Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток
Разработаны новые эффективные методы выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток из кордовой крови, которые позволяют практически полностью сохранять количественный и качественный состав клеток КК (в том числе и гемопоэтических) после выделения и обеспечивают достаточно высокую сохранность...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2008 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69037 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток / Л.А. Бабийчук, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев, О.Л. Зубова // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 3. — С. 348-351. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859594110436900864 |
|---|---|
| author | Бабийчук, Л.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. |
| author_facet | Бабийчук, Л.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. |
| citation_txt | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток / Л.А. Бабийчук, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев, О.Л. Зубова // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 3. — С. 348-351. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Разработаны новые эффективные методы выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток из кордовой крови, которые позволяют практически полностью сохранять количественный и качественный состав клеток КК (в том числе и гемопоэтических) после выделения и обеспечивают достаточно высокую сохранность после криоконсервирования. Анализ популяционного состава CD45⁺-клеток свидетельствует, что CD34⁺-клетки, а также лимфоциты и моноциты демонстрируют высокий уровень сохранности и жизнеспособности после размораживания.
Розроблено нові ефективні методи виділення та кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, які дозволяють практично повністю зберігати кількісний та якісний склад клітин КК (у тому числі і гемопоетичних) після виділення та забезпечують досить високу збереженість після кріоконсервування. Аналіз популяційного складу СD45⁺-клітин свідчить, що СD34⁺-клітини, а також лімфоцити та моноцити демонструють високий рівень збереженості та життєздатності після розмо- рожування.
There were elaborated new effective methods for isolation and cryopreservation of cord blood nucleated cells, which allow to preserve quite whole quantitative and qualitative contents of nucleated cells (including hemopoietic cells) after isolation and demonstrate quite a high recovery after freeze-thawing. The analysis of CD45⁺-cell population content testified that CD34⁺-cells as well as lymphocytes and monocytes manifested a high level of recovery and viability after freezing.
|
| first_indexed | 2025-11-27T19:40:12Z |
| format | Article |
| fulltext |
348 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
УДК 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42
Л.А. БАБИЙчУК, П.М. ЗУБОВ*, В.В. РЯЗАНЦЕВ, О.Л. ЗУБОВА
Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови:
оценка популяционного состава ядросодержащих клеток
UDC 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42
L.A. BABIYCHUK, P.M. ZUBOV*, V.V. RYAZANTSEV, O.L. ZUBOVA
Cord Blood Preservation Method with No Washing-Out:
Estimation of Populations of Nucleated Cells
Разработаны новые эффективные методы выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток из кордовой крови,
которые позволяют практически полностью сохранять количественный и качественный состав клеток КК (в том числе и
гемопоэтических) после выделения и обеспечивают достаточно высокую сохранность после криоконсервирования. Анализ
популяционного состава CD45+-клеток свидетельствует, что CD34+-клетки, а также лимфоциты и моноциты демонстрируют
высокий уровень сохранности и жизнеспособности после размораживания.
Ключевые слова: ядросодержащие клетки, криоконсервирование, ПЭО-1500, популяции, кордовая кровь.
Розроблено нові ефективні методи виділення та кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, які дозволяють
практично повністю зберігати кількісний та якісний склад клітин КК (у тому числі і гемопоетичних) після виділення та
забезпечують досить високу збереженість після кріоконсервування. Аналіз популяційного складу СD45+-клітин свідчить, що
СD34+-клітини, а також лімфоцити та моноцити демонструють високий рівень збереженості та життєздатності після розмо-
рожування.
Ключові слова: ядровмісні клітини, кріоконсервування, ПЕО-1500, популяції, кордова кров.
There were elaborated new effective methods for isolation and cryopreservation of cord blood nucleated cells, which allow to
preserve quite whole quantitative and qualitative contents of nucleated cells (including hemopoietic cells) after isolation and demonstrate
quite a high recovery after freeze-thawing. The analysis of CD45+-cell population content testified that CD34+-cells as well as lymphocytes
and monocytes manifested a high level of recovery and viability after freezing.
Key-words: nucleated cells, cryopreservation, PEO-1500, populations, cord blood.
В настоящее время значительно возрос интерес
к кордовой крови (КК) как к альтернативному
источнику репопулирующих гемопоэтических ство-
ловых клеток, пригодному для трансплантации.
Вследствие особенностей клеточного состава КК
и полученные из нее препараты находят все боль-
шее применение в клинической практике для
лечения целого ряда заболеваний, в первую оче-
редь гематологических [1].
