Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования
Проведенный сравнительный анализ структурно-функционального статуса стволовых кроветворных клеток (СКК) фетальной печени (ФП) 14 суток гестации и взрослого костного мозга (КМ) мышей линии СВА/H 4-месячного возраста продемонстрировал не только различия их исходных качественно-количественных характери...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2014 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2014
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68799 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Е. Ямпольская, Л.В. Останкова, М.В. Останков // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 2. — С. 118-131. — Бібліогр.: 35 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860197029279432704 |
|---|---|
| author | Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Ямпольская, Е.Е. Останкова, Л.В. Останков, М.В. |
| author_facet | Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Ямпольская, Е.Е. Останкова, Л.В. Останков, М.В. |
| citation_txt | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Е. Ямпольская, Л.В. Останкова, М.В. Останков // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 2. — С. 118-131. — Бібліогр.: 35 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Проведенный сравнительный анализ структурно-функционального статуса стволовых кроветворных клеток (СКК) фетальной печени (ФП) 14 суток гестации и взрослого костного мозга (КМ) мышей линии СВА/H 4-месячного возраста продемонстрировал не только различия их исходных качественно-количественных характеристик, но и разный ответ на действие факторов криоконсервирования. Клетки ФП или КМ замораживали по разным режимам под защитой 5 и 10% диметилсульфоксида. Для оценки структурно-функциональных характеристик СКК из разных источников использовали методы цитофлуориметрии (содержание CD34+СD38–-клеток), колониеобразования in vivo (КОЕс) и in vitro (КОЕ-ГМ). Установлено, что определенные режимы криоконсервирования способны проявлять эффект селективного обогащения популяций клеток с фенотипическими признаками кроветворных предшественников (CD34+СD38–-клетки). Сопоставление содержания КОЕс, КОЕ-ГМ, СКК и клеток с фенотипом CD34+СD38– показало, что режим криоконсервирования для клеток ФП не является «оптимальным» для КМ. Показано, что при варьировании условий криоконсервирования можно обеспечивать не только «оптимальную» сохранность кроветворных предшественников из ФП и КМ с разным исходным функциональным статусом, но и направленно регулировать его.
Проведений порівняльний аналіз структурно-функціонального статусу стовбурових кровотвірних клітин (СКК) фетальної печінки (ФП) 14-ї доби гестації та дорослого кісткового мозку (КМ) мишей лінії СВА/H 4-місячного віку продемонстрував не тільки відмінності їхніх вихідних якісно-кількісних характеристик, але й різну відповідь на дію чинників кріоконсервування. Клітини ФП або КМ заморожували за різними режимами під захистом 5 і 10% диметилсульфоксиду. Для оцінки структурно-функціональних характеристик СКК із різних джерел використовували методи цитофлуориметрії (вміст CD34+СD38–-клітин), колонієутворювання in vivo (КУОс) та in vitro (КУО-ГМ). Встановлено, що певні режими кріоконсервування здатні виявляти ефект селективного збагачення популяцій клітин із фенотиповими ознаками кровотвірних попередників (CD34+СD38–-клітини). Зіставлення вмісту КОЕс, КУО-ГМ, СКК та клітин із фенотипом CD34+СD38– показало, що режим кріоконсервування для клітин ФП не є «оптимальним» для КМ. Показано, що при варіюванні умов кріоконсервування можна забезпечувати не тільки «оптимальну» збереженість кровотвірних попередників із ФП та КМ і різним вихідним функціональним статусом, а й направлено регулювати його.
The performed comparative analysis of structural and functional status of fetal liver (FL) hematopoietic stem cells (HSCs) of 14 gestation days and adult bone marrow (BM) of 4-month-old CBA/H mice demonstrated not only the differences of their initial qualitative and quantitative characteristics but also different responses to the effect of cryopreservation factors. Either FL or BM cells were frozen according to various regimens under protection of 5 and 10% dimethyl sulfoxide. To estimate structural and functional characteristics of HSCs derived from different sources there were used cytofluorimetry (content of CD34+СD38– cells), methods of colony formation in vivo (CFUs) and in vitro (CFU-GM). It has been established that certain cryopreservation regimens are able to manifest the effect of selective enrichment of cell populations with phenotype of hemopoietic progenitors (CD34+CD38– cells). Comparing the content of CFUs, CFU-GM, HSCs and cells with CD34+CD38– phenotype has shown that cryopreservation regimen for FL cells was not optimal for BM. It has been demonstrated that varying cryopreservation conditions allowed not only to provide optimal preservation rate of hemopoietic progenitors derived from FL and BM with various initial functional status, but to control it purposefully.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:09:13Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 615.014.41:612.647.014.3:611.018.46
А.Н. Гольцев*, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская,
Е.Е. Ямпольская, Л.В. Останкова, М.В. Останков
Особенности изменения структурно-функциональных
характеристик стволовых кроветворных клеток из разных
источников после криоконсервирования
UDC 615.014.41:612.647.014.3:611.018.46
A.N. Goltsev*, T.G. Dubrava, Yu.A. Gaevskaya,
E.E. Yampolskaya, L.V. Ostankova, M.V. Ostankov
Peculiarities of Post Cryopreservation Changes
in Structural and Functional Characteristics of Hematopoietic
Stem Cells Derived from Various Sources
Реферат: Проведенный сравнительный анализ структурно-функционального статуса стволовых кроветворных клеток
(СКК) фетальной печени (ФП) 14 суток гестации и взрослого костного мозга (КМ) мышей линии СВА/H 4-месячного возраста
продемонстрировал не только различия их исходных качественно-количественных характеристик, но и разный ответ на
действие факторов криоконсервирования. Клетки ФП или КМ замораживали по разным режимам под защитой 5 и 10%
диметилсульфоксида. Для оценки структурно-функциональных характеристик СКК из разных источников использовали
методы цитофлуориметрии (содержание CD34+СD38–-клеток), колониеобразования in vivo (КОЕс) и in vitro (КОЕ-ГМ).
Установлено, что определенные режимы криоконсервирования способны проявлять эффект селективного обогащения
популяций клеток с фенотипическими признаками кроветворных предшественников (CD34+СD38–-клетки). Сопоставление
содержания КОЕс, КОЕ-ГМ, СКК и клеток с фенотипом CD34+СD38– показало, что режим криоконсервирования для клеток ФП
не является «оптимальным» для КМ. Показано, что при варьировании условий криоконсервирования можно обеспечивать
не только «оптимальную» сохранность кроветворных предшественников из ФП и КМ с разным исходным функциональным
статусом, но и направленно регулировать его.
Ключевые слова: криоконсервирование, фетальная печень, клетки костного мозга, стволовые кроветворные клетки.
Реферат: Проведений порівняльний аналіз структурно-функціонального статусу стовбурових кровотвірних клітин (СКК)
фетальної печінки (ФП) 14-ї доби гестації та дорослого кісткового мозку (КМ) мишей лінії СВА/H 4-місячного віку продемон-
стрував не тільки відмінності їхніх вихідних якісно-кількісних характеристик, але й різну відповідь на дію чинників кріоконсер-
вування. Клітини ФП або КМ заморожували за різними режимами під захистом 5 і 10% диметилсульфоксиду. Для оцінки
структурно-функціональних характеристик СКК із різних джерел використовували методи цитофлуориметрії (вміст
CD34+СD38–-клітин), колонієутворювання in vivo (КУОс) та in vitro (КУО-ГМ). Встановлено, що певні режими кріоконсервування
здатні виявляти ефект селективного збагачення популяцій клітин із фенотиповими ознаками кровотвірних попередників
(CD34+СD38–-клітини). Зіставлення вмісту КОЕс, КУО-ГМ, СКК та клітин із фенотипом CD34+СD38– показало, що режим
кріоконсервування для клітин ФП не є «оптимальним» для КМ. Показано, що при варіюванні умов кріоконсервування можна
забезпечувати не тільки «оптимальну» збереженість кровотвірних попередників із ФП та КМ і різним вихідним функціональним
статусом, а й направлено регулювати його.
Ключові слова: кріоконсервування, фетальна печінка, клітини кісткового мозку, стовбурові кровотвірні клітини.
Abstract: The performed comparative analysis of structural and functional status of fetal liver (FL) hematopoietic stem cells
(HSCs) of 14 gestation days and adult bone marrow (BM) of 4-month-old CBA/H mice demonstrated not only the differences of their
initial qualitative and quantitative characteristics but also different responses to the effect of cryopreservation factors. Either FL or
BM cells were frozen according to various regimens under protection of 5 and 10% dimethyl sulfoxide. To estimate structural and
functional characteristics of HSCs derived from different sources there were used cytofluorimetry (content of CD34+СD38– cells),
methods of colony formation in vivo (CFUs) and in vitro (CFU-GM). It has been established that certain cryopreservation regimens are
able to manifest the effect of selective enrichment of cell populations with phenotype of hemopoietic progenitors (CD34+CD38– cells).
Comparing the content of CFUs, CFU-GM, HSCs and cells with CD34+CD38– phenotype has shown that cryopreservation regimen for
FL cells was not optimal for BM. It has been demonstrated that varying cryopreservation conditions allowed not only to provide optimal
preservation rate of hemopoietic progenitors derived from FL and BM with various initial functional status, but to control it purposefully.
Key words: cryopreservation, fetal liver, bone marrow cells, hemopoietic stem cells.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-57-91, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: cryopato@rambler.ru
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 5791, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: cryopato@rambler.ru
Department of Cryopathophysiology and Immunology, Institute for
Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Aca-
demy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криопатофизиологии и иммунологии, Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 17.03.2014
Принята в печать 09.04.2014
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №2. – С. 118–131.
© 2014 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received March 17, 2014
Accepted April 9, 2014
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014. 24(2): 118–131.
© 2014 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
Длительное время трансплантация костного
мозга (КМ) была безальтернативным методом
лечения нарушений гемопоэза различного генеза
[22, 34]. В основе терапевтического эффекта донор-
ского КМ лежат экспансия введенных стволовых
кроветворных клеток (СКК) и репарация гемопоэ-
тической системы реципиента [1, 16]. Со временем
для лечения патологий различного генеза стало
возможным применение СКК из других источни-
ков, например, фетальной печени (ФП), кордовой
крови и т. д. [3, 21], необходимость создания запа-
сов которых предусматривает криоконсервиро-
вание, являющееся обязательным этапом приме-
нения такого рода тканевых субстратов в клини-
ческой практике [6, 29].
