Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека
Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной ср...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2008 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69057 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека / М.Ю. Стегний, Б.Т. Стегний, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 417-419. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859592417144995840 |
|---|---|
| author | Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. |
| author_facet | Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. |
| citation_txt | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека / М.Ю. Стегний, Б.Т. Стегний, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 417-419. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной среды 199 с добавлением 10% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида.
Розроблено спосіб консервування вірусу хвороби Марека, що полягає в застосуванні двохетапного режиму заморожування до –30°С зі швидкістю 1 град/хв; від –30 до –70°С зі швидкістю 5–10 град/хв з наступним зануренням у рідкий азот (–196°С) у такому складі захисного середовища: 80% живильного середовища 199 з додаванням 10% інактивованої сироватки крові великої рогатої худоби і 10% диметилсульфоксиду.
The cryopreservation method, consisting in application of two-stage freezing regimen down to -30°C with 1°C/min rate, from -30 down to –70°C with 5–10°C/min rate with following plunging into liquid nitrogen (–196°C) at that composition of protective media 199 nutrient media 80% with adding of inactivated serum of cattle blood 10% and dimethyl sulfoxide 10% has been developed for Marek’s disease virus.
|
| first_indexed | 2025-11-27T16:35:28Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 57.043;578.71
М.Ю. СТЕГНИЙ1*, Б.Т. СТЕГНИЙ1, А.Н. ГОЛЬЦЕВ2
Разработка способа криоконсервирования
вируса болезни Марека
UDC 57.043;578.71
M.YU. STEGNIY1*, B.T. STEGNIY1, A.N. GOLTSEV2
Developing of Cryopreservation Method
of Marek’s Disease Virus
Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима
замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением
в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной среды 199 с добавлением 10% инактивированной
сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида.
Ключевые слова: консервирование вируса болезни Марека, вакцина.
Розроблено спосіб консервування вірусу хвороби Марека, що полягає в застосуванні двохетапного режиму заморожування
до –30°С зі швидкістю 1 град/хв; від –30 до –70°С зі швидкістю 5–10 град/хв з наступним зануренням у рідкий азот (–196°С)
у такому складі захисного середовища: 80% живильного середовища 199 з додаванням 10% інактивованої сироватки крові
великої рогатої худоби і 10% диметилсульфоксиду.
Ключові слова: консервування вірусу хвороби Марека, вакцина.
The cryopreservation method, consisting in application of two-stage freezing regimen down to -30°C with 1°C/min rate, from -30
down to –70°C with 5–10°C/min rate with following plunging into liquid nitrogen (–196°C) at that composition of protective media 199
nutrient media 80% with adding of inactivated serum of cattle blood 10% and dimethyl sulfoxide 10% has been developed for Marek’s
disease virus.
Key-words: cryopreservation of Marek’s disease virus, vaccine.
Болезнь Марека (БМ) – это высококонтагиозное
заболевание кур и индеек. Существует 2 формы
течения болезни: первая, классическая – характе-
ризуется поражением периферической и централь-
ной нервной системы; вторая, острая – лейкозом и
образованием лимфоидных опухолей. В 1961 году
болезнь получила название по имени профессора
Королевского Венгерского университета Ж. Маре-
ка, которым впервые была описана. До применения
вакцинопрофилактики БМ наносила громадный
экономический ущерб во всех странах мира. Ви-
русная природа болезни была доказана в 1967 г.
Возбудитель БМ (ВБМ) относится к семейству
герпес-вирусов c кубическим типом симметрии и
формой икосаэдра [1]. Вирус имеет три серотипа:
к первому относятся вирусы, способные вызывать
лимфомы у птиц, а также аттенуированные его ва-
рианты. Природноослабленные неонкогенные ви-
русы БМ второго серотипа обладают протектив-
ными свойствами, поэтому используются как
усиливающие иммунный ответ компоненты в бива-
лентных вакцинах [2]. Третий серотип ВБМ пред-
ставлен антигенно родственными вирусами герпе-
са индеек. Основой профилактики БМ является
вакцинация бивалентными, поливалентными гете-
рологичными живыми вакцинами [4]. В лаборато-
рии биотехнологии ННЦ “ИЭКВМ” была создана
бивалентная культуральная живая вакцина против
болезни Марека из производственных штаммов
герпес-вируса кур SBG 2-го серотипа и герпес-ви-
руса индеек FC-126 3-го серотипа (регистрационное
свидетельство №1314-04-0188-05 от 18 октября
2005 г). Поскольку ВБМ является клеточно-связан-
ным, антигенные и иммуногенные свойства живой
вирус-вакцины зависят от жизнеспособности
клеток, в которых репродуцируется вирус.
Цель исследований – разработать оптимальную
систему криоконсервирования и хранения компо-
нентов вирус-вакцины против БМ в жизнеспо-
собной клетке.