Однако, учитывая небольшие объемы КК (в
среднем не более 100 мл), очень важным является
как заготовка максимального количества крови,
так и полное выделение ядросодержащих клеток
(ЯСК), в том числе и гемопоэтических, при сепара-
ции. Все это обусловливает необходимость разра-
ботки эффективных методов получения, криокон-
сервирования и хранения клеток КК.
В мировой практике наибольшее распростра-
нение получил метод выделения ЯСК в градиенте
плотности фиколла или перколла. Сепарация в
градиенте плотности позволяет получить преиму-
щественно мононуклеарные клетки, но приводит к
значительным потерям гемопоэтических пред-
шественников (от 30 до 50%) [4].
Для криоконсервирования ядросодержащих
клеток КК широко используется метод с приме-
нением криопротектора ДМСО [6]. Однако ДМСО,
хорошо проникающий в клетки, обусловливает
необходимость его удаления после разморажива-
ния, что существенно усложняет процедуру получе-
ния качественных деконсервированных клеток и
приводит к потере части клеток в процессе отмы-
вания. Поэтому наиболее перспективна для крио-
консервирования ядросодержащих клеток КК
КРИОБАНКИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ
ПУПОВИННОЙ КРОВИ В МЕДИЦИНЕ
CRYOBANKS OF CORD BLOOD.
PROSPECTS OF USING
CRYOPRESERVED PREPARATIONS
OF CORD BLOOD IN MEDICINE
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
349 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
разработка безотмывочных методов заморажи-
вания-отогрева с использованием непроникающих
в клетку криопротекторов.
Цель работы – разработка методов наиболее
полного выделения ЯСК из кордовой крови и
эффективного метода их криоконсервирования, а
также оценка сохранности и жизнеспособности
популяционного состава ЯСК кордовой крови до и
после криоконсервирования.
Материалы и методы
В работе использовали КК человека, заготов-
ленную на общепринятом глюкозо-цитратном
растворе. Кордовую кровь замораживали в день
взятия или после ее хранения при постоянной
температуре 4–2°С в течение 48 ч. Объем КК
меньше 60 мл в работе не использовали.
Фракцию ЯСК из КК выделяли с помощью
оригинального, двухэтапного центрифугирования
цельной крови при 200g в течение 20 мин с пос-
ледующим фракционированием и отделением слоя
ЯСК [2]. В части экспериментов ЯСК выделяли
стандартным фикольным методом. В качестве
криопротектора использовали 30%-й ПЭО-1500,
приготовленный на физиологическом растворе.
Криопротектор добавляли к суспензии клеток по
методу “холодовой” обработки 1:1 по объему [3].
Контролем сравнения служили пробы, обработан-
ные при комнатной температуре. Клетки замора-
живали до –196°С по специально разработанной
нами двухэтапной программе, отогревали при 42–
44°С в водяной термостатируемой бане при пос-
тоянном покачивании.
Исследования ЯСК (CD45+) кордовой крови, в
том числе и гемопоэтических (CD34+) до и после
криоконсервирования, были проведены методом
проточной цитофлуориметрии на проточном цито-
метре FACS Calibur фирмы Becton Dickinson
(США) с использованием реагентов Becton Dickin-
son по общепринятому международному ISHAGE
протоколу.
Результаты и обсуждение
Для разделения КК на плазму, ЯСК и эритро-
циты был применен метод двухэтапного центрифу-
гирования [2] с последующим разделением на
эритроциты и концентрат ЯСК в аутоплазме,
которые затем обрабатывали криопротектором и
замораживали.
Особую роль в последующем криоконсервиро-
вании и хранении играет оценка качества получае-
мых ЯСК, для чего было определено содержание
ядросодержащих (CD45+) и гемопоэтических
(CD34+) клеток, а также их жизнеспособность на
проточном цитофлуориметре. Для сравнения была
проведена оценка качества клеток, выделенных с
помощью общепринятого в мировой практике
метода с использованием фиколл-верографина.
Нами показано, что предложенный метод
сепарации клеток позволяет выделять до 95%
CD45+-клеток и до 97% CD34+-клеток. Важно от-
метить, что фиколл вызывает потери выделяемых
клеток (от 35 до 55%), поэтому его использование
не является однозначно положительным. Также
падает качество получаемого концентрата ЯСК,
так как снижается абсолютный показатель CD34+-
клеток (от 3,4±1,1×106 в цельной крови до 2,0±
1,3×106 в концентрате после выделения фиколлом).