Многочисленные исследования показали, что
криоконсервирование является не только методом
долгосрочного хранения биообъекта, но и факто-
ром управления его внутренним состоянием (intrin-
sic state) [2, 4, 5]. Причинами структурно-функцио-
нальных изменений СКК, вызванных криоконсер-
вированием, могут быть кристаллообразование,
изменение солевого градиента, рН среды, образо-
вание супероксидных радикалов и др. [9, 18]. Отме-
чено, что у криоконсервированных СКК временно
снижается способность распознавать микроокру-
жение и расселяться в нем вследствие шеддинга
части поверхностных мембранных структур, опре-
деляющих их функциональный статус [18, 20].
Установлена различная колониеобразующая спо-
собность СКК после криоконсервирования в зави-
симости от их нахождения в разных фазах клеточ-
ного цикла или стадии дифференцировки [8]. Отме-
ченные особенности структурно-функциональной
организации СКК могут определять различную их
криоустойчивость в зависимости от того, в каком
гемопоэтическом плацдарме они функционируют,
т. е. из какого источника получены [19, 21, 24]. По
мнению некоторых исследователей, СКК костного
мозга, формирующие колонии в селезенке летально
облученных реципиентов, уже продвинуты в диф-
ференцировке по сравнению с более потентными
СКК фетальной печени [17, 23, 27]. Кроме того, по
мере дифференцировки СКК меняют феноти-
пический репертуар и степень экспрессии различ-
ных мембранных молекул, определяющих их
хоуминг и ряд других характеристик при введении
реципиентам [6, 18]. При адаптации к условиям
микроокружения и ответе на местные регулятор-
ные сигналы, донорские СКК могут не только
изменять свой статус под их влиянием, но и высту-
пать в роли модификатора этого микроокружения
и в целом состояния гемопоэтического плацдарма
реципиента, продуцируя регуляторные медиаторы
с паракринной активностью [15]. Пластичность и
For a long time the transplantation of bone marrow
(BM) was the only method to treat disorders in
hematopoiesis of different genesis [17, 32]. The basis
of therapeutic effect of donor BM is the expansion of
the introduced hematopoietic stem cells (HSCs) and
reparation of recipient’s hematopoietic system [2, 33].
With the course of time the treatment of pathologies
of different genesis became possible by applying the
HSCs from other sources, e. g. fetal liver (FL), cord
blood etc. [7, 15], the necessity to create their stocks
requires cryopreservation, being consequently a man-
datory stage for using such a tissue substrate in clinical
practice [12, 26].
Numerous studies showed that cryopreservation
could be not only a method for long-term storage of
biological object, but a factor controlling its intrinsic
state as well [6, 8, 11]. The causes of structural and
functional changes in HSCs provided by cryopreser-
vation can be crystal formation, change of saline gra-
dient, medium pH, formation of superoxide radicals
etc. [5, 16]. There was a notion that cryopreserved
HSCs had a decreased ability to recognize microenvi-
ronment and populate it due to shedding of some
surface membrane structures determining their func-
tional status [5, 14]. Various colony-forming activities
of HSCs were found following cryopreservation de-
pending on their being in different phases of cell cycle
or differentiation [3]. The revealed peculiarities of
HSCs structure-functional organization may determine
their different cryoresistance depending on the hemo-
poietic environment wherein they function, i. e. which
source they are obtained from [9, 15, 20]. Some scien-
tists suggest that BM HSCs forming the colonies in
lethally irradiated recipients have already been advan-
ced in differentiation as compared to the more potent
FL HSCs [4, 19, 23]. Furthermore, as far as differen-
tiation proceeds, the HSCs change their phenotype re-
pertoir and expression rate of various membrane mole-
cules determining their homing and other characteristics
following introduction to recipients [5, 12]. During
adapting to microenvironment conditions and response
to local regulatory signals, donor HSCs can change
their status under that influence as well as function as
modifier of the microenvironment and in a whole of
the state of recipient’s hematopoietic environment pro-
du-cing regulatory mediators with a paracrine activity
[1]. Flexibility and variety of structural and functional
characteristics of bone marrow and fetal liver HSCs
a priori make them an extraordinary target for physical
and chemical factors implemented during cryopreser-
vation. Thus, an initial state of HSCs can determine a
functional activity of the frozen-thawed specimens
used in clinical practice, which include these cells.
The use of HSCs of various sources to treat autoim-
mune diseases including BM and FL necessitates the
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
119
широта структурно-функциональных характерис-
тик СКК костного мозга и фетальной печени
a priori делают их неординарной мишенью для
физико-химических факторов, реализуемых в
процессе криоконсервирования. Таким образом,
исходное состояние СКК может определять функ-
циональную активность используемого в клиничес-
кой практике деконсервированного материала, в
состав которого они входят.
Применение СКК из различных источников при
лечении аутоиммунных заболеваниях, в том числе
из КМ и ФП, обуславливает необходимость
создания их запасов и поиска «оптимальных»
методов криоконсервирования. В связи с этим
актуальным как в теоретическом, так и приклад-
ном аспектах остается изучение криолабильности
СКК из разных источников с целью разработки
«оптимальных» режимов их криоконсервирования.
Цель данной работы – провести сравнительный
анализ влияния различных условий криоконсерви-
рования на структурно-функциональное состояние
СКК фетальной печени и взрослого костного мозга.
Материалы и методы
Эксперименты выполняли на мышах линии
СВА/H 4-месячного возраста массой 20–25 г, со-
держащився в стандартных условиях вивария Ин-
ститута проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины (г. Харьков). Исследования прово-
дили в соответствии с «Общими принципами
экспериментов на животных», одобренными III
Национальным конгрессом по биоэтике (г. Киев,
2007) и согласованными с положениями «Европей-
ской конвенции о защите позвоночных животных,
используемых для экспериментальных и других
научных целей» (г. Страсбург, 1986).
Животных декапитировали под легким эфирным
наркозом. Фетальную печень, выделенную из эмб-
рионов на 14-й посткоитальный день, дезинтегри-
ровали в гомогенизаторе Поттера в среде 199 (Инс-
титут полиомиелита и вирусных энцефалитов, Рос-
сия) с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей
сыворотки («БиолоТ», Россия) и 2%-го цитрата
натрия (далее в тексте – рабочая среда) с после-
дующей очисткой через капроновый фильтр для
удаления конгломератов.
Клетки КМ вымывали из бедренных костей ра-
бочей средой. Однородную суспензию клеток
получали путем многократного пропускания через
иглы уменьшающегося диаметра (0,8–0,5 мм) и
капроновый фильтр.
Раствор для криоконсервирования клеток ФП
и КМ представлял собой рабочую среду с 10 или
20% диметилсульфоксида (ДМСО) («Артериум»,
Украина). К полученным на рабочей среде суспен-
establishing of their stocks and search for ‘optimal’
cryopreservation methods. Herewith relevant in both
theoretical and practical aspects is the studying of
cryolability in HSCs from different sources in order to
develop ‘optimal’ regimens for their cryopreservation.
The objective of this research was to perform a
comparative analysis of the effect of different cryo-
preservation conditions on structure-functional state
of fetal liver and adult bone marrow HSCs.
Materials and methods
The experiments were carried out in 4-month-old
CBA/H mice of 20–25 g weight kept under standard
conditions of the vivarium at the Institute for Problems
of Cryobiology and Cryomedicine of the National
Academy of Sciences of Ukraine (Kharkov). The stu-
dies were performed according to the General Prin-
ciples of the Experiments in Animals approved by the
3rd National Congress on Bioethics (Kiev, 2007) and
consistent with the regulations of European Convention
for the Protection of Vertebrate Animals used for Expe-
rimental and other Scientific Purposes (Strasbourg,
1986).
The animals were decapitated under light ether
anaesthesia. Fetal liver isolated from the embryos to
the 14th post-coital day, was pounded in Potter homo-
genizer in 199 medium (Institute of Poliomyelitis and
Viral Encephalitides, Russia) supplemented with 10%
fetal bovine serum (Biolot, Russia) and 2% sodium
citrate (hereinafter handling medium) with the follow-
ing purification through a nylon filter to remove con-
glomerates.
BM cells were washed out of femur bones with
the handling medium. Homogeneous suspension was
derived by repeated passage through needles of de-
creasing diameter (0.8–0.5 mm) and nylon filter.
The solution for cryopreservation of FL and BM
cells was the handling medium with 10 or 20% dimethyl
sulfoxide (DMSO) (Arterium, Ukraine). The obtained
with handling medium suspension of FL and BM cells
was dropwise supplemented with cryoprotective solu-
tion in 1:1 ratio at 18°C during 2 min (final concentration
of cryoprotectant made 5 and 10%). Cells were expo-
sed in solution for 10 min at the same temperature.
Cells of FL and BM with the concentration of
6.0×106 cells/ml and volume of 1.0 ml were frozen with
programmable freezer UOP-6 produced by Special
Designing and Technical Bureau with Experimental
Unit (IPC&C of the NAS of Ukraine, Kharkov) in
plastic ampoules (Nunc, Germany) by the following
regimens:
– Regimen 1 (R1) was the cooling from room tem-
perature down to –40°C with the cooling rate of
1 deg/min with 5% DMSO (freezing program was
developed for BM cells) [26];
120 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
зиям клеток ФП или КМ по каплям добавляли
криоконсервирующий раствор в соотношении 1:1
при температуре 18°С в течение 2 мин (конечная
концентрация криопротектора составила 5 и 10%).
Экспозицию клеток в растворе проводили в течение
10 мин при той же температуре. Клетки ФП или
КМ с концентрацией 6,0×106 кл/мл и объемом 1,0
мл замораживали на программном заморажива-
теле УОП-6 (СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины,
Харьков) в пластиковых ампулах («Nunc», Герма-
ния) по следующим режимам:
– режим 1 (Р1) – замораживание от комнатной
температуры до –40°С со скоростью 1 град/мин с
5% ДМСО (программа замораживания разрабо-
тана для клеток КМ) [29],
– режим 2 (Р2) – замораживание от комнатной
температуры до –40°С со скоростью 1 град/мин
с 10% ДМСО (программа замораживания разрабо-
тана для клеток КМ) [29],
– режим 3 (Р3) – замораживание от комнатной
температуры до –40°С со скоростью 1 град/мин, 10-
минутная выдержка, затем охлаждение при
10 град/мин до –80°С с 5% ДМСО (программа
замораживания разработана для клеток ФП) [13],
– режим 4 (Р4) – замораживание от комнатной
температуры до –40°С со скоростью 1 град/мин, 10-
минутная выдержка, затем охлаждение при
10 град/мин до –80°С с 10% ДМСО с последую-
щим погружением ампул в каждом случае в жид-
кий азот (программа замораживания разработана
для клеток ФП) [13].
