Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека
Исследовано влияние криоконсервирования на остеогенные и адипогенные свойства субкультивированных in vitro мезенхимальных стромальных клеток, полученных из фетальной печени и костного мозга взрослого человека. Показано сохранение пролиферативных свойств и дифференцировочного потенциала после криокон...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2008 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69055 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека / Н.Г. Скоробогатова, Ю.А. Петренко, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 410-412. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860204113505026048 |
|---|---|
| author | Скоробогатова, Н.Г. Петренко, Ю.А. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| author_facet | Скоробогатова, Н.Г. Петренко, Ю.А. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| citation_txt | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека / Н.Г. Скоробогатова, Ю.А. Петренко, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 410-412. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Исследовано влияние криоконсервирования на остеогенные и адипогенные свойства субкультивированных in vitro мезенхимальных стромальных клеток, полученных из фетальной печени и костного мозга взрослого человека. Показано сохранение пролиферативных свойств и дифференцировочного потенциала после криоконсервирования исследуемых клеток-предшественников, включающего медленное 2-этапное замораживание под защитой ДМСО.
Досліджено вплив кріоконсервування на остеогенні і адипогенні властивості субкультивованих in vitro мезенхімальних стромальних клітин, отриманих з фетальної печінки і кісткового мозку дорослої людини. Показано збереження проліферативних властивостей і диференціювального потенціалу після кріоконсервування дослідних клітин-попередників, що включає повільне 2-етапне заморожування під захистом ДМСО.
The cryopreservation influence on osteogenic and adipogenic capacities of expanded in vitro mesenchymal stromal cells derived from human fetal liver and adult bone marrow was investigated. Saving proliferative ability and differentiation potential of the progenitor cells after cryopreservation by 2-step slow freezing under Me2SO protection was shown.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:11:38Z |
| format | Article |
| fulltext |
410 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
УДК 615.014.41:611.36.013.08:611.018.46.08
Н.Г. СКОРОБОГАТОВА, Ю.А. ПЕТРЕНКО, Н.А. ВОЛКОВА, А.Ю. ПЕТРЕНКО*
Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства
мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной
печени и костного мозга взрослого человека
UDC 615.014.41:611.36.013.08:611.018.46.08
N.G. SKOROBOGATOVA, YU.A. PETRENKO, N.A., VOLKOVA, A.YU. PETRENKO*
Cryopreservation Effect on Differentiation Capacities
of Mesenchymal Stromal Progenitor Cells from
Human Fetal Liver and Adult Bone Marrow
Исследовано влияние криоконсервирования на остеогенные и адипогенные свойства субкультивированных in vitro
мезенхимальных стромальных клеток, полученных из фетальной печени и костного мозга взрослого человека. Показано
сохранение пролиферативных свойств и дифференцировочного потенциала после криоконсервирования исследуемых клеток-
предшественников, включающего медленное 2-этапное замораживание под защитой ДМСО.
Ключевые слова: криоконсервирование, мезенхимальные стромальные клетки-предшественники, фетальная печень, костный
мозг.
Досліджено вплив кріоконсервування на остеогенні і адипогенні властивості субкультивованих in vitro мезенхімальних
стромальних клітин, отриманих з фетальної печінки і кісткового мозку дорослої людини. Показано збереження проліфе-
ративних властивостей і диференціювального потенціалу після кріоконсервування дослідних клітин-попередників, що включає
повільне 2-етапне заморожування під захистом ДМСО.
Ключові слова: кріоконсервування, мезенхімальні стромальні клітини-попередники, фетальна печінка, кістковий мозок.
The cryopreservation influence on osteogenic and adipogenic capacities of expanded in vitro mesenchymal stromal cells derived
from human fetal liver and adult bone marrow was investigated. Saving proliferative ability and differentiation potential of the
progenitor cells after cryopreservation by 2-step slow freezing under Me2SO protection was shown.
Key-words: cryopreservation, mesenchymal progenitor stromal cells, fetal liver, bone marrow.
