водному
середовищі, гібридизація не спостерігається [13].
Тому для зберігання біосенсорів на основі фермен-
тів протягом тривалого часу з використанням кріо-
біологічних технологій необхідно, перш за все,
визначити оптимальні режими охолодження та
відігріву, які забезпечать збереження структурно-
функціональних властивостей біологічної частини
пристрою.
Представлена робота являє собою опис розроб-
леного технологічного процесу для довгострокового
зберігання електрохімічних ферментних біосенсо-
рів за низької температури, а також їх охолодження
та відігріву.
the devices. This determines the possibility of their use
in medicine, pharmaceutical, food, biotechnological and
chemical industries, agriculture, environmental
protection and etc.
If compared with other types of sensors, e. g. made
of biological tissues [15] and cells [14], the enzyme-
based biosensors have higher selectivity and sensitivity,
which often are critical parameters. However, the
usability of enzymes is limited by their relatively low
stability at room temperature. Depending on the nature
of the biological component of biosensors this could
remain active in immobilized state at moderately low
temperature (4°C, e.g. domestic refrigerator) only for
for 12 days (yeast cells) [12], 37 days (polyphenol
oxidase) [11], or about 3 months (alcohol dehydro-
genase) [16]. After rapid freezing, such enzymes as
lipase, amylase, trypsin and chymotrypsin may be
preserved for some time in an isolated state within
temperature range of –20...–25°C under glycerol
protection [4, 8, 17]. However, inactivation of major
part of enzymes occurs exactly within this temperature
range due to the effect of concentrated salt solutions
after freezing-out of the bulk water [5, 6]. In case of
freezing aqueous solutions of complex proteins with
quaternary structure the character of cryoinjuries chan-
ges. For example, freeze-thawing of lactate dehydroge-
nase solution resulted in hybridization of isoenzyme
forms. Three additional isoenzyme fractions were
revealed, which had intermediate electrophoretic mobi-
lity as for initial forms [13]. These intramolecular re-
arrangements of the enzyme were observed after slow
or multiple freezing down to –30 or –70°C, when the
‘solution effects’ had the maximum damaging effect
on biomacromolecules. However, if lactate dehydro-
genase was frozen rapidly down to –196°C in salt-
free aqueous medium, no hybridization was observed
[13]. Therefore, the proper long-term storage of the
enzyme-based biosensors using cryobiological tech-
niques needs first of all the providing of optimal cooling
and warming regimens, which would contribute to the
preservation of structural and functional properties of
biological component of a device.
This work is the description of technological pro-
cess, which provides a long-term storage of electro-
chemical enzyme biosensors at low temperature, as
well as cooling and warming.
Technological process was developed within the
frames of research project ‘Investigation of the Me-
thods to Preserve Stable Activity of Biological Sensors
During Long-Term Storage’ which was a part of the
program ‘Investigations in Sensor Systems and Techno-
logies’, using electrochemical enzyme biosensors pro-
vided by the Institute of Molecular Biology and Gene-
tics of the National Academy of Sciences of Ukraine
340 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
Технологічний процес розроблено в рамках нау-
кового проекту «Дослідження способів збереження
стабільної активності біологічних датчиків при
довгостроковому зберіганні», який є частиною
програми «Дослідження у галузі сенсорних систем
та технологій» на електрохімічних ферментних біо-
сенсорах наданих Інститутом молекулярної біології
і генетики НАН України (м. Київ). Біосенсори були
виготовлені на основі тонкоплівкових кондуктомет-
ричні перетворювачів (Інститут хемо- і біосенсо-
рики, Німеччина), і глюкозооксидази з Aspergillus
niger («Faizyme», ПАР), додатково очищеної мето-
дом гель-хромотографії на колонці з сефадексом
G-200.
Для заморожування біосенсорів за необхідними
режимами сконструйовано спеціальне устаткуван-
ня [9].
Раніше було показано, що для кріоконсервування
електрохімічних ферментних біосенсорів необхідно
використовувати кріозахистні сполуки [2]. У зв’язку
з цим перед процедурою кріоконсервування протес-
тований біосенсор поміщали у плівковий контейнер
з наступним додаванням водного розчину кріопро-
тектора гліцерину або 1,2-пропандіолу. Основними фі-
зико-хімічними параметрами гліцерину, який викорис-
товувався, є температура кипіння при 760 мм рт. ст. –
290°С; питома вага при 20°С – 1,2613 г/см3; показ-
ник заломлення світла при 20°С – 1,4740. Викорис-
таний у роботі пропандіол додатково очищено пере-
гонкою. Основні його фізико-хімічні параметри:
температура кипіння при 760 мм рт. ст. – 188°С;
питома вага при 20°С – 1,035–1,040 г/см3; показник
заломлення світла при 20°С – 1,431–1,433. Контей-
нер виготовлено з композитної поліїмід-фтороплас-
тової плівки [10] методом зварювання у вигляді
плоского прямокутника розміром 15×40 мм відпо-
відно до розмірів біосенсора. Технологічно контей-
нер спочатку зварюють з трьох боків, одну з мен-
ших сторін залишають вільною для заповнення
розчином кріопротектора. Після розміщення у
ньому біосенсора та додавання 60%-го водного
розчину гліцерину або 1,2-пропандіолу (близько
0,5 мл) товщина контейнера складає ~2 мм (рис. 1).
