Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека
Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной ср...
Збережено в:
| Дата: | 2008 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69057 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека / М.Ю. Стегний, Б.Т. Стегний, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 417-419. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69057 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-690572025-02-09T15:52:21Z Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека Developing of Cryopreservation Method of Marek’s Disease Virus Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной среды 199 с добавлением 10% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Розроблено спосіб консервування вірусу хвороби Марека, що полягає в застосуванні двохетапного режиму заморожування до –30°С зі швидкістю 1 град/хв; від –30 до –70°С зі швидкістю 5–10 град/хв з наступним зануренням у рідкий азот (–196°С) у такому складі захисного середовища: 80% живильного середовища 199 з додаванням 10% інактивованої сироватки крові великої рогатої худоби і 10% диметилсульфоксиду. The cryopreservation method, consisting in application of two-stage freezing regimen down to -30°C with 1°C/min rate, from -30 down to –70°C with 5–10°C/min rate with following plunging into liquid nitrogen (–196°C) at that composition of protective media 199 nutrient media 80% with adding of inactivated serum of cattle blood 10% and dimethyl sulfoxide 10% has been developed for Marek’s disease virus. 2008 Article Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека / М.Ю. Стегний, Б.Т. Стегний, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 417-419. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69057 57.043;578.71 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| spellingShingle |
Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной среды 199 с добавлением 10% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. |
| format |
Article |
| author |
Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. |
| author_facet |
Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. |
| author_sort |
Стегний, М.Ю. |
| title |
Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_short |
Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_full |
Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_fullStr |
Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_full_unstemmed |
Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_sort |
разработка способа криоконсервирования вируса болезни марека |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2008 |
| topic_facet |
Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69057 |
| citation_txt |
Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека / М.Ю. Стегний, Б.Т. Стегний, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 417-419. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT stegnijmû razrabotkasposobakriokonservirovaniâvirusaboleznimareka AT stegnijbt razrabotkasposobakriokonservirovaniâvirusaboleznimareka AT golʹcevan razrabotkasposobakriokonservirovaniâvirusaboleznimareka AT stegnijmû developingofcryopreservationmethodofmareksdiseasevirus AT stegnijbt developingofcryopreservationmethodofmareksdiseasevirus AT golʹcevan developingofcryopreservationmethodofmareksdiseasevirus |
| first_indexed |
2025-11-27T16:35:28Z |
| last_indexed |
2025-11-27T16:35:28Z |
| _version_ |
1849962090741104640 |
| fulltext |
УДК 57.043;578.71
М.Ю. СТЕГНИЙ1*, Б.Т. СТЕГНИЙ1, А.Н. ГОЛЬЦЕВ2
Разработка способа криоконсервирования
вируса болезни Марека
UDC 57.043;578.71
M.YU. STEGNIY1*, B.T. STEGNIY1, A.N. GOLTSEV2
Developing of Cryopreservation Method
of Marek’s Disease Virus
Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима
замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением
в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной среды 199 с добавлением 10% инактивированной
сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида.
Ключевые слова: консервирование вируса болезни Марека, вакцина.
Розроблено спосіб консервування вірусу хвороби Марека, що полягає в застосуванні двохетапного режиму заморожування
до –30°С зі швидкістю 1 град/хв; від –30 до –70°С зі швидкістю 5–10 град/хв з наступним зануренням у рідкий азот (–196°С)
у такому складі захисного середовища: 80% живильного середовища 199 з додаванням 10% інактивованої сироватки крові
великої рогатої худоби і 10% диметилсульфоксиду.
Ключові слова: консервування вірусу хвороби Марека, вакцина.
The cryopreservation method, consisting in application of two-stage freezing regimen down to -30°C with 1°C/min rate, from -30
down to –70°C with 5–10°C/min rate with following plunging into liquid nitrogen (–196°C) at that composition of protective media 199
nutrient media 80% with adding of inactivated serum of cattle blood 10% and dimethyl sulfoxide 10% has been developed for Marek’s
disease virus.
