Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ
Показана возможность адаптации перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) к росту на среде 199 в присутствии 0,1% метилцеллюлозы (МЦ) со снижением содержания сыворотки до 1%. Отмечены криопротекторные свойства МЦ при криоконсервировании клеток СПЭВ. Показана можливість адаптаціі перевитих кліт...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2008 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69019 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ / С.В. Кощий, И.П. Высеканцев, В.Ф. Марценюк, Т.Ф. Петренко, Е.В. Кудокоцева // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 3. — С. 285-288. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860086676915748864 |
|---|---|
| author | Кощий, С.В. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Петренко, Т.Ф. Кудокоцева, Е.В. |
| author_facet | Кощий, С.В. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Петренко, Т.Ф. Кудокоцева, Е.В. |
| citation_txt | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ / С.В. Кощий, И.П. Высеканцев, В.Ф. Марценюк, Т.Ф. Петренко, Е.В. Кудокоцева // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 3. — С. 285-288. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Показана возможность адаптации перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) к росту на среде 199 в присутствии 0,1% метилцеллюлозы (МЦ) со снижением содержания сыворотки до 1%. Отмечены криопротекторные свойства МЦ при криоконсервировании клеток СПЭВ.
Показана можливість адаптаціі перевитих клітин нирки ембріона свині (СПЕВ) до росту на середовищі 199 у присутності 0,1% метилцелюлози (МЦ) зі зниженням вмісту сироватки до 1%. Відзначено кріопротекторні властивості МЦ при кріокон- сервуванні клітин СПЕВ.
The possibility of adaptation of cultured embryonic pig kidney cells (SPEV) to growth in culturing medium 199+0.1% MC with reduced serum content to 1% has been shown. Cryoprotective properties of MC for the cryopreservation of SPEV have been determined.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:20:18Z |
| format | Article |
| fulltext |
285 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
УДК 57.043:576.3
С.В. КОЩИЙ*, И.П. ВЫСЕКАНЦЕВ, В.Ф. МАРЦЕНЮК, Т.Ф. ПЕТРЕНКО, Е.В. КУДОКОЦЕВА
Использование метилцеллюлозы при культивировании
и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ
UDC 57.043:576.3
S.V. KOSHCHIY*, I.P. VYSEKANTSEV, V.F. MARTSENYUK, T.F. PETRENKO, E.V. KUDOKOTSEVA
Using Methylcellulose during Culturing and Cryopreservation
of SPEV Passaged Culture
Показана возможность адаптации перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) к росту на среде 199 в присутствии
0,1% метилцеллюлозы (МЦ) со снижением содержания сыворотки до 1%. Отмечены криопротекторные свойства МЦ при
криоконсервировании клеток СПЭВ.
Ключевые слова: криоконсервирование, культивирование, метилцеллюлоза, перевиваемая культура, сыворотка.
Показана можливість адаптаціі перевитих клітин нирки ембріона свині (СПЕВ) до росту на середовищі 199 у присутності
0,1% метилцелюлози (МЦ) зі зниженням вмісту сироватки до 1%. Відзначено кріопротекторні властивості МЦ при кріокон-
сервуванні клітин СПЕВ.
Ключові слова: кріоконсервування, культивування, метилцелюлоза, перевита культура, сироватка.
The possibility of adaptation of cultured embryonic pig kidney cells (SPEV) to growth in culturing medium 199+0.1% MC with
reduced serum content to 1% has been shown. Cryoprotective properties of MC for the cryopreservation of SPEV have been
determined.
Key-words: cryopreservation, culturing, methylcellulose, passaged culture, serum.
Для выращивания большинства клеточных
линий используют среды с добавлением до 10%
сыворотки крупного рогатого скота или эмбрио-
нальной сыворотки (ЭС) теленка. Необходимость
использования сыворотки, для которой характерны
непостоянство сложного состава и ростстимули-
рующей активности, риск контаминации вирусами
и микоплазмами, создает ряд проблем как при
культивировании клеток, так и при их заморажи-
вании.