Оттаивание образцов проводили на водяной
бане при температуре 38…40°С до исчезновения
твердой фазы. Клетки однократно отмывали от
ДМСО путем покапельного добавления равного
объема рабочей среды, затем центрифугировали
(200g, 10 мин). Суспензии клеток, не подвергав-
шиеся процедуре замораживания-отогрева, далее
будем называть нативным контролем.
Сохранность клеток до и после криоконсерви-
рования определяли с помощью пропидий йодида
(«Sigma», США) на проточном цитофлуориметре
«FACS Calibur» («Becton Dickinson», США),
количество ядросодержащих клеток – в камере
Горяева.
Фенотипический анализ клеток осуществляли
на проточном цитофлуориметре «FACS Calibur»
(«Becton Dickinson»), используя моноклональные
антимышиные антитела к мембранным маркерам
СКК: CD34 (PE, «BD Biosciences», США), CD38
(FITC, «BD Biosciences») согласно инструкции
производителя. В качестве контроля использовали
пробы с добавлением неиммунных меченных FITC
и PE моноклональных антител («BD Biosciences»)
– Regimen 2 (R2) comprised cooling from room
temperature down to –40°C with the rate of 1 deg/min
with 10% DMSO (freezing program was developed
for BM cells) [26],
– Regimen 3 (R3) utilized cooling from room
temperature down to –40°C with the rate of 1 deg/min,
10-min pause, then cooling with 10 deg/min rate down
to –80°C with 5% DMSO (freezing program was
developed for FL cells) [35],
– Regimen 4 (R4) was the cooling from room
temperature down to –40°C with the rate of 1 deg/min,
10-min pause, then cooling with 10 deg/min rate down
to –80°C with 10% DMSO with the following plunging
of ampoules in each case in liquid nitrogen (freezing
program was developed for FL cells) [35].
Samples were thawed in water bath at 38…40°C
until disappearance of solid phase. Cells were one-
fold washed from DMSO by dropwise addition of
handling medium of equal volume, then centrifuged
(200g, 10 min). Cell suspension not subjected to freeze-
thawing we will refer to the native control.
Cell survival prior to and after cryopreservation was
determined using propidium iodide (Sigma, USA) with
flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson,
USA), number of nucleated cells was calculated in
Goryaev’s chamber.
Phenotype analysis of cells was performed with
flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson,
USA) using monoclonal anti-mouse antibodies to mem-
brane markers of HSCs: CD34 (PE, BD Biosciences,
USA), CD38 (FITC, BD Biosciences, USA) according
to the manufacturer’s instructions. As the control we
used the samples with addition of non-immune FITC
and PE marked monoclonal antibodies (BD Bioscien-
ces) of the same isotype as antibodies against the
studied marker.
Mean fluorescence intensity (MFI) by CD34 mar-
ker of FL and BM cells was determined with flow
cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson) [10].
Using logarithmic scale with a signal intensity within
the range of 64–1024 channels we measured MFI by
CD34 marker and expressed it in arbitrary units corres-
ponding to the median channel of marker’s maximum
lumines-cence. To minimize the errors in the samples
we analyzed 10,000 events. The data were statistically
processed with WinMDI 2.8 software.
The content of colony-forming units in spleen of
lethally irradiated recipients (sCFU) was assessed in
vivo by standard method [31]. Native control (nFL
and nBM) and cryopreserved (cFL and cBM) cell
suspensions in the dose of 1×105 cells/mouse (0.2 ml)
were injected into tail vein of recipient mice irradiated
by RUM-17 (Mosrentgen, Russia) in 850 R dose.
Irradiation conditions: dose power was 38.6 R/min,
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
121
того же изотипа, что и антитела к исследуемому
маркеру.
Среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ)
по CD34 маркеру клеток ФП и КМ определяли на
проточном цитофлуориметре «FACS Calibur»
(«Becton Dickinson») [14]. По логарифмической
шкале с интенсивностью сигнала в диапазоне от
64 до 1024 канала измеряли СИФ по CD34 маркеру
и выражали его в условных единицах, соответ-
ствующих среднему каналу максимального свече-
ния маркера. Для минимизации ошибок в пробах
анализировали 10000 событий. Статистический
учет данных осуществляли с помощью программы
«WinMDI 2.8».
Оценку содержания колониеобразующих
единиц в селезенке летально облученных реципиен-
тов (КОЕс) in vivo осуществляли общепринятым
методом [33]. Нативные контрольные (нФП и
нКМ) и криоконсервированные (кФП и кКМ) кле-
точные суспензии в дозе 1×105 кл/мышь (0,2 мл)
вводили в хвостовую вену мышам-реципиентам,
облученным на установке РУМ-17 («Мосрентген»,
Россия) в дозе 850 Р. Условия облучения: мощность
дозы – 38,6 Р/мин, напряжение – 220 кВ, сила тока –
10 мА, фильтры – 1 мм Cu + 1мм Al; фокусно-
дорзальное расстояние – 50 см. Мышей облучали
в коробке из оргстекла с индивидуальными ячей-
ками для каждого грызуна. После облучения экспе-
риментальные животные в течение 2 недель полу-
чали антибиотик «Энроксил» («KRKA», Словения)
и молочную сыворотку. Количество КОЕс учиты-
вали по числу колоний, образованных в селезенках
летально облученных реципиентов на 14-е сутки
после введения исследуемых клеточных суспен-
зий.
Содержание кроветворных предшественников
грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) in vitro опреде-
ляли по количеству колониеобразующих единиц
(КОЕ) и кластерообразующих единиц (КлОЕ) в
полужидком агаре. Клетки культивировали в кон-
центрации 1×105 кл/мл при температуре 37°С в
атмосфере 5% СО2 и 95%-й влажности воздуха
[12]. В нативном материале их идентифицировали
на 7-е сутки культивирования, в криоконсервиро-
ванном – на 14-е сутки, поскольку пролифера-
тивная активность КОЕ-ГМ была временно инги-
бирована под действием криоконсервирования [8].
Количество агрегатов, сформированных КОЕ-ГМ,
подсчитывали под инвертированным микроскопом
(×40). Интегральный показатель КОЕ-ГМ пред-
ставлял собой сумму кластеров, содержащих до
20 клеток, и колоний – более 20 клеток. Для оценки
особенностей распределения кроветворных клеток
различной степени дифференцировки был введен
индекс пролиферативной активности (ИПА) –
отношение КОЕ к КлОЕ.
voltage 220 kV, current intensity 10 mA, filters 1 mm
Cu + 1 mm Al; focal dorsal length 50 cm. Mice were
irradiated in the box made of organic glass with sepa-
rate wells for each rodent. Experimental animals
received Enroxil (KRKA, Slovenia) and whey during
2 weeks after irradiation. Number of sCFUs was calcu-
lated by the number of colonies formed in spleens of
lethally irradiated recipients on the 14th day after
administration of the studied cell suspensions.
Content of hematopoietic progenitors of granulomo-
nocytopoiesis (CFU-GM) was determined in vitro by
the number of colony-forming units (CFU) and cluster-
forming units (ClFU) in semisolid agar. Cells were cul-
tured in the concentration of 1×105 cells/ml at 37°C in
the atmosphere with 5% CO2 and 95% air humidity
[28]. In native material they were identified to the 7th
day of culture, and to the 14th day in cryopreserved one
since the proliferative activity of CFU-GM was tempo-
rarily inhibited under effect of cryopreservation [3].
Number of aggregates formed by CFU-GM was coun-
ted with inverted microscope (×40). Integral index of
CFU-GM was the sum of clusters containing up to 20
cells and colonies – more than 20 cells. To assess the
peculiarities of distribution of hematopoietic cells of
various differentiation degrees we used the proliferative
activity index (PAI) which is the ratio of CFU to ClFU.
The obtained data were statistically processed by
Student’s t-test using Excel (MS, USA). The data are
presented as mean ± standard error. The differences
were considered significant at p < 0.05.
Results and discussion
The results of assessing survival and quantitative
content of nucleated cells in FL and adult BM after
cryopreservation under different regimens are presen-
ted in Fig. 1. Significant differences of the studied
indices were obvious when using the same cryopreser-
vation regimens for FL and BM. Maximum indices of
survival and number of nucleated cells were obtained
under R3 for FL cells and R2 for BM (Fig. 1).
Key element in formation and providing the functio-
nal status of hematopoietic system is the population of
HSCs capable to intensive proliferation and differen-
tiation. The most known phenotype marker of HSCs
is membrane structure, CD34-sialomucin, its function
consists in interaction of earlier hematopoiesis proge-
nitors with BM stroma involving L-selectin adhesion
molecule. During committing of hematopoietic proge-
nitors the level of CD34 antigen expression decreases
with the simultaneous increase of differentiation antigen
CD38 expression [21]. So, CD34+CD38– cells tend to
be highly potent HSCs while subpopulation of CD34+
CD38– is represented by progenitors with restricted
differentiation potential.
Our results indicate a different character of change
in the content of CD34+CD38– cells in BM and FL
122 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
Полученные данные статистически обрабаты-
вали по методу Стьюдента с применением ком-
пьютерной программы «Exсel» («МS», США).
Данные приведены в виде среднего значения ±
стандартное отклонение. Различия считали ста-
тистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты оценки сохранности и количествен-
ного содержания ядросодержащих клеток в ФП и
взрослом КМ после криоконсервирования в раз-
личных режимах представлены на рис.1. Очевид-
ны существенные различия исследуемых показа-
телей при использовании одних и тех же режимов
криоконсервирования для клеток ФП и КМ. Мак-
симальные показатели сохранности и количества
ядросодержащих клеток были получены при
использовании Р3 для клеток ФП и Р2 – для КМ
(рис. 1).
Ключевым элементом формирования и обеспе-
чения функционального статуса гемопоэтической
системы является популяция СКК, способная к
интенсивной пролиферации и дифференцировке.
Наиболее известным фенотипическим маркером
СКК является мембранная структура CD34-сиало-
муцин, функция которой заключается во взаимо-
действии ранних предшественников гемопоэза со
стромой КМ при участии молекулы адгезии L-се-
лектина. По мере коммитирования гемопоэти-
ческих предшественников уровень экспрессии
CD34-антигена снижается с одновременным уве-
личением экспрессии дифференцировочного анти-
гена CD38 [25]. Таким образом, на роль высокопо-
тентных СКК претендуют СD34+СD38–-клетки, в
то время как субпопуляция клеток СD34+СD38+
представлена предшественниками с ограничен-
ным дифференцировочным потенциалом.