Key-words: cryopreservation of Marek’s disease virus, vaccine.
Болезнь Марека (БМ) – это высококонтагиозное
заболевание кур и индеек. Существует 2 формы
течения болезни: первая, классическая – характе-
ризуется поражением периферической и централь-
ной нервной системы; вторая, острая – лейкозом и
образованием лимфоидных опухолей. В 1961 году
болезнь получила название по имени профессора
Королевского Венгерского университета Ж. Маре-
ка, которым впервые была описана. До применения
вакцинопрофилактики БМ наносила громадный
экономический ущерб во всех странах мира. Ви-
русная природа болезни была доказана в 1967 г.
Возбудитель БМ (ВБМ) относится к семейству
герпес-вирусов c кубическим типом симметрии и
формой икосаэдра [1]. Вирус имеет три серотипа:
к первому относятся вирусы, способные вызывать
лимфомы у птиц, а также аттенуированные его ва-
рианты. Природноослабленные неонкогенные ви-
русы БМ второго серотипа обладают протектив-
ными свойствами, поэтому используются как
усиливающие иммунный ответ компоненты в бива-
лентных вакцинах [2]. Третий серотип ВБМ пред-
ставлен антигенно родственными вирусами герпе-
са индеек. Основой профилактики БМ является
вакцинация бивалентными, поливалентными гете-
рологичными живыми вакцинами [4]. В лаборато-
рии биотехнологии ННЦ “ИЭКВМ” была создана
бивалентная культуральная живая вакцина против
болезни Марека из производственных штаммов
герпес-вируса кур SBG 2-го серотипа и герпес-ви-
руса индеек FC-126 3-го серотипа (регистрационное
свидетельство №1314-04-0188-05 от 18 октября
2005 г). Поскольку ВБМ является клеточно-связан-
ным, антигенные и иммуногенные свойства живой
вирус-вакцины зависят от жизнеспособности
клеток, в которых репродуцируется вирус.
Цель исследований – разработать оптимальную
систему криоконсервирования и хранения компо-
нентов вирус-вакцины против БМ в жизнеспо-
собной клетке.
Материалы и методы
Для накопления биомассы ВБМ использовали
первично трипсинизированную клеточную куль-
417 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Пушкинская, 83, г. Харьков, Украина 61023; тел.:+38 (057)
707-20-38, электронная почта: stegniy@vet.kharkov.ua
1Национальный научный центр “Институт экспериментальной и
клинической ветеринарной медицины”, г. Харьков
2Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
1National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical
Veterinary Medicine”, Kharkov, Ukraine
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
* To whom correspondence should be addressed: 83, Pushkinskaya
str., Kharkov, Ukraine 61023; tel.:+380 57 707 2038, e-mail:
stegniy@vet.kharkov.ua
418 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
туру, полученную из 10–11-суточных куриных
эмбрионов (КЭ). Культивирование клеток осущест-
вляли по стандартной методике [5, 7] в смеси
равных объемов среды 199 и среды Игла с добав-
лением 10% сыворотки крови крупного рогатого
скота (к.р.с.). Заражение клеточного монослоя
проводили по методу [5]. Культивирование инфи-
цированных вирусом клеток осуществлялось в под-
держивающей среде того же состава, но с 2% сы-
воротки к.р.с. В работе использовали производст-
венные штаммы SBG, вируса второго серотипа
(Gallid herpesvirus type 2), FC-126 третьего серотипа
(Turkey herpesvirus type 3), контрольный штамм JM
(Gallid herpesvirus type 1) болезни Марека.
Сохранность системы вирус-клетка контро-
лировали методом суправитального окрашивания
трипановым синим в камере Горяева [10]. Для
повышения сохранности и жизнеспособности
криоконсервированных клеток применяли криопро-
тектор димексид в конечных концентрациях от 2
до 10%. Инфицированные клетки криоконсерви-
ровали в криопробирках фирмы Nunk объемом 4–
4,5 мл на программном замораживателе произ-
водства СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины.