К настоящему времени накоплено значительное
количество данных, касающихся криобиологи-
ческих характеристик клеток гемопоэтического
ряда. Возможности же сохранения другого ценного
пула, а именно мезенхимальных стромальных кле-
ток (МСК), остаются менее изученными. Согласно
современным представлениям этот пул включает
мультипотентные стволовые клетки, а также их
незрелые потомки с более ограниченными проли-
феративно-дифференцировочными свойствами [7].
Для криоконсервирования МСК традиционно
используют криопротектор диметилсульфоксид
(ДМСО) [4, 6]. Однако гетерогенный состав попу-
ляций МСК обусловливает методические ограни-
чения при оценке чувствительности наиболее
ранних предшественников к действию криоконсер-
вирования.
Цель исследования – определить влияние
криоконсервирования на способность дифферен-
цироваться in vitro в остеогенном и адипогенном
направлениях мезенхимальных стромальных кле-
ток, полученных из пре- и постнатальных гемопоэ-
тических источников (фетальной печени и кост-
ного мозга человека).
Материалы и методы
Объектом исследования служили фибробласто-
подобные клетки, изолированные из фетальной
печени человека (ФПЧ) 8–11 недель гестации и
костного мозга (КМ) взрослого человека. Первич-
ную суспензию клеток получали из ФПЧ фермен-
тативным методом [2] (n = 4), из КМ – путем
вымывания физиологической средой из спонгиоз-
ной костной ткани (n = 4). Сохранность клеток
определяли с помощью прижизненного окраши-
вания трипановым синим. Культивирование МСК
проводили в монослое в среде alpha-МЕМ (Sigma,
США), дополненной эмбриональной сывороткой
(ЭС) крупного рогатого скота (БиолоТ, Россия).
Для пассирования культур и одиночных колоний
использовали смесь 0,05% трипсина и 0,004% раст-
вора Версена.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-30-34, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3034, fax: +380 57
373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
411 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
Субкультивированные клетки ФПЧ
и КМ криоконсервировали в 1 мл куль-
туральной среды с 20 % ЭС и 10%
ДМСО со скоростью 1°С/мин до –80°С
с последующим погружением в жидкий
азот. Криоконсервированные образцы
хранили в жидком азоте в течение 4–6
месяцев. Клеточные суспензии отог-
ревали на водяной бане при 37°С.
Культивирование колониеобразую-
щих единиц фибробластов (КОЕф) до
и после криоконсервирования прово-
дили согласно методу, описанному в
работе [1]. Остеогенный и адипоген-
ный потенциал мезенхимальных пред-
шественников определяли in vitro при субкуль-
тивировании в индуктивных средах [8]. Остео-
генные клетки выявляли по экспрессии щелочной
фосфатазы, минерализацию внеклеточного мат-
рикса оценивали с помощью окрашивания по Ван-
Коссу, а адипогенные клетки – по окрашиванию Oil
Red O [5]. Контролем на спонтанную дифферен-
цировку служили клетки, культивированные без
специальных индукторов. В условиях световой
микроскопии определяли позитивно окрашенные
остеогенные и адипогенные клетки. Все экспери-
менты проводили с тройным повтором.
Результаты сохранности клеток представлены
как M±m.
Результаты и обсуждение
Сохранность клеток, изолированных из ФПЧ и
КМ, составляла 95,1±2,5 и 90,2±3,7 % соответст-
венно. В первичной культуре были выявлены КОЕф
в обеих группах. Посев 100 000–150 000 клеток/см2
приводил к формированию фибробласто-подобны-
ми клетками 70% конфлуентного монослоя к 9-м
суткам культивирования для клеток КМ и к 11–
12-м суткам – для ФПЧ. После двукратного пасси-
рования и культивирования в индуктивных средах
стромальные клетки ФПЧ и КМ демонстрировали
типичные признаки индуцированных адипо- и
остеогенной дифференцировок (накопление липид-
ных включений, позитивно окрашивающихся Oil
Red O, у адипогенных клеток и экспрессия щелоч-
ной фосфатазы на фоне появления характерных
полигональной и кубоидальной морфологии у диф-
ференцирующихся остеогенных клеток). В конт-
рольных культурах клеток ФПЧ спонтанных диф-
ференцировок выявлено не было. В случае КМ при
культивировании в ростовой среде без остеогенных
индукторов обнаружено незначительное количест-
во фибробластоподобных клеток, позитивных по
окрашиванию на щелочную фосфатазу.