Полученные нами результаты свидетельствуют
о разном характере изменения содержания
CD34+СD38–-клеток в КМ и ФП после криоконсер-
вирования (рис. 2). Так, для ФП содержание
CD34+СD38–-клеток значимо увеличивалось по
сравнению с нативным контролем только при ис-
пользовании Р3. При замораживании КМ по всем
режимам увеличивалось количество клеток с
фенотипом CD34+СD38–, причем максимально –
при Р2. Кроме того, на примере использования Р2
видно, что содержание CD34+СD38–-клеток в КМ
повышалось, в то время как в ФП – снижалось по
сравнению с соответствующим нативным контро-
лем. Уменьшение количества CD34+СD38–-клеток
после криоконсервирования в ФП при использо-
вании Р2, по-видимому, можно объяснить гибелью
части клеток, экспрессирующих маркер CD34
(гибель общей популяции клеток ФП составила
after cryopreservation (Fig. 2). In case of FL the
content of CD34+CD38– cells significantly enhanced
if compared with the native control only after using
R3. When freezing BM under all the regimens the num-
ber of cells with phenotype CD34+CD38– increased,
maximally after utilization of R2. In addition, R2 could
be example for the notion that the content of CD34+
CD38– cells in BM increased while in FL it lowered
as compared with the respective native control. Dec-
0
20
40
60
80
100
120
R1 R2 R3 R4
* * * * * *
С
од
ер
жа
ни
е
кл
ет
ок
, %
о
т
на
ти
ва
C
el
l c
on
te
nt
, %
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
0
20
40
60
80
100
120
R1 R2 R3 R4
* * *
*
Рис. 1. Cодержание сохранных и ядросодержащих
клеток в суспензиях ФП (A) и КМ (B) после криоконсер-
вирования по разным режимам (R – режим): – коли-
чество сохранных клеток; – количество ядросодер-
жащих клеток; за 100% принят показатель нативного
материала; * – различия значимы по отношению к
соответствующему нативному контролю, р < 0,05.
Fig. 1. Content of survived and nucleated cells in suspen-
sions of FL (A) and BM (B) after cryopreservation according
different regimens (R): – content of survived cells; –
content of nucleated cells; the index of native material was
assumed as 100%; * – differences are significant in
relation to the respective native control, p < 0.05.
С
од
ер
жа
ни
е
кл
ет
ок
, %
о
т
на
ти
ва
C
el
l c
on
te
nt
, %
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
A
B
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
123
reased number of CD34+CD38– cells after cryopreser-
vation of FL under R2 apparently can be explained by
death of the cells expressing CD34 marker (death of
total population of FL cells was 31%). Similar results
on decreased number of CD34+ cells during equilib-
ration with DMSO and following cryopreservation
using the above mentioned regimen were described
pre-viously [25]. Comparative assessing the sensitivity
to cryopreservation of CD34+CD38+ and CD34+CD38–
subpopulations of BM hematopoietic cells showed that
following cryopreservation under 10% DMSO protec-
tion the number of CD34+CD38+ cells lowered by
11.8%, and that of CD34+CD38– cells did not signifi-
cantly change [22]. Authors came to the conclusion
that the most cryoresistant were the CD34+ cells,
which did not express CD38 antigen, that testified the
ability of less committed progenitor cells to recover
the intracellular damages, i. e. CD34+CD38– cells were
more tolerant to the effect of cryopreservation factors.
The increased concentration of these cells after freeze-
thawing of FL under R3 and BM under R2 can not be
explained by redistribution of their subpopulation con-
tent due to the death of the part of the cells. Percentage
of dead cells after using R1 (see Fig. 1) and percentage
of cells with CD34+CD38– phenotype (see Fig. 2) are
incomparable because for FL and BM the death made
19 and 11.2% (the content of CD34+CD38– cells
increased by 44 and 43%, respectively). One of the
reasons for increase of HSC concentration in FL and
BM suspensions after cryopreservation under the
mentioned regimens may be the expression of CD34
marker in the cells which prior to cryopreservation were
31%). Аналогичные результаты уменьшения коли-
чества CD34+-клеток уже на этапе эквилибрации
с ДМСО и после криоконсервирования по вышеука-
занному режиму были получены ранее [28]. В ре-
зультате сравнительной оценки чувствительности
к криоконсервированию субпопуляций CD34+CD38+
и CD34+CD38– гемопоэтических клеток КМ было
установлено, что после криоконсервирования под
защитой 10% ДМСО количество CD34+CD38+-кле-
ток уменьшилось на 11,8%, а CD34+CD38– –
значимо не изменилось [26]. Авторы сделали зак-
лючение, что более криоустойчивыми являются
CD34+-клетки, которые не экспрессируют CD38-
антиген, что свидетельствует о способности менее
коммитированных клеток-предшественников к
восстановлению внутриклеточных повреждений,
т. е. CD34+CD38–-клетки более толерантны к
действию факторов криоконсервирования. Факт
повышения концентрации данных клеток после
замораживания-отогрева ФП по Р3 и КМ по Р2 не
может быть объяснен перераспределением их
субпопуляционного состава за счет гибели какой-
то части клеток. Процент погибших клеток после
использования P1 (см. рис. 1) и процент клеток с
фенотипом CD34+СD38– (см. рис. 2) абсолютно не-
сопоставимы: для ФП и КМ гибель составила 19
и 11,2% (содержание CD34+СD38–-клеток увеличи-
лось на 44 и 43% соответственно). Одной из причин
повышения концентрации СКК в суспензиях ФП и
КМ после криоконсервирования по указанным
режимам может быть экспрессия CD34-маркера
на клетках, которые до криоконсервирования были
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
N R1 R2 R3 R4
0
200
400
600
800
*#
#
#
#
Режимы замораживания
Freezing regimens
С
И
Ф
, у
сл
. е
д.
M
FI
, a
rb
. u
ni
ts
0
50
100
150
200
N R1 R2 R3 R4
0
200
400
600
800
**
*
# #
# #
С
од
ер
жа
ни
е
C
D
34
+ C
D
38
– -к
ле
то
к,
%
о
т
на
ти
ва
C
D
34
+ C
D
38
– c
el
l c
on
te
nt
, %
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
С
И
Ф
, у
сл
. е
д.
M
FI
, a
rb
. u
ni
ts
Рис. 2. Содержание СD34+СD38–-клеток (столбцы) и их СИФ (по СD34-маркеру, линия) в ФП (A) и КМ (B) после
криоконсервирования по разным режимам; R – режим; N – натив; за 100% принято количество колоний,
формируемых нативными клетками ФП и КМ; *, # – различия значимы по отношению к соответствующему нативному
контролю, р < 0,05.
Fig. 2. Content of CD34+CD38–-cells (columns) and their MFI (by CD34 marker, line) in FL (A) and BM (B) after
cryopreservation under different regimens (R); N – native; number of colonies formed by native cells of FL and BM were
assumed as 100%; *, # – differences are significant in relation to the respective native control, p < 0.05.
A B
С
од
ер
жа
ни
е
C
D
34
+ C
D
38
– -к
ле
то
к,
%
о
т
на
ти
ва
C
D
34
+ C
D
38
– c
el
l c
on
te
nt
, %
o
f n
at
iv
e
124 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
negative according to it, moreover intensity of these
modifications was determined by the type of biological
specimen. The extent of changes in expression level
of HSC membrane structures in response to cryoexpo-
sure could also depend on the type of receptors. For
example, following cryopreservation of BM the number
of Thy-1,2+ cells did not exceed 15% (their initial
content was defined as 100%) whereas in population
of stem cells able to form CFUs it was not more than
6% [31]. It is known that Thy-1,2 receptor is respon-
sible for HSCs homing, and its shedding after cryopre-
servation can be the cause for delayed population of
HSCs in hematopoietic environment after BM cells
introduction [5]. Assessing the content of cells in BM
which expressed receptor Mac-1 showed a decreased
number of these following cryopreservation [11]. Ana-
lysis of expression of different adhesion molecules in
CD34+ cells isolated from various sources demons-
trated a significant lowering in L-selectin expression
in CD34+ cells derived from peripheral blood, bone
marrow and cord blood: 1.6; 4.4 and 3.5 times, respec-
tively [14]. Different sensitivity to cryopreservation of
receptors responsible for cell-cell interactions was
experimentally shown when assessing the state of
CFU-GM in BM cells. These cells lost their sensitivity
to colony-stimulating activity of conditioned medium,
but preserved the response to the factors of feeder
layer after cryopreservation [18].
An essential component in flow cytometry analysis
of a cell state is the assessment of fluorescence inten-
sity of various markers using MFI value which reflects
functional state of the studied cells [10]. We have found
that after cryopreservation of FL and BM under all
the regimens MFI of CD34 marker significantly excee-
ded the level of native control. It should be noted that
changes of MFI and number of CD34+CD38– cells
were similar. Maximum increase of MFI compared
with the native control was also observed following
freezing of FL under R3 and BM under R2. Therefore,
proceeding from the data of MFI index, the cryopreser-
vation significantly influenced the number of FL and
BM cells with phenotype CD34+CD38– as well as their
functional activity.
It is known that a therapeutic potential of hemato-
poietic tissue is determined by functional activity of
HSCs contained in it, which could be determined by
colony formation in vitro and in vivo. One of the me-
thods is the assessment of HSC ability to form colonies
in vivo in spleen (CFUs) of lethally irradiated recipients
[31]. Using this method we have established that cryo-
preservation according all the regimens caused the
decrease of CFUs in fetal liver and bone marrow if
compared with the native material (Fig. 3). Maximum
survival of CFUs in FL and BM was provided by diffe-
rent cryopreservation regimens: R3 for FL and R2 for
«негативны» по нему, при этом интенсивность
подобных модификаций определялась видом
биоматериала. Степень изменения уровня экспрес-
сии мембранных структур СКК в ответ на крио-
воздействие может зависеть и от вида рецепторов.
Например, после криоконсервирования КМ
количество Thy-1,2+-клеток не превышало 15%
(исходное их содержание принято за 100%), тогда
как в популяции стволовых клеток, способных фор-
мировать КОЕс, – не более 6% [33]. Известно, что
рецептор Thy-1,2 отвечает за хоуминг СКК, а его
шеддинг после криоконсервирования может быть
причиной более позднего расселения СКК в гемо-
поэтическом плацдарме после введения КМ [18].
