Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени
Ревматоидный артрит (РА) является одним из самых распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов с многофакторной этиологией. Существенным моментом при РА является нарушения реализации в иммунокомпетентных клетках, в том числе и клетках моноцитарно-фагоцитарной системы (МФС), процес...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2014 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2014
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68840 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени / А.Н. Гольцев, Е.Е. Ямпольская, М.В. Останков, Н.А. Бондарович // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 3. — С. 249-261. — Бібліогр.: 26 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860007897683984384 |
|---|---|
| author | Гольцев, А.Н. Ямпольская, Е.Е. Останков, М.В. Бондарович, Н.А. |
| author_facet | Гольцев, А.Н. Ямпольская, Е.Е. Останков, М.В. Бондарович, Н.А. |
| citation_txt | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени / А.Н. Гольцев, Е.Е. Ямпольская, М.В. Останков, Н.А. Бондарович // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 3. — С. 249-261. — Бібліогр.: 26 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Ревматоидный артрит (РА) является одним из самых распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов с многофакторной этиологией. Существенным моментом при РА является нарушения реализации в иммунокомпетентных клетках, в том числе и клетках моноцитарно-фагоцитарной системы (МФС), процессов пролиферации и апоптоза. Одной из составляющих стратегии ограничения чрезмерного воспалительного ответа при РА может быть активация апоптоза в клетках МФС. На модели адъювантного артрита (АА) животных проведена сравнительная оценка развития апоптотических процессов в клетках МФС до и после введения нативных и криоконсервированных клеток фетальной печени (кКФП). С помощью вестерн-блот анализа показаны особенности экспрессии протеинов CD95-каскада в клетках МФС в условиях развития АА. Установлен более выраженный проапоптотический эффект после введения кКФП, степень проявление которого зависела от срока их введения.
Ревматоїдний артрит (РА) є одним із найпоширеніших хронічних запальних захворювань суглобів із багатофакторною етіологією. Суттєвим моментом при РА є порушення реалізації в імунокомпетентних клітинах, у тому числі й клітинах моноцитарно-фагоцитарної системи (МФС), процесів проліферації та апоптозу. Однією зі складових стратегії обмеження надмірної запальної відповіді при РА може бути активація апоптозу у клітинах МФС. На моделі ад’ювантного артриту (АА) тварин проведено порівняльну оцінку розвитку апоптотичних процесів у клітинах МФС до та після введення нативних і кріоконсервованих клітин фетальної печінки (кКФП). За допомогою вестерн-блот аналізу показано особливості експресії протеїнів CD95-каскаду в клітинах МФС в умовах прогресу АА. Встановлено більш виражений проапоптотичний ефект після введення кКФП, ступінь прояву якого залежала від строку їх введення.
Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most widespread chronic inflammatory diseases of the joints with multifactor etiology. A crucial point in RA is the disorder of proliferation and apoptosis in immunocompetent cells as well as in the cells of monocyte-phagocyte system (MPS). Using the model of adjuvant arthritis (AA) in animals we comparatively assessed the development of apoptotic processes in MPS cells before and after administration of native and cryopreserved fetal liver cells (cFLCs). By means of Western blot analysis we showed the peculiarities of CD-95 cascade proteins expression in MPS cells during development of AA. After administration of cFLCs we found more pronounced proapoptotic effect, which degree depended on the period of their administration.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:40:07Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 576.367:612.35.014.2-053.1:616.72-002.77
А.Н. Гольцев*, Е.Е. Ямпольская, М.В. Останков, Н.А. Бондарович
Исследование апоптотических процессов в клетках
моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного
артрита до и после введения криоконсервированных клеток
фетальной печени
UDC 576.367:612.35.014.2-053.1:616.72-002.77
A.N. Goltsev*, E.E. Yampolskaya, M.V. Ostankov, N.A. Bondarovich
Study of Apoptotic Processes in Cells of Monocyte-Phagocyte
System During Development of Adjuvant Arthritis Prior to and After
Administration of Fetal Liver Cells
Реферат: Ревматоидный артрит (РА) является одним из самых распространенных хронических воспалительных
заболеваний суставов с многофакторной этиологией. Существенным моментом при РА является нарушения реализации в
иммунокомпетентных клетках, в том числе и клетках моноцитарно-фагоцитарной системы (МФС), процессов пролиферации
и апоптоза. Одной из составляющих стратегии ограничения чрезмерного воспалительного ответа при РА может быть
активация апоптоза в клетках МФС. На модели адъювантного артрита (АА) животных проведена сравнительная оценка
развития апоптотических процессов в клетках МФС до и после введения нативных и криоконсервированных клеток
фетальной печени (кКФП). С помощью вестерн-блот анализа показаны особенности экспрессии протеинов CD95-каскада в
клетках МФС в условиях развития АА. Установлен более выраженный проапоптотический эффект после введения кКФП,
степень проявление которого зависела от срока их введения.
Ключевые слова: апоптоз, моноцитарно-фагоцитарная система, адъювантный артрит, клетки фетальной печени,
криоконсервирование.
Реферат: Ревматоїдний артрит (РА) є одним із найпоширеніших хронічних запальних захворювань суглобів із багато-
факторною етіологією. Суттєвим моментом при РА є порушення реалізації в імунокомпетентних клітинах, у тому числі й
клітинах моноцитарно-фагоцитарної системи (МФС), процесів проліферації та апоптозу. Однією зі складових стратегії
обмеження надмірної запальної відповіді при РА може бути активація апоптозу у клітинах МФС. На моделі ад’ювантного
артриту (АА) тварин проведено порівняльну оцінку розвитку апоптотичних процесів у клітинах МФС до та після введення
нативних і кріоконсервованих клітин фетальної печінки (кКФП). За допомогою вестерн-блот аналізу показано особливості
експресії протеїнів CD95-каскаду в клітинах МФС в умовах прогресу АА. Встановлено більш виражений проапоптотичний
ефект після введення кКФП, ступінь прояву якого залежала від строку їх введення.
Ключові слова: апоптоз, моноцитарно-фагоцитарна система, ад'ювантний артрит, клітини фетальної печінки,
кріоконсервування.
Abstract: Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most widespread chronic inflammatory diseases of the joints with multifactor
etiology. A crucial point in RA is the disorder of proliferation and apoptosis in immunocompetent cells as well as in the cells of
monocyte-phagocyte system (MPS). Using the model of adjuvant arthritis (AA) in animals we comparatively assessed the development
of apoptotic processes in MPS cells before and after administration of native and cryopreserved fetal liver cells (cFLCs). By means
of Western blot analysis we showed the peculiarities of CD-95 cascade proteins expression in MPS cells during development of AA.
After administration of cFLCs we found more pronounced proapoptotic effect, which degree depended on the period of their
administration.
Key words: apoptosis, monocyte-phagocyte system, adjuvant arthritis, fetal liver cells, cryopreservation.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-57-89, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: cryopato@rambler.ru
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 5789, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: cryopato@rambler.ru
Department of Cryopathophysiology and Immunology, Institute for
Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Acad-
emy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криопатофизиологии и иммунологии, Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 22.04.2014
Принята в печать 28.05.2014
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №3. – С. 249–261.
© 2014 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received April, 22, 2014
Accepted May, 28, 2014
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2014. 24(3): 249–261.
© 2014 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
Ревматоидный артрит (РА) – хроническое, сис-
темное, иммунозависимое, воспалительное забо-
левание с многофакторной этиологией. Для РА
характерно многолетнее прогрессирующее воспа-
ление, которое выражается в разрушении структур
суставов и поражении околосуставных тканей [6].
Rheumatoid arthritis (RA) is chronic, systemic,
immune-dependent, inflammatory disease of multi-
factor etiology. RA is characterized by long-term pro-
gressive inflammation manifesting in destruction of joint
structure and damage of periarticular tissues [16]. Ac-
tivation of monocyte-phagocyte system (MPS) cells
250 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
Активация клеток моноцитарно-фагоцитарной
системы (МФС) является одним из наиболее уни-
версальных звеньев патогенеза РА [17, 18]. Су-
ществует несколько фактов, дающих основание
рассматривать клетки МФС как возможную ми-
шень для терапевтических воздействий. Сущест-
венным моментом при РА является нарушение
реализации в иммунокомпетентных клетках,
включая клетки МФС, процессов пролиферации и
апоптоза, что способствует пролонгации иммуно-
воспалительного процесса [5, 21, 22]. В связи с
этим одной из составляющих стратегии ограниче-
ния чрезмерного воспалительного ответа при РА
может быть активация апоптоза в клетках МФС
[23].
К альтернативным подходам лечения РА можно
отнести клеточно-тканевую терапию [7], одним из
компонентов которой являются клетки фетальной
печени (КФП). Предыдущие исследования проде-
монстрировали способность продуктов фетопла-
центарного комплекса активировать апоптоз, хотя
механизм их действия остается до конца не изучен-
ным [2, 5]. Подобной активностью обладают α-фе-
топротеин КФП и плацентарный протеин PP-11.
