Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини
Використання комплексу клітин гранульози та кумулюса (КГК) може бути перспективним при співкультивуванні гамет та ембріонів у програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), що робить нагальним їх кріоконсервування. В роботі вивчали КГК жінок віком 25–39 років, які проходили курс лікування без...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2014 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2014
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68791 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини / М.П. Петрушко, В.І. Піняєв, О.Б. Ревенко , Н.О. Волкова, Н.Н. Чуб // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 1. — С. 57-66. — Бібліогр.: 23 назв. — укр., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860257511372750848 |
|---|---|
| author | Петрушко, М.П. Піняєв, В.І. Ревенко, О.Б Волкова, Н.О. Чуб, Н.Н. |
| author_facet | Петрушко, М.П. Піняєв, В.І. Ревенко, О.Б Волкова, Н.О. Чуб, Н.Н. |
| citation_txt | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини / М.П. Петрушко, В.І. Піняєв, О.Б. Ревенко , Н.О. Волкова, Н.Н. Чуб // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 1. — С. 57-66. — Бібліогр.: 23 назв. — укр., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Використання комплексу клітин гранульози та кумулюса (КГК) може бути перспективним при співкультивуванні гамет та ембріонів у програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), що робить нагальним їх кріоконсервування. В роботі вивчали КГК жінок віком 25–39 років, які проходили курс лікування безпліддя методом IVF. Для кріоконсервування суспензії КГК використовували 1,5 М розчин 1,2-ПД. Зразки охолоджували зі швидкістю 0,3 град/хв від 25 до –6°С, далі здійснювали ініціацію кристалоутворення, від –6 до –35°С швидкість охолодження складала 1 град/хв; після цього зразки занурювали в рідкий азот і зберігали при –196°С. Після відігрівання КГК зберігали свої основні властивості: здатність до адгезії та проліферації, а також гормонопродукуючу функцію. При культивуванні виявлено затримку розвитку культури КГК на 1–2 доби в порівнянні зі свіжовиділеними клітинами. Через 7 діб після експлантації культури деконсервованих КГК практично не відрізнялись від первинних культур КГК відповідного терміну розвитку in vitrо. Змінився рівень гормонопродукції КГК після кріоконсервування: естрадіолу – знизився на 89,9%, а прогестерону – підвищився на 81,4% відносно показників свіжовиділених суспензій. Отримані результати свідчать про те, що КГК можна отримувати і зберігати в умовах низькотемпературних банків з метою подальшого використання у ДРТ.
Использование комплекса клеток гранулезы и кумулюса (КГК) может быть перспективным при сокультивировании гамет и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), что делает актуальным их криоконсервирование. В работе изучали КГК женщин возрастом 25–39 лет, проходивших курс лечения бесплодия методом IVF. Для криоконсервирования суспензии КГК использовали раствор 1,5 М 1,2-пропандиола. Образцы охлаждали со скоростью 0,3 град/мин от 25 до –6°С, далее осуществляли инициацию кристаллообразования, от –6 до –35°С скорость охлаждения составляла 1 град/мин, после этого образцы погружали в жидкий азот и хранили при –196°С. После отогрева КГК сохраняли свои основные свойства: способность к адгезии и пролиферации, а также гормонопродуцирующую функцию. При культивировании выявлена задержка развития культуры КГК на 1–2 суток по сравнению со свежевыделенными клетками. Через 7 суток после эксплантации культуры деконсервированных КГК практически не отличались от первичных культур соответствующего срока развития in vitro. Изменился уровень гормонопродукции КГК после криоконсервирования: эстрадиола – снизился на 89,9%, а прогестерона – повысился на 81,4% относительно показателей свежевыделенных суспензий. Полученные результаты свидетельствуют о том, что КГК можно получать и хранить в условиях низкотемпературных банков с целью дальнейшего использования в ВРТ.
Utilization of granulosa and cumulus cell (GCC) complex could be prospective for co-culture of gametes and embryos as a part of assisted reproductive technologies (ART), that makes important their cryopreservation. The study was performed in GCCs of women aged 25–39, who underwent the treatment of infertility by IVF. Cryopreservation of GCC suspension was carried out using 1.5 M 1,2-propane diol solution. The samples were cooled with rate of 0.3 deg/min from 25 down to –6°C, thereafter the ice crystal initiation was done, from –6 down to –35°C the cooling rate was 1 deg/min, after that the samples were plunged into liquid nitrogen and stored then at –196°C. Following thawing the GCCs retained their main features: ability for adhesion and proliferation, and hormone production. During culture of GCCs its development was delayed for 1–2 days if compared with freshly isolated cells. In 7 days after explanting the cultures of frozen-thawed GCCs appeared nearly the same as primary cultures of corresponding terms of in vitro culture. The post thaw level of hormone production by GCCs was changed: decreased by 89.9% in case of estradiol, and increased by 81.4% for progesterone if compared with the indices of freshly isolated suspensions. The obtained results testify to a possibility to isolate the GCCs and then to store in low-temperature banks for prospective use in ART.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:50:47Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 576.535:57.043
М.П. Петрушко*, В.І. Піняєв, О.Б. Ревенко, Н.О. Волкова, Н.Н. Чуб
Морфофункціональні характеристики свіжовиділених
і кріоконсервованих клітин гранульози
та кумулюса яєчників людини
UDC 576.535:57.043
M.P. Petrushko*, V.I. Pinyaev, O.B. Revenko, N.O. Volkova, N.N. Chub
Morphofunctional Characteristics of Freshly Isolated and
Cryopreserved Human Ovarian Granulosa and Cumulus Cells
Реферат: Використання комплексу клітин гранульози та кумулюса (КГК) може бути перспективним при співкультивуванні
гамет та ембріонів у програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), що робить нагальним їх кріоконсервування.
В роботі вивчали КГК жінок віком 25–39 років, які проходили курс лікування безпліддя методом IVF. Для кріоконсервування
суспензії КГК використовували 1,5 М розчин 1,2-ПД. Зразки охолоджували зі швидкістю 0,3 град/хв від 25 до –6°С, далі
здійснювали ініціацію кристалоутворення, від –6 до –35°С швидкість охолодження складала 1 град/хв; після цього зразки
занурювали в рідкий азот і зберігали при –196°С. Після відігрівання КГК зберігали свої основні властивості: здатність до
адгезії та проліферації, а також гормонопродукуючу функцію. При культивуванні виявлено затримку розвитку культури КГК
на 1–2 доби в порівнянні зі свіжовиділеними клітинами. Через 7 діб після експлантації культури деконсервованих КГК
практично не відрізнялись від первинних культур КГК відповідного терміну розвитку in vitrо. Змінився рівень гормонопродукції
КГК після кріоконсервування: естрадіолу – знизився на 89,9%, а прогестерону – підвищився на 81,4% відносно показників
свіжовиділених суспензій. Отримані результати свідчать про те, що КГК можна отримувати і зберігати в умовах
низькотемпературних банків з метою подальшого використання у ДРТ.
Ключові слова: гранульоза, кумулюс, культивування, кріоконсервування.
Реферат: Использование комплекса клеток гранулезы и кумулюса (КГК) может быть перспективным при сокульти-
вировании гамет и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), что делает актуальным
их криоконсервирование. В работе изучали КГК женщин возрастом 25–39 лет, проходивших курс лечения бесплодия
методом IVF. Для криоконсервирования суспензии КГК использовали раствор 1,5 М 1,2-пропандиола. Образцы охлаждали
со скоростью 0,3 град/мин от 25 до –6°С, далее осуществляли инициацию кристаллообразования, от –6 до –35°С скорость
охлаждения составляла 1 град/мин, после этого образцы погружали в жидкий азот и хранили при –196°С. После отогрева
КГК сохраняли свои основные свойства: способность к адгезии и пролиферации, а также гормонопродуцирующую функцию.
