Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм
В работе изучено влияние времени экспозиции мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в составе альгинатных микросфер с применением криозащитной среды ДЭПС-1, состоящей из 10% диметилсульфоксида, 20% этиленгликоля, 20% 1,2-пропандиола и 0,5 M сахарозы, на их сохранность и метаболическую активность пос...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2014 |
| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2014
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68837 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм / В.С. Зайков, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова, А.И. Правдюк, Н.А. Волкова, С.П. Мазур, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 3. — С. 222-230. — Бібліогр.: 9 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859919675793604608 |
|---|---|
| author | Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Волкова, Н.А. Мазур, С.П. Петренко, А.Ю. |
| author_facet | Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Волкова, Н.А. Мазур, С.П. Петренко, А.Ю. |
| citation_txt | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм / В.С. Зайков, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова, А.И. Правдюк, Н.А. Волкова, С.П. Мазур, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 3. — С. 222-230. — Бібліогр.: 9 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | В работе изучено влияние времени экспозиции мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в составе альгинатных микросфер с применением криозащитной среды ДЭПС-1, состоящей из 10% диметилсульфоксида, 20% этиленгликоля, 20% 1,2-пропандиола и 0,5 M сахарозы, на их сохранность и метаболическую активность после криоконсервирования методом витрификации. В работе были использованы сферы с диаметром более 1 мм, полученные путем покапельного внесения альгината натрия в раствор хлорида кальция. Альгинатные сферы, полученные с помощью такого метода несли большее количество клеточного метериала по сравнению со сферами с диаметром (0,5 ± 0,2) мм, полученными путем распыления альгината в раствор хлорида кальция. Показано, что использование криозащитной среды ДЭПС-1 позволяет проводить успешное криоконсервирование МСК, инкапсулированных в альгинатные сферы с разным диаметром. Установлено, что для насыщения инкапсулированных МСК с диаметром 1,2 мм криозащитным раствором необходима более продолжительная экспозиция клеток в растворе по сравнению с МСК, инкапсулированными в сферы с диаметром 0,5 мм.
Досліджено вплив часу експозиції мезенхімальних стромальних клітин (МСК) у складі альгінатних мікросфер із застосуванням кріозахисного середовища ДЕПС-1, що складається з 10% диметилсульфоксиду, 20% етиленгліколю, 20% 1,2-пропандіолу і 0,5 M сахарози, на їх збереженість і метаболічну активність після кріоконсервування шляхом вітрифікації. У роботі були використані сфери з діаметром більше 1 мм, отримані шляхом покапельного внесення альгінату натрію у розчин хлориду кальцію. Альгінатні сфери, отримані за допомогою такого методу, несли більшу кількість клітинного матеріалу порівняно зі сферами з діаметром (0,5 ± 0,2) мм, отриманими шляхом розпилення альгінату в розчин хлориду кальцію. Показано, що використання кріозахисного середовища ДЕПС-1 дозволяє проводити успішне кріоконсервування МСК, інкапсульованих в альгінатні сфери, з різним діаметром. Встановлено, що для насичення кріозахисним розчином інкапсульованих МСК із діаметром 1,2 мм необхідна триваліша експозиція клітин у розчині порівнянно з МСК, інкапсульованими у сфери з діаметром 0,5 мм.
The aim of the study was to evaluate the effect of exposure duration of alginate encapsulated mesenchymal stromal cells (MSCs) in multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 (10% dimethyl sulfoxide, 20% ethylene glycol, 1,2-propane diol and 0.5 M sucrose) on survival and metabolic activity following cryopreservation using vitrification. The spheres of 1mm diameter obtained by dropwise addition of sodium alginate into calcium chloride were used in the experiments. Alginate spheres derived by this method contained more cells as compared to the spheres of (0.5 ± 0.2) mm derived by pulverizing the alginate into calcium chloride. It was shown that using of multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 allowed achieving successful cryopreservation of MSCs encapsulated in alginate spheres of different sizes. It was found that saturation with cryoprotective solution of MSCs encapsulated in spheres with 1.2 mm size needed a longer exposure with CPA if compared with spheres of 0.6 mm size.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:06:53Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 611.018.2/.6.086.13:664.644.7:57.043
В.С. Зайков*, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова,
А.И. Правдюк, Н.А. Волкова, С.П. Мазур, А.Ю. Петренко
Влияние криоконсервирования путем медленного
замораживания или витрификации на жизнеспособность
и метаболическую активность мезенхимальных
стромальных клеток, заключенных в альгинатные
сферы с диаметром более 1 мм
UDC 611.018.2/.6.086.13:664.644.7:57.043
V.S. Zaikov*, Yu.A. Petrenko, N.A. Trufanova,
A.I. Pravdyuk, N.A. Volkova, S.P. Mazur, A.Yu. Petrenko
Effect of Cryopreservation Using Slow Freezing
or Vitrification on Viability and Metabolic Activity
of Mesenchymal Stromal Cells Encapsulated Within Alginate
Spheres with Diameter of 1 mm and More
Реферат: В работе изучено влияние времени экспозиции мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в составе
альгинатных микросфер с применением криозащитной среды ДЭПС-1, состоящей из 10% диметилсульфоксида, 20% этилен-
гликоля, 20% 1,2-пропандиола и 0,5 M сахарозы, на их сохранность и метаболическую активность после криоконсервирования
методом витрификации. В работе были использованы сферы с диаметром более 1 мм, полученные путем покапельного
внесения альгината натрия в раствор хлорида кальция. Альгинатные сферы, полученные с помощью такого метода несли
большее количество клеточного метериала по сравнению со сферами с диаметром (0,5 ± 0,2) мм, полученными путем
распыления альгината в раствор хлорида кальция. Показано, что использование криозащитной среды ДЭПС-1 позволяет
проводить успешное криоконсервирование МСК, инкапсулированных в альгинатные сферы с разным диаметром. Уста-
новлено, что для насыщения инкапсулированных МСК с диаметром 1,2 мм криозащитным раствором необходима более
продолжительная экспозиция клеток в растворе по сравнению с МСК, инкапсулированными в сферы с диаметром 0,5 мм.
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, альгинатные сферы, витрификация, мультикомпонентный
раствор криопротекторов, ступенчатое насыщение клеток криозащитным раствором.
Реферат: Досліджено вплив часу експозиції мезенхімальних стромальних клітин (МСК) у складі альгінатних мікросфер
із застосуванням кріозахисного середовища ДЕПС-1, що складається з 10% диметилсульфоксиду, 20% етиленгліколю, 20%
1,2-пропандіолу і 0,5 M сахарози, на їх збереженість і метаболічну активність після кріоконсервування шляхом вітрифікації.