Кроме того, КФП продуцируют ряд медиаторов,
таких как ИЛ-4 и ИЛ-10, которые обладают как
противовоспалительной, так и проапоптотической
активностью [9, 13, 14, 20].
Необходимость применения КФП в клинической
практике определила разработку эффективных
методов их криоконсервирования и длительного
хранения. При этом воздействие низких темпе-
ратур может выступать в роли модификатора сос-
тояния биообъекта на молекулярном и клеточном
уровнях, в ряде случаев улучшая его терапевтичес-
кую эффективность [3, 4, 10, 15, 16]. Вместе с тем
нет данных о влиянии криоконсервирования на
выраженность апоптоза ИКК после введения КФП
реципиентам. В связи с этим представляет инте-
рес выяснение характера влияния криоконсерви-
рования на проапоптотический потенциал КФП в
отношении клеток МФС в условиях развития
адъювантного артрита (АА) животных – экспери-
ментального аналога РА человека.
Цель работы – сравнительная оценка развития
апоптотических процессов в клетках моноцитарно-
фагоцитарной системы в условиях формирования
адъювантного артрита до и после введения крио-
консервированных и нативных клеток фетальной
печени.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на 120 мышах линий
C57Bl/6J и СВА/Н 3-месячного возраста массой
18–20 г, которые были получены из питомника
is one of the most versatile links of RA pathogenesis
[14, 15]. There are several facts affording grounds to
consider MPS cells as a possible target for therapeutic
interventions. An essential point in RA is the disorder
of proliferation and apoptosis in immunocompetent cells
as well as in MPS ones, thereby prolonging immu-
noinflammatory process [13, 19, 20]. In this regard,
the activation of apoptosis in the MPS cells may be a
component of strategy restricting an excessive inflam-
matory response at RA [21].
Alternate approaches for treatment of RA include
cell and tissue therapy [23], one of the components of
which are fetal liver cells (FLCs). The previous investi-
gations have demonstrated the ability of fetoplacental
complex products to activate apoptosis, although the
mechanism of their action remains poorly studied [10,
13]. Similar activity is a feature of FLC α-fetoprotein
and placental protein PP-11. Furthermore, FLCs pro-
duce several mediators, such as IL-4 and IL-10 which
have both anti-inflammatory and proapoptotic activity
[4, 5, 9, 18].
The need to apply FLCs in clinical practice stipulated
the development of effective methods for their cryo-
preservation and long-term storage. Moreover the ef-
fect of low temperatures can be the modifier of biolo-
gical object state at molecular and cellular levels, in
some cases improving its therapeutic efficacy [8, 9,
11, 12, 25]. However, there are no data on the influence
of cryopreservation on the expression of ICC apoptosis
after FLC administration into the recipients. In this
respect it is of interest to clarify the character of cryo-
preservation impact on the FLC proapoptotic potential
in relation to MPS cells during development of adjuvant
arthritis (AA) in animals, experimental counterpart of
human RA.
The research aim was to comparatively assess the
development of apoptotic processes in cells of mono-
cyte-phagocyte system at adjuvant arthritis before and
after administration of native and cryopreserved fetal
liver cells.
Materials and methods
Experiments were carried out in 120 three months-
old C57Bl/6J and CBA/H mice of 18–20 g weight,
which were obtained from the nursery 'Stolbovaya' of
the Russian Academy of Medical Sciences with the
following storage under standard conditions in vivarium
at the IPC&C of the NASU. Each test group consisted
of 7 animals at least. Pathology was induced in CBA/H
mice by subplantar administration of complete Freund’s
adjuvant at the dose of 0.05 ml/mouse [1]. MPS cells
were derived from the mice peritoneal cavity (PC)
[26]. Their adhesive properties were measured in
plastic dishes (Spectar, Serbia) after incubation at 37°C
for one hour. The percentage of adherent cells (ACs)
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
251
РАМН «Столбовая» с последующим содержанием
в стандартных условиях вивария ИПКиК НАНУ.
В каждой исследуемой группе использовалось не
менее 7 животных. Патологию индуцировали у
мышей СВА/Н субплантарным введением полного
адъюванта Фрейнда в дозе 0,05 мл/мышь [11].
Клетки МФС получали из перитонеальной полости
(ПП) мышей [26]. Их адгезивные свойства опре-
деляли в пластиковых чашках («Spectar», Сербия)
после инкубации при температуре 37°С в течение
часа. Процент адгезивных клеток (АК) подсчиты-
вали как разницу между количеством внесенных
клеток и клеток в супернатанте [26]. Количество
клеток МФС в адгезивной фракции клеток ПП
определяли на проточном цитофлуориметре «FACS
Calibur» («Becton Dickinson», США), применяя
моноклональные антимышиные антитела к марке-
ру CD68 («Biolegend», США) согласно инструкции
производителя. В качестве контроля использовали
пробы с добавлением неимунных меченных FITC
моноклональных антител (МАТ) («Biolegend»).
Перед инкубацией с МАТ для внутриклеточных
антигенов клетки предварительно фиксировали и
пермеабилизировали с помощью набора реактивов
Cytofix/Cytoperm («BD Biosciences», США). Про-
цент мертвых клеток определяли методом окраши-
вания пропидий йодидом («Sigma», США) на
проточном цитофлуориметре «FACS Calibur»
(«Becton Dickinson») [24], количество ядросодер-
жащих клеток – в камере Горяева. Полученные
данные анализировали с помощью программы
«Win MDI 2.9».
Фетальную печень, выделенную из эмбрионов
на 14-й поскоитальный день, дезинтегрировали в
гомогенезаторе Поттера в среде 199 (Институт
полиомиелита и вирусных энцефалитов, Россия) с
добавлением 10%-й эмбриональной телячьей сы-
воротки («БиолоТ», Россия) и 2%-го цитрата нат-
рия (далее в тексте – рабочая среда) с последую-
щей очисткой через иглы уменьшающегося диа-
метра (0,8–0,5 мм) и капроновый фильтр. Раствор
для криоконсервирования КФП представлял собой
рабочую среду с 10%-м раствором диметилсуль-
фоксида (ДМСО) («Arterium», Украина). К полу-
ченной на рабочей среде суспензии клеток по кап-
лям добавляли криоконсервирующий раствор в
соотношении 1:1 при температуре 18°С в течение
2 мин (конечная концентрация ДМСО составила
5%). Экспозицию клеток в растворе проводили в
течение 10 мин при той же температуре. Клетки
фетальной печени с концентрацией 1×106/мл и
объемом 1,8 мл замораживали на программном за-
мораживателе («Cryoson», Германия) в пластико-
вых ампулах («Nunc», Германия) по следующей
программе: охлаждение от комнатной темпера-
was calculated as the difference between the amount
of administered cells and supernatant [26]. The number
of MPS cells in the adhesive fraction of PP cells was
determined by flow cytometer FACS Calibur (Becton
Dickinson, USA) using the anti-mouse monoclonal
antibodies to the marker CD68 (Biolegend, USA)
according to the manufacturer's instructions. As the
control we used the samples supplemented with
marked non-immune FITC monoclonal antibodies
(MABs) (Biolegend). Before incubation with MABs
for intracellular antigens the cells were preliminary
fixed and permeabilized with the set of reagents
Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, USA). The per-
centage of dead cells was determined by propidium
iodide staining (Sigma, USA) with the flow cytometer
FACS Calibur (Becton Dickinson) [22], the number
of nucleated cells – in Goryaev’s chamber. The data
obtained were analyzed using Win MDI 2.9.
Fetal liver isolated from embryos to the 14th post-
coital day was disintegrated in Potter homogenizer in
medium 199 (Institute of Poliomyelitis and Viral
Encephalitis, Russia) supplemented with 10% fetal
bovine serum (BioloT, Russia) and 2% sodium citrate
(hereinafter handling medium), followed by purification
through the needles of decreasing diameter (0.8–
0.5 mm) and nylon filter. Solution for cryopreservation
of FLCs is a handling medium with 10% dimethyl
sulfoxide (DMSO) (Arterium, Ukraine). The cell sus-
pension obtained in handling medium was dropwise
supplemented with cryopreserving solution in 1:1 ratio
at 18°C for 2 min (final DMSO concentration was
5%). Cells were exposed in the solution during 10 min
at the same temperature. Fetal liver cells of 1×106/ml
concentration in 1.8 ml volume were frozen with a
programmable freezer (Cryoson, Germany) in the plas-
tic vials (Nunc, Germany) by the following program:
cooling from room temperature down to –40°C with
the rate of 1 deg/min, 10-min pause, then cooling with
10 deg/min down to –80°C with the following plunging
of the vials into liquid nitrogen [25]. The samples were
thawed on water bath at 38...40°C until disappearance
of solid phase. The cells were once washed from
DMSO by dropwise addition of handling medium of
equal volume, and then they were centrifuged (200g,
10 min). FLC suspension not subjected to freeze-thaw-
ing will be hereafter denoted as native FLCs (nFLCs).