При культивировании выявлена задержка развития культуры КГК на 1–2 суток по сравнению со свежевыделенными
клетками. Через 7 суток после эксплантации культуры деконсервированных КГК практически не отличались от первичных
культур соответствующего срока развития in vitro. Изменился уровень гормонопродукции КГК после криоконсервирования:
эстрадиола – снизился на 89,9%, а прогестерона – повысился на 81,4% относительно показателей свежевыделенных
суспензий. Полученные результаты свидетельствуют о том, что КГК можно получать и хранить в условиях низкотемпе-
ратурных банков с целью дальнейшего использования в ВРТ.
Ключевые слова: гранулеза, кумулюс, культивирование, криоконсервирование.
Abstract: Utilization of granulosa and cumulus cell (GCC) complex could be prospective for co-culture of gametes and embryos
as a part of assisted reproductive technologies (ART), that makes important their cryopreservation. The study was performed in
GCCs of women aged 25–39, who underwent the treatment of infertility by IVF. Cryopreservation of GCC suspension was carried out
using 1.5 M 1,2-propane diol solution. The samples were cooled with rate of 0.3 deg/min from 25 down to –6°C, thereafter the ice
crystal initiation was done, from –6 down to –35°C the cooling rate was 1 deg/min, after that the samples were plunged into liquid
nitrogen and stored then at –196°C. Following thawing the GCCs retained their main features: ability for adhesion and proliferation,
and hormone production. During culture of GCCs its development was delayed for 1–2 days if compared with freshly isolated cells.
In 7 days after explanting the cultures of frozen-thawed GCCs appeared nearly the same as primary cultures of corresponding terms
of in vitro culture. The post thaw level of hormone production by GCCs was changed: decreased by 89.9% in case of estradiol, and
increased by 81.4% for progesterone if compared with the indices of freshly isolated suspensions. The obtained results testify to a
possibility to isolate the GCCs and then to store in low-temperature banks for prospective use in ART.
Key words: granulosa, cumulus, culture, cryopreservation.
*Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію:
вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015;
тел.: (+38 057) 373-31-19, факс: (+38 057) 373-30-84,
електронна пошта: cryo@online.kharkov.ua
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3119, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Department of Cryobiology of Reproduction System, Institute for
Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Aca-
demy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Відділ кріобіології системи репродукції, Інститут проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків
Надійшла 09.09.2013
Прийнята до друку 05.02.2014
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №1. – С. 57–66.
© 2014 Інститут проблем кріобіології і кріомедицины НАН України
Received September 9, 2013
Accepted February 5, 2014
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014. 24(1): 57–66.
© 2014 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
58 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
Культивування ооцитів та ембріонів in vitro –
суттєва складова технології IVF у лікуванні без-
пліддя. Практичним досвідом доведено високу
ефективність використання клітин гранульози та
кумулюса (КГК) у якості систем співкультивування
для дозрівання ооцитів та досягнення ембріонами
стадії експандованої бластоцисти [9, 16, 21, 23].
Відомо, що клітини гранульози та кумулюса є
медіаторами впливу гормонів на мейотичні пере-
творення хромосом в ооцитах. Так, раніше було виз-
начено, що клітини гранульози беруть участь у
проведенні регуляторних сигналів пролактину та
соматотропінів у клітини кумулюса, які по-різному
відповідають на сигнали цих гормонів [2, 15].
Останнім часом у комплексі лікування безплід-
дя із застосовуванням IVF технологій все частіше
використовують кріоконсервовані репродуктивні
клітини, що вимагає їх адекватного культивування
після розморожування [1, 4, 5]. Було б доцільним
збереження КГК для подальшого їх використання
при культивуванні деконсервованих ембріонів. Од-
нак, існує лише незначна кількість опублікованих
робіт щодо кріоконсервування комплексу КГК [10,
22].
Вище зазначене свідчить про те, що викорис-
тання комплексу КГК після заморожування може
бути перспективним при співкультивуванні гамет
та ембіонів у програмах допоміжних репродуктив-
них технологій.
Ізольовані КГК з преовуляторних фолікулів яєч-
ника людини – відносно новий об’єкт для кріобіоло-
гічних досліджень. Раніше вивчали комплекси з клі-
тин строми яєчників, гранульози і теки, які отриму-
вали з фолікулів різної стадії розвитку [17, 19].
Наразі завдяки прогресу в допоміжних репродук-
тивних технологіях, зокрема IVF, з’явилася можли-
вість отримання окремих КГК у достатньому
обсязі для дослідження, кріоконсервування та
застосування у програмах штучного запліднення.
Однак актуальними залишаються питання щодо
збереження морфологічної цілісності цих клітин,
можливості їхнього відновлення після заморожу-
вання-відігріву, синтезу та секреції статевих гор-
монів.
Клітини кумулюса є особливою субпопуляцією
клітин гранульози, диференціювання якої спрямо-
вується і підтримується ооцитом [2, 20]. У роботі
Y. Liu [18] зазначано, що кумулюс, отриманий з
ооцитів на стадії гермінативного везикула та мета-
фази I, відрізняється за своїми морфофункціональ-
ними характеристиками від кумулюса зрілих
ооцитів та демонструє високий рівень апоптозу. Бу-
ло показано, що морфофункціональний стан КГК
може корелювати з якістю ооциту та його здат-
Culturing of oocytes and embryos in vitro is essen-
tial component of IVF technique when treating infer-
tility. High efficiency of using the granulosa and cumu-
lus cells (GCCs) as the system of co-culture to provide
maturation of oocytes and development of embryos to
expanded blastocyst has been proved practically [5,
14, 20, 23].
It is known that granulosa and cumulus cells are
the mediators of hormone effect on meiotic transfor-
mations of chromosomes inside oocytes. For instance,
it found previously that granulosa cells participated in
conducting regulatory signals of prolactin and soma-
totropins to the cells of cumulus, having the mixed
reception of the signals from these hormones [13, 17].
Recently, the complex of infertility treatment in the
frames of IVF actively involves the cryopreserved
reproductive cells, and therefore an adequate culturing
after thawing is nessessary [3, 6, 7]. There would be
expedient to preserve GCCs for their further applica-
tion during culturing of frozen-thawed embryos. How-
ever, there are only a few published reports concerning
cryopreservation of GCCs complex [8, 22].
Above mentioned testifies to the fact that use of
complex of GCCs after freezing can be prospective
during co-culturing of gametes and embryos in assisted
reproductive technologies.
The GCCs isolated from human ovary preovulatory
follicles are quite new objects for cryobiological stu-
dies. Previous investigations were conducted in cellular
complexes of ovarian stroma, granulosa and thecas,
which were procured from the follicles of various
development stages [15, 18]. Nowadays, due to the
progress in assisted reproductive technologies, IVF in
particular, the possibility arised to obtain some GCCs
in the volume sufficient for experimental studies, cryo-
preservation and application in the programs of artificial
fertilization. However, the tasks of preserving morpho-
logical integrity of these cells, their possible restoration
after freeze-thawing, synthesis and secretion of sexual
hormones have remained actual.
Cumulus cells are a special subpopulation of granu-
losa cells, differentiation of which is directed and sup-
ported by oocyte [17, 19]. Liu [16] demonstrated that
cumulus, derived from oocytes at the germinal vesicle
stage and metaphase I, differed by its morphofunctional
characteristics from the one of mature oocytes, and
showed a high level of apoptosis. It has been shown
that morphofunctional state of GCCs could correlate
with the quality of oocyte and its ability to fertilization,
and early apoptosis of GCCs might accompany low
quality of embryos in vitro [13].
Owing to the complicated obtaining, uniqueness and
deficit of ovarian tissue, in particular GCCs, which are
derived from a body during laparotomy, laparoscopy,
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
59
ністю до запліднення, а ранній апоптоз КГК –
з низькою якістю ембріонів in vitro [15].