У роботі були використані сфери з діаметром більше 1 мм, отримані шляхом покапельного внесення альгінату натрію у роз-
чин хлориду кальцію. Альгінатні сфери, отримані за допомогою такого методу, несли більшу кількість клітинного матеріалу
порівняно зі сферами з діаметром (0,5 ± 0,2) мм, отриманими шляхом розпилення альгінату в розчин хлориду кальцію. Пока-
зано, що використання кріозахисного середовища ДЕПС-1 дозволяє проводити успішне кріоконсервування МСК, інкап-
сульованих в альгінатні сфери, з різним діаметром. Встановлено, що для насичення кріозахисним розчином інкапсульованих
МСК із діаметром 1,2 мм необхідна триваліша експозиція клітин у розчині порівнянно з МСК, інкапсульованими у сфери з
діаметром 0,5 мм.
Ключові слова: мезенхімальні стромальні клітини, альгінатні мікросфери, вітрифікація, мультикомпонентний розчин
кріопротекторів, ступінчасте насичення клітин кріозахисним розчином.
Abstract: The aim of the study was to evaluate the effect of exposure duration of alginate encapsulated mesenchymal stromal
cells (MSCs) in multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 (10% dimethyl sulfoxide, 20% ethylene glycol, 1,2-propane diol and
0.5 M sucrose) on survival and metabolic activity following cryopreservation using vitrification. The spheres of 1mm diameter
obtained by dropwise addition of sodium alginate into calcium chloride were used in the experiments. Alginate spheres derived by this
method contained more cells as compared to the spheres of (0.5 ± 0.2) mm derived by pulverizing the alginate into calcium chloride.
It was shown that using of multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 allowed achieving successful cryopreservation of MSCs
encapsulated in alginate spheres of different sizes. It was found that saturation with cryoprotective solution of MSCs encapsulated
in spheres with 1.2 mm size needed a longer exposure with CPA if compared with spheres of 0.6 mm size.
Key words: mesenchymal stromal cells, alginate microspheres, vitrification, multicomponent cryoprotective solution, stepwise
exposure.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-30-34, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: vedenii.zaikov@gmail.com
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 3733034, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: vedenii.zaikov@gmail.com
Department of Cryobiochemistry, Institute for Problems of Cryobiol-
ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криобиохимии, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 11.02.2014
Принята в печать 02.04.2014
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №3. – С. 222–230.
© 2014 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received February, 11, 2014
Accepted April, 02, 2014
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014. 24(3): 222–230.
© 2014 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
223
Инкапсуляция клеток в альгинатные сферы как
биотехнологический прием широко используется
в тканевой инженерии и клеточной терапии [5, 8].
Такая процедура, с одной стороны, обеспечивает
надежные иммобилизацию и иммуноизоляцию при
трансплантации, а с другой – сохраняет возмож-
ность обмена низкомолекулярными веществами
между клетками и внешней средой. Перспектив-
ной клеточной составляющей в технологии инкап-
суляции являются мезенхимальные стромальные
клетки (МСК) человека. Уникальные свойства
МСК (высокая пролиферативная активность, муль-
тилинейный дифференцировочный потенциал и
низкая иммуногенность) делают их привлекатель-
ным объектом для фундаментальных и приклад-
ных областей биологии и медицины [6]. Это, в
свою очередь, обуславливает актуальность разра-
ботки новых и усовершенствования существующих
методов создания низкотемпературных банков
инкапсулированных МСК (иМСК).
Ранее нами изучалась возможность сохранения
специфических свойств МСК при консервировании
их в составе альгинатных сфер с привлечением
медленного замораживания под защитой 10%
диметилсульфоксида (ДМСО), что позволило зна-
чительно сохранить жизнеспособность и метаболи-
ческую активность инкапсулированных клеток [7].
Также была осуществлена успешная модификация
метода витрификации суспензии МСК с использо-
ванием смеси криопротекторов ДЭПС-1 (10%
ДМСО, 20% этиленгликоля (ЭГ), 20% 1,2-пропан-
диола (1,2-ПД) и 0,5 M сахарозы) для иМСК в сос-
таве альгинатных сфер диаметром (0,5 ± 0,2) мм
[1]. Преимуществом такого «малого» диаметра
является удобство проведения манипуляций со сфе-
рами (в том числе в перспективе введения в орга-
низм реципиента с помощью стандартных инъек-
ционнных игл). Однако метод получения «малых»
сфер, основанный на распылении альгината в раст-
вор хлорида кальция, не позволял добиться высокой
концентрации инкапсулированных клеток вслед-
ствие нестабильной вязкости раствора. Разработка
другого методического подхода, заключающегося
в покапельном внесении альгината в раствор хло-
рида кальция, дала возможность частично преодо-
леть эти ограничения и значительно увеличить
концентрацию клеток в сферах. Альгинатные сфе-
ры, полученные с помощью второго метода, имели
больший диаметр. Поскольку размер и форма
образцов – значимые в криобиологических иссле-
дованиях параметры, возникает вопрос: будут ли
условия криоконсервирования МСК в составе сфер
«малого» диаметра обеспечивать сохранение их
Encapsulation of cells into alginate spheres is widely
used as a biotechnological method in tissue engineering
and cell therapy [2, 8]. This procedure, on the one
hand, provides reliable immobilization and immune
isolation during transplantation, and on another it
preserves the ability to provide low molecular weight
substances exchange between cells and their environ-
ment. Human mesenchymal stromal cells (MSCs) are
promising cell component for the encapsulation tech-
nique. The unique properties of MSCs (high proli-
ferative activity, multilinear differentiation potential and
low immunogenicity) make them an attractive object
for fundamental and applied fields of biology and medi-
cine [3]. This, in turn, stipulates the demand of deve-
loping new and improving existing methods to create
(establish) low-temperature banks of encapsulated
MSCs (eMSCs).
Previously we studied the possibility to maintain
specific properties of MSCs during their low tempe-
rature storage within the alginate spheres using slow
freezing and protection by 10% dimethyl sulfoxide
(DMSO), which resulted in significant preservation of
the viability and metabolic activity of the encapsulated
cells [6]. Moreover we performed a successful modifi-
cation of MSC suspension vitrification technique using
a mixture of cryoprotectants DEPS-1 (10% DMSO,
20% ethylene glycol (EG), 20% 1,2-propanediol (1,2-
PD) and 0.5 mol sucrose) for eMSCs within the alginate
spheres of (0.5 ± 0.2) mm diameter [7]. The advantage
of 'small' diameter is the convenience for performing
manipulations with the spheres (including the introduc-
tion to the recipient organism using standard injection
needles). However, the method of obtaining 'small'
spheres based on the spraying of alginate into calcium
chloride solution, did not allow to achieve a high
concentration of the encapsulated cells due to unstable
solution viscosity. Development of other methodological
approach involving dropwise addition of alginate to the
solution of calcium chloride gave the opportunity to
partially overcome these limitations and to significantly
increase cell concentration in the spheres. Alginate
spheres obtained by the second method had larger
diameter. Since the size and shape of the samples are
essential parameters in cryobiological research, there
arises a question whether the conditions for cryopre-
servation of MSCs within the spheres of 'small' diame-
ter would provide the preservation of their biological
properties within the alginate spheres with larger
diameter.