Native FLCs and cryopreserved FLCs (cFLCs ), the
survival of which in the test with propidium iodide was
not less than 80%, were once administered intravenously
in a dose of 5×106/mouse and 0.3 ml volume to the 7th
day (omitting the acute phase) or to the 14th day (early
chronic phase) of AA development. As a positive cont-
rol of AA therapy we used glucocorticoid-dexametha-
sone (DX) in a dose of 0.002 ml, which is the main
preparation for the basic RA therapy [16].
252 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
туры до –40°С со скоростью 1 град/мин, 10-ми-
нутная выдержка, затем охлаждение со скоростью
10 град/мин до –80°С и последующим погру-
жением ампул в жидкий азот [10]. Оттаивание
образцов проводили на водяной бане при темпера-
туре 38…40°С до исчезновения твердой фазы.
Клетки однократно отмывали от ДМСО путем
покапельного добавления равного объема рабочей
среды, затем центрифугировали (200g, 10 мин).
Суспензию КФП, не подвергавшуюся процедуре
замораживания-отогрева, далее будем называть
нативными КФП (нКФП). Нативные КФП и крио-
консервированные КФП (кКФП), сохранность кото-
рых в тесте с пропидий йодидом составляла не
менее 80%, вводили однократно внутривенно в дозе
5×106/мышь и объеме 0,3 мл на 7-е сутки (минуя
острую фазу) или 14-е сутки (начало хронической
фазы) развития АА. В качестве позитивного конт-
роля терапии АА использовали глюкокортикоид \
дексаметазон (ДК) в дозе 0,002 мл, который яв-
ляется основным препаратом базовой терапии РА
[6].
Оценку состояния клеток МФС проводили на
7, 14, 21, 28-е сутки после индукции АА и через 7 и
14 суток после введения КФП или ДК. Интактным
контролем были животные того же возраста, кото-
рые находились в тех же условиях, что и опытные
группы (таблица).
Анализировали активацию каспаз, FLIP и экс-
прессию CD95-рецептора с использованием моно-
и поликлональных антител: anti-CD95 (FL-335) –
поликлональные кроличьи антитела; anti-Caspase-
8 (p18 (D-8)) – моноклональные мышиные антитела
с изотипом IgG 2a; anti-cFLIP (5D8) – моноклональ-
ные мышиные антитела с изотипом IgG3; anti-Cas-
pase-3 (46) – моноклональные мышиные антитела
с изотипом IgG1; вторичные HRP-конъюгирован-
ные антикроличьи антитела (s2040); вторичные
HRP-конъюгированные антимышиные IgG (s2005)
(«Santa Cruz», США).
Исследование апоптоза в клетках МФС на
разных стадиях развития АА до и после введения
КФП проводили с помощью вестерн-блот анализа
в лизатах клеток МФС. Анализ проводили в 12%-м
полиакриламидном геле в присутствии додецил-
сульфата натрия (180 V, 25 мA) в течение часа.
Размер белков контролировали с помощью стан-
дартов («Fermentas», США). Перенос на нитроцел-
люлозную мембрану («Pharmacia», США) осу-
ществляли полусухим способом. Блокирование
неспецифического связывания на мембране прово-
дили в 5%-м сухом молоке. Анализ интенсивности
хемилюминесценции выполняли с помощью суб-
страта пероксидазы («Perkin Elmer», США).
Изображение анализировалось с использованием
The state of MPS cells were assessed to the days
7, 14, 21, 28 after induction of AA and in 7 and 14 days
after administration of FLCs or DX. The animals of
the same age and under the same conditions as the
experimental groups were the intact control (Table).
We analyzed the activation of caspases, FLIP and
CD95-receptor expression using mono- and polyclonal
antibodies: anti-CD95 (FL-335) – rabbit polyclonal
antibodies; anti-Caspase-8 (p18 (D-8)) – mouse
monoclonal antibodies with isotype IgG2a; anti-cFLIP
(5D8) – mouse monoclonal antibodies with isotype
IgG3; anti-Caspase-3 (46) – mouse monoclonal anti-
bodies with isotype IgG1; secondary HRP-conjugated
anti-rabbit antibodies (s2040); secondary HRP-conju-
gated anti-mouse IgG (s2005) (Santa Cruz, USA).
Apoptosis in MPS cells at various stages of AA
development prior to and after administration of FLCs
was studied using Western blot analysis of MPS cell
lysates. The analysis was performed in 12% polyacry-
lamide gel with sodium dodecyl sulfate (180 V, 25 mA)
during one hour. The size of proteins was monitored
by the standards (Fermentas, USA). Transfer to nitro-
cellulose membrane (Pharmacia, USA) was performed
by semi-dry method. Nonspecific binding on the mem-
brane was blocked in 5% dry milk. Chemiluminescence
intensity was analyzed using peroxidase substrate
(Perkin Elmer, USA). The image was analyzed with
ImageJ 1.36 (USA), estimating the relative amount of
protein in units of optical density.
The catalytic activity of caspases 3 and 8 in MPS
cells was determined by measuring the proteolytic
cleavage of fluorogenic substrates: ZIETD-AFC and
AC-DEVD-AMC (Calbiochem, La Jolla, USA).
Fluorescence was measured with spectrophotometer
(Perkin Elmer, USA) by output of AFC product
(caspase 8, extinction at 400 nm, emission at 505 nm)
or AMC one (caspase 3, extinction at 380 nm, emission
at 460 nm). The results are presented in fluorescence
units per mg of total protein.
The obtained data were statistically processed by
Student’s t-test using Statistika 7.0 (USA). The diffe-
rences between the groups were considered significant
at p < 0.05. The experiments were performed in accor-
dance with the General Principles of Experiments in
Animals approved by the 3rd National Congress on Bio-
ethics (Kiev, 2007) consistent with the regulations of
the European Convention for the Protection of Verteb-
rate Animals used for Experimental and other Scientific
Purposes (Strasbourg, 1986).
Results and discussion
As the findings show the PC of intact mice contains
about 33% of cells with adhesive potential. According
to the cytofluorometry data 78% of them expressed
CD68-structure known as a marker of monocytes and
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
253
«ImageJ 1.36» (США), с оценкой относительного ко-
личества белка в единицах оптической плотности.
Каталитическую активность каспаз 3 и 8 в клет-
ках МФС устанавливали путем измерения протео-
литического расщепления флуорогенных субстра-
тов: ZIETD-AFC и AC-DEVD-AMC («Calbiochem»,
США). Флуоресценцию определяли с помощью
спектрофотометра («Perkin Elmer», США) по вы-
ходу продукта AFC (каспаза 8, экстинция 400 нм,
эмиссия 505 нм) или AMC (каспаза 3, экстинция
380 нм, эмиссия 460 нм). Результаты представлены
в единицах флуоресценции на 1 мг общего белка.
Полученные данные статистически обрабаты-
вали по методу Стьюдента-Фишера с использова-
нием программы «Statistika 7.0» (США). Различия
между группами считали значимыми при р < 0,05.
Эксперименты проведены в соответствии с «Об-
щими принципами экспериментов на животных»,
одобренными III Национальным конгрессом по
биоэтике (г. Киев, 2007) и согласованными с поло-
жениями «Европейской конвенции о защите позво-
ночных животных, используемых для экспери-
ментальных и других научных целей» (г. Страсбург,
1986).
Результаты и обсуждение
Как следует из полученных нами результатов,
в ПП интактных мышей содержится около 33%
клеток с адгезивным потенциалом. По данным
цитофлуориметрии, 78% из них экспрессировало
CD68-структуру, известную как маркер моноцитов
и макрофагов [19]. Анализ результатов экспери-
ментов показал, что развитие АА сопровождалось
увеличением в ПП как общего содержания клеток,
так и клеток с маркерами МФС, что свидетель-
ствует об активации клеток данной системы
(рис. 1).
Показатели спонтанной гибели клеток МФС
свидетельствуют о том, что у интактных животных
процент погибших клеток не превышал (1,97 ±
0,03)%, а в группах животных с АА – (5,2 ± 0,5)%
(р < 0,05). После введения ДК во всех исследуе-
мых группах (группы 6–9) количество погибших
клеток значительно увеличивалось по сравнению
с животными без введения препарата. Введение
обоих видов КФП также приводило к увеличению
содержания погибших клеток, причем данный
показатель зависел как от срока введения, так и
вида материала. Максимальная гибель наблюда-
лась после введения кКФП на 7-е сутки развития
АА, которая была значимо выше, чем после
применения нКФП. При введении КФП на 14-е
сутки развития патологии уже через неделю после
их введения этот показатель снижался (таблица).
macrophages [17]. Analysis of experimental results
showed that the development of AA was accompanied
by an increase in PC of total content of cells as well
as the cells with MPS markers, indicating the activation
of cells in this system (Fig. 1).
Indices of spontaneous death of MPS cells suggest
that in the intact animals the percentage of dead cells
did not exceed (1.97 ± 0.03)%, while in the groups of
animals with AA it was (5.2 ± 0.5)% (p < 0.05). After
DX administration, in all experimental groups (groups
6–9) the number of dead cells significantly increased
compared to that of animals not administered with any
preparation. The administration of both types of FLCs
also resulted in an increased level of cell death, more-
over this index depended on the period of administration
and the type of material. Maximal death was observed
after administration of cFLCs to the 7th day of AA,
which was significantly higher than after applying
nFLCs. In one week after administration of FLCs to
the 14th day of pathology development this index
reduced (Table).