У зв’язку зі складністю отримання, унікальніс-
тю і дефіцитністю тканини яєчника, зокрема КГК,
які вилучають з організму при лапаротомії, лапарос-
копії, а також проведенні IVF, консервування цих
клітин з метою подальшого їх застосування є важ-
ливим завданням кріобіології.
Наразі для кріоконсервування оваріальної тка-
нини використовують переважно два кріопротек-
тори – диметилсульфоксид і 1,2-пропандіол (1,2-ПД).
Численні експериментальні дані, отримані D.A. Gook
зі співавторами [11–14], показали успішне кріо-
консервування фрагментів оваріальної тканини під
захистом 1,2-ПД. Але не зрозуміло, чи буде успіш-
ним застосування цього протоколу для суспензії
ізольованих КГК.
Виходячи з цього, метою роботи була оцінка
морфофункціональних властивостей клітин грану-
льози та кумулюса яєчника людини до та після
кріоконсервування під захистом 1,2-ПД.
Матеріали та методи
У роботі ми використовували лише кумулюс,
який отримували після денудації ооцитів, що пере-
бували на стадії метафази II мейозу.
Клітини гранульози та кумулюса отримували з
яєчників жінок віком 25–39 років, які проходили курс
лікування безпліддя методом IVF з їх інформо-
ваної письмової згоди. Індукцію суперовуляції
проводили за класичним довгим середньолютеїно-
вим протоколом, з використанням агоністів гонадо-
тропін-релізінг гормону «Декапептил» («Ferring»,
Німеччина) у дозі 3,75 мг та рекомбінантного фо-
лікулостимулюючого гормону «Гонал F» («Serono»,
Італія). У якості тригеру остаточного дозрівання
фолікулів використовували «Овітрел» («Serono») у
дозі 250 мкг. Трансвагінальну пункцію фолікулів
виконували під контролем ультразвукової скануючої
системи «Phillips HD-11» (Німеччина).
Після виділення ооцитів фолікулярну рідину з
рештою клітин переносили в конічні пластикові про-
бірки та залишали за кімнатної температури на го-
дину. Після осадження клітин супернатант видаляли
та проводили трикратне відмивання КГК від ерит-
роцитів та інших клітин дебрису шляхом ресуспен-
дування осаду в 1 мл культурального середовища
(«Fertilization medium «COOK», Австралія). Розмі-
ри фрагментів тканини КГК складали (3,2 ±
0,6) мм2.
Первинну суспензію КГК отримували шляхом
дезагрегації фрагментів тканини КГК у розчині
гіалуронідази («Toskani», Іспанія). Суспензія була
розподілена на дві групи. Першу групу (контроль)
as well as during IVF, the preservation of these cells
with the aim of further their use is an important task
of cryobiology.
Nowadays, two cryoprotectants are widely used
to cryopreserve ovarian tissue: dimethylsulfoxide and
1,2-propane diol (1,2-PD). Numerous experimental data
obtained by Gook et al. [9–12] have shown a success-
ful cryopreservations of ovarian tissue fragments under
protection of 1,2-PD. However, it is unclear if these
protocol could be successfully applied to cryopreserve
suspension of isolated GCCs.
On that basis, the research aim was to estimate
morphofunctional properties of human granulosa cells
and ovarian cumulus prior to and after cryopreservation
under protection of 1,2-PD.
Materials and methods
The experiments were performed only in the
cumulus obtained after denudation of oocytes being at
the meiosis metaphase II.
The cells of granulosa and cumulus were obtained
from the ovaries of women aged 25–39, treated for
infertility by IVF with their informed written consent.
Superovulation was induced by means of traditional
long-term mean lutein protocol using agonists gonado-
tropin-releasing hormone Decapeptyl (Ferring, Germa-
ny) in a dose of 3.75 mg and recombinant follicle-stimu-
lating hormone Gonal-F (Serono, Italy). As the trigger
for complete maturation of follicles we used Ovitrelle
(Serono) in a dose of 250 mg. Transvaginal puncture
of follicles was performed under the control of ultra-
sound scanning system Phillips HD-11 (Germany).
After isolation of oocytes the follicular fluid with
the rest of cells was transferred to cone-like plastic
tubes and was kept at room temperature for one hour.
After sedimentation of cells the supernatant was
removed and three-fold washing of GCCs to remove
erythrocytes and other debris cells was carried-out by
re-suspending the sediment in 1 ml culturing medium
(Fertilization medium, COOK, Australia). The sizes
of GCCs tissue fragments were (3.2 ± 0.6) mm2.
Primary suspension of GCCs was obtained by
means of desaggregation of GCCs tissue fragments in
hyaluronidase solution (Toscani, Spain).
Suspension was divided into two groups. The first
group (control) comprised freshly isolated GCCs, the
second one were the GCCs cryopreserved under the
protection of 1,2-PD. The solution of 1.5 M 1,2-PD
was added to GCC suspension slowly during 5 min up
to 1:1 ratio, then incubated at 20°C during 20 min. The
suspension was thereafter transferred to 5 mm poly-
ethylene straws and frozen with the device Cryo Logic
CK 8800i (Australia) using the following protocol:
cooling rate of 0.3 deg/min from 25 down to –6°C,
60 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
складали свіжовиділені КГК, другу – КГК, які кріо-
консервували в розчині 1,2-ПД. Розчин 1,5 М
1,2-ПД додавали до суспензії КГК повільно впро-
довж 5 хв у співвідношенні 1:1, інкубували за
температури 20°С впродовж 20 хв. Далі суспензію
переносили в поліетиленові соломини діаметром
5 мм та заморожували в пристрої «Cryo Logic СL
8800i» (Австралія), використовуючи наступну про-
граму: швидкість охолодження 0,3 град/хв від 25
до –6°С, ініціація кристалоутворення впродовж 5 с,
від –6 до –35°С охолодження зі швидкістю 1 град/хв;
далі зразки занурювали в рідкий азот і зберігали за
–196°С. Соломинки відігрівали на водяній бані за
37°С.
Для оцінки морфофункціонального стану свіжо-
виділеної і кріоконсервованої суспензії КГК її пере-
носили в 0,8 мл культурального середовища і куль-
тивували під мінеральним маслом у 4-луночному
планшеті («Nunc», Німеччина), не змінюючи сере-
довище протягом 14 діб у CO2-інкубаторі («Sanyo»,
Японія) при 6% CO2, 37°С та вологості 95%. Кожні
24 години оцінювали морфологічний стан КГК, вико-
ристовуючи мікроскоп «Olympus IX-71» (Японія).
Функціональні показники клітин, а саме рівень
секреції естрадіолу та прогестерону до середовища
культивування, оцінювали за допомогою імунофер-
ментного аналізу, застосовуючи набори «Еstradiol
Еlisa kit» і «Progesterone Еlisa kit» («DRG», США).
Для встановлення наявності ліпідних крапель,
що можуть бути опосередкованим показником
можливості стероїдогенезу, використовували флуо-
ресцентний барвник нільський червоний (НЧ).
Флуоресценцію клітин реєстрували на 7-у добу
культивування КГК за допомогою конфокального
лазерного скануючого мікроскопа «LSM 510
META» («Сarl Zeiss», Німеччина). Флуоресценцію
збуджували гелій-неоновим лазером із довжиною
хвилі 543 нм, емісію реєстрували в червоному
діапазоні з максимумом 631 нм.
Отримані числові результати обробляли статис-
тично за допомогою комп’ютерних програм «Mic-
rosoft Excel» та «Origin 6.1». Дані представлені в
вигляді середнє ± помилка середнього. Вірогід-
ність розбіжностей оцінювали з використанням
критерія Стьюдента-Фішера.
Результати та обговорення
Після виділення та ферментативної дезагрегації
фрагментів КГК первинна суспензія отриманих
клітин являла собою суміш ізольованих клітин
неоднакової величини з переважно округлою
формою та клітинних агрегатів, які мали різний
розмір. У складі такої гетерогенної суспензії спос-
терігались поодинокі еритроцити (рис. 1, A). Слід
induced ice crystal initiation for 5 seconds, from –6
down to –35°C cooling with the rate of 1 deg/min,
then the samples were plunged into liquid nitrogen and
stored at –196°C. The straws were warmed in water
bath at 37°C.