Herewith, the aim of this study was to assess the
viability and metabolic state of MSCs within the alginate
spheres of different diameters after cryopreservation
using slow freezing and vitrification.
224 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
биологических свойств в составе альгинатных
сфер, имеющих больший диаметр.
В связи с вышеизложенным целью данной
работы было оценить жизнеспособность и метабо-
лическое состояние МСК в составе альгинатных
сфер разного диаметра после криоконсервирования
путем медленного замораживания и витрификации.
Материалы и методы
В экспериментах использовали МСК дермы
человека, полученные от взрослых доноров с их
информированного согласия. Клетки получали
методом эксплантации кусочков [2]. Далее их куль-
тивировали в среде α-MEM («Sigma», США), до-
полненной 10% эмбриональной сыворотки (ЭС)
крупного рогатого скота («Биолот, Россия), 2 мМ
L-глютамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мг/мл
стрептомицина при 37°С, 5% СО2 и 95% влажнос-
ти. При достижении 60–70% конфлуента в моно-
слое, МСК 2–3-го пассажа трипсинизировали по
стандартной методике и осаждали с помощью цен-
трифугирова-ния при 200g в течение 7 мин. Полу-
ченный осадок ресуспендировали в очищенном
растворе 1,2% альгината натрия («Sigma») на осно-
ве фосфатного буферного раствора (ФБР; «Sigma»).
Суспензию клеток в растворе альгината натрия
распыляли с помощью специально сконструирован-
ного устройства [3] либо вносили покапельно с
помощью инъекционной иглы (диаметром 0,8 мм)
в раствор 100 мМ CaCl2. После полимеризации (в
течение 10 мин) сферы промывали ФБР, дополнен-
ным 25 мМ HEPES («Sigma»), для удаления избыт-
ка CaCl2. При распылении диаметр этих сфер сос-
тавлял (0,5 ± 0,2) мм (группа иМСК-0,5), а после
покапельного внесения – (1,2 ± 0,1) мм (группа
иМСК-1,2). Полученные сферы на сутки помещали
в условия культивирования, описанные выше.
Медленное замораживание иМСК-1,2 с контро-
лируемыми скоростями охлаждения проводили под
защитой 10%-го ДМСО в среде α-MEM («Sigma»),
содержащей 20% ЭС. Для этого сферы переносили
в криоконтейнеры («Nunc», США) объемом 2 мл
(из расчета 6 сфер на одну криопробирку), содер-
жавшие 500 мкл криозащитного раствора, и вы-
держивали 15 мин при комнатной температуре.
Образцы охлаждали со скоростью 1 град/мин до
–80°С с использованием программного замора-
живателя «ЗП-10» (СКТБ с ОП ИПКиК НАН
Украины), после чего переносили в жидкий азот и
хранили от 1 до 5 суток. Образцы отогревали на
водяной бане при температуре 37°С, отмывали
путем покапельного внесения 5 мл среды α-MEМ
в течение 10 мин со сменой раствора.
Для проведения экспериментов по витрификации
в аналогичные вышеуказанным криоконтейнеры
Materials and methods
The experiments were performed in human dermal
MSCs derived from adult donors after their informed
consent. The cells were obtained by explantation of
fragments [4]. These were cultured in α-MEM (Sigma,
USA) supplemented with 10% fetal bovine serum
(FBS) (Biolot, Russia), 2 mM L-glutamine, 50 IU/ml
penicillin and 50 mg/ml streptomycin at 37°C, 5% CO2
and 95% humidity. Following reaching 60–70% con-
fluent monolayer the MSCs of passages 2–3 were tryp-
sinized by standard technique and sedimented by cent-
rifugation at 200g for 7 min. The resulting pellet was
resuspended in purified solution of 1.2% sodium algi-
nate (Sigma) based on the phosphate buffered saline
(PBS; Sigma). The cell suspension in sodium alginate
solution was sprayed with specially designed device
[5] or was dropped with an injection needle (0.8 mm
diameter) into the solution of 100 mM CaCl2. After
polymerization (during 10 min) the spheres were
washed by PBS supplemented with 25 mM HEPES
(Sigma) to remove the excess of CaCl2. In case of
spraying the diameter of the spheres was (0.5 ±
0.2) mm (group of eMSCs-0.5) and in case of dropping
it made (1.2 ± 0.1) mm (group of eMSCs-1.2). The
resulting spheres were placed for 24 hrs in culture
conditions described above.
Slow freezing of eMSCs-1.2 with the controlled
cooling rates was performed under protection of 10%
DMSO in α-MEM (Sigma), containing 20% FBS. For
this purpose, the spheres were transferred to 2 ml
cryocontainers (Nunc, USA) (6 spheres per cryovial)
containing 500 µl of cryoprotective solution and incu-
bated for 15 min at room temperature. The samples
were cooled at 1 deg/min down to –80°C using the
programmable freezer ZP-10 (Special Designing and
Technical Bureau with Experimental Unit of the Insti-
tute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
of the National Academy of Sciences, Ukraine), then
transferred into liquid nitrogen and stored from 1 to
5 days. The samples were warmed in water bath at
37°C, washed by dropwise addition of 5 ml α-MEM
during 10 min solution changing.
The experiments on vitrification were performed
in equal cryocontainers: 6 eMSC-1.2 spheres were pla-
ced to 100 µl FBS supplemented with 25 mmol HEPES
(Sigma). Then, cryoprotective solution DEPS-1 [7] was
poured to the containers and the spheres were incuba-
ted at room temperature by one or two stages. To per-
form one-step exposure the solution with spheres was
mixed with 900 µl DEPS-1 and incubated for 5 min, in
case of two steps the cryocontainer with spheres was
filled with 100 µl DEPS-1 (the first stage) and then
with 800 µl of the same cryoprotectant solution (the
second stage). After introducing DEPS-1 at the first
stage the exposure time was 2 min 30 sec [7] or 4 min
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
225
помещали по 6 сфер иМСК-1,2 в 100 мкл ФБР,
дополненного 25 мМ HEPES («Sigma»). Далее в
контейнеры вносили криозащитный раствор ДЭПС-1
[1] и проводили инкубирование сфер при комнат-
ной температуре в один или два этапа. При одно-
этапной экспозиции к раствору со сферами добав-
ляли 900 мкл ДЭПС-1 и выдерживали 5 мин, при
двухэтапной вначале в криоконтейнер со сферами
вносили 100 мкл ДЭПС-1 (первый этап), а затем
добавляли еще 800 мкл того же раствора криопро-
текторов (второй этап). После внесения ДЭПС-1
на первом этапе время экспозиции составляла
2 мин 30 с [1] или 4 мин 30 с, на втором – 30 с. По-
сле экспозиции криоконтейнеры погружали в жид-
кий азот. Отогрев проводили на водяной бане при
температуре 37°С, содержимое криоконтейнеров
немедленно переносили в 5 мл раствора 0,5 М саха-
розы на основе ФБР и в течение 5 мин поэтапно
вводили 5 мл среды α-MEМ («Sigma»).