Инфекционную активность ВБМ определяли тит-
рованием на культуре клеток КЭ в культуральных
матрасах емкостью 50 см3. При этом заражение
проводили в объеме 0,5 см3 каждого десятикрат-
ного разведения вируса на 4–5 флаконов монослоя
клеток по стандартной методике [5]. После этого
инфицированную культуру инкубировали при
температуре 39°С в течение 4–5 суток со сменой
поддерживающей среды. По истечении 4–5 суток
после инфицирования монослой отмывали 0,5%
раствором уксусной кислоты с последующим
окрашиванием 0,1% раствором амидового черно-
го. Титр инфекционной активности вируса опреде-
ляли по среднему числу образовавшихся фокусов
(ФОЕ): Т=(ХФ1+ХФ2+ХФ3)×Р/N, где ХФ –
количество фокусов, подсчитанных в каждом мат-
расе с клетками, зараженными определенным раз-
ведением вируса; Р – разведение вируса; N – коли-
чество использованных для подсчета емкостей.
Результаты и обсуждение
Как показали немногочисленные исследования
возможности криоконсервирования инфициро-
ванных вирусом клеток для биотехнологии [6],
разработка оптимальных способов этого процесса
усложняется из-за суммирования криоповреж-
дений системы вирус-клетка и повреждений,
полученных клетками в процессе внутриклеточной
репродукции вируса. Существенное значение при
этом имеют скорость, с которой осуществляют
замораживание, конечная температура криокон-
сервирования и последующего хранения, выбор
криопротектора и отработка оптимальной концент-
рации его применения. Анализ данных литературы
показал, что для криоконсервирования переви-
ваемых клеточных линий с успехом применяют в
качестве криопротектора димексид или самосто-
ятельно, или как компонент в смеси криопротек-
торов [3, 8].
Штаммы SBG и FC-126 активно размножались
в первичной культуре клеток КЭ, проявляя при этом
цитопатический эффект в виде образования харак-
терных фокусов, состоящих из округлых клеток
(рисунок). После явного проявления цитопатичес-
кого эффекта монослой снимали со стекла смесью
раствора версена с трипсином с последующим
добавлением поддерживающей среды; центри-
фугировали 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную
жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в
защитной среде. Затем расфасовывали в крио-
пробирки и охлаждали на программном замо-
раживателе с применением быстрой со скоростью
300–400 град/мин (путем прямого погружения в
жидкий азот) и двухступенчатой программ: от тем-
пературы 4°С до –30°С со скоростью 1 град/мин;
от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с пос-
ледующим погружением в жидкий азот (–196°С).
В качестве сред криоконсервирования исполь-
зовали: поддерживающую среду; поддерживаю-
щую среду с добавлением 10% димексида; пита-
тельную среду 199 с добавлением 10% инактиви-
рованной сыворотки крови к.р.с. и 10% димексида.
Эффективность применяемых режимов криокон-
сервирования и криозащитных сред оценивали по
сохранности клеток и инфекционной активности
вируса. Если сохранность клеток не превышала
30%, данные криозащитные смеси и режимы замо-
раживания не считали удовлетворительными. Ис-
ходная концентрация инфицированных вирусом
клеток в криопробирках составляла 5–6 млн/см3.
Цитопатический эффект ВБМ в первичной культуре клеток
эмбрионов куриных фибробластов.
419 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
Результаты проведенных экспериментов пока-
зали, что применение быстрой программы криокон-
сервирования с использованием поддерживающей
среды и поддерживающей среды с добавлением
10% димексида не обеспечивало сохранности ин-
фицированных клеток выше 30%. Максимальная
сохранность инфицированных клеток, криоконсер-
вированных с применением быстрой программы и
среды консервирования, включающей 199 пита-
тельную среду с добавлением 10% инактивирован-
ной сыворотки крови к.р.с. и 10% димексида, сос-
тавляла 33,7%. В таблице представлены данные,
полученные в результате проведенных экспери-
ментов с применением двухступенчатой програм-
мы замораживания и вышеупомянутой криозащит-
ной среды, включающей 10% инактивированной
сыворотки крови к.р.с. и 10% димексида. Приме-
нение димексида в концентрации 15% в составе
той же криозащитной среды вызывало тенденцию
снижения инфекционной активности вируса. Как
видно из данных таблицы, применение двухэтап-
ного режима замораживания и среды консервиро-
вания, включающей 199 питательную среду с
добавлением 10% инактивированной сыворотки
крови к.р.с. и 10% димексида, позволяет получить
сохранность инфицированных клеток (не ниже
40%), которая обеспечивает инфекционную актив-
ность вакцинных штаммов ВБМ согласно ТУ У
24.4-00497087-015:2005.