The noted fact of cell death may be the result of
apoptotic processes activation and it can be implemen-
ted through modulating of intracellular signals with
intracellular proteins-caspases. Common index of apop-
Рис. 1. Cодержание CD68+ и адгезивных клеток в общей
суспензии клеток перитонеальной полости на разных
стадиях развития адъювантного артрита; – АК; –
CD68+; * – значимые различия по сравнению с
интактными животными; p < 0,05.
Fig. 1. Content of CD68+ and adherent cells in total sus-
pension of peritoneal cavity at different stages of adjuvant
arthritis. Notes: – ACs, – CD68+; * – significant changes
if compared with intact animals; p < 0.05.
0
10
20
30
40
50
60
70
Интакт 7 14 21 28
С
од
ер
жа
ни
е
ад
ге
зи
вн
ы
х
ил
и
C
D
68
+ -
кл
ет
ок
,%
Ad
he
si
ve
o
r C
D
68
+ c
el
l c
on
tre
nt
, %
Срок развития АА, суток
AA development term, days
Intact
*
*
* *
* * *
*
хынтовижыппурГ
slaminafospuorG
ыппургдоП
хынтовиж
spuorgbuS
slaminafo
еинажредоС
котелкхишбигоп
%,СФМ
daedfotnetnoC
%,sllecSPM
)ьлортнок(еынткатнИ
)lortnoc(tcatnI 1 30,0±79,1
вотараперпяинедеввзеБ
fonoitartsinimdatuohtiW
snoitaraperp
котус7АА
AAfoyadht7 2 2,0±4,4
котус41АА
AAfoyadht41 3 1,0±1,3
котус12АА
AAfoyadts12 4 64,0±25,4
котус82АА
AAfoyadht82 5 5,0±2,5
анозатемаскедеинедевВ
fonoitartsinimdA
enosahtemaxed
)яинедеввелсопюледензереч(KГ+котус7АА
)noitartsinimdaretfakeewenoni(XD+AAfoyadht7 6 *8,0±6,81
)яинедеввелсопиледен2зереч(KГ+котус7АА
)noitartsinimdaretfaskeewowtni(XD+AAfoyadht7 7 *6,0±9,71
)яинедеввелсопюледензереч(KГ+котус41АА
)noitartsinimdaretfakeewenoni(XD+AAfoyadht41 8 *91,0±8,61
)яинедеввелсопиледен2зереч(KГ+котус41АА
)noitartsinimdaretfaskeewowtni(XD+AAfoyadht41 9 *11,0±4,61
ПФKкеинедевВ
sCLFcfonoitartsinimdA
)яинедеввелсопюледензереч(ПФKк+котус7АА
)noitartsinimdaretfakeewenoni(sCLFc+AAfoyadht7 01 *50,0±5,9 #
)яинедеввелсопиледен2зереч(ПФKк+котус7АА
)noitartsinimdaretfaskeewowtni(sCLFc+AAfoyadht7 11 *1,0±1,6 #
)яинедеввелсопюледензереч(ПФKк+котус41АА
)noitartsinimdaretfakeewenoni(sCLFc+AAfoyadht41 21 *50,0±9,7 #
)яинедеввелсопиледен2зереч(ПФKк+котус41АА
)noitartsinimdaretfaskeewowtni(sCLFc+AAfoyadht41 31 *1,0±1,8 #
ПФKнеинедевВ
sCLFnfonoitartsinimdA
)яинедеввелсопюледензереч(ПФKн+котус7АА
)noitartsinimdaretfakeewenoni(sCLFn+AAfoyadht7 41 *3,0±6,8 #
)яинедеввелсопиледен2зереч(ПФKн+котус7АА
)noitartsinimdaretfaskeewowtni(sCLFn+AAfoyadht7 51 *80,0±4,7 #
)яинедеввелсопюледензереч(ПФKн+котус41АА
)noitartsinimdaretfakeewenoni(sCLFn+AAfoyadht41 61 *5,0±5,7 #
)яинедеввелсопиледен2зереч(ПФKн+котус41АА
)noitartsinimdaretfaskeewowtni(sCLFn+AAfoyadht41 71 *52,0±57,5 #
254 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
Примечание: различия значимы (р < 0,05) по сравнению с: * – животными без введения препаратов; # – между группами
животных, которым вводили кКФП и нКФП.
Notes: significant changes (p < 0.05) if compared with * – animals not administered with any preparations; # – between groups of
animals administered with cFLCs and nFLCs.
Процентное содержание погибших клеток МФС у животных на разных стадиях
развития адъювантного артрита и после введения КФП
Сontent of dead MPS cells in animals at different stages of adjuvant arthritis and after FLCs administration
tosis induction is the caspase 3 activation [6] accom-
panied by the appearance of product of its catalytic
activity, protein p17. In terms of the obtained results
the protein p17 was in lysates of MPS cells in all the
studied groups except the intact animals (group 1)
which were observed to have a background level of
enzyme (Fig. 2, A).
Отмеченный факт гибели клеток может быть
результатом активации апоптотических процессов
и реализоваться через модулирование внутрикле-
точных сигналов при участии внутриклеточных
белков-каспаз. Классическим показателем индук-
ции апоптоза является активация каспазы 3 [8],
сопровождающаяся появлением продукта ее
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
255
каталитической активности – бел-
ка р17. Как следует из полученных
результатов, белок р17 присутст-
вовал в лизатах клеток МФС всех
исследуемых групп животных,
кроме интактных (группа 1), у ко-
торых наблюдался фоновый уро-
вень фермента (рис. 2, А).
Для количественной оценки ка-
талитической активности каспа-
зы 3 в разных экспериментальных
группах был использован DEVD-
AMC флуорогенный метод. Наибо-
лее выраженная активность фер-
мента (рис. 3) наблюдалась в груп-
пах животных, которым вводили
ДК, с максимальным показателем
в группе 7 (через 2 недели после
введения ДК – на 7-е сутки разви-
тия АА). Высокий уровень актив-
ности каспазы 3 также был отме-
чен в группах животных, которым
вводили кКФП. При этом макси-
мальный результат, сравнимый по
эффективности с ДК, наблюдался
через неделю после введения
кКФП на 7-е сутки развития АА
(группа 10, С).
We used fluorogenic method
DEVD-AMC to evaluate caspase 3
activity in different experimental groups.
The most pronounced enzyme activity
(Fig. 3) was observed in the groups of
animals which were administered DX
with maximum index in group 7 (in 2
weeks after DX administration – to the
7th day of AA development). High level
of caspase 3 activity was also noted in
groups of animals which were adminis-
tered cFLCs. Furthermore, the maxi-
mum result compared to DX by the effi-
cacy was revealed in one week after
cFLCs administration to the 7th day of
AA development (group 10, C).
A positive effect after cFLCs admi-
nistration to the 7th day of pathology de-
velopment was kept during two weeks.
Administration of cFLCs to the 14th day
of AA (group 12, C) led to less acti-
vation of caspase 3 although this index
exceeded that in group of animals not
treated with preparations (groups 4
and 5, A). It is worth noting that nFLCs
Рис. 2. Экспрессия протеинов каскада CD95 в клетках моноцитарно-
фагоцитарной системы у животных на разных стадиях развития адъю-
вантного артрита и после введения КФП: int – интактные; A – без введе-
ния препаратов; B – введение дексаметазона; C – введение кKФП; D –
введение нKФП. Вестерн-блот анализ против CD95, каспазы 3(С3), FLIP,
каспазы 8 (C8) был проведен на лизатах клеток МФС (р17 – продукт
протеолиза каспазы 3; р18 – продукт протеолиза каспазы 8). Вестерн-
блот анализ против актина был проведен в качестве контроля количест-
ва общего белка в образце. Нумерация групп животных соответствует
приведенной в таблице.
Fig. 2. Expression of CD95 cascade proteins in MPS cells in animals at
different stages of adjuvant arthritis and after administration of FLCs: int –
intact; A –without administration of preparations; B – administration of dex-
amethasone; C – administration of cFLCs; D –administration of nFLCs.
Western blot analysis of CD95, caspase 3(C3), FLIP, caspase 8 (C8) was
performed in MPS cell lysates (p17 – product of caspase 3 proteolysis;
p18 – product of caspase 8 proteolysis). Western blot analysis of actin was
performed to control the amount of total protein in the sample. Enumeration
of animal groups corresponds to the one presented in the Table.
int
Рис. 3. Активность каспазы 3 в лизатах клеток моноцитарно-
фагоцитарной системы у животных на разных стадиях развития
адъювантного артрита и после введения КФП: int – интактные; A –
без введения препаратов; B – введение дексаметазона; C – введение
кKФП; D – введение нKФП. Нумерация изучаемых групп животных
соответствует группам в таблице. * – значимые различия з группой
животных без введения препаратов; # – между группами животных,
которым вводили кКФП и нКФП; р < 0,05.