Для оценки влияния экспозиции на жизнеспособ-
ность суспензии МСК в пробирки, содержащие
клетки в 100 мкл физиологического буфера, вносили
400 мкл раствора криопротекторов, содержащего
10% ДМСО, 20–60% ЭГ, 0–20% 1,2-ПД и 0,5 M
сахарозы (в конечной концентрации). Время экспо-
зиции составляло 5 мин, после чего клетки отмы-
вали.
Деконсервированные сферы с МСК культиви-
ровали в течение суток в условиях, описанных
выше. На одну сферу с МСК приходилось не менее
100 мкл среды культивирования.
Метаболическую активность иМСК оценивали
по степени восстановления редокс-индикатора
Alamar Blue™ (AB; «Serotec», США) на одних и
тех же сферах до криоконсервирования, непосред-
ственно после отогрева и через сутки культивиро-
вания после отогрева. Для этого в лунки культу-
рального планшета со сферами добавляли 100 мкл
5%-го раствора АВ. Флуоресценцию восстановлен-
ной формы AB определяли через 2 ч культивирова-
ния на спектрофлуориметре («Tecan GENios»,
Австралия) при длине волны возбуждения 550 нм
и волны эмиссии 590 нм. Обработку данных прово-
дили с помощью программы «XFLUOR4 v.4.50»
(«Tecan GENios»). Результаты представляли как
различия между значением флуоресценции опытной
и холостой пробы (5%-й раствор АВ) и выражали
в условных единицах флуоресценции (УЕФ). Для
оценки метаболической активности иМСК-0,5 и
иМСК-1,2 использовали одинаковое количество ин-
капсулированного клеточного материала и выра-
жали как УЕФ на лунку. Для определения количест-
ва клеток сферы растворяли в 10 мМ раствора
этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА;
30 sec, at the second stage it was 30 sec. After expo-
sure the cryocontainers were immersed into liquid nit-
rogen. Thawing was performed in water bath at 37°C,
the content of cryocontainers was immediately trans-
ferred into 5 ml of 0.5 mol FBS-based sucrose solution
and during 5 min 5 ml of α-MEM (Sigma) was added
stepwise.
To assess the effect of exposure on the viability of
MSC suspension the vials containing cells in 100 µl of
physiological saline were supplemented with 400 µl of
cryoprotectant solution containing 10% DMSO, 20–
60% of ethylene glycol, 0–20% of the 1,2-PD and 0.5
sucrose (final concentration). The exposure time was
5 min, whereat the cells were washed.
Frozen-thawed spheres with MSCs were cultured
for 24 hrs under conditions described above. We used
not less than 100 µl of culture medium per one sphere
with MSCs.
Metabolic activity of eMSCs was assessed by the
degree of recovery of redox indicator Alamar Blue™
(AB; Serotec, USA) in the same spheres prior to cryo-
preservation, immediately after thawing and in a day
of culture after thawing. For this purpose the wells of
culture plate with spheres were supplemented with 100
µl of 5% AB solution. The fluorescence of the reduced
AB form was determined after 2 hrs of culture using
a spectrofluorometer (Tecan GENios, Australia) at the
excitation wavelength of 550 nm and emission wave-
length of 590 nm. The data were processed with
XFLUOR4 v.4.50 (Tecan GENios). The results were
presented as the differences between the values of
fluorescence of experimental and blank sample (5%
AB solution) and expressed in arbitrary fluorescence
units (AFU). To assess the metabolic activity of
eMSCs-0.5 and eMSCs-1.2 we used the same amount
of encapsulated cell material and expressed it as AFU
per well. To determine the number of cells the spheres
were dissolved in 10 mM of ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA; Sigma), the cells were counted in Go-
ryaev’s chamber. The effect of cryopreservation on
metabolic state of cells involved in eMSCs-1.2 was
estimated by AB test in the same spheres and expres-
sed in percentage as AFU per one sphere after cryo-
preservation/AFU per one sphere before cryopreserva-
tion.
Viability of eMSCs was assessed by MTT assay,
in 24 hrs of culture after encapsulation we compared
the indices of eMSCs-0.5 and eMSCs-1.2. For eMSCs-
1.2 the viability was determined also after cryopreser-
vation: into each well we placed one alginate sphere
with MSCs and added 100 µl of the medium containing
MTT indicator (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-
diphenyl-2H-tetrazoliumbromide) with concentration of
5 mg/ml. After 2 hrs of incubation at 37°C the spheres
226 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
«Sigma») и подсчитывали клетки из осадка в каме-
ре Горяева. При исследовании влияния криоконсер-
вирования на метаболическое состояние клеток в
составе иМСК-1,2 АВ-тест проводили на одних и
тех же сферах и выражали в процентах как УЕФ
на одну сферу после криоконсервирования / УЕФ
на одну сферу до криоконсервирования.
Жизнеспособность иМСК оценивали с помо-
щью МТТ-теста: через сутки культивирования пос-
ле инкапсуляции сравнивали показатели иМСК-0,5
и иМСК-1,2. Для иМСК-1,2 определяли жизнеспо-
собность также после криоконсервирования: в каж-
дую лунку помещали по одной альгинатной сфере
с МСК и далее вносили 100 мкл среды, содержа-
щей индикатор МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-
2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид) в концентра-
ции 5 мг/мл. После 2 ч культивирования при темпе-
ратуре 37°С сферы растворяли путем добавления
10 мМ раствора ЭДТА. Клетки осаждали с помо-
щью центрифугирования при 200g в течение 7 мин.
Полученный осадок ресуспендировали в физиоло-
гическом растворе, подсчет клеток осуществляли
в камере Горяева. Жизнеспособность определяли
как отношение числа клеток, накопивших формазан,
к общему числу клеток и выражали в процентах.
Статистически полученные результаты обраба-
тывали с использованием программного пакета
«Origin 6.7». Данные представляли в виде (x ± y)%.
Для оценки значимости различий между показа-
телями использовали параметрический метод
статистического анализа (t-критерий Стьюдента).