Метилцеллюлоза (МЦ), наряду с поливинил-
пирролидоном и другими синтетическими полиме-
рами, применяется при культивировании клеток
животных на средах без сыворотки или с низким
ее содержанием. Она используется также как крио-
протектор в комбинации с ДМСО или для замены
ДМСО при криоконсервировании перевиваемых
клеток в средах, свободных от сыворотки [4, 5].
Мы изучали возможность культивирования пере-
виваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ)
на питательной среде 199 с низким содержанием
ЭС при многократном пассировании. В процессе
адаптации клеток к росту на средах с низким
содержанием сыворотки в ростовую среду добав-
ляли 0,1% МЦ.
Цель работы – изучение влияния состава крио-
защитной среды (среда 199 с добавлением ДМСО,
МЦ, ДМСО с ЭС, МЦ с ДМСО) на жизнеспособ-
ность клеток СПЭВ, культивируемых на среде с
разным содержанием сыворотки.
Материалы и методы
Объектом исследования служили клетки СПЭВ
(получены в НПО “Биолек”, г. Харьков). Культуру
клеток выращивали на среде 199 с 10; 5; 2,5; 1%
ЭС в стеклянных матрасах емкостью 0,25 л и
пробирках Лейтона при 37°С; коэффициент пере-
сева культур 1:4 – 1:6. Клетки снимали со стекла
смесью растворов 0,25% трипсина и 0,02% вер-
сена в соотношении 1:5–1:6; время контакта с
клетками при 37°С – 10-20 мин. Характер и дина-
мику формирования клеточного монослоя контро-
лировали визуально с использованием инвертиро-
ванного микроскопа БИОЛАМ П-1 (ЛОМО,
Россия).
При криоконсервировании суспензию клеток в
криозащитной среде помещали в ампулы (Nunc)
объемом 1мл. Пробы замораживали после 20-ми-
нутной эквилибрации с криопротектором по двух-
этапной программе: I этап – охлаждение со ско-
ростью 1°С/мин до –70°С, II этап – погружение в
жидкий азот [2]. После хранения в течение месяца
клетки отогревали на водяной бане (37–38°С),
подсчитывали количество клеток в камере Горяе-
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
286 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
ва и определяли их жизнеспособность методом
исключения красителя 0,4%-го трипанового синего
[1].
Статистическую обработку полученных резуль-
татов проводили согласно [3], достоверными счи-
тали различия данных при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Культивирование клеток без сыворотки и с низ-
ким ее содержанием возможно, в основном, для
перевиваемых клеточных линий. Процесс адапта-
ции обычно состоит в поэтапном снижении кон-
центрации сыворотки с последующей заменой
оставшегося небольшого количества сыворотки
соответствующим набором веществ определен-
ного состава. Мы изучали возможность культиви-
рования клеток СПЭВ на среде 199 с содержанием
2,5 и 1% сыворотки в присутствии 0,1% МЦ.
В предварительных экспериментах определяли
влияние 0,1% МЦ в ростовой среде на пролифе-
рацию клеток. Клетки культивировали с одинако-
вой посевной концентрацией 1×105 клеток/мл и
различным составом питательных сред. Характер
и динамику клеточного монослоя контролировали
визуально с помощью светового микроскопа ежед-
невно в течение 5 суток. Результаты исследования
динамики роста клеток от момента посева до
выхода на стационарную фазу приведены в табл. 1.
В образцах 1, 5, 7, 8 формировался полноценный
монослой примерно одновременно с контролем.
В образце 3, питательная среда которого состояла
Таблица 1. Влияние состава питательной среды на пролиферацию клеток СПЭВ
из среды 199 с 2,5% ЭС, на 4-е сутки наблюдалась
деградация монослоя. Культивирование клеток
только на среде 199 (образец 1), среде 199 с 1%
МЦ (образец 2), на среде 199 с содержанием
сыворотки меньше 1% (образец 6) приводило к
деструктивным изменениям в формировании
монослоя уже на 2-е сутки: клетки, прикрепившиеся
к поверхности стекла на 1-е сутки, постепенно
переходили в суспензию.