To assess morphofunctional state of freshly isolated
and cryopreserved suspension the GCCs were trans-
ferred into 0.8 ml of culturing medium and cultured
under mineral oil in 4-well plate (Nunc, Germany)
without changing the medium during 14 days in CO2
incubator (Sanyo, Japan) at 6% CO2, 37°C and 95%
humidity. Each 24 hrs the morphological state of GCCs
was estimated using microscope Olympus IX-71 (Japan).
Functional parameters of cells, viz. the estradiol
and progesterone secretion to culture medium, were
assessed with immune enzyme analysis using Estradiol
Elisa Kit and Progesterone Elisa Kit (DRG, USA).
To determine the presence of lipid drops, which
could be an indirect index of possible steroidogenesis,
the GCCs were stained with Nile red (NR). Fluores-
cence of the cells was performed to the 7th culturing
day by means of confocal laser scanning microscope
LSM 510 META (Carl Zeiss, Germany). The fluores-
cence was excited by He-Ne laser with 543 nm wa-
velength, emission was recorded in red band with maxi-
mum at 631 nm.
The numerical data were processed using the com-
puter software Microsoft Excel and Origin 6.1. The
data are presented as mean ± error of the mean. Signi-
ficance of the differences was estimated using Student-
Fisher criterion.
Results and discussion
After isolation and enzymatic disaggregation of
GCCs fragments the primary suspension of the ob-
tained cells represented the mixture of isolated cells
of various size with predominantly round shape and
cell aggregates with various dimensions. Only single
erythrocytes were found in this heterogeneous sus-
pension (Fig. 1A). It should be noted that together with
the cells with distinctly contoured membrane, nucleus
and light, somewhere granular cytoplasm the aggre-
gates comprised dark coloured dead cells with impaired
membrane and cell detritus.
Explantation of such primary suspension of GCCs
in described conditions resulted in sedimentation of cell
elements and aggregates to the bottom of cultural plate
and adherence to it. During first day of culturing the
majority of elements of primary suspension adhered
to the bottom of cultural plate (82.0 ± 0.7)%. Herewith
cell aggregates looked like round formations consisted
of dark granulated cells. The part of cells preserved a
rounded shape the rest demonstrated initial signs of
flattening on a substrate (Fig. 1B).
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
61
зауважити, що до складу агрегатів,
крім клітин з чітко контурованою
мембраною, ядром та світлою, поде-
куди зернистою цитоплазмою, входи-
ли загиблі клітини темного кольору з
порушеною мембраною та клітинний
детрит.
Експлантація такої первинної сус-
пензії КГК за умов культивування при-
водила до осідання клітинних елемен-
тів та агрегатів на дно культурального
плейту і прикріплення до нього. Про-
тягом першої доби культивування
більшість елементів первинної сус-
пензії адгезували до дна культураль-
ної чашки ((82,0 ± 0,7)%). Клітинні аг-
регати при цьому мали вигляд округ-
лих утворень, які складалися з темних
гранульованих клітин. Частина клітин
зберігали округлу форму, решта де-
монстрували початкові ознаки роз-
пластування на субстраті (рис. 1, B).
При подальшому культивуванні
первинної культури КГК відбувалися
розпластування поодиноких клітин, які
були прикріплені до субстрату, а та-
кож міграція клітин із агрегатів та їх
розпластування навколо агрегату
(рис. 1, C).
Подальше культивування призво-
Рис. 1. Свіжовиділена первинна суспензія КГК (A). Первинна культура
КГК через 1 (B), 3 (C) та 7 (D) діб. Прижиттєве спостереження; A –
×200; B, C, D – ×400.
Fig. 1. Primary suspension of GCCs (A). Primary culture of GCCs follow-
ing 1st (B), 3rd (C) and 7th (D) day. Supravital observation; A – ×200; B, C,
D – ×400.
дило до розвитку культури КГК. На 7-му добу
культивування відбувалося збільшення грануляції
клітин, які складали агрегати. Центр агрегату у
більшості випадків був багатошаровий і утворений
з клітинних елементів з мембраною, яка не мала
чіткого контура. На периферії агрегатів розташо-
вувалися розпластані переважно епітеліоподібні клі-
тини, які мігрували по поверхні субстрату і форму-
вали зону росту (рис. 1, D).
У деяких випадках, особливо коли агрегат скла-
дався з невеликої кількості клітин, відбувалось
практично повне його розпластування на поверхні
дна культурального плейту з формуванням моно-
шарового осередка гранульованих клітин.
Після 7-ї доби культивування КГК у культурі
спостерігалось поступове її старіння, ознаками яко-
го були компактизація клітинного матеріалу з утво-
ренням цитосфер та їх відкріплення від дна культу-
рального плейту.
Життєздатність деконсервованих КГК, яку оці-
нювали шляхом забарвлення клітин трипановим си-
нім одразу після відігрівання, складала (72 ± 4,5)%.
Після розморожування суспензії КГК її вигляд
та склад відрізнялися від первинної суспензії,
Further culturing of primary culture of GCCs was
accompanied with the flattening of several cells,
adhered to substrate as well as migration of cells from
aggregates and their flattening around an aggregate
(Fig. 1C).
Following culturing resulted in the development of
GCCs culture. To the 7th culturing day the granulation
of cells inside the aggregates enhanced. Centre of
aggregates was as a rule multilayered and formed of
cells with non-distinct contoured membrane. Periphery
of aggregates was occupied mainly by flattened
epithelioid cells, which migrated on a surface of sub-
strate and formed a growth zone (Fig. 1D).
In some cases, especially when an aggregate comp-
rised a small number of cells, these flattened nearly
completely on a bottom surface of cultural plate,
forming the monolayer areas of granulated cells.
After the 7th day of GCCs culturing, their culture
demonstrated gradual ageing, which signs were
compactization of cells in terms of cytospheres for-
mation and their detachment from the bottom of cultural
plate.
Viability of GCCs estimated immediately post thaw
by staining of the cells with trypan blue made (72 ± 4.5)%.
A B
C D
62 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
збільшувалася кількість зруйнованих
клітин і спостерігався клітинний дет-
рит (рис. 2, A).
Перебування клітин в умовах
культивування призводило до се-
диментації та прикріплення клітин-
них елементів КГК до субстрату
(рис. 2, B).
Протягом 2–3 діб культивування
після експлантації суспензії більшість
клітин та агрегатів адгезувала до
субстрату, і на периферії агрегатів
з’являлися поодинокі клітини, які ви-
селились і розпласталися на поверхні
культурального пластику (рис. 2, C).
Ці процеси протікали повільніше, ніж
у первинних культурах КГК, що дає
підстави для припущень щодо наяв-
ності фази затримання розвитку кріо-
консервованих КГК in vitro, під час
якої у клітинах можливо відбувається
репарація нелетальних ушкоджень.
З часом процеси міграції та роз-
пластування кріоконсервованих КГК
підсилювались, і через 7 діб після
експлантації культури деконсервова-
них КГК практично не відрізнялись
від первинних культур КГК відповід-
ного терміну перебування in vitrо.
При культивуванні протягом наступ-
Рис. 2. Деконсервована суспензія КГК (A); ×200. Культура деконсер-
вованих КГК через 1 (B), 3 (C) та 7 (D) діб; ×400. Прижиттєве спосте-
реження; A, B – ×200; C, D – ×400.
Fig. 2. Frozen-thawed GCCs one hour post thaw (A). Culture of frozen-
thawed GCCs following 1st (B), 3rd (C) and 7th (D) day. Supravital
observation; A, B – ×200; C, D – ×400.