Оценка содержания в КМ клеток, экспрессирую-
щих рецептор Mac-1, показала уменьшение их коли-
чества после криоконсервирования [5]. Анализ
экспрессии различных молекул адгезии на CD34+-
клетках, выделенных из различных источников,
также продемонстрировал значимое снижение экс-
пресии молекулы L-selectin на CD34+-клетках, по-
лученных из периферической крови, костного мозга
и кордовой крови в 1,6; 4,4 и 3,5 раза соответственно
[20]. Разная чувствительность к криоконсерви-
рованию рецепторов, отвечающих за межклеточ-
ные взаимодействия, экспериментально показана
при оценке состояния КОЕ-ГМ клеток КМ. Эти
клетки утрачивали чувствительность к колониести-
мулирующей активности кондиционной среды,
сохраняя ее к факторам фидерного слоя после
криоконсервирования [10].
Важным компонентом анализа состояния кле-
ток методом проточной цитофлуориметрии являет-
ся оценка интенсивности флуоресценции того или
иного маркера с использованием показателя СИФ,
который отражает функциональное состояние
исследуемых клеток [14]. Установлено, что после
криоконсервирования ФП и КМ по всем режимам
СИФ маркера CD34 существенно превышала уро-
вень нативного контроля. Необходимо отметить,
что изменения СИФ и количества CD34+CD38–-
клеток были сходны. Максимальное увеличение
СИФ по сравнению с нативным контролем наблю-
дали также при замораживании ФП по Р3 и КМ по
Р2. Таким образом, исходя из показателя СИФ,
криоконсервирование оказывало существенное
влияние как на количество клеток ФП и КМ с
фенотипом СD34+CD38–, так и на их функциональ-
ную активность.
Известно, что терапевтический потенциал гемо-
поэтической ткани определяется функциональной
активностью содержащихся в ней СКК, которую
определяют методами колониеобразования in vivo
и in vitro. Одним из методов является оценка спо-
собности СКК формировать колонии in vivo в селе-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
125
BM (see Fig. 2). It is known that during 12th–16th days
of gestation FL is a main organ of hematopoiesis
wherein expansion and differentiation of hematopoietic
cells occur [4]. In this period liver contains a great
number of long-term (LT-HSCs) and short-term hema-
topoietic cells (ST-HSCs), the activity of which is cont-
rolled by Steel factor, granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor and interleukin-3 functioning in syner-
gism [30, 34]. High replicative potential of these cells,
ability to differentiate into various hematopoietic linea-
ges, prevent the death of lethally irradiated recipients
are confirmed by numerous studies [19, 23, 29, 34].
Nevertheless, even with the same concentration of
CD34+ CD38– cells in native FL ((0.35 ± 0.02)%) and
BM ((0.30 ± 0.04)%) the colony-forming potential of
FL was significantly lower than that of BM (4.31 ± 0.57
and 16.7 ± 1.34, respectively). Therefore microenviron-
ment of spleen is not an ‘optimal’ site to reveal func-
tional activity of FL HSCs. Apparently subpopulation
of BM cells forming colonies in spleen of lethally irra-
diated recipients is less potent than the one of FL cells.
In general terms, the HSCs with a potential to form
colonies in vitro are more advanced in differentiation
than CFUs [23]. The results of evaluation of their
colony-forming activity after cryopreservation are pre-
sented in Fig. 4. Firstly, like for CFUs under all the
cryopreservation regimens the CFU-GM content was
lower than in native material. Secondly, peculiarities
of changes in content of these hematopoietic functional
units in FL and BM after utilization of certain regimen
were the same as for CFUs. Maximum survival of
fetal liver CFU-GM was provided by R3 as well.
зенке (КОЕс) летально облученных реципиентов
[33]. Используя данный метод, было установлено,
что криоконсервирование во всех режимах вызы-
вало снижение КОЕс фетальной печени и костного
мозга по сравнению с нативным материалом
(рис. 3). Максимальную сохранность КОЕс в ФП
и КМ обеспечивали разные режимы криоконсерви-
рования: Р3 для ФП и Р2 для КМ. Необходимо от-
метить, что колониеобразующая активность СКК
in vivo после криоконсервирования не всегда соот-
ветствовала содержанию CD34+СD38–-клеток как
в ФП, так и в КМ (см. рис. 2). Известно, что с 12-х
по 16-е сутки гестации ФП является основным ор-
ганом гемопоэза, в котором происходят экспансия
и дифференцировка гемопоэтических клеток [17].
В этот период в печени содержится большое коли-
чество long-term (LT-HSC) и short-term hematopoie-
tic stem cells (ST-HSC), активность которых контро-
лируется клеточным фактором Стила, гранулоци-
тарно-макрофагальным колониестимулирующим
фактором и интерлекином-3, действующими в
синергизме [32, 35]. Высокий репликативный по-
тенциал этих клеток, способность дифференциро-
ваться в различные ростки кроветворения, защи-
щать от гибели летально облученных реципиентов
подтверждены результатами многих работ [23, 27,
31, 35]. Тем не менее, даже при одинаковой кон-
центрации CD34+СD38–-клеток в нативных ФП
((0,35 ± 0,02)%) и КМ ((0,30 ± 0,04)%), колониеобра-
зующий потенциал ФП был существенно ниже КМ
(4,31 ± 0,57 и 16,7 ± 1,34 соответственно). Следова-
тельно, микроокружение селезенки не является
0
20
40
60
80
100
120
R1 R2 R3 R4
*
*
*
С
од
ер
жа
ни
е
КО
Ес
, %
о
т
на
ти
ва
C
FU
s
co
nt
en
t,
%
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
0
20
40
60
80
100
120
R1 R2 R3 R4
* *
*
С
од
ер
жа
ни
е
КО
Ес
, %
о
т
на
ти
ва
C
FU
s
co
nt
en
t,
%
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
A B
Рис. 3. Содержание КОЕс в ФП (A) и КМ (B) после криоконсервирования по разным режимам; R – режим; за
100% принято количество колоний, формируемых нативными КОЕс ФП и КМ; * – различия значимы по отношению
к соответствующему нативному контролю, p < 0,05.
Fig. 3. Content of CFUs in FL (A) and BM (B) after cryopreservation under different regimens (R); number of colonies
formed by native sCFU of FL and BM were assumed as 100%; * – differences are significant in relation to the respective
native control, p < 0.05.
126 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
Interestingly, that PAI increased 1.2 times under these
conditions if compared with the control, indicating the
redistribution of progenitors in favour of more potent
CFUs.
Peculiarities of changes in CFU-GM subpopulation
content in BM and subsequently PAI had certain
differences if compared to FL cells. In particular, during
cryopreservation of BM the more preferable for
preserving the colony-forming potential of CFU-GM
were R2 and R4, although the latter did not provide
balanced subpopulation content (CFU and ClFU). It is
«оптимальным» сайтом для проявления функцио-
нальной активности СКК фетальной печени.
Вероятно, что субпопуляция клеток КМ, форми-
рующих колонии в селезенке летально облученных
реципиентов, является менее потентной, чем ФП.
В общем, СКК с потенциалом формирования
колоний в системе in vitro являются более прод-
винутыми в дифференцировке, чем КОЕс [27].
Результаты аттестации их колониеобразующей
активности после криоконсервирования представ-
лены на рис. 4. Во-первых, как и для КОЕс, при
всех режимах криоконсервирования содержание
КОЕ-ГМ было ниже, чем у нативного материала.
Во-вторых, особенности изменения этих функцио-
нальных единиц гемопоэза в ФП и КМ при конкрет-
ном режиме были такие же, как и для КОЕс.
Максимальную сохранность КОЕ-ГМ фетальной
печени обеспечивал также Р3. Интересно, что при
этих условиях достоверно увеличивался в 1,2 раза
ИПА по сравнению с контролем, что свидетельст-
вует о перераспределении предшественников в
сторону более потентных КОЕ.
Характер изменения субпопуляционного состава
КОЕ-ГМ в КМ и соответственно ИПА имел опре-
деленные отличия по сравнению с клетками ФП.
Так, при криоконсервировании КМ более предпоч-
тительными для колониеобразующего потенциала
КОЕ-ГМ были Р2 и Р4, хотя последний не обес-
печивал сбалансированного субпопуляционного
состава (КОЕ и КлОЕ). Следует отметить, что
колониеобразующая активность КОЕ-ГМ феталь-
ной печени или костного мозга, криоконсервирован-
ных в определенном режиме, также совпадала с
характером изменения КОЕс.
Неоднократно отмечалось, что СКК феталь-
ных тканей имеют ряд существенных различий по
сравнению с такими же клетками взрослого орга-
низма. Например, колониеобразующая активность
СКК фетального КМ и кордовой крови превышала
таковую взрослого КМ и периферической крови
[21]. В исследованиях Y.Y. Ng и соавт. показаны
функциональные отличия CD34+-клеток КМ и
кордовой крови в системах in vitro и in vivo [24].
Установлено, что CD34+-клетки кордовой крови
обладали лучшей и долгосрочной приживляемос-
тью в организме реципиента. Кроме того, выяв-
лены достоверные различия уровней экспрессии
ключевых транскрипционных факторов, генов, иг-
рающих важную роль в процессах адгезии/мигра-
ции, пролиферации, дифференцировки, апоптоза кле-
ток КМ, кордовой крови и генов, ассоциированных
с клеточным циклом [24].
Проведенный нами сравнительный анализ
структурно-функционального потенциала СКК
фетальной печени и взрослого костного мозга
0
20
40
60
80
100
120
N R1 R2 R3 R4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
* *
*
#
С
од
ер
жа
ни
е
КО
Е-
ГМ
, %
о
т
на
ти
ва
C
FU
-G
M
c
on
te
nt
, %
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
И
П
А,
у
сл
. е
д.
PA
I,
ar
b.
u
ni
ts
0
20
40
60
80
100
120
N R1 R2 R3 R4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
*
*
#
#
#
Рис. 4. Содержание КОЕ-ГМ (столбцы) и индекс проли-
феративной активности (ИПА, линия) в ФП (A) и КМ (B)
после криоконсервирования по разным режимам; R –
режим; N – натив; за 100% принято количество колоний,
формируемых нативными КОЕ-ГМ ФП и КМ; *, # – раз-
личия значимы по отношению к соответствующему на-
тивному контролю, р < 0,05.
Fig. 4. Content of CFU-GM (columns) and proliferative
activity index (PAI, line) in FL (A) and BM (B) after cryopreser-
vation under different regimens; number of colonies
formed by native CFU-GM of FL and BM were assumed as
100%; *, # – differences are significant in relation to the
respective native control, p < 0.05
С
од
ер
жа
ни
е
КО
Е-
ГМ
, %
о
т
на
ти
ва
C
FU
-G
M
c
on
te
nt
, %
o
f n
at
iv
e
Режимы замораживания
Freezing regimens
И
П
А,
у
сл
. е
д.