Присутствие МЦ в образцах 5 и 8, культивируе-
мых с пониженным содержанием сыворотки, сти-
мулировало рост клеток, плотность популяции кле-
ток на см2 была на уровне с контролем. Таким
образом, полученные результаты показали воз-
можность применения 0,1% МЦ для культивирова-
ния клеток СПЭВ в среде 199 с низким содержа-
нием сыворотки и обусловили необходимость
адаптации клеток.
Клетки СПЭВ адаптировали к росту на среде
199 с 2,5 и 1% сыворотки путем снижения концент-
рации сыворотки в 2 раза после нескольких пас-
сажей и добавления в ростовую среду с низким
содержанием сыворотки 0,1% МЦ. Результаты
непрерывного пассирования клеток в течение 4-х
месяцев на этих средах свидетельствуют о сохране-
нии их пролиферативной активности. Клетки фор-
мировали плотный монослой через 48–72 ч при
посеве 0,8–2,2×105 клеток/мл, который сохранялся
без изменений в течение 3-х суток. Урожай клеток
с 0,25 л матраса во всех вариантах составлял 1,2–
4×107 клеток. Примером влияния 0,1% МЦ на
ремоН
ацзарбо
адусоспиТ
ялд
-ивитьлук
яинавор
каквабоД
991едерс
%,иктусвяолсономяинаворимрофакиманиД
ьтсонтолП
,иицялупоп
мс/.лк 2
1 2 3 4 5
1 акриборП
анотйеЛ
:ьлортноK
СЭ%5 20 03- 59 001 001 001 2,2 × 01
5
2 акриборП
анотйеЛ - 03-02 5 -- 01
оньледтО
.лперкирп
иктелк
- - -
3 акриборП
анотйеЛ СЭ%5,2 03 58 59 59 08 2,1 × 01 5
4 акриборП
анотйеЛ ЦМ%1,0 02 01
оньледтО
.лперкирп
иктелк
- - -
5 акриборП
анотйеЛ
+СЭ%52,1
ЦМ%1,0 53-03 08-57 59 - 89 001 001 4,2 × 01
5
6 акриборП
анотйеЛ
+СЭ%6,0
ЦМ%51,0 02 53 02 - -
-
7 сартаМ
л52,0
:ьлортноK
СЭ%5 04 58 001 001 001 7,1 × 01
5
8 сартаМ
л52,0
+СЭ%5,2
ЦМ%1,0 04 57 001 001 001 3,2 × 01
5
287 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
пролиферацию клеток СПЭВ
являются кривые динамики
урожайности клеток до форми-
рования монослоя, культиви-
руемых в средах с различным
содержанием сыворотки (рису-
нок). Характер приведенных
кривых свидетельствует о том,
что присутствие 0,1% МЦ сти-
мулировало рост клеток, их уро-
жайность при одинаковой по-
севной концентрации была на
20–30% выше по сравнению с
питательной средой без МЦ.
Таким образом, сохранение
биологической активности и
способности к пролиферации
клеток на среде с 1% сыворот-
ки и 0,1% МЦ свидетельствует
о возможности поддержания их
роста, а также о перспективе
культивирования клеток СПЭВ
в среде без сыворотки.
Сохранность перевиваемых
культур в жидком азоте в крио-
защитных средах без сыворот-
ки – важная задача в создании
банка клеток, адаптированных
к росту в среде без сыворотки.