Далі його остаточно герметично заварюють зі сто-
рони, яка залишалась вільною, спеціально розробле-
ним пристроєм, розміщують у касеті-холдері та
охолоджують із швидкістю 1–3 град/хв до –196°С
(або до –80°С). Таку швидкість охолодження
використовують для кращого збереження струк-
турно-функціонального стану глюкозооксидази і ці-
лісності електрохімічного трансдьюсера [2]. Після
цього контейнер переносять у сховище і зберігають
при –196 або –80°С.
Для зберігання біосенсорів після повільного
охолодження за температури –80°С було розробле-
(Kyiv). The biosensors were produced on the base of
thin-film conductometric transducers (Institute of
Chemo- and Biosensorics (Germany) and glucose oxi-
dase from Aspergillus niger (Faizyme, South Africa),
additionally purified by gel chromatography in Sephadex
G-200 column.
Biosensors were frozen in the equipment specially
designed to comply the needed regimens [9].
It was previously shown that to cryopreserve elect-
rochemical enzyme biosensors one should apply
cryoprotective compounds [2]. In this regard prior to
cryopreservation the biosensor was placed into a film
container, and then an aqueous solution of cryopro-
tectant, glycerol or propane diol, was added. Main
physico-chemical parameters of the used glycerol were
as follows: boiling temperature at 760 mm Hg was
290°C, relative density at 20°C equaled 1.2613 g/cm3,
light refractive index at 20°C corresponded 1.4740.
The used in the work propane diol was additionally
purified by distillation. Its main physico-chemical
parameters were as follows: boiling point at 760 mm
Hg was 188°C, relative density at 20°C made 1.035–
1.040 g/cm3, light refractive index at 20°C correspon-
ded 1.431–1.433. The container was made of com-
posite polyimide-PTFE film [10] by welding and
appeared as a flat rectangle of 15×40 mm size, which
was specified by the biosensor dimensions. According
to the process flow the container is to be firstly welded
along three sides, one of the smaller sides to remain
intact for further filling with cryoprotectant solution.
After placing the biosensor inside and filling with 60%
aqueous solution of glycerol or 1,2-propanediol (about
0.5 ml) the container thickness is ~2 mm (Fig. 1).
Afterwards the unwelded side is to be finally sealed
off with specially designed device, the container to be
Рис.1. Контейнер із біосенсором всередині.
Fig. 1. Container with biosensor inside.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
341
но легку прямокутну алюмінієву касету з 12 комір-
ками (рис. 2), розмірами 50×37×55 мм і вагою 25 г.
Касету розділено внутрішніми стінками на квад-
ратні комірки, в які по діагоналі вкладають контей-
нери. Для зберігання кількох біосенсорів кожний з
них окремо занурюють у плівковий контейнер, а
потім усі контейнери розміщують у касеті з комір-
ками.
Касета-холдер для повільного охолодження кон-
тейнерів із біосенсорами до –196°С – циліндр діа-
метром 46 мм та висотою 52 мм, складений із згор-
нутих особливим чином 17 алюмінієвих пластин
(рис. 3, A). Зверху конструкція має вигляд квітки з
однаковими «пелюстками-комірками», які розташо-
вані за центральною симетрією для створення у
всіх комірках однакових температурних умов
(рис. 3, B). Суцільно приєднане кругле дно та криш-
ка касети з термоізолюючого матеріалу запобі-
гають теплообміну з торців касети. У газовому
середовищі посудини Дьюара зі зрідженим азотом,
в яку занурюється касета, присутній значний
градієнт температур (від близької до кімнатної –
зверху, до температури рідкого азоту – над дзер-
калом рідини) і температура біля нижньої частини
касети може суттєво відрізнятися від температури
біля верхньої. Запропонована конструкція касети
placed then into the cassette holder and cooled with
1–3°C/min rate down to –196°C (or down to –80°C).