Fig. 3. Caspase 3 activity in MPS cell lysates of animals at different
stages of adjuvant arthritis and after administration of FLCs: int – intact;
A –without administration of preparations; B – administration of
dexamethasone; C – administration of cFLCs; D –administration of
nFLCs. Enumeration of animal groups corresponds to the one presented
in the Table. * – significant changes if compared with groups of animals
not administered with any preparations; # – between groups of animals
administered with cFLCs and nFLCs; p < 0.05.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Группы животных Groups of animals
Ак
ти
вн
ос
ть
к
ас
па
зы
-3
,
О
ЕФ
/м
г
бе
лк
а
C
as
pa
se
3
a
ct
iv
ity
, R
FU
/m
g
of
p
ro
te
in
А B C Dint
*
*
** *
* * *
#
# #
# #
#
256 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
Положительный эффект после введения кКФП
на 7-е сутки развития патологии сохранялся на
протяжении двух недель. Введение кКФП на 14-е
сутки АА (группа 12, С) приводило к меньшей
активации каспазы 3, хотя этот показатель пре-
вышал таковой в группе животных без введения
препаратов (группы 4 и 5, А). Важно отметить, что
нКФП имели примерно одинаковый эффект не
зависимо от срока введения, и он существенно
уступал эффекту в случае введения криоконсер-
вированных клеток. Более высокие, по сравнению
с животными с АА без введения препаратов, пока-
затели активности каспазы 3 в группах животных,
получавших КФП, могут быть обусловлены акти-
вацией «рецепторов летальности», играющих веду-
щую роль в стимуляции программированной
клеточной гибели, например CD 95-рецептора –
представителя семейства фактора некроза опухоли
(ФНО) [5].
Известно, что в отличие от нейтрофилов макро-
фаги устойчивы к CD95/CD95L-опосредованному
апоптозу [23]. Данный феномен связывают с повы-
шенной (обычно при патологических состояниях)
внутриклеточной экспрессией ингибитора апоптоза
с-FLIP (caspase 8 homologue FLICE-inhibitory
protein). Он действует как «молекула-переключа-
тель», смещая активность Fas-сигнала в сторону
пролиферации [12].
На рис. 2 видно, что клетки МФС во всех иссле-
дуемых группах имели высокий и примерно одина-
ковый уровень экспрессии CD95-структуры, что
свидетельствует об их готовности к апоптозу. Так-
же установлена высокая экспрессия FLIP у живот-
ных с АА, что в свою очередь соответствовало
самому низкому проценту погибших клеток. У ле-
ченых ДК животных также был отмечен высокий
уровень экспрессии FLIP. Важно, что уровень экс-
прессии этого протеина после введения животным
КФП был значительно ниже. Данный факт позво-
ляет говорить о том, что вводимые КФП, возможно,
обладают более широким спектром как про- так и
антиапоптотической активности относительно
клеток МФС реципиентов с АА. Нами было пока-
зано, что такого рода активность характерна имен-
но для КФП, поскольку после применения ДК по-
добного эффекта не наблюдалось (см. рис. 2, В).
Способность КФП продуцировать те или иные
регуляторные медиаторы при лечении РА является
многоплановой и определяется выраженностью
иммуновоспалительного процесса в организме [1].
Как отмечалось выше, имея a priori разный исход-
ный статус перед введением реципиенту, нативные
и криоконсервированные КФП могут по-разному
«отвечать» на сложившуюся на данный момент в
организме ситуацию [3]. Подтверждением этому
had virtually the same effect not depending on the
period of administration, and it was significantly inferior
to the effect in case of cryopreserved cells administ-
ration. Higher indices of caspase 3 activity in groups
of the animals treated with FLCs as compared to the
animals with AA not administered any preparation can
be caused by the activation of ‘lethality receptors’,
playing a leading role in the stimulation of programmed
cell death, such as CD-95 receptor, a representative
of the family of tumor necrosis factor (TNF) [14].
It is known that in contrast to neutrophils, macro-
phages are resistant to CD95/CD95L-mediated apop-
tosis [21]. This phenomenon is associated with an in-
creased (usually under pathological conditions) intra-
cellular expression of apoptosis inhibitor c-FLIP
(caspase 8 homologue FLICE-inhibitory protein). It
functions as a ‘switching molecule’ displacing the acti-
vity of Fas-signal towards proliferation [2].
Fig. 2 shows that the MPS cells in all experimental
groups had high and nearly the same level of CD95
structure expression, which indicated their readiness
to apoptosis. We also found high expression of FLIP
in the animals with AA, which in turn corresponded to
the lowest percentage of dead cells. In DX-treated
animals we also noted a high level of FLIP expression.
It is important that the expression level of this protein
after administration of FLCs into animals was consi-
derably lower. This fact suggests that the administered
FLCs may have wider spectrum of both pro- and
antiapoptotic activity in relation to the MPS cells of
the recipients with AA. We have shown that this kind
of activity is typical for FLCs, since after applying DX
this effect was not observed (see Fig. 2, B). The ability
of FLCs to produce any regulatory mediators during
treatment of RA is multidimensional and it is determi-
ned by the severity of immunoinflammatory process
in a body [7]. As mentioned above, native and cryo-
preserved FLCs a priori having different initial status
prior to administration into a recipient may ‘response’
in different ways to the current situation in an organism
[8]. This is proved by the established fact of FLIP
production reduction. As is known, FLIP in the apop-
totic cascade may be either an inhibitor or inducer of
apoptosis interacting directly with the CD95 ligand
through its ‘death domain’ and competing with pro-
caspase 8 for the binding [2]. Therefore, it was of in-
terest to assess the activity of caspase 8, one of the
main caspases initiating apoptosis.
The analysis of the caspase 8 activation (see Fig. 2)
by proteolysis products allowed establishing the
tendency of its increase after FLCs administration. We
did not manage to reveal the difference in the amount
of p18 as compared to the intact control and other ex-
perimental groups. In order to establish more subtle
differences in the content of this protein we used
0
500
1000
1500
2000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
257
активация каспазы 8 была отмечена после введе-
ния кКФП на 7 и 14-е сутки развития АА. При этом
максимальная активность каспазы 8 в обоих случа-
ях наблюдалась через 2 недели после введения
клеток (рис. 4, С).
Подобные изменения наблюдали и после введе-
ния нКФП (рис. 4, D), но активность каспазы 8 была
более чем в 2 раза меньше, чем у животных в груп-
пе с введением кКФП и не превышала показатели
контроля через неделю после введения нКФП на 7
и 14-е сутки развития АА (группы 14 и 16).
Очевидно, что различия в проявлении как про-,
так и антиапоптотической активности кКФП в
отношении клеток МФС по сравнению с нКФП
могут быть обусловлены следующими причинами.
Во-первых перераспределением после криоконсер-
вирования популяционного состава в суспензии
КФП [4]. Ранее установлено, что некоторые режи-
мы замораживания-отогрева способны селективно
влиять на клетки гемопоэтических тканей, повы-
шая содержание в них стволовых элементов [4, 10].
Этим объясняют, например, изменение иммуно-
реактивности криоконсервированного материала по
сравнению с нативным [15], его способности взаи-
модействовать с различными системами организ-
method of determining the catalytic activity of caspase
8, which consists in measuring the amount of product
of proteolytic cleavage of fluorogenic substrate. There
were established the significant differences in indices
between the groups. Thus, the most pronounced acti-
vation of caspase 8 was noted after FLCs administra-
tion to the 7th and 14th days of AA. Moreover the
maximum caspase 8 activity in both cases was obser-
ved in 2 weeks after cell administration (Fig. 4, C).
Similar changes were observed after administration
of nFLCs (Fig. 4, D), but the caspase 8 activity by
more than two times was lower than that of the group
with administration of cFLCs and did not exceed the
control values one week later administration of nFLCs
to the 7th and 14th days of AA (groups 14 and 16).
Apparently, the differences in manifestation of both
pro- and antiapoptotic activity of cFLCs in relation to
MPS cells as compared to nFLCs may be stipulated
by the following reasons. Firstly, this is the redistribution
of population content in FLC suspension after cryo-
preservation [9]. Previously we have found that cer-
tain regimens of freeze-thawing can selectively affect
the cells of hematopoietic tissues, increasing the content
of stem elements in them [9, 25]. This is explained, for
instance, by the change in immunoreactivity of
Рис. 4. Активность каспазы 8 в лизатах клеток моноцитарно-
фагоцитарной системы у животных на разных стадиях развития
адъювантного артрита и после введения КФП: int – интактные; A –
без введения препаратов; B – введение дексаметазона; C – введение
кKФП; D – введение нKФП. Нумерация изучаемых групп животных
соответствует группам в таблице. * – значимые различия с группой
животных без введения препаратов; # – между группами животных,
которым вводили кКФП и нКФП; р < 0,05.
Fig. 4. Caspase 8 activity in MPS cell lysates of animals at different
stages of adjuvant arthritis and after administration of FLCs: int – intact;
A –without administration of preparations; B – administration of
dexamethasone; C – administration of cFLCs; D –administration of
nFLCs. Enumeration of animal groups corresponds to the one presented
in the Table. * – significant changes if compared with groups of animals
not administered with any preparations; # – between groups of animals
administered with cFLCs and nFLCs; p < 0.05.