В настоящей работе было выявлено, что при
предварительном субкультивировании и после-
Свойства субкультивированных мезенхимальных
стромальных клеток-предшественников ФПЧ и КМ
до и после криоконсервирования
дующем криоконсервировании стромальные клет-
ки-предшественники ФПЧ сохраняли способность
к остеогенной и адипогенной дифференцировкам
in vitro (таблица). Эти данные свидетельствовали
об устойчивости к действию криоконсервирования
у субкультивированных МСК фетального проис-
хождения.
Исследование влияния криоконсервирования на
пролиферацию и дифференцировочный потенциал
МСК взрослого человека важно как для понимания
механизмов регуляции пролиферативно-диффе-
ренцировочных процессов стромальных предшест-
венников, так и для разработки методов низкотем-
пературного консервирования исследуемых кле-
ток. МСК КМ были получены из поликлональных
субкультур (3-го пассажа) и в результате экспансии
единичных колоний, криоконсервированы по 2-этап-
ному протоколу, примененному для субкультивиро-
ванных клеток ФПЧ. Криоконсервированные МСК
КМ сохраняли колониеобразующую способность
и дифференцировочные остеогенные и адипоген-
ные свойства in vitro (таблица). Оценка минерали-
зации матрикса с помощью окрашивания по Ван-
Коссу подтвердила функциональную активность
дифференцировавшихся остеобластов. В то же
время в контрольных культурах были отмечены
единичные ранние признаки спонтанной остеоген-
ной дифференцировки.
Ранее нами была установлена чувствитель-
ность КОЕф ФПЧ к переохлаждению при медлен-
ном замораживании первичной суспензии [3].
Определено, что снижение уровня переохлаждения
путем инициации кристаллообразования позволяет
сохранить клоногенные МСК в первичной суспен-
зии ФПЧ, способные к экспансии и направленным
остео- и адипогенной дифференцировкам in vitro
[8]. Анализ настоящих и ранее полученных резуль-
татов позволяет сделать вывод о том, что МСК
человека, свежеизолированные из раннего гемопоэ-
тического источника (фетальной печени), более
чувствительны к действию низкотемпературного
ртемараП
ЧПФ МK
од елсоп од елсоп
,ьтсоннархоС
% 5,2±1,59 6,4±0,37 7,3±2,09 2,5±4,86
йыннегоетсО
лаицнетоп + + +
+
йыннегопидА
лаицнетоп + + +
+
412 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
Литература
Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Волкова Н.А., Скоробога-
това Н.Г. Колониеобразующая активность фибробласто-
подобных клеток-предшественников из эмбриональной
печени человека в условиях in vitro // Доповіді Національної
академії наук України.– 2005.– №2.– С. 138–141.
Демидова С.А., Левина Д.С., Блюмкин В.Н. Методические
указания по работе с клеточными культурами.– М.: Ин-т
вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, 1971.–
С. 14–15.
консервирования, в частности к переохлаждению,
по сравнению с субкультивированными клетками.
Для выяснения причин этих различий необходимы
дополнительные исследования.
Результаты проведенных исследований суб-
культивированных in vitro МСК фетальной печени
и КМ человека свидетельствуют о сохранении их
пролиферативных свойств и дифференцировочного
потенциала после криоконсервирования, включа-
ющего медленное 2-этапное замораживание под
защитой ДМСО.
1.
2.
Скоробогатова Н.Г., Грищук В.П., Петренко А.Ю. Роль
переохлаждения в сохранении клоногенных свойств
фибробластоподобных клеток-предшественников эмбрио-
нальной печени человека после криоконсервирования //
Пробл. криобиологии.– 2006.– Т. 16, №1.– С. 24–31.
Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growh kinetics,
self-renewal, and the osteogenic potential of purified human
mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and
following cryopreservation // J. Cell. Biochem.– 1997.–
Vol. 64, N2.– P. 278–294.
Histological and histohemical methods. Theory and practice.
Second edition / Edited by J.A. Kilrnan.– Oxford: Pergamon
Press, 1990.– 433 p.
Lee M.W., Choi J., Yang M. S. et al. Mesenchymal stem cells
from cryopreserved human umbilical cord blood // Biochem.