них 7 діб спостерігалось поступове старіння
деконсервованих КГК, подібне до відповідних змін
у первинній культурі у той же термін, яке виража-
лося переважно у відкріпленні клітинних елементів.
Таким чином, протягом перших 7 діб культиву-
вання свіжовиділені та кріоконсервовані КГК де-
монстрували здатність до адгезії, розпластування
і міграції з виявленням певного цитотипу (клітини
округлої форми з великим ядром та зернистою
цитоплазмою). Затримка у розвитку культури де-
консервованих клітин на 1–4-у добу експерименту
може свідчити про виникнення нелетальних ушко-
джень у клітинах в процесі кріоконсервування, зо-
крема в їх мембранах: зміни фазового стану ліпідів
клітинних мембран, порушення активності мемб-
ранозв’язаних ферментів тощо. При подальшому
перебуванні клітин у культурі ці порушення зни-
кають, про що свідчать спостереження за культу-
рою КГК на 7-у добу культивування.
У повній мірі функціональний стан, специфічний
для КГК, може бути оцінений лише за здатністю
до гормоногенезу. Аналіз гормонопродукуючої
функції свіжовиділених та кріоконсервованих клітин
КГК на 1-у, 3-ю, 7-у доби культивування показав,
Appearance and composition of thawed GCC
suspension changed as compared to primary sus-
pension, the number of destroyed cells increased and
cell detritus was found (Fig. 2A).
Staying of the cells under culture conditions led to
sedimentation and adherence of cell elements of GCCs
to a substrate (Fig. 2B).
During 2–3 days after start of explantation the
majority of cells and aggregates of the suspension
adhered to the substrate and single cells appeared in
the periphery of aggregates which migrated and
flattened thereafter on a cultural plastics surface
(Fig. 2C). These processes proceeded more slowly
than those in primary cultures of GCCs, this enabled
to suppose the presence of delayed in vitro develop-
ment phase in cryopreserved GCCs, which was
nessessary for reparation of non-lethal impairments.
Over time the migration and flattening of cryo-
preserved GCCs strengthened and 7 days later the
initiated explantation the frozen-thawed GCCs culture
had almost no differences from primary cultures of
GCCs of the same in vitro culture terms. Following 7
days of culture were accompanied with gradual ageing
of frozen-thawed GCCs, similar to corresponding
A B
C D
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
63
що рівень секреції прогестерону деконсервованими
КГК був статистично значуще вищим, ніж у свіжо-
виділених клітин, а естрадіолу – статистично зни-
жувався (таблиця). Як видно, співвідношення про-
дукції естрадіолу і прогестерону КГК зберігається,
але змінюються показники кількості продукції цих
гормонів клітинами. Так, рівень секреції естрадіолу
після кріоконсервування знизився на 89,9% відносно
цих показників до кріоконсервування. У той самий
час рівень секреції прогестерону деконсервованими
КГК підвищився на 81,4% відносно показників
первинної культури.
Можна припустити, що нелетальні ушкодження
плазматичної мембрани КГК, які виникають під
час кріоконсервування, можуть змінювати проник-
ність мембран до гормонів та в цілому впливати
на стероїдогенез, але механізм цього явища потре-
бує окремих досліджень і подальшого з’ясування.
Відомо, що цитоплазма КГК у нормі містить
значну кількість ліпідних гранул, які депонують
холестерин, що є субстратом для синтезу стероїд-
них гормонів. Іх наявність в КГК можливо вста-
новити за допомогою флуоресцентного барвника
НЧ.
Як видно, на 7-у добу культивування інтенсив-
ність світіння в окремих клітинах первинної культури
може бути різною, що, ймовірно, залежить від кіль-
кості та розташування ліпідних крапель (рис. 3, A).
Після кріоконсервування близько (70,0 ± 7,1)%
КГК мали яскраву флуоресценцію (рис. 3, B).
Інтенсивність світіння кріоконсервованих КГК була
на рівні свіжовиділених зразків. Наявність ліпідних
включень у КГК після кріоконсервування може
опосередковано свідчити про наявність депо хо-
лестеролу, який є необхідною складовою продукції
стероїдних гормонів.
Відомо, що навіть за оптимальних умов кріокон-
сервування в збережених клітинах виявляються
Вміст гормонів у середовищі культивування свіжовиділених та кріоконсервованих КГК
Content of hormones in culturing medium of freshly isolated and cryopreserved GCCs
Примітка: * – значущі відмінності в порівнянні з первинною культурою на відповідних строках культивування, p ≤ 0,05.
Note: * – the differences are statistically significant if compared with primary culture of corresponding culture terms, p ≤ 0.05.
changes in primary culture at the same term, and which
was mainly manifested in detachment of cell elements.
Thus, during first 7 days of culture the freshly
isolated and cryopreserved GCCs demonstrated the
ability to adhere, flatten and migrate with the appea-
rance of certain phenotype (cells of roundish shape
with large nucleus and granular cytoplasm). Delay in
culture development of the frozen-thawed cells from
1st through 4th experimental days could testify to the
appearance of non-lethal impairments of cells resulted
from the cryopreservation, in particular of their
membranes, e. g. to the change in phase state of cell
membrane lipids, disordered activity of membrane-
bound enzymes etc. During further staying of cells in
the culture conditions these impairments disappeared,
which was confirmed with observation of the GCCs
culture to the 7th culture day.
The functional state specific for GCCs could be
properly estimated only considering hormonopoiesis.
Analysis of hormone producing function of freshly
isolated and cryopreserved GCCs to the 1st, 3rd, 7th
culture days has shown that the secretion level of
progesterone by frozen-thawed GCCs was significantly
higher than in freshly isolated cells and estradiol one
was significantly reduced (Table). It could be seen,
that ratio between the values of estradiol and pro-
gesterone production by GCCs was kept, but the
absolute indices of hormone production by the cells
altered. For instance, the secretion rate of estradiol
following cryopreservation reduced by 89.9% in
respect of these indices prior to cryopreservation. At
the same time, the secretion level of progesterone in
thawed GCCs increased by 81.4% vs. indices observed
in the primary culture.
It could be assumed that non-lethal impairments of
GCCs plasma membrane appearing during cryopre-
servation could change the permeability to hormones
and generally affect steroidogenesis but the mecha-
,яннавувитьлукнімреТ
абод
syad,mreterutuC
лм/гп,лоідартсЕ
lm/gp,loidartsE
л/ьломн,норетсегорП
l/lomn,enoretsegorP
арутьлуканнивреП
erutlucyramirP
арутьлуK
КГKхинавовреснокед
dewaht-nezorffoerutluC
sCGC
арутьлуканнивреП
erutlucyramirP
арутьлуK
КГKхинавовреснокед
dewaht-nezorffoerutluC
sCGC
1 1,85±03722 3,22±773 * 8,2±0,8 4,2±2,55 *
3 9,561±09305 9,17±0417 * 6,5±1,07 1,8±0,001 *
7 5,607±08222 3,161±0913 * 90,0±2,01 8,7±1,09 *
64 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
нелетальні ушкодження, які істотно знижують біо-
логічні властивості клітинних культур [3]. Але ці
пошкодження можуть бути усунені за певних умов
культивування, тобто коли клітини здатні відновити
свої морфофункціональні властивості.
Дотепер у сучасній літературі замало даних що-
до впливу факторів кріоконсервування на морфо-
функціональні характеристики окремих КГК і вони
мають розрізнений характер, але існує чимало
повідомлень стосовно кріоконсервування фрагмен-
тів тканини яєчників.
Так, було встановлено факт збільшення проліфе-
ративних властивостей та життєздатності фраг-
ментів тканини яєчників людини після кріоконсер-
вування [8]. В іншому дослідженні піддавали по-
вільному заморожуванню фрагменти яєчників кози
в розчинах, які містять різні внутрішньоклітинні кріо-
протектори, а саме етиленгліколь, пропандіол або
диметилсульфоксид [23]. Ультраструктурний аналіз
виявив морфологічно нормальні преантральні фолі-
кули в контролі та культивованих фрагментах до і
після кріоконсервування та короткострокового куль-
тивування [7].