Результаты и обсуждение
Метод распыления суспензии клеток в растворе
1,2%-го альгината натрия позволил получить
сферы диаметром (0,5 ± 0,2) мм, количество кле-
ток внутри одной сферы составляло от 100 до 150.
were dissolved by mixing with 10 mM EDTA solution.
The cells were pelleted by centrifugation at 200 g for
7 min. The obtained pellet was resuspended in saline,
the cells were counted in Goryaev’s chamber. Viability
was de-termined as the ratio of number of cells
accumulated formazan to total number of cells and
expressed in percents.
The obtained results were statistically processed
using the Origin 6.7 software. The data were expressed
as (x ± y)%. To assess the significance of differences
between the indices we used parametric method of
statistical analysis (Student’s t-test)
Results and discussion
Method of spraying the suspension of cells in
solution of 1.2% sodium alginate allowed to get spheres
with diameter (0.5 ± 0.2) mm, the number of cells within
spheres made from 100 to 150. Method of dropping
the suspension into the polymerization solution using
injection needles allowed to increase the diameter of
spheres up to (1.2 ± 0.1) mm and the number of cells
in each sphere up to 8,000–12,000. Visual assessment
revealed no differences between two options of
encapsulation, cell size varied within the same ranges,
they were mostly rounded and homogeneously
distributed over the volume of carrier (Fig. 1).
In 24 hrs of eMSCs culture we assessed the cell
state in the spheres. It has been shown that encap-
sulation regardless of the used method did not adversely
affect cell viability, by MTT test it was above 90%.
Cells in the ‘small’ (eMSCs-0.5) and ‘large’ (eMSCs-1.2)
spheres reduced the AB similarly ((0.17 ± 0.05) AFU/
well and (0.16 ± 0.02) AFU/well, respectively),
indicating the same level of metabolic activity.
The spheres of 1.2 mm diameter with MSCs were
cryopreserved one day later encapsulation using slow
freezing or vitrification under protection of DEPS-1
Рис. 1. Внешний вид МСК, инкапсулированных в альгинатные сферы
диаметром: А – (0,5 ± 0,2) мм; В – (1,2 ± 0,1) мм.
Fig. 1. Appearance of MSCs encapsulated into alginate spheres with two
diameters: A – (0.5 ± 0.2) mm; B – (1.2 ± 0.1) mm.
A B
Метод покапельного внесения сус-
пензии в полимеризационный раст-
вор с помощью инъекционных игл
дал возможность увеличить диа-
метр сфер до (1,2 ± 0,1) мм и коли-
чество клеток в каждой сфере до
8000–12000. Визуальная оценка не
выявила отличий между обоими ва-
риантами инкапсуляции: размер
клеток варьировал в тех же преде-
лах, они имели преимущественно
округлую форму и равномерно рас-
пределялись по объему носителя
(рис. 1).
Через сутки культивирования
иМСК была проведена оценка сос-
тояния клеток в сферах. Было
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
227
показано, что процесс инкапсуляции при исполь-
зовании двух методов негативно не влиял на жиз-
неспособность клеток, по МТТ-тесту она состав-
ляла более 90%. Клетки в «малых» (иМСК-0,5) и
«больших» (иМСК-1,2) сферах с аналогичной
интенсивностью восстанавливали АВ (0,17 ± 0,05)
УЕФ/лунка и (0,16 ± 0,02) УЕФ/лунка соответст-
венно, что свидетельствует об одинаковом уровне
метаболической активности.
Сферы диаметром 1,2 мм с МСК через сутки
после инкапсуляции криоконсервировали путем
медленного замораживания или витрификации под
защитой смеси ДЭПС-1, применяя методические
подходы для сфер «малого» диаметра [1, 7]. При
медленном замораживании использовали экспози-
цию иМСК с 10%-м ДМСО в среде α-MEM, содер-
жащей 20% ЭС, с последующим охлаждением
образцов со скоростью 1 град/мин. Витрификацию
проводили под защитой смеси ДЭПС-1 с экспози-
цией в течение 2 мин 30 с на первом этапе и 30 с –
на втором.
Результаты МТТ-теста, проведенного после
криоконсервирования путем медленного замора-
живания, показали значимое снижение жизнеспо-
собности иМСК на 20% по отношению к показате-
лям до замораживания (рис. 2). Снижение метабо-
лической активности (АВ-тест) составило около
30%. После витрификации-отогрева снижение
жизнеспособности и метаболической активности
иМСК было более выраженным и составило около
70%. Для криоконсервирования иМСК-1,2 приме-
няли режимы, адаптированные ранее для сфер
меньшего диаметра (0,5 мм). Медленное замора-
живание под защитой 10%-го ДМСО позволило
сохранить жизнеспособность иМСК-0,5 на уровне
(87 ± 2)% (окрашивание фенилацетатом/этидиум-
бромидом) [7]. Использование того же метода для
иМСК-1,2 также дало приемлемые результаты.
Это свидетельствует о том, что медленное замора-
живание может быть применено для альгинатных
сфер с иМСК независимо от их диаметра.
Подход к витрификации иМСК-1,2, зарекомен-
довавший себя для иМСК-0,5 [1], не дал удовлетво-
рительных результатов. На основании предыду-
щего опыта мы предположили, что альгинатный
носитель может замедлять проникновение крио-
протектора в клетки. Возможно, установленная
ранее для «малых» сфер оптимальная продолжи-
тельность инкубирования в растворе ДЭПС-1 до
витрификации оказалась недостаточной для кле-
ток в составе носителей большего диаметра. Для
проверки такого предположения на основе скринин-
га были выбраны два варианта более длительной
обработки раствором криопротекторов: одноэтап-
mixture, the methodical approaches were the same as
for ‘small’ spheres [6, 7]. For slow freezing technique
the eMSCs were incubated with 10% DMSO in
α-MEM supplemented with 20% FBS and then the
samples were cooled with the rate of 1 deg/min.
Vitrification was carried out under protection of DEPS-
1 mixture with exposure lasted 2 min 30 sec at the
first stage and 30 sec at the second one.
The results of MTT assay performed after cryopre-
servation involving slow freezing showed a significant
decrease in eMSCs viability by 20% in relation to the
values before freezing (Fig. 2). Reduction of metabolic
activity (AB test) was about 30%. Following vitrifi-
cation and warming the viability and metabolic activity
of eMSCs decreased more and made about 70%. To
cryopreserve eMSCs-1.2 we used the regimens being
previously adapted for spheres of smaller diameter (0.5
mm). Slow freezing under protection of 10% DMSO
allowed to get high viability of eMSCs-0.5, (87 ± 2)%
(staining with phenylacetate/ethidium bromide) [6].