PA
I,
ar
b.
u
ni
ts
A
B
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
127
показал не только различия их исходных качествен-
но-количественных характеристик, но и разный
ответ на действие факторов криоконсервирования.
Принципиально важно, что использование такого
методического подхода, как криоконсервирование,
позволило подтвердить присутствие в ФП и КМ
субпопуляций СКК разной степени дифферен-
цировки, обладающих разной криочувствитель-
ностью.
Из полученных данных следует, что СКК, фор-
мирующие колонии in vivo (КОЕс) и in vitro (КОЕ-
ГМ), находятся в одной зоне криолабильности, но
по-разному «отвечают» на каждый из четырех
режимов криоконсервирования. Известно, что пос-
ле криоконсервирования состояние клеток, оценен-
ное по фенотипическим признакам не всегда
совпадает с их функциональным статусом [18].
Следует отметить, что характер изменения коло-
ниеобразующей активности клеток стволового
компартмента разного уровня дифференцировки
(рис. 3, 4) в ФП и КМ не совпадал с содержанием
CD34+CD38–-клеток (см. рис. 2). После криокон-
сервирования в Р3 концентрация CD34+CD38–-
клеток ФП и их СИФ увеличивались (см. рис. 2, A),
а содержание в ней КОЕс и КОЕ-ГМ снижалось
по сравнению с нативным материалом. Использо-
вание Р2 приводило к снижению как количества
CD34+CD38–-клеток, так и колониеобразующего
потенциала ФП. Несмотря на повышенное содер-
жание CD34+СD38–-клеток (см. рис. 2, B), в КМ
после замораживания во всех режимах уменьша-
лось содержание КОЕс и КОЕ-ГМ по сравнению
с нативным контролем (см. рис. 3, 4). Вместе с
тем на фоне некоторого уменьшения количества
ядросодержащих клеток в суспензиях ФП и КМ
Р2 и Р3 способствовали селективному их обога-
щению клетками с фенотипом СКК (см. рис. 2) и
обеспечивали достаточное сохранение функцио-
нально активных КОЕс и КОЕ-ГМ, ответственных
за реализацию терапевтического потенциала иссле-
дуемого материала.
После выхода из состояния глубокого холодо-
вого анабиоза в кроветворных предшественниках
развиваются нелетальные повреждения, вызываю-
щие временное ингибирование их функционального
потенциала [8, 18]. Полученные данные о криочув-
ствительности соматических тканеспецифических
стволовых клеток свидетельствуют о том, что в
их иерархической лестнице существуют предшест-
венники, отличающиеся уровнем дифференцировки
и функциональным статусом, что может опреде-
лять разный «ответ» стволовых клеток на физико-
химические факторы криоконсервирования. Напри-
мер, в работе Е.А. Порожан и соавт. проведена
оценка фенотипических характеристик фетальных
worth to note that colony-forming activity of fetal liver
or bone marrow CFU-GM cryopreserved under
certain regimen was also consistent with the peculia-
rities of CFUs content changes.
Fetal tissue HSCs were repeatedly mentioned to
have some significant changes as compared to the
same cells of adult organism. For example, colony-
forming activity of fetal BM and cord blood HSCs
exceeded the one of adult BM and peripheral blood
[15]. Studies of Ng Y.Y. et al. showed functional
differences of BM and cord blood CD34+ cells in vitro
and in vivo [20]. It was established that CD34+ cells
of cord blood had better and long-lasting grafting in
the recipient’s organism. In addition, a significant
differences were revealed in expression level of trans-
cription factors and genes that participate significantly
in adhesion/migration, proliferation, differentiation,
apoptosis of cells of BM, cord blood and genes asso-
ciated with a cell cycle [19].
The performed by us comparative analysis of
structural and functional potential of fetal liver and adult
bone marrow HSCs showed the differences of their
initial qualitative and quantitative characteristics as well
as various response to the effect of cryopreservation
factors. It is crucial that the use of such a methodical
approach as cryopreservation enabled confirming the
presence in FL and BM of HSC populations of various
differentiation levels and possessing different cryosen-
sitivity.
The data obtained show that HSCs forming colonies
in vivo (CFUs) and in vitro (CFU-GM) are in the
same zone of cryolability, but ‘response’ in a different
way to the each of the four cryopreservation regimens.
It is known that following cryopreservation the cell
state assessed by phenotypic characteristics is not
always consistent with their functional status [5]. It
should be noted that the way of changing of colony-
forming activity in stem cells of various differentiation
level (Fig. 3, 4) in FL and BM did not coincide with the
content of CD34+CD38– cells (see Fig. 2). After
cryopreservation according R3 the concentration of
CD34+CD38– and MFI of FL cells increased (Fig. 2A),
and the content of CFUs and CFU-GM in it decreased
as compared with the native specimens. Using R2
reduced both the number of CD34+CD38– cells and
colony-forming potential of FL. Despite of an enhanced
content of CD34+CD38– cells (Fig. 2B) in BM after
freezing according all the regimens the content of CFUs
and CFU-GM decreased as compared with the native
control (Fig. 3, 4). Nevertheless, on the background of
a slight decrease of nucleated cells content in sus-
pensions of FL and BM, the utilization of R2 and R3
contributed to their selective enrichment with cells of
HSCs phenotype (Fig. 2) and provided sufficient
preservation of functionally active CFUs and CFU-GM
128 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
нервных клеток 11 суток гестации и установлен
факт большей криостабильности клеток с феноти-
пом CD133+ и nestin+, которые являются наименее
дифференцированной популяцией [11]. А. Rubin-
shtein и F. Trobaug более 30 лет назад показали,
что после замораживания-отогрева суспензия мие-
локариоцитов «обогащается» СКК, что обуслов-
лено гибелью, в первую очередь, клеток КМ, нахо-
дящихся на терминальной стадии дифференци-
ровки [30]. На модели аденокарциномы Эрлиха
было продемонстрировано, что стволовые раковые
клетки поздних стадий развития более криочувст-
вительны по сравнению с нативными образцами,
а также криоконсервированными клетками более
ранних сроков гестации [7]. Полученные нами ре-
зультаты свидетельствуют о возможности исполь-
зования криоконсервирования не только как ме-
тода долгосрочного хранения биообъекта, но и как
управления его внутренним состоянием (intrinsic
state).
Выводы
Продемонстрирована разная криоустойчивость
СКК фетальной печени и взрослого костного мозга
в завимости от режима замораживания. Сопостав-
ление функциональных параметров (КОЕс и КОЕ-
ГМ) и фенотипических маркеров (CD34 и СD38)
показало, что «оптимальным» режимом для клеток
ФП является Р3, а для КМ – Р2. Установлено, что
при варьировании условий криоконсервирования
можно изменять функциональный потенциал СКК
из разных источников.
Проведенные исследования являются актуаль-
ными как в теоретическом, так и прикладном
аспектах с точки зрения оптимизации методов
криоконсервирования и повышения терапевти-
ческого потенциала СКК.
responsible for implementing the therapeutic potential
of the studied material.
After leaving the deep cold hibernation the hema-
topoietic progenitors had non-lethal damages causing
temporary inhibition of their functional potential are
developed [3, 5]. The findings about cryosensitivity of
somatic tissue-specific stem cells attested that their
hierarchy system included the progenitors varying by
differentiation level and functional status that might
determine a different ‘response’ of stem cells to physi-
cal and chemical factors of cryopreservation. For
example, the study of Porozhan et al. reported the
assessment of phenotypic characteristics of fetal neural
cells of 11 gestation days and the fact of higher
cryostability of the cell with CD133+ and nestin+
phenotype being the least differentiated population [24].
Rubinstein and Trobaug showed more than 30 years
ago that following freeze-thawing the suspension of
myelocariocytes was ‘enriched’ with HSCs that was
caused by death, primarily of BM cells, being at the
terminal stage of differentiation [27]. Using the model
of Ehrlich’s carcinoma it was demonstrated that
cancer stem cells of late development stages were
more cryosensitive as compared to the native samples
and cryopreserved cells of earlier gestation terms [13].
The obtained by us results testify to the possible use
of cryopreservation not only as method for long-term
storage of biological object, but also for controlling its
intrinsic state.
Conclusions
Different cryosensitivity of fetal liver and adult bone
marrow HSCs depending on the freezing regimen was
demonstrated. Comparison of functional parameters
(CFUs and CFU-GM) and phenotype markers (CD34
and CD38) showed that R3 was an ‘optimal’ regimen
for FL cells, and R2 did for BM. We have found that
varying cryopreservation conditions could change func-
tional potential of HSCs derived from different sour-
ces.
The conducted experiments are relevant both
theoretically and practically due to the need of optimi-
zation of cryopreservation methods and improvement
of HSC therapeutic potential.
Литература
1. Вермель А.Е. Стволовые клетки: общая характеристика и
перспективы применения в клинической практике // Клин.
медицина. – 2004. – №1. – С. 5–11.
2. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Гаевская Ю.А. и др. Криобиоло-
гические технологии как компонент оптимизированных
методов лечения аутоиммунных заболеваний // Клін. іму-
нол. алергол. інфектол. – 2009. – Т. 20–21, №1–2. – С. 46–51.
3. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Луценко Е.Д. и др. Поиск альтер-
нативных криоконсервированию путей модификации им-
мунореактивности алломиелотрансплантата. II. Возмож-
ность сотрансплантации клеток эмбриональной печени //
Проблемы криобиологии. – 2000. – №1. – С.10–21.
4. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В. и др. Особен-
ности влияния криоконсервирования на функциональный
потенциал стволовых кроветворных клеток фетальной
References
1. Burdon T.J., Paul A., Noiseux N. et al. Bone marrow stem cell
derived paracrine factors for regenerative medicine: current
perspectives and therapeutic potential. Bone Marrow
Research 2011; 2011. Article ID 207326.
2. Catacchio I., Berardi S., Reale A. et al. Evidence for bone mar-
row adult stem cell plasticity: properties, molecular mecha-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
129
печени разных сроков гестации // Проблемы криобиоло-
гии. – 2009. – Т. 19, №2. – С. 186–199.
5. Гольцев А.Н., Мацевитая И.Ю., Луценко Е.Д. и др. К воп-
росу модификации иммунореактивности миелотранс-
плантата после криоконсервирования // Проблемы крио-
биологии. – 2010. – Т. 20, №2. – С. 145–152.