Группы животных Groups of animals
Ак
ти
вн
ос
ть
к
ас
па
зы
-8
,
О
ЕФ
/м
г
бе
лк
а
C
as
pa
se
8
a
ct
iv
ity
, R
FU
/m
g
of
p
ro
te
in
является установленный нами факт
уменьшения продукции FLIP. Как
известно, FLIP в апоптотическом
каскаде может быть как ингибито-
ром, так и индуктором апоптоза,
взаимодействуя напрямую с CD95
лигандом через свой «домен смер-
ти» и конкурируя с прокаспазой 8 за
связывание [12]. Поэтому представ-
ляло интерес провести оценку актив-
ности каспазы 8 – одной из основных
каспаз, инициирующих апоптоз.
Проведенный анализ активации
каспазы 8 (см. рис. 2) по продуктам
протеолиза позволил установить тен-
денцию ее повышения после введе-
ния кКФП. Разницу в количестве p18
по сравнению с интактным контро-
лем и другими экспериментальными
группами обнаружить не удалось.
С целью установления более тонких
различий содержания данного белка
был использован метод определения
каталитической активности каспа-
зы 8, заключающийся в измерении
количества продукта протеолитичес-
кого расщепления флуорогенного
субстрата. Были установлены значи-
мые межгрупповые различия показа-
телей. Так, наиболее выраженная
А B C Dint
*
*
*
*
*
#
#
#
#
#
#
*
#
#
258 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
ма. Во-вторых, КФП продуцируют в высокой кон-
центрации такие медиаторы, как α-фетопротеин,
ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ-10, которые при определенных
условиях способны оказывать проапоптотическое
действие на клетки МФС [9, 13, 14, 20]. Например,
апоптогенное действие ФНО-α, играющего клю-
чевую роль в патогенезе ряда воспалительных за-
болеваний аутоиммунного генеза, в том числе РА,
ассоциируют с активацией каскада каспаз. При
связывании ФНО-α со своим рецептором на по-
верхности клетки формируется внутриклеточный
комплекс «домена смерти» и каспазы 8, в резуль-
тате активации которого происходит запуск всего
протеолитического каскада. Однако этот медиатор
нельзя рассматривать как безусловный индуктор
клеточной гибели, поскольку имеются данные о
его антиапоптозном эффекте, который связан с
перманентной продукцией короткоживущих ингиби-
торов апоптоза, в частности с активацией одного
из ключевых факторов транскрипции – NF-kB.
Известно, что антиапоптотические эффекты харак-
терны для цитокинов воспалительного пула в
физиологических концентрациях, тогда как их вы-
сокие концентрации вызывают обратную реакцию
[5].
Очевидно, что в процессе криоконсервирования
в КФП, как и в других биообъектах, могут прохо-
дить качественные изменения. На примере моно-
нуклеаров периферической крови продемонстри-
ровано значительное увеличение продукции таких
цитокинов, как ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ-10 после хо-
лодового воздействия [25]. Не исключено, что
криоконсервирование, как стрессиндуцирующий
фактор, способно изменять и профиль продуцируе-
мых КФП медиаторов, что может отражаться на
их терапевтическом потенциале [15, 16]. В-третьих,
нельзя недооценивать возможность факторов
криоконсервирования влиять на уровень экспрессии
определенных генов в КФП, кодирующих синтез
регуляторных медиаторов, активаторов/ингибито-
ров апоптотических каскадов. В данном случае
речь может идти как об особенностях «акцептор-
ных» взаимодействий медиатор (лиганд) с мише-
нями (рецепторами) в системе донорский материал/
организм реципиента, так и о дозозависимом прояв-
лении эффекта этими медиаторами. Можно пола-
гать, что продуцируемые КФП медиаторы находят
свои альтернативные пути активации апоптоти-
ческих каскадов, отличающихся от таковых у
классических индукторов апоптоза – глюкокорти-
коидов. Так, в наших экспериментах, во всех
исследуемых группах животных после применения
ДК была отмечена активация каспазы 3, тогда как
для каспазы 8 данный факт не был установлен.
Кроме того, под действием КФП повышалась
cryopreserved material compared to the native one
[18], its ability to interact with different systems of an
organism. Secondly, FLCs in high concentrations
produce mediators such as α-fetoprotein, TNF-α ,
IFN-γ, IL-10, which under certain conditions can have
proapoptotic effect on MPS cells [3, 4, 5, 18]. For
example, the apoptogenic effect of TNF-α, which
plays a key role in pathogenesis of several inflamma-
tory diseases of autoimmune origin, including RA, is
associated with the activation of the caspase cascade.
Upon binding of TNF-α to its receptor on the cell sur-
face is formed an intracellular complex ‘death domain’
and the caspase 8, its activation results in the trigger
of the entire proteolytic cascade. However, this media-
tor should not be considered as an unconditional inducer
of cell death, since there is evidence on its antiapoptotic
effect that is associated with a permanent production
of short-living apoptosis inhibitors, particularly with the
activation of a key transcription factor NF-kB. It is
known that antiapoptotic effects are characteristic for
cytokines of inflammatory pool at physiological con-
centrations, whereas their high concentrations cause
reverse response [13].
Obviously, in the process of cryopreservation the
qualitative changes may occur in FLCs as well as in
other biological objects. In the example of peripheral
blood mononuclear cells we demonstrated a significant
rise of cytokine production such as TNF-α, IFN-γ, IL-
10 after cold exposure [24]. It is possible that cryopre-
servation as a stress-inducing factor is also capable to
change the profile of FLC-produced mediators, which
can affect their therapeutic potential [11, 12]. Thirdly,
one should not underestimate the possibility of cryopre-
servation factors to influence the level of expression
of certain genes in FLCs coding the synthesis of
regulatory mediators, activators/inhibitors of apoptotic
cascades. In this case, we can talk about the features
of ‘acceptor’ interactions between mediators (ligands)
and targets (receptors) within the system donor ma-
terial/recipient organism as well as the dose-dependent
manifestation of the effect by these mediators. We
can assume that the mediators produced by FLCs find
their alternative ways of apoptotic cascades activation
that differ from those of classical apoptosis inducers,
glucocorticoids. Thus, in our experiments in all the
groups of animals after application of DX we observed
the activation of caspase 3, whereas in caspase 8 the
one was not established. At the same time, under the
effect of FLCs the caspase 3 and 8 activities increased.
These data suggest that in FLCs there is a specific
‘protein profile’ determining a unique phenomenology
of their behavior in animals with AA.
Of particular relevance are the results attesting the
presence of more pronounced proapoptotic effect in
cFLCs when administering into animals, escaping an
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
259
активность каспазы 3 и 8. Эти данные позволяют
говорить о наличии у КФП специфического «про-
теинового профиля», который обусловливает
уникальную феноменологию их поведения у
животных с АА.
Особую значимость имеют результаты, свиде-
тельствующие о проявлении более выраженного
проапоптотического эффекта кКФП при их введе-
нии животным, минуя острую фазу развития пато-
логии (на 7-е сутки АА). Ранее было показано, что
активность биологических веществ, присутст-
вующих в продуктах эмбриофетоплацентарного
комплекса, может проявляться в различной степе-
ни, в зависимости от характера антигенной нагруз-
ки на иммунную систему реципиента в конкретный
период развития заболевания [1]. Наши данные
подтверждают этот тезис, поскольку терапевти-
ческий эффект КФП зависел не только от их качест-
венных характеристик, но и срока введения клеток.
Так, при введении кКФП на 7-е сутки развития АА
мы наблюдали активацию обеих каспаз, в то время
как эффект после введение нКФП в данный период
развития патологии существенно уступал криокон-
сервированным клеткам. Очевидно, что проявле-
ние разной степени активности КФП определяется
фазой развития иммуновоспалительной реакции,
которая на 7-е сутки имеет более благоприятный
профиль для коррекции состояния МФС. Таким
образом, полученные результаты являются экспе-
риментальным обоснованием возможности ис-
пользования КФП в качестве потенциальных пре-
паратов при лечении АА – экспериментального
аналога РА человека с обязательным учетом схем
их применения в клинике.
Выводы
Установлено снижение апоптотической актив-
ности в клетках МФС на фоне активации антиапоп-
тотического каскада у животных с АА, что подтвер-
ждается высоким уровнем экспрессии ингибитора
апоптоза – FLIP. Продемонстрирована способность
нативных и криоконсервированных КФП проявлять
проапоптотическую активность относительно кле-
ток МФС при развитии АА у животных. Установ-
лена зависимость терапевтического эффекта КФП
от вида и срока введения клеток. Более выражен-
ный проапоптотический эффект наблюдался после
введения кКФП на 7-е сутки развития АА, что
сопровождалось максимальной активацией белков
CD95 каскада.