This cooling rate provides higher preservation of struc-
tural and functional state of glucose oxidase as well as
integrity of electrochemical transducer [2]. Then the
container is to be stored in the low temperature bank
at either –196 or –80°C.
To store the biosensors after slow cooling at –80°C
there was designed a lightweight (25 g) aluminum
cassette with 12 cells (Fig. 2). This is of a rectangular
shape and has dimensions of 50×37×55 mm. Cassette
is divided by means of inner walls to form square cells,
wherein the containers are diagonally placed. To store
several biosensors, each of them is to be separately
sealed into the film container, which is to be then placed
into the cassette with cells.
Cassette holder for slow cooling of the containers
with biosensors down to –196°C is a cylinder of 46 mm
diameter and 52 mm height, made of 17 specially rolled
aluminum plates (Fig. 3A). A top view of the design
represents a ‘flower’ with equal petal-like cells, located
B
Рис. 3. Циліндрична касета для керованого охоло-
дження: A – загальний вид; B – вид зверху.
Fig. 3. Cylindrical cassette for controlled cooling: A – gene-
ral view; B – top view.
Рис. 2. Прямокутна касета для охолодження біосенсо-
рів до помірно низьких температур.
Fig. 2. Rectangular cassette for cooling biosensors down
to moderately low temperatures.
A
342 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
забезпечує охолодження тільки з боків, при цьому
її алюмінієві стінки, завдяки високій теплопровід-
ності, ефективно вирівнюють температуру по ви-
соті, а також радіально.
Пристрій, розроблений для повільного охоло-
дження контейнерів з біосенсорами, використо-
вується з посудинами Дьюара типу Х-5 («Темет»,
Україна) без додаткової модифікації (рис. 4). Ме-
ханізм пристрою складається з трьох основних
частин: шасі, блока «мотор-редуктор» та штанги,
на якій встановлена касета з контейнерами (рис. 5).
Особливість конструкції – наявність «контейнера-
свідка» 23 на нижній стороні кришки 19, який іден-
тичний тим, що використовуються для заморожу-
вання біосенсорів. Його загерметизовано після вве-
дення всередину вимірювального спаю термопа-
ри 22, який перед тим проведено крізь порожній
шток 1, отвір 20 у нижньому кінці штока та отвір
21 у кришці 19. «Контейнер-свідок» закріплено так,
що після фіксації касети-холдера він розміщується
у комірці так само, як й інші контейнери. Темпера-
туру всередині «контейнера-свідка» можна вважа-
ти такою ж, як і в інших контейнерах.
centrosymmetrically to maintain the same temperature
conditions in all the cells (Fig. 3B). Insulated round
bottom and cover of the cassette are tightly connected
and prevent a heat transfer from the cassette ends.
Gaseous environment of Dewar vessel with liquid
nitrogen, wherein the cassette is immersed, has a signi-
ficant temperature gradient (in a top there is almost
‘room temperature’ and the temperature of liquid nitro-
gen is above the liquid mirror), so the temperature at
the lower part of the cassette may differ considerably
from the temperature at the top. The proposed design
of cassette provides cooling solely along the sides,
moreover, the aluminum walls due to a high thermal
conductivity effectively allocate the temperature verti-
cally and radially.
The device for slow cooling of the containers with
biosensors is designed to fit Dewars of H-5 type
(Temet, Ukraine) without any additional modification
(Fig. 4). The mechanism of the device consists of three
main parts: chassis, ‘motor-reducer’ block and the rod
holding the cassette with containers (Fig. 5). The de-
sign feature is the presence of spectacor container 23
located on lower part of cap 19, which is identical to
those used for cooling the biosensors. It is sealed after
being placed inside of a measuring junction of ther-
mocouple 22, pulled previously through the rod 1, orifice
20 in lower end of the rod and the orifice 21 in the cap
19. Spectacor container is fixed in such way that after
fixing the holder cassette it is located in a cell equally
to other containers. The temperature inside the spec-
tacor container could be considered the same as for
other containers.
The principle of the device operation is described
below.
Base 5 of the device is mounted on a cryogenic
Dewar vessel H-5 neck and fixed with screws 8. Here-
with the revolute arm 7 crosses the center orifice 6
and prevents an accidental falling of the holder 15
inside a cryogenic Dewar vessel. When holder 15 is
detached from the device the containers with biosensors
are placed into the cells 16 leaving one of them free.