Метод центрифугирования для получения концен-
трата ЯСК, обогащенного стволовыми клетками,
позволяет практически полностью сохранить (до
3,2±1,2×106) изначальное количество CD34+-клеток,
присутствующих в цельной крови.
Важно отметить, что уже на этапе выделения
фиколлом снижается жизнеспособность ЯСК на 5–
10% и до 15% стволовых гемопоэтических клеток.
Это может указывать на явный дестабилизирую-
щий эффект данного вещества на клетки. При вы-
делении ЯСК разработанным нами методом сни-
жение жизнеспособности клеток не наблюдалось.
В дальнейших исследованиях для криоконсер-
вирования концентрата ЯСК кордовой крови был
применен метод “холодовой” обработки ПЭО-1500
[3] и специальный режим двухэтапного заморажи-
вания до –196°С. Данный метод позволяет
Рис. 1. Жизнеспособность CD45+-клеток после крио-
консервирования.
Quadrant statistica
X Parameter: 7AAD (Log)
Y Parameter: CD45 FITC (Log)_________________________
Quad % Gated
Region % Gated
UL 83.93
UR 16.07
LL 0.00
LR 0.00
350 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
сохранять после размораживания до 75% CD45+-
клеток и до 83% CD34+-клеток. При этом жизне-
способность CD45+-клеток составляла до 85, а
CD34+-клеток до 90% (рис.1).
Анализ популяционного состава лейкоцитов
показал, что как процесс инкубации клеток с крио-
протектором ПЭО-1500, так и процесс криоконсер-
вирования вызывает перераспределение в процен-
тном содержании лимфоцитов, моноцитов и грану-
лоцитов в сторону увеличения удельного содер-
жания фракции мононуклеаров за счет снижения
количества гранулоцитов (рис.2).
Пересчет в абсолютные значения показал, что
разработанный метод криоконсервирования поз-
воляет сохранять 95±3,3% лимфоцитов, 85±4,9%
моноцитов и 48±3,9% гранулоцитов от первона-
чального их содержания в цельной КК.
Определение сохранности является очень важ-
ным, но недостаточным тестом для оценки струк-
турно-функциональной полноценности клеток. В
связи с этим была определена жизнеспособность
как популяций лейкоцитов, так и гемопоэтических
стволовых клеток по ДНК красителю 7ААD.
Проведенный анализ показал, что жизнеспо-
собность CD34+-клеток составляла после размора-
живания до 90%. Жизнеспособность популяций
ЯСК была максимальна у лимфоцитов (95±2,8%)
и минимальна у гранулоцитов (87±5,9%). Жизне-
способность моноцитов составляла 93±4,7%.
Следует отметить, что после выделения моно-
нуклеаров фиколлом процентное соотношение
CD45+- клеток в среднем составляло: лимфоци-
тов – 66±8,8%, моноцитов – 24±2,2%, гранулоци-
тов – 4,5±0,9%. На стадиях обработки криопротек-
Рис. 2. Популяционный состав ЯСК кордовой крови до (а) и после (б) криоконсервирования.
тором и после замораживания-отогрева данное
соотношение достоверно не изменялось. Жизне-
способность клеток была значительно ниже, чем
при разработанном нами методе (лимфоциты –
78±6,2%, моноциты – 75±5,9%). Жизнеспособность
CD34+-клеток составляла порядка 54%.
Выводы
1. Предложенный метод выделения ЯСК из
кордовой крови позволяет практически полностью
сохранять их количественный и качественный
состав.
2. Разработанный безотмывочный метод крио-
консервирования ЯСК с непроникающим криопро-
тектором ПЭО-1500 обеспечивает высокую сох-
ранность и жизнеспособность после криоконсер-
вирования популяций лимфоцитов, моноцитов, а
также CD34+-клеток.
Region statistica
Gate % Gated_______________
Lymph 48.10
Mon 15.61
Gran 36.31
Region statistica
Gate % Gated_______________
Lymph 32.54
Mon 9.56
Gran 58.07a б
Литература
Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Полу-
чение и клиническое применение периферических гемо-
поэтических стволовых клеток из пуповинной крови //
Вопросы онкологии.– 2000.– Т. 46, №5.– С. 156–164.
Пат. України № 23499 МПКС12N5/00. Спосіб виділення
ядровмісних клітин кордової крові / Л.О. Бабійчук, В.В. Ря-
занцев, О.Л. Зубова, В.І. Грищенко; Заявл. 22.01.2007; Опубл.