При замораживании использо-
вали клетки СПЭВ, адаптиро-
ванные к культивированию с
различным содержанием сыво-
ротки. Клетки после снятия со
стекла суспендировали в сре-
Таблица 2. Жизнеспособность клеток СПЭВ после
замораживания-отогрева
Рис. 1. Пролиферация клеток СПЭВ, культивируемых
в разных средах: ● – среда 199 + 5% ЭС; ▲ – среда 199
+ 2,5% ЭС; ■ – среда 199 + 1% ЭС + 0,1% МЦ; ▲ –
среда 199 + 2,5 % ЭС + 0,1% МЦ.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80 100 120
Ко
ли
че
ст
во
ж
из
не
сп
ос
об
ны
х
кл
ет
ок
, ×
10
6
Срок культивирования, ч
де 199 и постепенно добавляли в нее равный объем
приготовленной ex tempore на среде 199 крио-
защитной среды. Конечная концентрация клеток и
криопротекторов в образцах перед заморажива-
нием приведены в табл. 2. Контролем при замора-
живании служила среда 199 + 5% ДМСО + 10%
ЭС для клеток, выращенных на питательной среде
с 10% ЭС.
Из приведенных в табл.2 данных следует,что
криоконсервирование культивируемых с 5; 2,5; 1%
сыворотки линий клеток СПЭВ на среде с 5%
ДМСО и соответствующим содержанием сыво-
ротки обеспечивало высокую сохранность клеток.
Постепенное снижение концентрации сыворотки в
ростовой среде при культивировании позволило
получить для адаптированной к росту с 1% сыво-
ротки линии СПЭВ количество жизнеспособных
клеток 92,0±3,7, что достоверно выше контроля.
Также не наблюдалось различий в процентном
содержании жизнеспособных клеток для предва-
ацзарборемоН адерсяантищазоирK яицартнецноK
лм1вкотелк
ьтсонбосопсензиЖ
,котелк
%,xS±x
)йежассап5(СЭ%01+991адерс:ыдерсйомеуривитьлукватсоС
1 СЭ%01 0,7 × 01 5 6,4±0,83
2 ОСМД%5 0,7 × 01 5 9,1±3,26
3 СЭ%01+ОСМД%01 0,7 × 01 5 0,3±0,76
4 СЭ%01+ОСМД%5 0,7 × 01 5 7,2±7,39
)йежассап61(СЭ%5+991адерс:ыдерсйомеуривитьлукватсоС
1 СЭ%5+ОСМД%01 8,3 × 01 5 0,4±1,38
2 СЭ%5+ОСМД%5 8,3 × 01 5 6,2±5,49
3 ЦМ%1,0+ОСМД%5 8,3 × 01 5 8,4±2,98
4 ЦМ%1,0+СЭ%5 8,3 × 01 5 9,3±1,54
)йежассап8(ЦМ%1,0+СЭ%5,2+991адерс:ыдерсйомеуривитьлукватсоС
1 СЭ%2+ОСМД%5 2,3 × 01 6 5,4±0,88
2 ЦМ%1,0+ОСМД%5 2,3 × 01 6 0,5±5,09
3 ЦМ%1,0+СЭ%2 2,3 × 01 6 4,4±2,95
)йежассап6(ЦМ%1,0+СЭ%1+991адерс:ыдерсйомеуривитьлукватсоС
1 СЭ%1+ОСМД%5 0,2 × 01 6 7,3±0,29
2 ЦМ%1,0+ОСМД%5 0,2 × 01 6 2,4±0,19
3 ЦМ%1,0+СЭ%1 0,2 × 01 6 9,2±7,84
288 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
рительно адаптированных линий после заморажи-
вания-отогрева в среде без сыворотки с 5%
ДМСО + 0,1% МЦ. Количество сохранных клеток
89,2±4,8; 90,5±5,0; 91,0±4,2% было несколько ниже
по сравнению с контролем, но достаточным для
замораживания клеток без сыворотки в качестве
инокулята.
Таким образом, введение в среду консервиро-
вания 0,1% МЦ вместо сыворотки во всех случаях
способствовало повышению показателей сохран-
ности клеток после криоконсервирования.
Выводы
1. Установлено, что введение 0,1% МЦ в росто-
вую среду позволяет адаптировать клетки СПЭВ
к культивированию на среде 199 с низким содержа-
нием сыворотки.
Литература
Культура животных клеток. Методы / Под ред.
Р. Фрешни.– М.: Мир, 1989.– 333 с.
Методы культивирования клеток. Сб. научных трудов /
Под ред. Г.П. Пинаева.– Л.: Наука, 1988.– 313 с.