Проведенные исследования являются актуаль-
ными с точки зрения повышения эффективности
методов лечения патологий аутоиммунного генеза,
в основе которых лежат нарушения процессов
апоптоза.
acute phase of disease (to the day 7 of AA). Previously
it has been shown that the activity of biological substan-
ces present in the products of embryofetoplacental
complex may be manifested in various degrees, depen-
ding on the character of an antigenic load on the reci-
pient’s immune system in a specific period of the disea-
se [7]. Our findings prove this thesis, as long as the
therapeutic effect of FLCs depended not only on their
qualitative characteristics, but also on the period of
cells administration. Thus, when administering the
cFLCs to the 7th day of AA, we observed activation
of both caspases, while the effect after the nFLCs ad-
ministration in this period of pathology was significantly
inferior to the cryopreserved cells. It is obvious that
the expression of different activity in FLCs is deter-
mined by the phase of immunoinflammatory reaction
development which to the 7th day has more favorable
profile for the correction of MPS state. Thus, the re-
sults obtained are experimental basis for the possibility
of using FLCs as potential preparations for the treat-
ment of AA, experimental counterpart of human RA,
with the obligatory consideration of schemes of their
application in the clinic.
Conclusions
We established the reduction of apoptotic activity
in the MPS cells on the background of activation of
antiapoptotic cascade in the animals with AA, as
evidenced by a high level of expression of FLIP, the
inhibitor of apoptosis. We have demonstrated the abi-
lity of native and cryopreserved FLCs to manifest pro-
apoptotic activity as regard to MPS cells during the
development of AA in animals. The dependence of
FLCs therapeutic effect on the type and period of cell
administration was established. More pronounced
proapoptotic effect was observed after administration
of cFLCs to the 7th day of AA, which was accompa-
nied by the maximum activation of CD95 cascade
protein.
The studies are relevant in terms of increase in
treatment efficiency of pathologies of autoimmune
genesis, which are based on a disordered apoptosis.
References
1. Bendele A.M. Animal models of rheumatoid arthrit is.
J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4): 377–385.
2. Catrina A.I., Ulfgren A.K., Lindblad S. et al. Low levels of
apoptosis and high FLIP expression in early rheumatoid arthritis
synovium. Ann Rheum Dis 2002; 61: 934–936.
3. Chereshnev V.A., Rodionov S.Yu., Cherkasov V.A. et al. Alpha-
fetoprotein. Ekaterinburg: Uro RAN; 2004.
4. Dubich E., Semenkova L., Dubich I. et al. Fetoprotein causes
apoptosis in tumor cells via a pathway independent of CD 95,
TNFR1 and TNFR2 through activation of caspase-3-like
proteases. Eur J Biochem 1999; 266(3): 750–761.
260 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
Литература
1. Гольцев А.М., Бабенко Н.М., Останкова Л.В. и др. Засто-
сування кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацен-
тарного комплексу як коректорів аутоімунних захворю-
вань на моделі експериментального алергійного енцефа-
ломієліту (ЕАЕ) // Трансплантологія. – 2003. – Т. 4, №1. –
С. 207–209.
2. Гольцев А.Н., Грищенко В.И., Рассоха И.В. и др. Возмож-
ность использования продуктов эмбриофетоплацен-
тарного комплекса как корректора апоптотических про-
цессов при аутоиммунных заболеваниях // Проблемы
криобиологии. – 2003. – №4. – С. 41–48.
3. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г, Гаевская Ю.А. и др. Криобио-
логические технологии как компонент оптимизированных
методов лечения аутоиммунных заболеваний // Клінічна
імунологія. Алергологія. Інфектологія. – 2009. – №1–2. –
С. 46–51.
4. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В. и др. Осо-
бенности влияния криоконсервирования на функцио-
нальный потенциал стволовых кроветворных клеток
фетальной печени разных сроков гестации // Проблемы
криобиологии. – 2009. – Т. 19, №2. – С. 186–199.
5. Гольцев А.Н., Ямпольская Е.Е. Апоптоз клеток моноци-
тарно-фагоцитарной системы и механизмы его регуля-
ции // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, №4. – С. 408–
419.
6. Коваленко В.М. Ревматичні захворювання: сучасні тен-
денції фармакотерапії // Укр. ревматол. журн. – 2009. –
Т. 3, №37. – С. 511.
7. Сухих Г.Т., Богданова И.М., Малайцев В.В., Фисенко А.П.
Перспективы использования фетальных стволовых/про-
гениторных клеток человека в клеточной терапии // Бюл.
эксперим. биологии и медицины. – 1998. – Т. 126. – С. 178–
181.
8. Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других
клеточных функций // Биохимия. – 2003. – Т. 68, Вып.4. –
С. 453–466.
9. Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Черкасов В.А. и др. Альфа-
фетопротеин. – Екатеринбург: Уро РАН, 2004. – 376 с.
10.Ямпольская Е.Е., Гольцев А.Н., Гурина Т.М. Изменение
функционального потенциала клеток фетальной печени
в зависимости от режима криоконсервирования // Світ
медицини та біології. – 2007. – №1. – С. 89–93.
11.Bendele A.M. Animal models of rheumatoid arthritis // J. Mus-
culoskel. Neuron. Interact. – 2001. – Vol. 1, №4. – P. 377–385.
12.Catrina A.I., Ulfgren A.K., Lindblad S. et al. Low levels of
apoptosis and high FLIP expression in early rheumatoid arthritis
synovium // Ann. Rheum. Dis. – 2002. – №61. – P. 934–936.
13.Dubich E., Semenkova L., Dubich I. et al. Fetoprotein causes
apoptosis in tumor cells via a pathway independent of CD 95,
TNFR1 and TNFR2 through activation of caspase-3-like
proteases // Eur. J. Biochem. – 1999. – Vol. 266, №3. – P. 750–
761.
14.Estaquier J., Ameisen J.C. A role for T-helper type 1 and type
2 cytokines in the regulation of human monocyte apoptosis //
Blood. – 1997. – Vol. 90, №4. – P. 1618–1625.
15.Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-
vation: an optimizing factor for therapeutic potential of feto-
placental complex products // Biopreservation and Biobank-
ing. – 2009. – Vol. 7, №1. – P. 29–38.
16.Goltsev A.N., Lutsenko E.D., Dimitrov A.Yu. et al. Peculiarities
of functional state modulation of genetic apparatus of fetal
liver cells with stemness characteristics after cryopreser-
vation // CryoLetters. – 2011. – Vol. 32, №6. – P. 543–544.
17. Huang Q., Ma Y., Adebayo A., Pope R.M. Increased macro-
phage activation mediated through toll–like receptors in
rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. – 2007. – Vol. 56, №7. –
P. 2192–2201.
18. Kinne R.W., Stuhlmller B., Palombo-Inne E. et al. The role of
macrophages in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In:
5.Estaquier J., Ameisen J.C. A role for T-helper type 1 and type 2
cytokines in the regulation of human monocyte apoptosis.
Blood 1997; 90(4): 1618–1625.
6.Fil'chenkov A.A. Caspases: regulators of apoptosis and other
cell functions. Biochemistry 2003; 68(4): 453–466.
7.Goltsev A.M., Babenko N.M., Ostankova L.V. Use of embryo-
fetoplacental complex products as correctors of autoimmune
diseases in experimental model of allergic encephalomyelitis.
Transplantologiya 2003; 4(1): 207–209.
8.Goltsev A.N., Dubrava T.G., Gayevskaya Yu.A. et al. Cryobio-
logical technologies as a component of optimized methods in
therapy of autoimmune diseases. Klin Imunol Alergol Infektol
2009; 1–2: 46–51.
9.Goltsev A.N., Dubrava T.G., Ostankova L.V. et al. Peculiarities
of cryopreservation effect on functional potential of fetal liver
hemopoietic stem cells of various gestation terms. Problems
of Cryobiology 2009; 19(2): 186–199.
10.Goltsev A.N., Grischenko V.I., Rassokha I.V., Ostankov M.V.
Possibility of using the embryo fetoplacental complex products
to correct apoptotic processes under autoimmune disease.
Problems of Cryobiology 2003; 4: 41–48.
11.Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-
vation: an optimizing factor for therapeutic potential of feto-
placental complex products. Biopreservation and Biobanking
2009; 7(1): 29–38.
12.Goltsev A.N., Lutsenko E.D., Dimitrov A.Yu. et al. Peculiarities
of functional state modulation of genetic apparatus of fetal
liver cells with stemness characteristics after cryopreser-
vation. CryoLetters 2011; 32(6): 543–544.
13.Goltsev A.N., Yampolskaya E.E. Cell apoptosis of monocyte-
phagocyte system and mechanisms for its regulation. Problems
of Cryobiology 2006; 16(4): 408–419.
14.Huang Q., Ma Y., Adebayo A., Pope R.M. Increased macro-
phage activation mediated through toll-like receptors in
rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2007; 56(7): 2192–2201.
15.Kinne R.W., Stuhlmller B., Palombo-Inne E. et al. The role of
macrophages in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In:
rheumatoid arthritis: the new frontiers in pathogenesis and
treatment. Oxford University Press; 2000: p. 69–87.
16.Kovalenko V.M. Rheumatic diseases: modern trends in pharma-
cotherapy. Ukr Revmatol Zhurn 2009; 3 (37): 511.