Выводы
Разработан способ консервирования вируса
болезни Марека (декларативный патент на полез-
ную модель [9]), который заключается в примене-
нии двухэтапного режима замораживания: до –30°С
со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со
Инфекционная активность вакцинных штаммов ВБМ и сохранность инфицированных клеток ФЭК,
криоконсервированных с применением двухэтапного режима замораживания
Примечание: уровень значимости – p<0,005.
Литература
Криоконсервирование клеточных суспензий / Под общ.
ред. А.А. Цуцаевой и др.– Киев: Наук. думка, 1983.– 240 с.
Лукина В.А., Соловьёв Б.В., Быкова Н.Н. Современное
состояние и перспективы вакцинопрофилактики болезни
Марека // Научные основы производства ветеринарных
биологических препаратов: Тезисы докладов. – Щёлково,
2000.– С. 6–8.
Лярски З. Диагностика вирусных болезней животных /
Под ред. В.Н. Сюрина.– М.: Колос, 1980.– 399 с.
Самуйленко А.Я., Непоклонов Е.А., Соловьев Б.В. Инфек-
ционная патология животных. Т. 1.– М.: ИКЦ «Академ-
книга», 2006.– 1911 с.
Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии
и биотехнологии.– Киев: Урожай, 1993.– 151 с.
Стегний Б.Т. Сравнительное изучение криозащитного
эффекта различных криопротекторов для культур и
тканей // Актуальные проблемы ветеринарной виру-
сологии: Тезисы доклада научной конференции.– Вла-
димир, 1986.– С. 50–52.
Стегний М.Ю., Дикий И.Л., Стегний Б.Т. Особенности
криоконсервирования клеток, инфицированных виру-
сами // Експериментальна і клінічна медицина.– 1999.–
№2.– С. 111–113.
Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. Вирусные
болезни животных.– М., 1998.– 928 с.
Фрешни Р. Культура животных клеток: Методы. – М.: Мир,
1989.– 332 с.
Патент України на к/м № 4912, МПК7 С12 N7/00. Спосіб
консервування вірусу хвороби Марека / М.Ю. Стегній,
Б.Т. Стегній, О.В. Заремба. Заявлено 24.05.04; Опубл.
15.02.2005.– Бюл. №2.
Поступила 22.08.2008
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
скоростью 5–10 град/мин с последующим погруже-
нием в жидкий азот (–196°С) в таком составе
защитной среды: 80% питательной среды 199, 10%
инактивированной сыворотки крови к.р.с. и 10%
диметилсульфоксида.
МБВамматшеинавзаН елсопиктелкеыннархоС
%,яинавижаромзар
йонноицкефниртиТ
одМБВитсонвитка
мс/ЕОФ,яинавижаромаз 3
йонноицкефниртиТ
елсопитсонвитка
мс/ЕОФ,яинавижаромзар 3
GBS
57,0±7,24
52,1±7,34
52,1±2,74
52,1±2,14
4× 01 6
4× 01 6
6× 01 6
5× 01 6
71,1±39811
52,1±98811
52,1±08811
52,1±64811
621-CF
04,1±7,48
74,1±4,87
74,1±8,77
04,1±3,08
3,5 × 01 6
3,5 × 01 6
5,5 × 01 6
3,3 × 01 6
52,1±0463
52,1±0963
52,1±0063
71,1±9763
|