Раніше було продемонстровано зменшення
щільності міжклітинних контактів після кріоконсер-
вування ізольованих КГК [6]. У той самий час іс-
нують дані щодо впливу розчинів кріопротекторів
на ушкодження ДНК [17]. Цікаво, що після еквіліб-
рації КГК із розчинами етиленгліколю (40%) та
гліцеролу (28%) кількість ушкоджень ДНК була
нижчою, ніж у свіжовиділених клітинах. Тобто після
еквілібрації з кріопротекторами та після подаль-
шого кріоконсервування авторами було відмічено
високу життєздатність клітин.
У даній роботі ми вивчали морфофункціональні
властивості КГК не у складі фрагментів яєчника,
nisms of such phenomena require sepa-
rate studies and further elucidation.
It is known that cytoplasm of GCCs
normally contains a significant amount
of lipid granules which depot choles-
terol, which is a substrate to synthesize
steroid hormones. Their presence could
be visualised using fluorescent dye Nile
red.
It is seen, that to the 7th culture day
the fluorescence intensity in individual
cells could be different, depending likely
on number and location of lipid drops.
After cryopreservation about (70 ±
7.1)% GCCs had bright fluorescence
(Fig. 3B). The fluorescence intensity
of cryopreserved GCCs was at the
level of freshly isolated samples. The
cells were of round shape with mani-
Рис.3. Флуоресценція в КГК на 7-у добу культивування: A – у первинній
культурі; B – у культурі деконсервованих КГК. Конфокальна мікро-
скопія; забарвлення НЧ; суміщення зображень флуоресценції та в
прохідному світлі.
Fig. 3. GCCs fluorescence to the 7th culturing day: A – prior to cryopre-
servation, B – after cryopreservation. Confocal microscopy; staining with
Nile red; merged images of fluorescence and transmitted light.
fested granular cytoplasm. The presence of lipid inclu-
sions in GCCs after cryopreservation could indirectly
testify to a possible presence of cholesterol depot being
an essential component to produce steroid hormones.
It is known that even optimal cryopreservation con-
ditions could lead to appearance of non-lethal injuries
in the survived cells, which considerably reduce the
biological properties of cell cultures [21]. However,
these damages could be eliminated under certain cultu-
re conditions, allowing the cells to recover their morpho-
functional features.
To date there are not enough reported data about
the effect of cryopreservation factors on morphofunc-
tional characteristics of isolated GCCs and these are
of odd character, however, the cryopreservation of
ovarian tissue fragments is described widely.
For instance, the fact of increasing proliferative
properties and viability of fragments of human ovarian
tissue fragments after cryopreservation has been found
[4]. In other study, goat ovarian fragments were slowly
frozen in the solutions containing different intracellular
cryoprotectants, namely ethylene glycol, propane diol
and dimethyl sulfoxide [23]. Ultrastructural analysis
revealed morphologically normal preantral follicles in
the control and cultured fragments prior to and after
cryopreservation and short-term culturing [2].
Reduced tightness of intercellular contacts in GCCs
was demonstrated after cryopreservation of some
GCCs there [1]. At the same time there are data as
for the effect of cryoprotective solutions on DNA
damage [15]. Of interest is the fact that after
equilibration of GCCs with the solutions of ethylene
glycol (40%) and glycerol (28%) the number of DNA
damages was lower than in freshly isolated cells.
Moreover, after equilibration with cryoprotectants and
A B
Література
1. Грищенко В.И., Паращук Ю.С., Дахно Ф.В., Юрченко Г.Г.
Криобиология и проблемы бесплодия. – К.: Наук. думка,
1990. – 135 с.
2. Лебедева И.Ю., Кибардина Т.В., Кузьмина Т.И. Участие
клеток гранулезы в опосредовании действия пролактина
и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы коров
in vitro // Цитология. – 2005. – Т. 47, №10 – С. 882–888.
3. Петренко А.Ю. Изучение репарации мембран митохонд-
рий после замораживания-отогрева // Криобиология. –
1987. – №2. – С. 24–29.
4. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование
для создания банка клеток: современные концепции на
рубеже ХХI столетия // Проблемы криобиологии. – 2003. –
№2. – С. 62–83.
5. Чуб Н.Н., Лобынцева Г.С., Демина Л.Г. Влияние криопротек-
торов на морфологическую целостность и функциональ-
ную полноценность овариальной ткани человека //
Криоконсервирование клеток и тканей: Сб. науч. тр. –
Харьков, 1989. – С. 118.
6. Alisch A., Ruping K., Koster F. et al. Cumulus cell apoptosis as
a predictor for oocyte quality in artificial reproduction techni-
que // Zentralbl. Gynakol. – 2003. – Vol. 125, №11. – P. 452–
457.
7. Castro S.V., de Carvalho A.A., da Silva C.M. et al. Freezing
solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum main-
tains survival and ultrastructure of goat preantral follicles after
cryopreservation and in vitro culture of ovarian tissue // Cell
Tissue Res. – 2011. – Vol. 346, №2. – P. 283–292.
8. Isachenko V., Isachenko E., Mallmann P., Rahimi G. Increasing
follicular and stromal cell proliferation in cryopreserved human
ovarian tissue after long-term precooling prior to freezing: in
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
65
а власне у суспензії цих клітин. Було встановлено,
що при культивуванні свіжовиділених клітин ад-
гезію і міграцію відмічали на 2-у добу. В той самий
час після кріоконсервування під захистом 1,2-ПД
морфофункціональну активність клітин спостері-
гали протягом 3- та 4-ї доби. На 7-у добу культиву-
вання КГК після кріоконсервування відзначали
множинну міграцію клітинних елементів у моно-
шарі. При подальшому культивуванні кріоконсерво-
ваних КГК до 14-ї доби більшість клітин і агрегатів
відкріплювалася від дна чашки, що було ознакою
старіння культури.
Одержані результати свідчать про те, що КГК
можна отримувати і зберігати в умовах низькотем-
пературних банків з метою подальшого викорис-
тання для співкультивування гамет та ембріонів in
vitro у допоміжних репродуктивних технологіях.
Висновки
Низькотемпературне консервування КГК під
захистом розчину 1,5 М 1,2-ПД з використанням
повільного заморожування дозволяє зберегти мор-
фологічну цілісність та функціональну активність
клітин, ознакою чого є здатність їх до адгезії, роз-
пластування, міграції та проліферації в умовах куль-
тивування, а також продукції стероїдних гормонів.
References
1. Alisch A., Ruping K., Koster F. et al. Cumulus cell apoptosis as
a predictor for oocyte quality in artificial reproduction techni-
que. Zentralbl Gynakol 2003; 125(11): 452–457.
2. Castro S.V., de Carvalho A.A., da Silva C.M., et al. Freezing
solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum main-
tains survival and ultrastructure of goat preantral follicles after
cryopreservation and in vitro culture of ovarian tissue. Cell
Tissue Res 2011; 346(2): 283–292.
3. Chub N.N., Lobyntseva G.S., Demina L.G. Effect of cryopro-
tectants on morphological and functional integrity of human
ovarian tissue. In: Cryopreservation of cells and tissues.
Kharkov; 1989: p. 118.
4. Isachenko V., Isachenko E., Mallmann P., Rahimi G. Increasing
follicular and stromal cell proliferation in cryopreserved human
ovarian tissue after long-term precooling prior to freezing: in
vitro versus chorioallantoic membrane (CAM) xenotransplan-
tation. Cell Transplant 2013; 22(11): 2053–2061.
5. Freeman M., Whitworth C., Hill G. Granulosa cell co-culture
enhances human embryo development and pregnancy rate
following in vitro fertilization. Hum Reprod 1995; 10(2): 408–414.