When attaching to the device, the holder 15 is pushed
from the bottom with fitting free cell to the spectacor
container 23, and getting cylinder finger 18 into
the orifice 1 of the rod 1, and fixing them with tightly
closing cap 19. Owing to the material (stainless steel)
and design the rod has a very low thermal conductivity
and mini-mally affects the temperature within the cas-
sette. Thus, the temperature in the spectacor container
is the same as in other containers. By means of the
revolute arm 7 the central orifice 6 is opened, after-
wards electric motor 12 starts to operate. The rod 1 is
moving downwards and locates the holder 15 into a
cryogenic vessel. The velocity of the holder 15 is being
Рис. 4. Зовнішній вигляд пристрою для керованого
охолодження контейнерів з біосенсорами на посудині
Дьюара.
Fig. 4. External view of the device for controlled cooling the
containers with biosensors on Dewar vessel.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
343
Далі подано опис принципу роботи даного
пристрою.
Основою 5 пристрій установлюють на горло-
вину кріогенної посудини Дьюара Х-5 й закріп-
люють гвинтами 8. При цьому поворотний важіль
7 перетинає центральний отвір 6 і запобігає випад-
ковому падінню холдера 15 всередину кріогенної
посудини Дьюара. В комірки 16 холдера 15, від’єд-
наного від пристрою, поміщають контейнери з біо-
сенсорами так, щоб одна із комірок 16 залишалася
вільною. При установці в пристрій холдер 15 віль-
ною коміркою насувають знизу на «контейнер-сві-
док» 23, попадаючи циліндричним штирем 18 в
отвір штока 1, і фіксують в ньому щільно закритою
кришкою 19. Завдяки матеріалу (нержавіюча
сталь) і конструкції шток має незначну теплопро-
відність і мінімально впливає на температуру все-
редині касети. Таким чином, температура в «кон-
тейнері-свідку» така ж, як і в інших контейнерах.
Поворотним важілем 7 звільняється центральний
отвір 6, після чого включається електродвигун 12.
Шток 1, переміщаючись униз, занурює холдер 15
всередину кріогенної посудини. Швидкість зану-
рення холдера 15 та відповідно швидкість охоло-
дження контейнерів задається електричним блоком
і контролюється показаннями термопари 22. При
досягненні необхідної температури електродвигун
12 перемикається на підйом та у крайньому верх-
ньому положенні штока 1 вимикається. Після ви-
конання програми заморожування касета-холдер
легко від’єднується від пристрою, контейнери
виймають і переносять до низькотемпературного
сховища, а холдер після нетривалого відігрівання й
сушіння готовий до подальшої роботи.
При зберіганні у сховищі біосенсори повинні бути
занурені у рідкий азот.
Для розморожування контейнери з біосенсорами
відігрівають на водяній бані при 20°С до повного
розтавання середовища кріоконсервування у плів-
plunged and, correspondingly, the rate of containers
cooling is set with electric unit and controlled by a
thermocouple 22 readings. When reaching the desired
temperature, the electric motor 12 is switched to lift
and stops after reaching upper limit of the rod 1. After
finishing the freezing program the holder cassette is
easily detached from the device, the containers are
pulled out and could be transferred to a low-temperature
tank and the holder after a short warming and drying
is ready for further work.
During storage in a tank the biosensors should be
submerged into liquid nitrogen.
Thawing of the containers with biosensors is
performed by warming in a water bath at 20°C until a
complete thawing of cryopreservation medium in a film
container, then it is cut with scissors, the biosensor is
pulled out by means of tweezers, washed in 10 mM
phosphate buffer solution for 30 min with three-fold
buffer solution changing.
The development of described cryopreservation
technology was accompanied with permanent control
Рис. 5. Схема пристрою охолодження контейнерів з
біосенсорами: 1 – рухливий шток; 2 – підшипникова
обойма; 3 – корпус; 4 – кронштейн; 5 – основа; 6, 20,
21 – отвори; 7 – поворотний важіль; 8 – фіксуючий гвинт;
9 – тросик; 10 – шків; 11 – редуктор; 12 – електродвигун;
13 – пружина; 14 – пружинний фіксатор; 15 – холдер;
16 – секція ячейки; 17 – термоізолюючий диск; 18 –
штир; 19 – кришка холдера; 22 – вимірювальний кінець
термопари; 23 – «контейнер-свідок».
Fig. 5. Diagram of the device for cooling the containers with
biosensors: 1 – rod; 2 – bearing hoop; 3 – body frame; 4 –
bracket; 5 – base; 6, 20, 21 – orifices; 7 – revolute arm; 8 –
fixing screw; 9 – cable thread; 10 – pulley; 11 – reducing
gear; 12 – electric motor; 13 – spring; 14 – spring fixative;
15 – holder; 16 – section of the cell; 17 – thermoinsulating
disk; 18 – finger contact; 19 – holder cap; 22 – measuring
junction of thermocouple; 23 – spectacor container.