17. Linehan S.A. The mannose receptor is expressed by subsets
of APC in non-lymphoid organs. BMC Immunol 2005; 6: 1471–
1477.
18.Mangan D.F., Robertson B., Wahl S.M. IL-4 enhances program-
med cell death (apoptosis) in stimulated human monocytes.
J Immunol 1992; 148(6): 1812–1816.
19.Maniati E., Potter P., Rogers N.J., Morley B.J. Control of apop-
tosis in Autoimmunity. J Pathology 2008; 214: 190–198.
20.Nagata S., Hanayama R., Kawane K. Autoimmunity and the
clearance of dead cells. Cell 2010; 140: 619–630.
21.Pope R.M. Apoptosis as a therapeutic tool in rheumatoid arthritis.
Nature Reviews Immunology 2002; 2(7): 1–9.
22.Riccardi C., Nicoletti I. Analysis of apoptosis by propidium iodide
staining and flow cytometry. Nature Protocols 2006; 1: 1458–
1461.
23.Sukhikh G.T., Bogdanova I.M., Malaytsev V.V., Fisenko A.P.
Prospectives of using human fetal stem/progenitor cells in cell
therapy. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 1998;
126: 178–181.
24.Venkatarman M. Effect of cryopreservation on immune respon-
ses. VIII. Enhanced secretion of interferon-gamma by frozen
human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology 1995;
32: 528–534.
25.Yampolskaya K.Ye., Goltsev A.N., Gurina T.M. Change in func-
tional potential of fetal liver cells dependent from cryopreser-
vation regimen. Svit of Medicine and Biology 2007. 1: 89–93.
26.Zhang X., Goncalves R., Mosser D.M. The Isolation and
Characterization of Murine Macrophages. Curr Protoc Immunol;
2008; Chapter: Unit–14.1.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 24, №/issue 3, 2014
261
rheumatoid arthritis: the new frontiers in pathogenesis and
treatment / Ed. by Wollheim F., Firestein G.S., Panayi G.S.
Oxford University Press. – 2000. – P. 69–87.
19. Linehan S.A. The mannose receptor is expressed by subsets
of APC in non–lymphoid organs// BMC Immunol. – 2005. –
Vol. 6. – P. 1471–1477.
20. Mangan D.F., Robertson B., Wahl S.M. IL–4 enhances
programmed cell death (apoptosis) in stimulated human
monocytes // J. Immunol. – 1992. – Vol. 148, №6. – P. 1812–
1816.
21. Maniati E., Potter P., Rogers N.J., Morley B.J. Control of
apoptosis in Autoimmunity // J. Pathology. – 2008. – Vol. 214. –
P. 190–198.
22. Nagata S., Hanayama R., Kawane K. Autoimmunity and the
clearance of dead cells // Cell. – 2010. – №140. – P. 619–630.
23. Pope R.M. Apoptosis as a therapeutic tool in rheumatoid
arthritis // Nature Reviews Immunology. – 2002. – Vol. 2, №7. –
P. 1–9.
24. Riccardi C., Nicoletti I. Analysis of apoptosis by propidium
iodide staining and flow cytometry // Nature Protocols. – 2006. –
№1. – P. 1458–1461.
25. Venkatarman M. Effect of cryopreservation on immune
responses. VIII. Enhanced secretion of interferon-gamma by
frozen human peripheral blood mononuclear cells //
Cryobiology. – 1995. – Vol. 32. – P. 528–534.
26. Zhang X., Goncalves R., Mosser D.M. The Isolation and
Characterization of Murine Macrophages // Curr. Protoc.
Immunol. – 2008., Chapter: Unit–14.1.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68840 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:40:07Z |
| publishDate | 2014 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Гольцев, А.Н. Ямпольская, Е.Е. Останков, М.В. Бондарович, Н.А. 2014-09-30T06:34:52Z 2014-09-30T06:34:52Z 2014 Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени / А.Н. Гольцев, Е.Е. Ямпольская, М.В. Останков, Н.А. Бондарович // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2014. — Т. 24, № 3. — С. 249-261. — Бібліогр.: 26 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68840 576.367:612.35.014.2-053.1:616.72-002.77 Ревматоидный артрит (РА) является одним из самых распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов с многофакторной этиологией. Существенным моментом при РА является нарушения реализации в иммунокомпетентных клетках, в том числе и клетках моноцитарно-фагоцитарной системы (МФС), процессов пролиферации и апоптоза. Одной из составляющих стратегии ограничения чрезмерного воспалительного ответа при РА может быть активация апоптоза в клетках МФС. На модели адъювантного артрита (АА) животных проведена сравнительная оценка развития апоптотических процессов в клетках МФС до и после введения нативных и криоконсервированных клеток фетальной печени (кКФП). С помощью вестерн-блот анализа показаны особенности экспрессии протеинов CD95-каскада в клетках МФС в условиях развития АА. Установлен более выраженный проапоптотический эффект после введения кКФП, степень проявление которого зависела от срока их введения. Ревматоїдний артрит (РА) є одним із найпоширеніших хронічних запальних захворювань суглобів із багатофакторною етіологією. Суттєвим моментом при РА є порушення реалізації в імунокомпетентних клітинах, у тому числі й клітинах моноцитарно-фагоцитарної системи (МФС), процесів проліферації та апоптозу. Однією зі складових стратегії обмеження надмірної запальної відповіді при РА може бути активація апоптозу у клітинах МФС. На моделі ад’ювантного артриту (АА) тварин проведено порівняльну оцінку розвитку апоптотичних процесів у клітинах МФС до та після введення нативних і кріоконсервованих клітин фетальної печінки (кКФП). За допомогою вестерн-блот аналізу показано особливості експресії протеїнів CD95-каскаду в клітинах МФС в умовах прогресу АА. Встановлено більш виражений проапоптотичний ефект після введення кКФП, ступінь прояву якого залежала від строку їх введення. Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most widespread chronic inflammatory diseases of the joints with multifactor etiology. A crucial point in RA is the disorder of proliferation and apoptosis in immunocompetent cells as well as in the cells of monocyte-phagocyte system (MPS). Using the model of adjuvant arthritis (AA) in animals we comparatively assessed the development of apoptotic processes in MPS cells before and after administration of native and cryopreserved fetal liver cells (cFLCs). By means of Western blot analysis we showed the peculiarities of CD-95 cascade proteins expression in MPS cells during development of AA. After administration of cFLCs we found more pronounced proapoptotic effect, which degree depended on the period of their administration. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени Study of Apoptotic Processes in Cells of Monocyte-Phagocyte System During Development of Adjuvant Arthritis Prior to and After Administration of Fetal Liver Cells Article published earlier |
| spellingShingle | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени Гольцев, А.Н. Ямпольская, Е.Е. Останков, М.В. Бондарович, Н.А. Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| title | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени |
| title_alt | Study of Apoptotic Processes in Cells of Monocyte-Phagocyte System During Development of Adjuvant Arthritis Prior to and After Administration of Fetal Liver Cells |
| title_full | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени |
| title_fullStr | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени |
| title_full_unstemmed | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени |
| title_short | Исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени |
| title_sort | исследование апоптотических процессов в клетках моноцитарно-фагоцитарной системы при развитии адъювантного артрита до и после введения криоконсервированных клеток фетальной печени |
| topic | Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| topic_facet | Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68840 |
| work_keys_str_mv | AT golʹcevan issledovanieapoptotičeskihprocessovvkletkahmonocitarnofagocitarnoisistemyprirazvitiiadʺûvantnogoartritadoiposlevvedeniâkriokonservirovannyhkletokfetalʹnoipečeni AT âmpolʹskaâee issledovanieapoptotičeskihprocessovvkletkahmonocitarnofagocitarnoisistemyprirazvitiiadʺûvantnogoartritadoiposlevvedeniâkriokonservirovannyhkletokfetalʹnoipečeni AT ostankovmv issledovanieapoptotičeskihprocessovvkletkahmonocitarnofagocitarnoisistemyprirazvitiiadʺûvantnogoartritadoiposlevvedeniâkriokonservirovannyhkletokfetalʹnoipečeni AT bondarovična issledovanieapoptotičeskihprocessovvkletkahmonocitarnofagocitarnoisistemyprirazvitiiadʺûvantnogoartritadoiposlevvedeniâkriokonservirovannyhkletokfetalʹnoipečeni AT golʹcevan studyofapoptoticprocessesincellsofmonocytephagocytesystemduringdevelopmentofadjuvantarthritispriortoandafteradministrationoffetallivercells AT âmpolʹskaâee studyofapoptoticprocessesincellsofmonocytephagocytesystemduringdevelopmentofadjuvantarthritispriortoandafteradministrationoffetallivercells AT ostankovmv studyofapoptoticprocessesincellsofmonocytephagocytesystemduringdevelopmentofadjuvantarthritispriortoandafteradministrationoffetallivercells AT bondarovična studyofapoptoticprocessesincellsofmonocytephagocytesystemduringdevelopmentofadjuvantarthritispriortoandafteradministrationoffetallivercells |