Biophys. Res. Commun.– 2004.– Vol. 320, N1.– P. 273–278.
Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cells // Science.–
1999.– Vol. 284, N5411.– P. 143–147.
Skorobogatova N.G., Petrenko A.Yu. Colony-forming and
differentiation properties of fibroblast-like progenitor cells from
human fetal liver before and after cryopreservation under
DMSO protection // Acta Biochimica Polonica.– 2007.– Vol. 54,
Suppl. 2.– P. 27–28.
Поступила 01.07.2008
3.
4.
5.
6.
7.
8.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69055 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:11:38Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Скоробогатова, Н.Г. Петренко, Ю.А. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. 2014-10-04T14:43:54Z 2014-10-04T14:43:54Z 2008 Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека / Н.Г. Скоробогатова, Ю.А. Петренко, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 410-412. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69055 615.014.41:611.36.013.08:611.018.46.08 Исследовано влияние криоконсервирования на остеогенные и адипогенные свойства субкультивированных in vitro мезенхимальных стромальных клеток, полученных из фетальной печени и костного мозга взрослого человека. Показано сохранение пролиферативных свойств и дифференцировочного потенциала после криоконсервирования исследуемых клеток-предшественников, включающего медленное 2-этапное замораживание под защитой ДМСО. Досліджено вплив кріоконсервування на остеогенні і адипогенні властивості субкультивованих in vitro мезенхімальних стромальних клітин, отриманих з фетальної печінки і кісткового мозку дорослої людини. Показано збереження проліферативних властивостей і диференціювального потенціалу після кріоконсервування дослідних клітин-попередників, що включає повільне 2-етапне заморожування під захистом ДМСО. The cryopreservation influence on osteogenic and adipogenic capacities of expanded in vitro mesenchymal stromal cells derived from human fetal liver and adult bone marrow was investigated. Saving proliferative ability and differentiation potential of the progenitor cells after cryopreservation by 2-step slow freezing under Me2SO protection was shown. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека Cryopreservation Effect on Differentiation Capacites of Mesenchymal Stromal Progenitor Cells from Human Fetal Liver and Adult Bone Marrow Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека Скоробогатова, Н.Г. Петренко, Ю.А. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| title | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека |
| title_alt | Cryopreservation Effect on Differentiation Capacites of Mesenchymal Stromal Progenitor Cells from Human Fetal Liver and Adult Bone Marrow |
| title_full | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека |
| title_fullStr | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека |
| title_full_unstemmed | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека |
| title_short | Влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека |
| title_sort | влияние криоконсервирования на дифференцировочные свойства мезенхимальных стромальных клеток-предшественников фетальной печени и костного мозга взрослого человека |
| topic | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| topic_facet | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69055 |
| work_keys_str_mv | AT skorobogatovang vliâniekriokonservirovaniânadifferencirovočnyesvoistvamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokpredšestvennikovfetalʹnoipečeniikostnogomozgavzroslogočeloveka AT petrenkoûa vliâniekriokonservirovaniânadifferencirovočnyesvoistvamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokpredšestvennikovfetalʹnoipečeniikostnogomozgavzroslogočeloveka AT volkovana vliâniekriokonservirovaniânadifferencirovočnyesvoistvamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokpredšestvennikovfetalʹnoipečeniikostnogomozgavzroslogočeloveka AT petrenkoaû vliâniekriokonservirovaniânadifferencirovočnyesvoistvamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokpredšestvennikovfetalʹnoipečeniikostnogomozgavzroslogočeloveka AT skorobogatovang cryopreservationeffectondifferentiationcapacitesofmesenchymalstromalprogenitorcellsfromhumanfetalliverandadultbonemarrow AT petrenkoûa cryopreservationeffectondifferentiationcapacitesofmesenchymalstromalprogenitorcellsfromhumanfetalliverandadultbonemarrow AT volkovana cryopreservationeffectondifferentiationcapacitesofmesenchymalstromalprogenitorcellsfromhumanfetalliverandadultbonemarrow AT petrenkoaû cryopreservationeffectondifferentiationcapacitesofmesenchymalstromalprogenitorcellsfromhumanfetalliverandadultbonemarrow |