икзарзінавужділсоД
selpmaS
кугдіВ
%,ароснесоіб
rosnesoiB
%,esnopser
)икборбозеб(ьлортноK
lortnocdetaert-noN 001
унирецілгіничзорум-%06вяіцизопскЕ
noituloslorecylg%06nierusopxE 5±19
улоіднапорп-2,1іничзорум-%06вяіцизопскЕ
noitulosloidenaporp-2,1%06nierusopxE 5±59
C°691–ирпвікор2могяторпяннагіребЗ
унирецілгіничзорум-%06у
C°691– tasraey2gnirudegarotS
noituloslorecylg%06ni
8±56
С°08–ирпукормогяторпяннагіребЗ
унирецілгіничзорум-%06у
C°08–tasraey2gnirudegarotS
noituloslorecylg%06ni
8±57
С°08–ирпукормогяторпяннагіребЗ
улоіднапорп-2,1іничзорум-%06у
C°08–tasraey2gnirudegarotS
noitulosloidenaporp-2,1%06ni
8±97
С°4ирпукормогяторпяннагіребЗ
C°4taraey1gnirudegarotS 0
344 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
Вплив умов обробки/зберігання на відгук біосенсорів
Biosensors response following treatments/storage
Примітки: відгук біосенсорів наведено у відсотках від конт-
ролю – біосенсорів, що не були піддані обробці; дані є середнім
від 7 паралельних повторів ± стандартна помилка середнього.
Notes: response of biosensors is expressed in percents of the
response of the control non-treated biosensors; the data are mean ±
standard error of the mean of 7 parallel experiments.
ковому контейнері, після чого його розрізають ножи-
цями, пінцетом витягують біосенсор, відмивають
у 10 мМ фосфатному буферному розчині протягом
30 хв з трикратною заміною рідини.
При розробці описаної технології кріоконсерву-
вання на всіх етапах здійснювали контроль за
роботою біосенсорів на основі ферментів (на прик-
ладі глюкозооксидази), для чого їх занурювали у
комірку об’ємом 2 мл з 10 мМ фосфатним буфер-
ним розчином, рН 7,4. Відгук біосенсорів на дода-
вання розчину 1 мМ глюкози реєстрували за допо-
могою установки для роботи з кондуктометрични-
ми ферментними біосенсорами [7]. Якщо величина
відгуку складала близько 70% від відгуку біосен-
сора до кріоконсервування і не змінювалася після
відмивання та наступних трьох додавань 1 мМ роз-
чину глюкози, біосенсор вважали робочим. Вели-
чину відгуку біосенсора з глюкозо-оксидазою до
заморожування на введення 1 мМ розчину глюкози
у калій-фосфатному буфері приймали за 100%.
Як було зазначено вище, для захисту біосенсо-
рів при заморожуванні та відігріванні використову-
вали 60%-й водний розчин гліцерину або 1,2-пропан-
діолу [2]. Як видно з таблиці, інкубація біосенсорів
у розчинах кріопротекторів з триразовим відмиван-
ням буферним розчином протягом 30 хв незначно
погіршує величину відгуку біосенсора. Досліджу-
вали вплив повільного і швидкого заморожування
та наступного відігрівання в середовищах (що
містили або не містили кріопротектори) на відгук
біосенсорів. Результати свідчать, що після швид-
кого заморожування біосенсорів на основі глюкозо-
оксидази і наступного відігріву відгуку не було, в
той час як при використанні повільного заморожу-
вання він складав (23 ± 4)%. Після повільного
заморожування біосенсорів у середовищі з кріо-
протекторами та вігіріву їх відгук знаходився у
межах, що забезпечують ефективну роботу прист-
роїв. Величину відгуку досліджували також через
тиждень, 3, 6 місяців, 1 та 2 роки зберігання при
відповідних режимах заморожування. Біосенсори
зберігали також при 4°С як з дослідженими кріо-
протекторами, так і без них. В усіх випадках після
зберігання при цій температурі відгук не реєстру-
вався. Результати наших досліджень свідчать, що
біосенсори на основі ферментів (на прикладі глю-
козооксидази) можуть зберігатися 2 роки у рідкому
азоті (–196°С) або 1 рік при –80°С у 60%-му розчині
гліцерину без суттєвої втрати ферментної актив-
ності (таблиця).