6. Fuller B., Green C., Grischenko V.I. Cryopreservation for cell
banking: current concepts at the turn of 21st century. Problems
of Cryobiology 2003; (2): 62–83.
7. Grischenko V.I., Paraschuk Yu.S., Dakhno F.V., Yurchenko G.G.
Cryobiology and infertility problems. Kiev: Naukova Dumka; 1990.
after further cryopreservation the authors have noted
a high cell viability.
In the present study we assessed morphofunctional
properties of GCCs, which were not the part of ovarian
fragments, but represented the suspension of isolated
cells. It has been established that during culture of
freshly isolated cells their adhesion and migration were
found to the 2nd day. At the same time after cryo-
preservation under 1,2-PD protection the morphofunc-
tional activity of cells was observed during the 3rd and
4th days. To the 7th day of GCCs culture post thaw,
numerous cells migrated to monolayer. Following
culturing of cryopreserved GCCs till the 14th day was
accompanied by detachment of most cells and aggre-
gates from the plate bottom which was the sign of
culture ageing.
The findings testify to the fact that GCCs could be
obtained and preserved under low temperature bank
conditions with the aim of their further application for
in vitro co-culture of gametes and embryos as a part
of assisted reproductive technologies.
Conclusions
Low temperature preservation of GCCs under
protection of 1.5 M 1,2-PD solution using slow freezing
enabled the preservation of morphological integrity and
functional activity of cells, the features of that were
the ability of their adhesion, flattening, migration and
proliferation under culturing conditions, as well as
producing of steroid hormones.
vitro versus chorioallantoic membrane (CAM) xenotransplan-
tation // Cell Transplant. – 2013. – Vol. 22, №11. – Р. 2053–
2061.
9. Freeman M., Whitworth C., Hill G. Granulosa cell co-culture
enhances human embryo development and pregnancy rate
following in vitro fertilization // Hum. Reprod. – 1995. – Vol. 10,
№2. – P. 408–414.
10.Gunasena K., Villines P., Critser J. Live births after autologous
transplantation of cryopreserved mouse ovaries // Hum.
Reprod. – 1997. – Vol. 12, №1. – Р. 101–106.
11.Gook D.A., Osborn S.M., Bourne H., Johnston W.I. Fertilization
of human oocytes following cryopreservation; normal karyo-
types and absence of stray chromosomes // Hum. Reprod. –
1994. – Vol. 9, №4. – P. 684–691.
12.Gook D.A., Osborn S.M., Johnston W.I. Cryopreservation of
mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the
configuration of the meiotic spindle // Hum. Reprod. – 1993. –
Vol. 8, №7 – P. 1101–1109.
13.Gook D.A., Osborn S.M., Johnston W.I. Parthenogenetic acti-
vation of human oocytes following cryopreservation using
1,2-propanediol // Hum. Reprod. – 1995. – Vol. 10, №3. –
P. 654–658.
14.Gook D.A., Schiewe M.C., Osborn S.M. et al. Intracytoplasmic
sperm injection and embryo development of human oocytes
cryopreserved using 1,2-propanediol // Hum. Reprod. – 1995. –
Vol. 10, №10. – P. 2637–2641.
15.Host E., Mikkelsen A.L., Lindenberg S., Smidt-Jensen S.
Apoptosis in human cumulus cells in relation to maturation
stage and cleavage of the corresponding oocyte // Acta
Obstet. Gynecol. Scand. – 2000. – Vol. 79, №11. – P. 936–
940.
16.Johnson J., Higdon H., Boone W. Effect of human granulosa
cell co-culture using standard culture media on the maturation
and fertilization potential of immature human oocytes // Fertil.
Steril. – 2008. – Vol. 90, №5. – Р. 1674–1679.
17.Lindley E., Jacobson J., Corselli J. Cryopreservation of human
cumulus cells for co-cultures and assessment of DNA damage
after thawing using the comet assay II // J. Assist. Reprod.
Genet. – 2001. – Vol. 18, №10. – Р. 534–538.
18.Liu Y., Holyoak G., Wang S., Bunch T. The importance of cumulus
cells on the in vitro production of bovine oocytes // Therio-
genology. – 1995. – Vol. 43, №1. – Р. 267.
19.McNatty K.P., Baird D.T., Bolton A. et al. Concentration of estro-
gens and androgens in human ovarian venous plasma and
follicular fluid throughout the menstrual cycle // J. Endocrinol. –
1976. – Vol. 71(2). – P. 77–85.
20.Muiheron G., Bossert N., Lapp J. et al. Human granulose-luteal
and cumulus cells ezpress transforming growth factors-beta
type 1 and type 2 mRNA // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1992. –
Vol. 74, №2. – Р. 32–40.
21.Parikh F., Nadkarni S., Naik N. еt al. Cumulus coculture and
cumulus-aided embryo transfer increases pregnancy rates in
patients undergoing in vitro fertilization // Fertil. Steril. – 2006. –
Vol. 86, №4. – Р. 839–847.
22.Ruppert-Lingham C.J., Paynter S.J., Godfrey J. et al. Develop-
mental potential of murine germinal vesicle stage cumulus-
oocyte complexes following exposure to dimethylsulphoxide
or cryo-preservation: loss of membrane integrity of cumulus
cells after thawing // Hum. Reprod. – 2003. – Vol. 18, №2. –
Р. 392–398.
23.Zhang A., Xu B., Sun Y. et al. The effect of human cumulus
cells on the maturation and developmental potential of immature
oocytes in ICSI cycles // J. Assist. Reprod. Genet. – 2012. –
Vol. 29, №4. – Р. 313–319.
8. Gunasena K., Villines P., Critser J. Live births after autologous
transplantation of cryopreserved mouse ovaries. Hum Reprod
1997; 12(1): 101–106.
9. Gook D.A., Osborn S.M., Bourne H., Johnston W.I. Fertilization
of human oocytes following cryopreservation; normal karyo-
types and absence of stray chromosomes. Hum Reprod 1994;
9(4): 684–691.
10.Gook D.A., Osborn S.M., Johnston W.I. Cryopreservation of
mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the
configuration of the meiotic spindle. Hum Reprod 1993; 8(7):
1101–1109.
11.Gook D.A., Osborn S.M., Johnston W.I. Parthenogenetic acti-
vation of human oocytes following cryopreservation using
1,2-propanediol. Hum Reprod 1995; 10(3): 654–658.
12.Gook D.A., Schiewe M.C., Osborn S.M. et al. Intracytoplasmic
sperm injection and embryo development of human oocytes
cryopreserved using 1,2-propanediol. Hum Reprod 1995;
10(10): 2637–2641.
13.Host E., Mikkelsen A.L., Lindenberg S., Smidt-Jensen S.
Apoptosis in human cumulus cells in relation to maturation
stage and cleavage of the corresponding oocyte. Acta Obstet
Gynecol Scand 2000; 79(11): 936–940.
14.Johnson J., Higdon H., Boone W. Effect of human granulosa
cell co-culture using standard culture media on the maturation
and fertilization potential of immature human oocytes. Fertil
Steril 2008; 90(5): 1674–1679.
15.Lindley E., Jacobson J., Corselli J. Cryopreservation of human
cumulus cells for co-cultures and assessment of DNA damage
after thawing using the comet assay II. J Assist Reprod Genet
2001; 18(10): 534–538.
16.Liu Y., Holyoak G., Wang S., Bunch T. The importance of cumulus
cells on the in vitro production of bovine oocytes. Therio-
genology 1995; 43(1): 267.
17.Lebedeva I. Yu., Kibardina T.V., Kuzmina T.I. Participation of
granulosa cells in mediating effect of prolactin and somato-
tropin on bovine oocyte-cumulus complexes in vitro. Tsytolo-
giya 2005; 47(10): 882–888.
18.McNatty K.P., Baird D.T., Bolton A. et al. Concentration of estro-
gens and androgens in human ovarian venous plasma and
follicular fluid throughout the menstrual cycle. J Endocrinol
1976; 71(2): 77–85.