6. Гольцев А.Н., Останкова Л.В., Дубрава Т.Г. и др. Крио-
консервирование как фактор модификации структурно-
функционального состояния и механизма реализации
лечебного эффекта клеток стволового компартмента в
условиях развития патологий аутоиммунного генеза //
Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины /
Под. ред. А.Н. Гольцева. – Харьков, 2012. – С. 543–551.
7. Гольцев А.М., Сафранчук О.В., Бондарович М.О. та ін. Зміна
кріолабільності стовбурових пухлинних клітин залежно
від фази росту аденокарциноми // Фізіол. журн. – 2011. –
Т. 57, №4. – С. 68–76.
8. Дубрава Т.Г. Эффективность криоконсервирования крове-
творных клеток в зависимости от их исходных свойств:
автореф. дис. … канд. биол. наук. – Харьков, 1986. – 14 с.
9. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Останков М.В. Влияние изоли-
рованных физико-химических факторов криоконсервиро-
вания на клетки костного мозга с различным исходным
статусом // Проблемы криобиологии. – 2003. – №4 – С. 3–
11.
10.Луценко Е.Д. Использование пеннинг-метода для получе-
ния обогащенных стволовыми клетками популяций из
криоконсервированного костного мозга // Проблемы крио-
биологии. – 1995. – № 4. – С. 52–54.
11.Порожан Е.А., Останков М.В., Бабенко Н.Н., Гольцев А.Н.
Оценка фенотипических характеристик фетальных нерв-
ных клеток после криоконсервирования с использова-
нием различных режимов замораживания // Проблемы
криобиологии. – 2012. – Т. 22, №1. – С. 39–48.
12.Шерешков С.И. Культивирование гемопоэтических кле-
ток на полутвердых питательных средах // Лаб. дело. –
1974. – №3. – С. 146–150.
13.Ямпольская Е.Е., Гольцев А.Н., Гурина Т.М. Изменение
функционального потенциала клеток фетальной печени
в зависимости от режима криоконсервирования // Світ
медицини та біології. – 2007. – №1. – С. 89–93.
14.Пат. №58203, Україна, МПК А61В5/00. Спосіб оцінки стану
імунокомпетентної сфери організму / Гольцев А.М., Луцен-
ко О.Д., Дубрава Т.Г. и др.; заявл. 03.08.2010; опубл.
11.04.2011, Бюл. №7.
15.Burdon T.J., Paul A., Noiseux N. et al. Bone marrow stem cell
derived paracrine factors for regenerative medicine: current
perspectives and therapeutic potential // Bone Marrow Re-
search. – 2011. – Vol. 2011. – ID 207326, 14 p.
16.Catacchio I., Berardi S., Reale A. et al. Evidence for bone
marrow adult stem cell plasticity: properties, molecular mecha-
nisms, negative aspects, and clinical applications of hemato-
poietic and mesenchymal stem cells transdifferentiation // Stem
Cells International. – 2013. – Vol. 2013. – ID 589139, 11 p.
17.Ema H., Nakauchi H. Expansion of hematopoietic stem cells in
the developing liver of a mouse embryo // Blood. – 2000. –
Vol. 95, №7. – P. 2284–2288.
18.Goltsev A. N., Babenko N. N., Dubrava T. G. et al. Modification
of the state of bone marrow hematopoietic cells after cryopre-
servation // Int. J. Refrig. – 2006. – Vol. 29, №3. – P. 358–367.
19.Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-
vation: an optimizing factor for therapeutic potential of fetopla-
cental complex products // Biopreservation and Biobanking. –
2009. – Vol. 7, №1. – P. 29–38.
20. Hattori Y., Kato H., Nitta M., Takamoto S. Decrease of L-selectin
expression in human CD34+ cells on freeze-thawing and rapid
recovery with short-term incubation // Exp. Hematol. – 2001. –
Vol. 29, №1. – P. 114–112.
21.Huang S., Law P., Ho A.D. Candidate hematopoietic stem cells
from fetal tissues, umbilical cord blood vs. adult bone marrow
nisms, negative aspects, and clinical applications of hemato-
poietic and mesenchymal stem cells transdifferentiation. Stem
Cells Int 2013; 2013. Article ID 589139.
3. Dubrava T.G. Efficiency of hematopoietic cell cryopreservation
depending on their initial properties [dissertation]. Kharkov;
2005.
4. Ema H., Nakauchi H. Expansion of hematopoietic stem cells in
the developing liver of a mouse embryo. Blood 2000; 95(7):
2284–2288.
5. Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G. et al. Modification of
the state of bone marrow hematopoietic cells after cryopreser-
vation. Int J Refrigeration 2006; 29(3): 358–367.
6. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Gayevskaya Yu.A. et al. Cryobio-
logical technologies as a component of optimized methods in
therapy of autoimmune diseases. Klin Imunol Alergol Infektol
2009; (1–2): 46–51.
7. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Lutsenko E.D., et al. Search for the
alternative to cryopreservation methods of modifing the
immunereactivity of the allomyelotransplant. II. Possible co-
transplantation of embryonic liver cells. Problems of Cryobio-
logy 2000; (1): 10–21.
8. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Ostankova L.V., et al. Peculiarities
of cryopreservation effect on functional potential of fetal liver
hemopoietic stem cells of various gestation terms. Problems
of Cryobiology 2009; 19(2): 186–199.
9. Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-
vation: an optimizing factor for therapeutic potential of feto-
placental complex products. Biopreservation and Biobanking
2009; 7(1): 29–38.
10.Goltsev A.N., Lutsenko Ye.D., Dubrava T.G. et al. Method of
assessing state of organism's immune competence. Patent of
Ukraine 58203, IPC А61В5/00. 2011 Apr11
11.Goltsev A.N., Matsevitaya I.Yu., Lutsenko Ye.D., et al. On the
modification of immunoreactivity of myelotransplant after cryo-
preservation. Problems of Cryobiology 2010; 20(2): 145–152.
12.Goltsev A.N., Ostankova L.V., Dubrava T.G. et al. Cryopreser-
vation as the factor of modification of structural and functional
state and the realization mechanism of therapeutic effect of
compartment stem cells under autoimmune genesis pathology
development. In: Goltsev A.N., editor. Current problems of cryo-
biology and cryomedicine. Kharkov; 2012. p. 543–551.
13.Goltsev A.N., Safranchuk O.V., Bondarovich M.O. et al. Change
in cryolability of stem tumor cells depending on adenocarci-
noma growth phase. Fiziol Zhurnal 2011; 57(4): 68–76.
14.Hattori Y., Kato H., Nitta M., Takamoto S. Decrease of L-selectin
expression in human CD34+ cells on freeze–thawing and rapid
recovery with short-term incubation. Exp Hematol 2001; 29(1):
114–112.
15.Huang S., Law P., Ho A.D. Candidate hematopoietic stem cells
from fetal tissues, umbilical cord blood vs. adult bone marrow
and mobilized peripheral blood. Exp Hematol 1998; 26(12):
1162–1171.
16.Kozlova Yu.A., Goltsev A.N., Ostankov M.V. Influence of certain
physical and chemical factors of cryopreservation on bone
marrow cells with various initials structural an functional status.
Problems of Cryobiology 2003; (4): 3–11.
17.Ljungman P., Bregni M., Brune M. et al. Allogeneic and
autologous transplantation for haematological diseases, solid
tumours and immune disorders: current practice in Europe
2009. Bone Marrow Transplant 2010; 45(2): 219–234.
18.Lutsenko E.D. Application of penning-methods for obtaining
enriched stem cells of population from cryopreserved bone
marrow. Problems of Cryobiology 1995; (4): 52–54.
19.Micklem H.S., Ford C.E., Evans E.P. et al. Competitive in vivo
proliferation of foetal and adult haematopoietic cells in lethally
irradiated mice. J Cell Physiol 1972; 79(2): 293–298.
20.Ng Y.Y., van Kessel B., Lokhorst H.M. et al. Gene-expression
profiling of CD34+ cells from various hematopoietic stem-cell
sources reveals functional differences in stem-cell activity.
J Leukoc Biol 2004; 75(2): 314–323.
130 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
and mobilized peripheral blood // Exp. Hematol.– 1998.– Vol. 26,
№12. – P. 1162–1171.
22.Ljungman P., Bregni M., Brune M. et al. Allogeneic and auto-
logous transplantation for haematological diseases, solid tu-
mours and immune disorders: current practice in Europe
2009 // Bone Marrow Transplant. – 2010. – Vol. 45, №2. –
P. 219–234.
23.Micklem H.S., Ford C.E., Evans E.P. et al. Competitive in vivo
proliferation of foetal and adult haematopoietic cells in lethally
irradiated mice // J. Cell Physiol. – 1972. – Vol. 79, №2. –
P. 293–298.
24. Ng Y.Y., van Kessel B., Lokhorst H.M. et al. Gene-expression
profiling of CD34+ cells from various hematopoietic stem-cell
sources reveals functional differences in stem-cell activity //
J. Leukoc. Biol. – 2004. – Vol. 75, №2 – P. 314–323.
25.Nielsen J.S., McNagny K.M. Novel functions of the CD34 family //
J. Cell Sci. – 2008. – Vol. 121. – P. 3682–3692.
26.Ojeda-Uribe M. Peripheral blood and BM CD34+CD38– cells
show better resistance to cryopreservation than CD34+CD38+
cells in autologous stem cell transplantation // Cytotherapy. –
2004. –Vol. 6, №6. – P. 571–583.
27.Orkin S.H., Nathan D.G., Ginsburg D. et al. Nathan and Oski's
hematology of infancy and childhood. – Philadelphia: Elsevier,
2009. – 1841 p.
28.Rosillo M.C., Ortuсo F., Rivera J., Moraleda J.M, Vicente V.
Cryopreservation modifies flow-cytometric analysis of hemo-
poietic cells // Vox Sang. – 1995. – Vol. 68, №4. – P. 210–214.
29.Rowley S.D., Bensinger W.I., Gooley T.A. Effect of cell con-
centration on bone marrow and peripheral blood stem cell
cryopreservation // Blood. – 1994. – Vol. 83, №9. – P. 2731–
2736.
30.Rubinshtein A., Trobaugh F. Ultrastructure of presumptive
hematopoietic stem cells // Blood. – 1973. – Vol. 42, №1. –
P. 61–80.
31.Shizuru J.A., Negrin R.S., Weissman I.L. Hematopoietic stem
and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of
the hematolymphoid system // Annu. Rev. Med. – 2005. –
Vol. 56. – Р. 509–538.