Таким чином, спираючись на проведені раніше
експериментальні дослідження зі збереження ста-
більної активності ферментів після дії низьких
of the enzyme-based biosensors operation (glucose
oxidase based biosensors as a case study). To do this
the devices were immersed into a 2 ml well with
10 mM phosphate buffer saline, pH 7.4. Response of
biosensors to the supplementing of 1 mM glucose
solution was recorded by experimental assembly for
conductometric enzyme-based biosensors [7]. If the
response of biosensor was about 70% of the value
before cryopreservation and it did not change after
washing and the following three supplementations of
1 mM glucose, the biosensor was considered as valid
one. As 100% was assumed the response of the
glucose oxidase based biosensor prior to freezing to
the supplementing of 1 mM glucose solution in
potassium phosphate buffer saline.
As it was mentioned above, to protect the biosen-
sors during freeze-thawing there was used 60% aqueo-
us solution of glycerol or 1,2-propanediol [2]. The incu-
bation of biosensors in solutions of cryoprotectants with
triple washing with the buffer solution for 30 min slightly
decreased the response of biosensor (Table). The ef-
fect of slow and rapid freezing as well as subsequent
thawing in the media with and without cryoprotectants
on response of biosensors was investigated. The results
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
345
Література
1. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Э. Тернера,
И. Карубе, Дж. Уилсона. – М.: Мир, 1992. – 615 с.
2. Грищенко В.І., Нардід О.А., Розанова К.Д. та ін. Низько-
температурна стабілізація глюкозооксидази в складі біо-
логічного сенсора // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22,
№3. – С. 236–242.
3.Дзядевич С.В., Солдаткін О.П. Наукові та технологічні засади
створення мініатюрних електрохімічних біосенсорі. – Київ:
Наук. думка, 2006. – 256 с.
4. Мосолов В.В., Соколова Е.В. Взаимодействие гликолей и
глицерина с активным центром трипсина и химотрип-
сина // Докл. АН СССР. – 1972. – Т. 207, №1. – С. 91–93.
5. Науменко Е.И., Розанова Е.Д. Изучение механизмов крио-
повреждения изолированной цитохромоксидазы // Вторая
всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным
вопросам криобиологии, 9–11 октября 1984 г.: Тезисы
докл. – Харьков, 1984. – С. 61.
6. Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Науменко Е.И. Влияние замо-
раживания-отогрева на структуру и функцию цитохром-
оксидазы // Укр. биохим. журнал. – 1985. – Т. 57, №1. –
С. 61–64.
7. Солдаткін О.П. Розробка наукових та технологічних засад
створення електрохімічних біосенсорів для потреб меди-
цини, біотехнології та охорони навколишнього середовища:
Автореф. дис. … докт. біол. наук. – К., 1998. – 40 с.
8. Юрченко Т.Н., Козлова В.Ф., Скорняков Б.А. Влияние крио-
протекторов на биологические системы. – К. : Наук. думка,
1989. – 238 с.
9. Пат. України №23507 МПК F25B19/00. Пристрій для заморо-
жування біоматеріалів / Д.О. Мангасаров, О.А. Нардід,
К.Д. Розанова, М.І. Щетинський; заявл. 22.01.2007; надрук.
25.05.2007, Бюл. №7.
10.Пат. України №70805А МПК А01N1/12. Контейнер для
низькотемпературного консервування біологічних
об'єктів / В.І. Грищенко, О.Т. Ходько, О.С. Прокопюк та ін.;
заявл.29.12.2003; надрук. 15.10.2004, Бюл. №10.
11.Climent P.V., Serralheiro M.L.M., Rebelo M.I.F. Development of
a new amperometric biosensor based on polyphenoloxidase
and polyethersulphone membrane // Pure Appl. Chem. – 2001. –
Vol. 73, №12. – P. 1993–1999.
12.Korpan Y.I., Dzyadevich S.V., Zharova V.P., El'skaya A.V.
Conductometric biosensor for ethanol detection based on
whole yeast cells // Укр. біохім. журнал. – 1994. – Т. 66,
№1. – С. 78–82.
13.Market C. L. Lactate degidrogenaze izozymes: Dissociation
and recombination of subunits // Science. – 1963. – Vol. 140,
№3573. – P. 341–350.
References
1. Biosensors: bases and applications/ Ed. by E. Turner, I. Karube,
J. Wilson. – Moscow: Mir, 1992. – 615 p.
2. Grischenko V.I., Nardid O.A., Rozanova K.D. et al. Low
temperature stabilization of glucose oxidase as component of
biological sensor // Biopolymery I Klityna. – 2006. – Vol. 22,
N3. – P. 236–242.
3. Dzyadevich S.V., Soldatkin O.P. Scientific and technological
grounds of creating miniature electrochemical biosensors. –
Kyiv: Naukova Dumka, 2006. – 256p.