Статистична обробка результатів біологічних експери-
ментів: Навч. посібник.– Донецьк, 1999.– 186 с.
Schroder M., Friedl P. A protein-free solution as replacement
for serum in trypsinization protocols for anchorage-dependent
cells // Meth. Cell Sci.– 1997.– Vol. 19.– P. 137–147.
Merten O.W., Petres S., Couve E. A simple serum-free
freezing medium for serum-free cultured cells // Biologicals.–
1995.– Vol. 23.– P. 185–189.
Поступила 1.07.2008
1.
2.
3.
4.
5.
2. Экспериментально показано, что МЦ обла-
дает криопротекторными свойствами при крио-
консервировании перевиваемых клеток СПЭВ.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69019 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:20:18Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Кощий, С.В. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Петренко, Т.Ф. Кудокоцева, Е.В. 2014-10-04T06:17:40Z 2014-10-04T06:17:40Z 2008 Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ / С.В. Кощий, И.П. Высеканцев, В.Ф. Марценюк, Т.Ф. Петренко, Е.В. Кудокоцева // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 3. — С. 285-288. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69019 57.043:576.3 Показана возможность адаптации перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) к росту на среде 199 в присутствии 0,1% метилцеллюлозы (МЦ) со снижением содержания сыворотки до 1%. Отмечены криопротекторные свойства МЦ при криоконсервировании клеток СПЭВ. Показана можливість адаптаціі перевитих клітин нирки ембріона свині (СПЕВ) до росту на середовищі 199 у присутності 0,1% метилцелюлози (МЦ) зі зниженням вмісту сироватки до 1%. Відзначено кріопротекторні властивості МЦ при кріокон- сервуванні клітин СПЕВ. The possibility of adaptation of cultured embryonic pig kidney cells (SPEV) to growth in culturing medium 199+0.1% MC with reduced serum content to 1% has been shown. Cryoprotective properties of MC for the cryopreservation of SPEV have been determined. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ Using Methylcellulose during Culturing and Cryopreservation of SPEV Passaged Culture Article published earlier |
| spellingShingle | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ Кощий, С.В. Высеканцев, И.П. Марценюк, В.Ф. Петренко, Т.Ф. Кудокоцева, Е.В. Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| title | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ |
| title_alt | Using Methylcellulose during Culturing and Cryopreservation of SPEV Passaged Culture |
| title_full | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ |
| title_fullStr | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ |
| title_full_unstemmed | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ |
| title_short | Использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры СПЭВ |
| title_sort | использование метилцеллюлозы при культивировании и криоконсервировании перевиваемой культуры спэв |
| topic | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| topic_facet | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69019 |
| work_keys_str_mv | AT koŝiisv ispolʹzovaniemetilcellûlozyprikulʹtivirovaniiikriokonservirovaniiperevivaemoikulʹturyspév AT vysekancevip ispolʹzovaniemetilcellûlozyprikulʹtivirovaniiikriokonservirovaniiperevivaemoikulʹturyspév AT marcenûkvf ispolʹzovaniemetilcellûlozyprikulʹtivirovaniiikriokonservirovaniiperevivaemoikulʹturyspév AT petrenkotf ispolʹzovaniemetilcellûlozyprikulʹtivirovaniiikriokonservirovaniiperevivaemoikulʹturyspév AT kudokocevaev ispolʹzovaniemetilcellûlozyprikulʹtivirovaniiikriokonservirovaniiperevivaemoikulʹturyspév AT koŝiisv usingmethylcelluloseduringculturingandcryopreservationofspevpassagedculture AT vysekancevip usingmethylcelluloseduringculturingandcryopreservationofspevpassagedculture AT marcenûkvf usingmethylcelluloseduringculturingandcryopreservationofspevpassagedculture AT petrenkotf usingmethylcelluloseduringculturingandcryopreservationofspevpassagedculture AT kudokocevaev usingmethylcelluloseduringculturingandcryopreservationofspevpassagedculture |