19.Muiheron G., Bossert N., Lapp J. et al. Human granulose-luteal
and cumulus cells ezpress transforming growth factors-beta
type 1 and type 2 mRNA. J Clin Endocrinol Metab 1992; 74(2):
32–40.
20.Parikh F., Nadkarni S., Naik N. еt al. Cumulus coculture and cu-
mulus-aided embryo transfer increases pregnancy rates in
patients undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 2006; 86(4):
839–847.
21.Petrenko A.Y. Study of mitochondria membrane reparation after
freeze-thawing. Kriobiologiya 1987; (2): 24–29.
22.Ruppert-Lingham C.J., Paynter S.J., Godfrey J. et al. Develop-
mental potential of murine germinal vesicle stage cumulus-
oocyte complexes following exposure to dimethylsulphoxide
or cryo-preservation: loss of membrane integrity of cumulus
cells after thawing. Hum Reprod 2003; 18(2): 392–398.
23.Zhang A., Xu B., Sun Y. et al. The effect of human cumulus
cells on the maturation and developmental potential of immature
oocytes in ICSI cycles. J Assist Reprod Genet 2012; 29(4):
313–319.
66 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 1, 2014
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68791 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:50:47Z |
| publishDate | 2014 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Петрушко, М.П. Піняєв, В.І. Ревенко, О.Б Волкова, Н.О. Чуб, Н.Н. 2014-09-28T17:51:20Z 2014-09-28T17:51:20Z 2014 Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини / М.П. Петрушко, В.І. Піняєв, О.Б. Ревенко , Н.О. Волкова, Н.Н. Чуб // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 1. — С. 57-66. — Бібліогр.: 23 назв. — укр., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68791 576.535:57.043 Використання комплексу клітин гранульози та кумулюса (КГК) може бути перспективним при співкультивуванні гамет та ембріонів у програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ), що робить нагальним їх кріоконсервування. В роботі вивчали КГК жінок віком 25–39 років, які проходили курс лікування безпліддя методом IVF. Для кріоконсервування суспензії КГК використовували 1,5 М розчин 1,2-ПД. Зразки охолоджували зі швидкістю 0,3 град/хв від 25 до –6°С, далі здійснювали ініціацію кристалоутворення, від –6 до –35°С швидкість охолодження складала 1 град/хв; після цього зразки занурювали в рідкий азот і зберігали при –196°С. Після відігрівання КГК зберігали свої основні властивості: здатність до адгезії та проліферації, а також гормонопродукуючу функцію. При культивуванні виявлено затримку розвитку культури КГК на 1–2 доби в порівнянні зі свіжовиділеними клітинами. Через 7 діб після експлантації культури деконсервованих КГК практично не відрізнялись від первинних культур КГК відповідного терміну розвитку in vitrо. Змінився рівень гормонопродукції КГК після кріоконсервування: естрадіолу – знизився на 89,9%, а прогестерону – підвищився на 81,4% відносно показників свіжовиділених суспензій. Отримані результати свідчать про те, що КГК можна отримувати і зберігати в умовах низькотемпературних банків з метою подальшого використання у ДРТ. Использование комплекса клеток гранулезы и кумулюса (КГК) может быть перспективным при сокультивировании гамет и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), что делает актуальным их криоконсервирование. В работе изучали КГК женщин возрастом 25–39 лет, проходивших курс лечения бесплодия методом IVF. Для криоконсервирования суспензии КГК использовали раствор 1,5 М 1,2-пропандиола. Образцы охлаждали со скоростью 0,3 град/мин от 25 до –6°С, далее осуществляли инициацию кристаллообразования, от –6 до –35°С скорость охлаждения составляла 1 град/мин, после этого образцы погружали в жидкий азот и хранили при –196°С. После отогрева КГК сохраняли свои основные свойства: способность к адгезии и пролиферации, а также гормонопродуцирующую функцию. При культивировании выявлена задержка развития культуры КГК на 1–2 суток по сравнению со свежевыделенными клетками. Через 7 суток после эксплантации культуры деконсервированных КГК практически не отличались от первичных культур соответствующего срока развития in vitro. Изменился уровень гормонопродукции КГК после криоконсервирования: эстрадиола – снизился на 89,9%, а прогестерона – повысился на 81,4% относительно показателей свежевыделенных суспензий. Полученные результаты свидетельствуют о том, что КГК можно получать и хранить в условиях низкотемпературных банков с целью дальнейшего использования в ВРТ. Utilization of granulosa and cumulus cell (GCC) complex could be prospective for co-culture of gametes and embryos as a part of assisted reproductive technologies (ART), that makes important their cryopreservation. The study was performed in GCCs of women aged 25–39, who underwent the treatment of infertility by IVF. Cryopreservation of GCC suspension was carried out using 1.5 M 1,2-propane diol solution. The samples were cooled with rate of 0.3 deg/min from 25 down to –6°C, thereafter the ice crystal initiation was done, from –6 down to –35°C the cooling rate was 1 deg/min, after that the samples were plunged into liquid nitrogen and stored then at –196°C. Following thawing the GCCs retained their main features: ability for adhesion and proliferation, and hormone production. During culture of GCCs its development was delayed for 1–2 days if compared with freshly isolated cells. In 7 days after explanting the cultures of frozen-thawed GCCs appeared nearly the same as primary cultures of corresponding terms of in vitro culture. The post thaw level of hormone production by GCCs was changed: decreased by 89.9% in case of estradiol, and increased by 81.4% for progesterone if compared with the indices of freshly isolated suspensions. The obtained results testify to a possibility to isolate the GCCs and then to store in low-temperature banks for prospective use in ART. uk Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини Morphofunctional Characteristics of Freshly Isolated and Cryopreserved Human Ovarian Granulosa and Cumulus Cells Article published earlier |
| spellingShingle | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини Петрушко, М.П. Піняєв, В.І. Ревенко, О.Б Волкова, Н.О. Чуб, Н.Н. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини |
| title_alt | Morphofunctional Characteristics of Freshly Isolated and Cryopreserved Human Ovarian Granulosa and Cumulus Cells |
| title_full | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини |
| title_fullStr | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини |
| title_full_unstemmed | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини |
| title_short | Морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини |
| title_sort | морфофункціональні характеристики свіжовиділених і кріоконсервованих клітин гранульози та кумулюса яєчників людини |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68791 |
| work_keys_str_mv | AT petruškomp morfofunkcíonalʹníharakteristikisvížovidílenihíkríokonservovanihklítingranulʹozitakumulûsaâêčnikívlûdini AT pínâêvví morfofunkcíonalʹníharakteristikisvížovidílenihíkríokonservovanihklítingranulʹozitakumulûsaâêčnikívlûdini AT revenkoob morfofunkcíonalʹníharakteristikisvížovidílenihíkríokonservovanihklítingranulʹozitakumulûsaâêčnikívlûdini AT volkovano morfofunkcíonalʹníharakteristikisvížovidílenihíkríokonservovanihklítingranulʹozitakumulûsaâêčnikívlûdini AT čubnn morfofunkcíonalʹníharakteristikisvížovidílenihíkríokonservovanihklítingranulʹozitakumulûsaâêčnikívlûdini AT petruškomp morphofunctionalcharacteristicsoffreshlyisolatedandcryopreservedhumanovariangranulosaandcumuluscells AT pínâêvví morphofunctionalcharacteristicsoffreshlyisolatedandcryopreservedhumanovariangranulosaandcumuluscells AT revenkoob morphofunctionalcharacteristicsoffreshlyisolatedandcryopreservedhumanovariangranulosaandcumuluscells AT volkovano morphofunctionalcharacteristicsoffreshlyisolatedandcryopreservedhumanovariangranulosaandcumuluscells AT čubnn morphofunctionalcharacteristicsoffreshlyisolatedandcryopreservedhumanovariangranulosaandcumuluscells |