4. Mosolov V.V., Sokolova E.V. Interaction of glycols and glycerol
with active center of trypsin and chymotrypsin // Doklady AN
SSSR. – 1972. – Vol. 207, N1. – P. 91–93.
5. Naumenko E.I., Rozanova E.D. Study of mechanisms of
cryodamage of isolated cytochrome oxidase// The Second
All-Union Conference on Theoretical and Applied Questions
of Cryobiology, October 9–11, 1984: Proceeding. – Kharkov,
1984. – P. 61.
6. Rozanova E.D., Moiseyev V.A., Naumenko E.I. Effect of freeze–
thawing on structure and function of cytochrome oxidase //
Ukr. Biokhim. Zhurnal – 1985. – V. 57, N1. – P. 61–64.
7. Soldatkin O.P. Development of scientific and technological bases
for creation of electrochemical biosensors for demands of
medicine, biotechnology and environmental protection:
Author’s abstract …Doct. Biol. Sci. – Kiev, 1998. – 40p.
температурах створено підходи, які забезпечують
зберігання біосенсорів на основі глюкозооксидази
за температури зрідженого азоту протягом 2 років
і протягом 1 року за температури –80°С без істот-
ного впливу на їхню функцію. Запропоновані спосо-
би довгострокового зберігання ферментних біосен-
сорів дали можливість створити технологію збері-
гання біосенсорів на основі глюкозооксидази, яка
дозволяє проводити операції з заморожування, збе-
рігання й відігрівання біосенсорів. Розроблено й
виготовлено зразки контейнерів, касет-холдерів, а
також устаткування для заморожування біосен-
сорів за необхідними режимами.
testified that after rapid freezing of glucose oxidase-
based biosensors and subsequent warming no response
was found while after using slow freezing it was (23 ±
4)%. After slow freezing of biosensors in the medium
with cryoprotectants their response was within the
limits, considered as providing an effective operation
of biosensors. The response was also investigated fol-
lowing 1 week, 3, 6 months and 1 and 2 years of storage
after using corresponding freezing regimens. Biosen-
sors were also stored at 4°C both with or without the
cryoprotectants. In all the cases, no response was
found following storage at this temperature. Our results
indicate that enzyme-based biosensors (glucose oxidase
based biosensors as a case study) could be stored for
2 years in liquid nitrogen (–196°C) or during a year at
–80°C in 60% glycerol solution without significant loss
of enzyme activity (Table).
Thus, based on preliminary conducted experimental
research on preservation of stable activity of enzymes
after exposure to low temperatures we represented in
this paper the approaches to storage of glucose oxi-
dase-based biosensors at the temperature of liquid nitro-
gen for two years and during a year at –80°C without
significant loss of their function. Proposed methods of
long-term storage of enzyme-based biosensors enabled
to develop a technological process of glucose oxidase-
based biosensors storage, which included freezing,
storage and thawing of biosensors. The model contai-
ners, cassette holders and equipment for freezing bio-
sensors were designed and produced to provide to
the elaborated regimens.
346 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
14.Pancrasio J.J.,WhelanJ.P., Borkholder D.A. et al. Development
and application of cell-based biosen-sors // Ann. Biomed.
Eng. – 1999. – Vol. 27. – P. 697–711.
15.Sanders C.A., Rodriguez M.Jr., Greenbaum E. Stand–off tissue
based biosensors for the detection of chemical warfare agents
using photosynthetic fluorescence induction // Biosens.
Bioelectron. – 2001. – Vol. 16. – P. 439–446.
16.Santos A.S., Freire R.S., Kubota L.T. Highly stable amperometric
biosensor for ethanol based on Meldola's blue adsorbed on
silica gel modified with niobium oxide // J. Electroanal. Chem. –
2003. – Vol. 547, Issue 2. – P. 135–142.
17.Whittman J.H., Rosano H.L. Effects of freeze-thaw process
on amylase // Cryobiology.– 1973.– Vol. 10, №3.– P.240–243.
8. Yurchenko T.N., Kozlova V.F., Skornyakov B.A. Effect of cryo-
protectants on biological systems. – Kiev: Naukova Dumka,
1989. – 238p.
9. Patent of Ukraine N23507 IPC F25B19/00. Device for freezing
biomaterials/ D.O. Mangasarov, O.A. Nardid, K.D. Rozanova
et al. Appl. 22.01.2007; Publ. 25.05.2007, Bul. N7.
10. Patent of Ukraine N70805A IPC A01N1/12. Container for low
temperature preservation of biological objects/ V.I. Grischenko,
O.T. Khodko, O.S. Prokopyuk et al. App. 29.12. 2003; Publ.
15.10.2004, Bul. 10.