Applying the same method for eMSCs-1.2 also gave
satisfactory results. In other words, this indicates the
Рис. 2. Жизнеспособность иМСК-1,2 мм по МТТ-тесту
( )и метаболическая активность по АВ-тесту ( ) после
криоконсервирования с использованием медленного
замораживания под защитой 10% ДМСО или витрифи-
кации в растворе ДЭПС-1; за 100% приняты значения,
полученные до криоконсервирования; * – различия
значимы по отношению к показателям до криокон-
сервирования (p < 0,05, n = 6), # – показателям после
витрификации (p < 0,05, n = 6).
Fig. 2. Viability of eMSCs-1.2 mm by MTT assay ( ) and
metabolic activity by AB test ( ) after cryopreservation using
slow freezing under 10% DMSO protection or vitrification
in DEPS-1solution; the values obtained before cryopreser-
vation are denoted as 100%; * – the differences are signi-
ficant in relation to the indices prior to cryopreservation
(p < 0.05, n = 6), # – the indices after vitrification (p < 0.05,
n = 6).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 2
*
*
*
*
#
#
П
ок
аз
ат
ел
ь,
%
о
т
ко
нт
ро
ля
In
de
x,
%
o
f c
on
tro
l
Медленное
замораживание
Slow freezing
Витрификация
Vitrification
яинаворивреснокоирклокоторП
locotorpnoitavreserpoyrC
аверготоелсопонневтсдерсопенилетазакоП
gnimrawretfayletaidemmisecidnI
елсопяинаворивитьлукиктусзеречилетазакоП
авергото
gnimrawtsoperutlucsrh42nisecidnI
%,BA %,ТТМ %,BA %,ТТМ
елсоп1-СПЭДвяицакифиртиВ
ним5еинечетвпатэнидовиицабукни
petsenoretfa1-SPEDninoitacifirtiV
nim5rofnoitabucni
1,2±0,36 1 3,1±0,28 1 1,2±65 2,1 5,1±0,57 1
елсоп1-СПЭДвяицакифиртиВ
моврепанним4(апатэавдвиицабукни
)моротван–с03,епатэ
petsowtretfa1-SPEDninoitacifirtiV
ces03,petstsrifehttanim4(noitabucni
)petsdnocesehtta
41,2±00,55 2,1 25,2±0,47 2,1 45,2±00,74 3,2,1 21,3±00,76 3,2,1
ОСМД%01еровтсарвеинавижаромаЗ
юьтсороксйомеурилортнокйокзинс
htiwOSMD%01fonoitulosnignizeerF
etardellortnocwol
81,2±00,07 2,1 *1,3±0,08 87,1±00,24 3,2,1 3,2±0,55 3,2,1
228 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
ной с экспозицией в 100% ДЭПС-1 в течение 5 мин
и двухэтапной с 4-минутной экспозицией в 50%
ДЭПС-1 на первом этапе и 30 с в 100% ДЭПС-1 –
на втором.
Как оказалось, использование обоих вариантов
действительно позволило значительно увеличить
показатели как жизнеспособности, так и метаболи-
ческой активности иМСК после витрификации и
отогрева (таблица). Более того, было обнаружено
некоторое преимущество одноэтапного протокола
экспозиции – средние показатели жизнеспособ-
ности и метаболической активности после витри-
фикации и отогрева клеток, обработанных раство-
ром ДЭПС-1 в течение 5 мин, были выше таковых
для случая двухэтапной экспозиции в смеси крио-
протекторов в течение 4 мин на первом этапе и
30 с – на втором. Такие различия важны с техно-
логической точки зрения: очевидно, что одноэтап-
ный протокол экспозиции в растворе криопротек-
торов является более простым по сравнению с
двухэтапным. Интересно, что такая продолжитель-
ная инкубация в случае неинкапсулированной
суспензии клеток приводила к полной их гибели
(жизнеспособность на уровне (4 ± 2)%), вследст-
вие высокой концентрации криопротекторов в раст-
воре. Можно предположить, что высокие значения
жизнеспособности и метаболической активности
клеток, полученные после их витрификации в
составе альгинатных сфер, могут быть обусловле-
slow freezing as applicable for the alginate spheres
with eMSCs regardless of their diameter.
The approach tested for vitrification of eMSCs-
1.2 which was developed for eMSCs-0.5 [7] did not
give satisfactory results. Based on the previous expe-
rience we assumed that the alginate carrier might dece-
lerate the penetration of cryoprotectant into the cells.
Probably the duration of incubation in DEPS-1 solution
prior to vitrification established previously as optimal
for ‘small’ spheres was insufficient for cells placed
into the carriers of larger diameter. To verify this
assump-tion we performed screening and selected two
options of longer treatment with cryoprotectant
solution: one-step exposure in 100% DEPS-1 for 5 min,
and two-step 4-min exposure in 50% DEPS-1 at the
first stage and 30 sec in 100% DEPS-1 at the second
stage.
As it was found, both options of treatment allowed
to increase considerably the indices of viability and
metabolic activity of eMSCs following vitrification and
warming (Table). Moreover, we have found an advan-
tage of one-step exposure protocol, i. e. average meta-
bolic activity and viability of eMSCs after vitrification
and thawing of the cells treated with DEPS-1 solution
for 5 min were higher than those in the case of two-
step exposure in a mixture of cryoprotectants for 4 min
at the first stage and 30 sec at the second one. Such
differences are important from a technological point
of view, it is obvious that one-step protocol of exposure
Жизнеспособность по МТТ-тесту и метаболическая активность по АВ-тесту иМСК-1,2
после витрификации-отогрева с использованием различных протоколов экспозиции
Viability by MTT assay and metabolic activity by AB test of eMSCs-1.2
after vitrification-warming using different exposure protocols
Примечание: за 100% приняты значения до криоконсервирования; 1 – различия значимы по отношению к показателям до
криоконсервирования (p < 0,05), 2 – после отогрева (p < 0,05), 3 – витрификации с одноэтапной инкубацией в ДЭПС-1 (p < 0,05,
n = 6).
Note: the indices prior to cryopreservation are denoted as 100%; 1 – differences are significant in relation to the indices before
cryopreservation (p < 0.05), 2 – after thawing (p < 0.05), 3 – vitrification after one-step incubation in DEPS-1 (p < 0.05, n = 6).
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
229
ны способностью альгинатного гидрогеля снижать
негативное влияние на клетки. Этот вопрос тре-
бует отдельного изучения, поскольку его решение
может существенно повысить эффективность
криоконсервирования биологических объектов.