25.05.2007. Бюл.№7.
Пат. України №30888А МПК6А01N1/02. Спосіб консерву-
вання еритроцитів/ Л.О. Бабійчук, В.І. Грищенко, С. Суміда,
В.А. Бондаренко, Н.Г. Землянських, Т.П. Бондаренко.
Заявл. 16.06.98; Опубл. 15.12.2000.– Бюл. №7.
Cornetta K., Laughlin M., Carter S. et al. Umbilical cord blood
transplantation in adults: results of the prospective cord blood
transplantation (COBLT) // Biol. Blood Marrow Transplant.–
2005.– Vol. 11, N2.– Р. 149–160.
1.
2
3.
4.
351 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №3
Denning-Kendall P., Donaldson C., Nicol A. et al. Optimal
processing of human umbilical cord blood for clinical banking //
Exp. Hematol.– 1996.– Vol. 24, N 12.– P. 1394–1401.
Laroche V., McKenna D., Moroff G. et al. Cell loss and
recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of
postthaw and postwash samples // Transfusion.– 2005.–
Vol. 45, N12.– P. 1909–1916.
Поступила 10.07.2008
5.
6.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69037 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-27T19:40:12Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Бабийчук, Л.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. 2014-10-04T06:56:52Z 2014-10-04T06:56:52Z 2008 Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток / Л.А. Бабийчук, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев, О.Л. Зубова // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 3. — С. 348-351. — Бібліогр.: 6 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69037 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42 Разработаны новые эффективные методы выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток из кордовой крови, которые позволяют практически полностью сохранять количественный и качественный состав клеток КК (в том числе и гемопоэтических) после выделения и обеспечивают достаточно высокую сохранность после криоконсервирования. Анализ популяционного состава CD45⁺-клеток свидетельствует, что CD34⁺-клетки, а также лимфоциты и моноциты демонстрируют высокий уровень сохранности и жизнеспособности после размораживания. Розроблено нові ефективні методи виділення та кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, які дозволяють практично повністю зберігати кількісний та якісний склад клітин КК (у тому числі і гемопоетичних) після виділення та забезпечують досить високу збереженість після кріоконсервування. Аналіз популяційного складу СD45⁺-клітин свідчить, що СD34⁺-клітини, а також лімфоцити та моноцити демонструють високий рівень збереженості та життєздатності після розмо- рожування. There were elaborated new effective methods for isolation and cryopreservation of cord blood nucleated cells, which allow to preserve quite whole quantitative and qualitative contents of nucleated cells (including hemopoietic cells) after isolation and demonstrate quite a high recovery after freeze-thawing. The analysis of CD45⁺-cell population content testified that CD34⁺-cells as well as lymphocytes and monocytes manifested a high level of recovery and viability after freezing. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток Cord Blood Preservation Method with No Washing-Out, Estimation of Population Composition of Nucleated Cells Article published earlier |
| spellingShingle | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток Бабийчук, Л.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» |
| title | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток |
| title_alt | Cord Blood Preservation Method with No Washing-Out, Estimation of Population Composition of Nucleated Cells |
| title_full | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток |
| title_fullStr | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток |
| title_full_unstemmed | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток |
| title_short | Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток |
| title_sort | безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток |
| topic | Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» |
| topic_facet | Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69037 |
| work_keys_str_mv | AT babiičukla bezotmyvočnyimetodkriokonservirovaniâkordovoikroviocenkapopulâcionnogosostavaâdrosoderžaŝihkletok AT zubovpm bezotmyvočnyimetodkriokonservirovaniâkordovoikroviocenkapopulâcionnogosostavaâdrosoderžaŝihkletok AT râzancevvv bezotmyvočnyimetodkriokonservirovaniâkordovoikroviocenkapopulâcionnogosostavaâdrosoderžaŝihkletok AT zubovaol bezotmyvočnyimetodkriokonservirovaniâkordovoikroviocenkapopulâcionnogosostavaâdrosoderžaŝihkletok AT babiičukla cordbloodpreservationmethodwithnowashingoutestimationofpopulationcompositionofnucleatedcells AT zubovpm cordbloodpreservationmethodwithnowashingoutestimationofpopulationcompositionofnucleatedcells AT râzancevvv cordbloodpreservationmethodwithnowashingoutestimationofpopulationcompositionofnucleatedcells AT zubovaol cordbloodpreservationmethodwithnowashingoutestimationofpopulationcompositionofnucleatedcells |