11.Climent P.V., Serralheiro M.L.M., Rebelo M.I.F. Development of
a new amperometric biosensor based on polyphenoloxidase
and polyethersulphone membrane // Pure Appl. Chem. – 2001. –
Vol. 73, N12. – P. 1993–1999.
12.Korpan Y.I., Dzyadevich S.V., Zharova V.P., El'skaya A.V.
Conductometric biosensor for ethanol detection based on
whole yeast cells // Ukr. Biokhim. Zhurnal. – 1994. – Vol. 66,
N1.– P. 78–82.
13.Market C. L. Lactate degidrogenaze izozymes: Dissociation
and recombination of subunits // Science. – 1963. – Vol. 140,
N3573. – P. 341–350.
14.Pancrasio J.J.,WhelanJ.P., Borkholder D.A. et al. Development
and application of cell-based biosen-sors // Ann. Biomed.
Eng. – 1999. – Vol. 27. – P. 697–711.
15.Sanders C.A., Rodriguez M.Jr., Greenbaum E. Stand–off tissue
based biosensors for the detection of chemical warfare agents
using photosynthetic fluorescence induction // Biosens.
Bioelectron. – 2001. – Vol. 16. – P. 439–446.
16.Santos A.S., Freire R.S., Kubota L.T. Highly stable amperometric
biosensor for ethanol based on Meldola's blue adsorbed on
silica gel modified with niobium oxide // J. Electroanal. Chem. –
2003. – Vol. 547, Issue 2. – P. 135–142.
17.Whittman J.H., Rosano H.L. Effects of freeze-thaw process
on amylase // Cryobiology.– 1973.– Vol. 10, N3.– P.240–243.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68765 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-11-29T11:36:29Z |
| publishDate | 2013 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Нардід, О.А. Мангасаров, Д.О. Щетинський, М.І. 2014-09-28T09:23:58Z 2014-09-28T09:23:58Z 2013 Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів / О.А. Нардід, Д.О. Мангасаров, М.І. Щетинський // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 4. — С. 338-346. — Бібліогр.: 17 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68765 57.043:577.15:543.15 На основі запропонованих способів зберігання ферментних біосенсорів відпрацьовано технологічний процес, який дозволяє швидко й зручно проводити процедури заморожування, зберігання й відігрівання цих пристроїв. Для цього було розроблено й виготовлено зразки низькотемпературних контейнерів, холдер-касет, обладнання для заморожування згідно з необхідними режимами. З урахуванням виготовленого устаткування створено технологію довгострокового зберігання мініатюрних електрохімічних біосенсорів на основі глюкозооксидази. На основе предложенных способов хранения ферментных биосенсоров отработан технологический процесс, который позволяет быстро и удобно проводить процедуры замораживания, хранения и отогрева этих устройств. Для этого были разработаны и изготовлены образцы контейнеров, холдер-кассет, оборудования для замораживания согласно необходимых режимов. С учетом изготовленного оборудования создана технология долгосрочного хранения миниатюрных электрохимических биосенсоров на основе глюкозооксидазы. Basing on the proposed approaches for storage of enzyme-based biosensors a technological process was developed, which allowed rapid and easy freezing, storage and warming of these devices. To do this we designed and produced the samples of containers, holder-cassettes, equipment for freezing according to the needed regimens. The produced equipment was involved to creation of technology for long-term storage of miniature glucose oxidase-based electrochemical biosensors. uk Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Криогенное оборудование Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів Technology of Enzyme Based Biosensors Cryopreservation Article published earlier |
| spellingShingle | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів Нардід, О.А. Мангасаров, Д.О. Щетинський, М.І. Криогенное оборудование |
| title | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів |
| title_alt | Technology of Enzyme Based Biosensors Cryopreservation |
| title_full | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів |
| title_fullStr | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів |
| title_full_unstemmed | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів |
| title_short | Технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів |
| title_sort | технологічні підходи до кріоконсервування біосенсорів на основі ферментів |
| topic | Криогенное оборудование |
| topic_facet | Криогенное оборудование |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68765 |
| work_keys_str_mv | AT nardídoa tehnologíčnípídhodidokríokonservuvannâbíosensorívnaosnovífermentív AT mangasarovdo tehnologíčnípídhodidokríokonservuvannâbíosensorívnaosnovífermentív AT ŝetinsʹkiimí tehnologíčnípídhodidokríokonservuvannâbíosensorívnaosnovífermentív AT nardídoa technologyofenzymebasedbiosensorscryopreservation AT mangasarovdo technologyofenzymebasedbiosensorscryopreservation AT ŝetinsʹkiimí technologyofenzymebasedbiosensorscryopreservation |