32. Suzuki A., Zheng Y., Kaneko S. et al. Clonal identication and
characterization of self–renewing pluripotent stem cells in
the developing liver // J. Cell Biol. – 2002. – Vol. 156, №1. –
Р. 173–184.
33.Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation
sensitivity of normal mouse bone marrow cells // Radiat. Res. –
1961. – Vol. 14. – P. 213–222.
34.Tyndall A., Gratwohl A. Hemopoietic blood and marrow trans-
plants in the treatment of severe autoimmune disease // Curr.
Opin. Hematol. – 1997. – Vol. 4, №6. – P. 390–394.
35.Wu D.D., Nayar R., Keating A. Synergistic effect of stem cell
factor with interleukin-3 or granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor on the proliferation of murine primitive
hematopoietic progenitors // Exp. Hematol. – 1994. – Vol. 22,
№6. – P. 495–500.
21.Nielsen J.S., McNagny K.M. Novel functions of the CD34 family.
J Cell Sci 2008; 121: 3682–3692.
22.Ojeda-Uribe M. Peripheral blood and BM CD34+CD38– cells
show better resistance to cryopreservation than CD34+CD38+
cells in autologous stem cell transplantation. Cytotherapy 2004;
6(6): 571–583.
23.Orkin S.H., Nathan D.G., Ginsburg D. et al., editors. Nathan
and Oski's hematology of infancy and childhood. Philadelphia:
Elsevier; 2009.
24.Porozhan Ye.A., Ostankov M.V., Babenko N.N., Goltsev A.N.
Assessment of phenotype characteristics of fetal neural cells
after cryopreservation using different freezing regimens. Prob-
lems of Cryobiology 2012; 22(1): 39–48.
25.Rosillo M.C., Ortuсo F., Rivera J., Moraleda J.M, Vicente V.
Cryopreservation modifies flow-cytometric analysis of hemo-
poietic cells. Vox Sang 1995; 68(4): 210–214.
26.Rowley S.D., Bensinger W.I., Gooley T.A. Effect of cell con-
centration on bone marrow and peripheral blood stem cell
cryopreservation. Blood 1994; 83(9): 2731–2736.
27.Rubinshtein A., Trobaugh F. Ultrastructure of presumptive
hematopoietic stem cells. Blood 1973; 42(1): 61–80.
28.Shereshkov S.I. Culturing of hematopoietic cells on semisolid
nutrient media. Lab Delo 1974; (3): 146–150.
29.Shizuru J.A., Negrin R.S., Weissman I.L. Hematopoietic stem
and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of
the hematolymphoid system. Annu Rev Med 2005; 56: 509–
538.
30.Suzuki A., Zheng Y., Kaneko S. et al. Clonal identication and
characterization of self–renewing pluripotent stem cells in
the developing liver. J Cell Biol 2002; 156(1): 173–184.
31.Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation
sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res
1961; 14: 213–222.
32.Tyndall A., Gratwohl A. Hemopoietic blood and marrow trans-
plants in the treatment of severe autoimmune disease. Curr
Opin Hematol 1997; 4(6): 390–394.
33.Vermel A.E. Stem cells: total characteristic and application
perspectives in clinical practice. Klin Meditsina 2004; (1): 5–
11.
34.Wu D.D., Nayar R., Keating A. Synergistic effect of stem cell
factor with interleukin-3 or granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor on the proliferation of murine primitive hema-
topoietic progenitors. Exp Hematol 1994; 22(6): 495–500.
35.Yampolskaya K.Ye., Goltsev A.N., Gurina T.M. Change in
functional potential of fetal liver cells dependent from cryopre-
servation regimen. Svit Meditsiny i Biologii 2007; (1): 89–93.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 2, 2014
131
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68799 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:09:13Z |
| publishDate | 2014 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Ямпольская, Е.Е. Останкова, Л.В. Останков, М.В. 2014-09-29T17:34:31Z 2014-09-29T17:34:31Z 2014 Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Е. Ямпольская, Л.В. Останкова, М.В. Останков // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 2. — С. 118-131. — Бібліогр.: 35 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68799 615.014.41:612.647.014.3:611.018.46 Проведенный сравнительный анализ структурно-функционального статуса стволовых кроветворных клеток (СКК) фетальной печени (ФП) 14 суток гестации и взрослого костного мозга (КМ) мышей линии СВА/H 4-месячного возраста продемонстрировал не только различия их исходных качественно-количественных характеристик, но и разный ответ на действие факторов криоконсервирования. Клетки ФП или КМ замораживали по разным режимам под защитой 5 и 10% диметилсульфоксида. Для оценки структурно-функциональных характеристик СКК из разных источников использовали методы цитофлуориметрии (содержание CD34+СD38–-клеток), колониеобразования in vivo (КОЕс) и in vitro (КОЕ-ГМ). Установлено, что определенные режимы криоконсервирования способны проявлять эффект селективного обогащения популяций клеток с фенотипическими признаками кроветворных предшественников (CD34+СD38–-клетки). Сопоставление содержания КОЕс, КОЕ-ГМ, СКК и клеток с фенотипом CD34+СD38– показало, что режим криоконсервирования для клеток ФП не является «оптимальным» для КМ. Показано, что при варьировании условий криоконсервирования можно обеспечивать не только «оптимальную» сохранность кроветворных предшественников из ФП и КМ с разным исходным функциональным статусом, но и направленно регулировать его. Проведений порівняльний аналіз структурно-функціонального статусу стовбурових кровотвірних клітин (СКК) фетальної печінки (ФП) 14-ї доби гестації та дорослого кісткового мозку (КМ) мишей лінії СВА/H 4-місячного віку продемонстрував не тільки відмінності їхніх вихідних якісно-кількісних характеристик, але й різну відповідь на дію чинників кріоконсервування. Клітини ФП або КМ заморожували за різними режимами під захистом 5 і 10% диметилсульфоксиду. Для оцінки структурно-функціональних характеристик СКК із різних джерел використовували методи цитофлуориметрії (вміст CD34+СD38–-клітин), колонієутворювання in vivo (КУОс) та in vitro (КУО-ГМ). Встановлено, що певні режими кріоконсервування здатні виявляти ефект селективного збагачення популяцій клітин із фенотиповими ознаками кровотвірних попередників (CD34+СD38–-клітини). Зіставлення вмісту КОЕс, КУО-ГМ, СКК та клітин із фенотипом CD34+СD38– показало, що режим кріоконсервування для клітин ФП не є «оптимальним» для КМ. Показано, що при варіюванні умов кріоконсервування можна забезпечувати не тільки «оптимальну» збереженість кровотвірних попередників із ФП та КМ і різним вихідним функціональним статусом, а й направлено регулювати його. The performed comparative analysis of structural and functional status of fetal liver (FL) hematopoietic stem cells (HSCs) of 14 gestation days and adult bone marrow (BM) of 4-month-old CBA/H mice demonstrated not only the differences of their initial qualitative and quantitative characteristics but also different responses to the effect of cryopreservation factors. Either FL or BM cells were frozen according to various regimens under protection of 5 and 10% dimethyl sulfoxide. To estimate structural and functional characteristics of HSCs derived from different sources there were used cytofluorimetry (content of CD34+СD38– cells), methods of colony formation in vivo (CFUs) and in vitro (CFU-GM). It has been established that certain cryopreservation regimens are able to manifest the effect of selective enrichment of cell populations with phenotype of hemopoietic progenitors (CD34+CD38– cells). Comparing the content of CFUs, CFU-GM, HSCs and cells with CD34+CD38– phenotype has shown that cryopreservation regimen for FL cells was not optimal for BM. It has been demonstrated that varying cryopreservation conditions allowed not only to provide optimal preservation rate of hemopoietic progenitors derived from FL and BM with various initial functional status, but to control it purposefully. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования Peculiarities of Post Cryopreservation Changes in Structural and Functional Characteristics of Hematopoietic Stem Cells Derived from Various Sources Article published earlier |
| spellingShingle | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Ямпольская, Е.Е. Останкова, Л.В. Останков, М.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования |
| title_alt | Peculiarities of Post Cryopreservation Changes in Structural and Functional Characteristics of Hematopoietic Stem Cells Derived from Various Sources |
| title_full | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования |
| title_fullStr | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования |
| title_full_unstemmed | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования |
| title_short | Особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования |
| title_sort | особенности изменения структурно-функциональных характеристик стволовых кроветворных клеток из разных источников после криоконсервирования |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68799 |
| work_keys_str_mv | AT golʹcevan osobennostiizmeneniâstrukturnofunkcionalʹnyhharakteristikstvolovyhkrovetvornyhkletokizraznyhistočnikovposlekriokonservirovaniâ AT dubravatg osobennostiizmeneniâstrukturnofunkcionalʹnyhharakteristikstvolovyhkrovetvornyhkletokizraznyhistočnikovposlekriokonservirovaniâ AT gaevskaâûa osobennostiizmeneniâstrukturnofunkcionalʹnyhharakteristikstvolovyhkrovetvornyhkletokizraznyhistočnikovposlekriokonservirovaniâ AT âmpolʹskaâee osobennostiizmeneniâstrukturnofunkcionalʹnyhharakteristikstvolovyhkrovetvornyhkletokizraznyhistočnikovposlekriokonservirovaniâ AT ostankovalv osobennostiizmeneniâstrukturnofunkcionalʹnyhharakteristikstvolovyhkrovetvornyhkletokizraznyhistočnikovposlekriokonservirovaniâ AT ostankovmv osobennostiizmeneniâstrukturnofunkcionalʹnyhharakteristikstvolovyhkrovetvornyhkletokizraznyhistočnikovposlekriokonservirovaniâ AT golʹcevan peculiaritiesofpostcryopreservationchangesinstructuralandfunctionalcharacteristicsofhematopoieticstemcellsderivedfromvarioussources AT dubravatg peculiaritiesofpostcryopreservationchangesinstructuralandfunctionalcharacteristicsofhematopoieticstemcellsderivedfromvarioussources AT gaevskaâûa peculiaritiesofpostcryopreservationchangesinstructuralandfunctionalcharacteristicsofhematopoieticstemcellsderivedfromvarioussources AT âmpolʹskaâee peculiaritiesofpostcryopreservationchangesinstructuralandfunctionalcharacteristicsofhematopoieticstemcellsderivedfromvarioussources AT ostankovalv peculiaritiesofpostcryopreservationchangesinstructuralandfunctionalcharacteristicsofhematopoieticstemcellsderivedfromvarioussources AT ostankovmv peculiaritiesofpostcryopreservationchangesinstructuralandfunctionalcharacteristicsofhematopoieticstemcellsderivedfromvarioussources |