Жизнеспособность и метаболическая актив-
ность клеток, определенные непосредственно пос-
ле отогрева, не могут считаться адекватными по-
казателями криоконсервирования. Известно, что
в течение некоторого времени после отогрева в
части клеток развиваются деструктивные процес-
сы, инициированные во время криоконсервирова-
ния. Так, отмечена активация каскада апоптоза
после отогрева клеточной суспензии, что приводит
к дополнительному снижению ее жизнеспособ-
ности в течение последующих суток [9]. Также
нами было установлено, что в ходе рекультивиро-
вания МСК после криоконсервирования в составе
макропористых носителей показатель жизнеспо-
собности суспензии снижается и достигает мини-
мума к концу первых суток, а затем увеличивается,
очевидно, вследствие пролиферации выживших
клеток [4]. По результатам исследования установ-
лено, что через сутки рекультивирования после
витрификации и отогрева «больших» сфер показате-
ли жизнеспособности и метаболической активнос-
ти были ниже на 7–8% по сравнению с таковыми
непосредственно после отогрева. Таким образом,
полученные данные свидетельствуют о сохранении
морфофункциональных свойств МСК, перенесших
процедуру витрификации в составе альгинатных
микросфер, однако необходимо дальнейшее усо-
вершенствование методов криоконсервирования,
предотвращающих снижение показателей жизне-
способности клеток в ходе рекультивирования.
Выводы
Мезенхимальные стромальные клетки могут
быть инкапсулированы в альгинатные сферы раз-
ного диаметра (0,5 ± 0,2) и (1,2 ± 0,1) мм с сохра-
нением жизнеспособности и метаболической ак-
тивности.
Витрификация МСК в составе сфер разного
диаметра во многом определяется временем экс-
позиции с раствором криопротекторов. С увеличе-
нием диаметра сфер с (0,5 ± 0,2) до (1,2 ± 0,1) мм
время экспозиции, необходимое для сохранения
жизнеспособности и метаболической активности
клеток после витрификации, тоже увеличивалось.
Показатели жизнеспособности и метаболичес-
кой активности МСК, заключенных в альгинатные
сферы разного диаметра, могут быть сохранены
при криоконсервировании как путем медленного
замораживания, так и витрификации.
in the solution of cryoprotectants is simpler if compared
to a two-step one. Interestingly, that such a continuous
incubation of non-encapsulated cell suspension resulted
in their complete death (viability of (4 ± 2)%), likely
due to high concentration of cryoprotectants in solution.
It can be suggested that high values of cell viability
and metabolic activity obtained after vitrification within
the alginate spheres could result from the ability of
alginate hydrogel to reduce negative effects on the
cells appeared during cryopreservation. This question
requires a more detailed individual study, as its solving
can significantly improve the efficiency of cryopreser-
vation of biological objects.
Viability and metabolic activity of cells assessed
immediately after thawing could not be considered as
reliable indices of cryopreservation. It is known that
the destructive processes initiated during cryopreser-
vation are developed in the cells during some period of
time post warming. For instance, the apoptotic cascade
activation after warming of cell suspension that led to
a further reduction of cell viability during the following
days was reported [9]. Also we have established that
during reculturing of MSCs after cryopreservation
within macroporous carriers the viability of suspension
decreased and reached a minimum to the end of the
first day and then again increased likely due to prolife-
ration of survived cells [1]. In the present research it
was revealed that following 24 hr reculturing after
vitrification and warming of ‘large’ spheres the indices
of viability and metabolic activity were lower by 7–
8% if compared with those immediately after thawing.
Therefore, the findings attested the preservation of
morphological and functional properties of MSCs
undergone vitrification within alginate microspheres,
but there is a need in further improvement of cryopre-
servation methods preventing the decrease in cell via-
bility during reculturing.
Conclusions
Mesenchymal stromal cells can be encapsulated
into alginate spheres of different diameters (0.5 ± 0.2)
and (1.2 ± 0.1) mm preserving their viability and meta-
bolic activity.
MSC vitrification within the spheres of various
diameter is largely determined by the exposure time
with the solution of cryoprotectants. With the increase
in the diameter of spheres from (0.5 ± 0.2) to (1.2 ±
0.1) mm the exposure time required to maintain viability
and metabolic activity of cells after vitrification also
increases.
The viability and metabolic activity of MSCs
involved into alginate spheres of different diameter can
be preserved during cryopreservation both by slow
freezing and vitrification.
Литература
1. Зайков В.С., Петренко Ю.А., Труфанова Н.А. и др. Витри-
фикация мезенхимальных стромальных клеток в составе
альгинатных микросфер // Проблемы криобиологии. –
2012. – Т. 22, №4. – С. 14–20.
2. Петренко А.Ю., Петренко Ю.А., Мазур С.П. и др. Выделение
и мультилинейная дифференцировка стромальных клеток
из тканей плодов и взрослого человека // Транспланто-
логія. – 2007. – Т. 9, №1. – С. 218–220.
3. Правдюк А.И., Петренко Ю.А., Волкова Н.А., Петренко А.Ю.
Свойства мезенхимальных стромальных клеток челове-
ка при инкапсуляции в альгинатные микрокапсулы // Био-
технология. – 2010. – Т. 3, №2. – С. 62–70.
4. Katsen-Globa A., Meiser I., Petrenko Y.A. et al. Towards ready-
to-use 3-D scaffolds for regenerative medicine: adhesion-
based cryopreservation of human mesenchymal stem cells
attached and spread within alginate-gelatin cryogel scaffolds //
J. Mater. Sci. Mater. Med. – 2014. – Vol. 25, №3. – P. 857–871.
5. Murua A., Portero A., Orive G. et al. Cell microencapsulation
technology: towards clinical application // J. Control. Rel. –
2008. – Vol. 132, №4. – P. 76–83.
6. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential
of adult human mesenchymal stem cells // Science. – 1999. –
Vol. 284, №5411. – P. 143–147.
7. Pravdyuk A.I., Petrenko Y.A., Fuller B.J., Petrenko A.Y. Cryopre-
servation of alginate encapsulated mesenchymal stromal
cells // Cryobiology. – 2013. – Vol. 66, №3. – P. 215–222.
8. Zimmermann H., Shirley S.G., Zimmerman U. Alginate-based
encapsulation of cells: past, present and future // Cur. Diabetes
Rep. – 2007. – Vol. 7, №4. – P. 314–320.
9. Wagh V., Meganathan K., Jagtap S. et al. Effects of cryopre-
servation on the transcriptome of human embryonic stem cells
after thawing and culturing // Stem Cell Rev. – 2011. – Vol. 7. –
P. 506–517.
References
1. Katsen-Globa A., Meiser I., Petrenko Y.A. et al. Towards ready-
to-use 3-D scaffolds for regenerative medicine: adhesion-
based cryopreservation of human mesenchymal stem cells
attached and spread within alginate-gelatin cryogel scaffolds.
J Mater Sci Mater Med. 2014; 25(3): 857–871.
2. Murua A., Portero A., Orive G. et al. Cell microencapsulation
technology: towards clinical application. J Control Rel 2008;
132(4): 76–83.
3. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential
of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;
284(5411): 143–147.
4. Petrenko A.Y., Petrenko Y.A., Mazur S.P. et. al. Isolation and
multilinear differentiation of stromal cells from fetal and adult
tissue. Transplantology 2007; 9(1): 218–220.
5. Pravdyuk A.I., Petrenko Y.A., Volkova N.A., Petrenko A.Y. Pro-
perties of human mesenchymal stromal cells in alginate micro-
capsules. Biotekhnologiya 2010; 3(2): 62–70.
6. Pravdyuk A.I., Petrenko Y.A., Fuller B.J., Petrenko A.Y. Cryopre-
servation of alginate encapsulated mesenchymal stromal cells.
Cryobiology 2013; 66(3): 215–222.
7. Zaikov V.S., Petrenko Y.A., Trufanova N.A. et. al. Cryopreser-
vation of human mesenchymal stromal cells in suspension
and encapsulated in alginate microbeads by vitrification in
multicomponent solutions. Probl Cryobiol Cryomed 2012; 22(4):
14–20.
8. Zimmermann H., Shirley S.G., Zimmerman U. Alginate-based
encapsulation of cells: past, present and future. Cur Diabetes
Rep 2007; 7(4): 314–320.
9. Wagh V., Meganathan K., Jagtap S. et al. Effects of cryopreser-
vation on the transcriptome of human embryonic stem cells
after thawing and culturing. Stem Cell Rev 2011; 7: 506–517.
230 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68837 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:06:53Z |
| publishDate | 2014 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Волкова, Н.А. Мазур, С.П. Петренко, А.Ю. 2014-09-30T06:27:48Z 2014-09-30T06:27:48Z 2014 Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм / В.С. Зайков, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова, А.И. Правдюк, Н.А. Волкова, С.П. Мазур, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 3. — С. 222-230. — Бібліогр.: 9 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68837 611.018.2/.6.086.13:664.644.7:57.043 В работе изучено влияние времени экспозиции мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в составе альгинатных микросфер с применением криозащитной среды ДЭПС-1, состоящей из 10% диметилсульфоксида, 20% этиленгликоля, 20% 1,2-пропандиола и 0,5 M сахарозы, на их сохранность и метаболическую активность после криоконсервирования методом витрификации. В работе были использованы сферы с диаметром более 1 мм, полученные путем покапельного внесения альгината натрия в раствор хлорида кальция. Альгинатные сферы, полученные с помощью такого метода несли большее количество клеточного метериала по сравнению со сферами с диаметром (0,5 ± 0,2) мм, полученными путем распыления альгината в раствор хлорида кальция. Показано, что использование криозащитной среды ДЭПС-1 позволяет проводить успешное криоконсервирование МСК, инкапсулированных в альгинатные сферы с разным диаметром. Установлено, что для насыщения инкапсулированных МСК с диаметром 1,2 мм криозащитным раствором необходима более продолжительная экспозиция клеток в растворе по сравнению с МСК, инкапсулированными в сферы с диаметром 0,5 мм. Досліджено вплив часу експозиції мезенхімальних стромальних клітин (МСК) у складі альгінатних мікросфер із застосуванням кріозахисного середовища ДЕПС-1, що складається з 10% диметилсульфоксиду, 20% етиленгліколю, 20% 1,2-пропандіолу і 0,5 M сахарози, на їх збереженість і метаболічну активність після кріоконсервування шляхом вітрифікації. У роботі були використані сфери з діаметром більше 1 мм, отримані шляхом покапельного внесення альгінату натрію у розчин хлориду кальцію. Альгінатні сфери, отримані за допомогою такого методу, несли більшу кількість клітинного матеріалу порівняно зі сферами з діаметром (0,5 ± 0,2) мм, отриманими шляхом розпилення альгінату в розчин хлориду кальцію. Показано, що використання кріозахисного середовища ДЕПС-1 дозволяє проводити успішне кріоконсервування МСК, інкапсульованих в альгінатні сфери, з різним діаметром. Встановлено, що для насичення кріозахисним розчином інкапсульованих МСК із діаметром 1,2 мм необхідна триваліша експозиція клітин у розчині порівнянно з МСК, інкапсульованими у сфери з діаметром 0,5 мм. The aim of the study was to evaluate the effect of exposure duration of alginate encapsulated mesenchymal stromal cells (MSCs) in multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 (10% dimethyl sulfoxide, 20% ethylene glycol, 1,2-propane diol and 0.5 M sucrose) on survival and metabolic activity following cryopreservation using vitrification. The spheres of 1mm diameter obtained by dropwise addition of sodium alginate into calcium chloride were used in the experiments. Alginate spheres derived by this method contained more cells as compared to the spheres of (0.5 ± 0.2) mm derived by pulverizing the alginate into calcium chloride. It was shown that using of multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 allowed achieving successful cryopreservation of MSCs encapsulated in alginate spheres of different sizes. It was found that saturation with cryoprotective solution of MSCs encapsulated in spheres with 1.2 mm size needed a longer exposure with CPA if compared with spheres of 0.6 mm size. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм Effect of Cryopreservation Using Slow Freezing or Vitrification on Viability and Metabolic Activity of Mesenchymal Stromal Cells Encapsulated Within Alginate Spheres with Diameter of 1 mm and More Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Волкова, Н.А. Мазур, С.П. Петренко, А.Ю. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм |
| title_alt | Effect of Cryopreservation Using Slow Freezing or Vitrification on Viability and Metabolic Activity of Mesenchymal Stromal Cells Encapsulated Within Alginate Spheres with Diameter of 1 mm and More |
| title_full | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм |
| title_fullStr | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм |
| title_full_unstemmed | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм |
| title_short | Влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм |
| title_sort | влияние криоконсервирования путем медленного замораживания или витрификации на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток, заключенных в альгинатные сферы с диаметром более 1 мм |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68837 |
| work_keys_str_mv | AT zaikovvs vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT petrenkoûa vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT trufanovana vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT pravdûkai vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT volkovana vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT mazursp vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT petrenkoaû vliâniekriokonservirovaniâputemmedlennogozamoraživaniâilivitrifikaciinažiznesposobnostʹimetaboličeskuûaktivnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokzaklûčennyhvalʹginatnyesferysdiametrombolee1mm AT zaikovvs effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore AT petrenkoûa effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore AT trufanovana effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore AT pravdûkai effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore AT volkovana effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore AT mazursp effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore AT petrenkoaû effectofcryopreservationusingslowfreezingorvitrificationonviabilityandmetabolicactivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedwithinalginatesphereswithdiameterof1mmandmore |