Материалы и методы
Для накопления биомассы ВБМ использовали
первично трипсинизированную клеточную куль-
417 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Пушкинская, 83, г. Харьков, Украина 61023; тел.:+38 (057)
707-20-38, электронная почта: stegniy@vet.kharkov.ua
1Национальный научный центр “Институт экспериментальной и
клинической ветеринарной медицины”, г. Харьков
2Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
1National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical
Veterinary Medicine”, Kharkov, Ukraine
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
* To whom correspondence should be addressed: 83, Pushkinskaya
str., Kharkov, Ukraine 61023; tel.:+380 57 707 2038, e-mail:
stegniy@vet.kharkov.ua
418 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
туру, полученную из 10–11-суточных куриных
эмбрионов (КЭ). Культивирование клеток осущест-
вляли по стандартной методике [5, 7] в смеси
равных объемов среды 199 и среды Игла с добав-
лением 10% сыворотки крови крупного рогатого
скота (к.р.с.). Заражение клеточного монослоя
проводили по методу [5]. Культивирование инфи-
цированных вирусом клеток осуществлялось в под-
держивающей среде того же состава, но с 2% сы-
воротки к.р.с. В работе использовали производст-
венные штаммы SBG, вируса второго серотипа
(Gallid herpesvirus type 2), FC-126 третьего серотипа
(Turkey herpesvirus type 3), контрольный штамм JM
(Gallid herpesvirus type 1) болезни Марека.
Сохранность системы вирус-клетка контро-
лировали методом суправитального окрашивания
трипановым синим в камере Горяева [10]. Для
повышения сохранности и жизнеспособности
криоконсервированных клеток применяли криопро-
тектор димексид в конечных концентрациях от 2
до 10%. Инфицированные клетки криоконсерви-
ровали в криопробирках фирмы Nunk объемом 4–
4,5 мл на программном замораживателе произ-
водства СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины.
Инфекционную активность ВБМ определяли тит-
рованием на культуре клеток КЭ в культуральных
матрасах емкостью 50 см3. При этом заражение
проводили в объеме 0,5 см3 каждого десятикрат-
ного разведения вируса на 4–5 флаконов монослоя
клеток по стандартной методике [5]. После этого
инфицированную культуру инкубировали при
температуре 39°С в течение 4–5 суток со сменой
поддерживающей среды. По истечении 4–5 суток
после инфицирования монослой отмывали 0,5%
раствором уксусной кислоты с последующим
окрашиванием 0,1% раствором амидового черно-
го. Титр инфекционной активности вируса опреде-
ляли по среднему числу образовавшихся фокусов
(ФОЕ): Т=(ХФ1+ХФ2+ХФ3)×Р/N, где ХФ –
количество фокусов, подсчитанных в каждом мат-
расе с клетками, зараженными определенным раз-
ведением вируса; Р – разведение вируса; N – коли-
чество использованных для подсчета емкостей.
Результаты и обсуждение
Как показали немногочисленные исследования
возможности криоконсервирования инфициро-
ванных вирусом клеток для биотехнологии [6],
разработка оптимальных способов этого процесса
усложняется из-за суммирования криоповреж-
дений системы вирус-клетка и повреждений,
полученных клетками в процессе внутриклеточной
репродукции вируса. Существенное значение при
этом имеют скорость, с которой осуществляют
замораживание, конечная температура криокон-
сервирования и последующего хранения, выбор
криопротектора и отработка оптимальной концент-
рации его применения. Анализ данных литературы
показал, что для криоконсервирования переви-
ваемых клеточных линий с успехом применяют в
качестве криопротектора димексид или самосто-
ятельно, или как компонент в смеси криопротек-
торов [3, 8].
Штаммы SBG и FC-126 активно размножались
в первичной культуре клеток КЭ, проявляя при этом
цитопатический эффект в виде образования харак-
терных фокусов, состоящих из округлых клеток
(рисунок). После явного проявления цитопатичес-
кого эффекта монослой снимали со стекла смесью
раствора версена с трипсином с последующим
добавлением поддерживающей среды; центри-
фугировали 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную
жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в
защитной среде. Затем расфасовывали в крио-
пробирки и охлаждали на программном замо-
раживателе с применением быстрой со скоростью
300–400 град/мин (путем прямого погружения в
жидкий азот) и двухступенчатой программ: от тем-
пературы 4°С до –30°С со скоростью 1 град/мин;
от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с пос-
ледующим погружением в жидкий азот (–196°С).
В качестве сред криоконсервирования исполь-
зовали: поддерживающую среду; поддерживаю-
щую среду с добавлением 10% димексида; пита-
тельную среду 199 с добавлением 10% инактиви-
рованной сыворотки крови к.р.с. и 10% димексида.
Эффективность применяемых режимов криокон-
сервирования и криозащитных сред оценивали по
сохранности клеток и инфекционной активности
вируса. Если сохранность клеток не превышала
30%, данные криозащитные смеси и режимы замо-
раживания не считали удовлетворительными. Ис-
ходная концентрация инфицированных вирусом
клеток в криопробирках составляла 5–6 млн/см3.
Цитопатический эффект ВБМ в первичной культуре клеток
эмбрионов куриных фибробластов.
419 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
Результаты проведенных экспериментов пока-
зали, что применение быстрой программы криокон-
сервирования с использованием поддерживающей
среды и поддерживающей среды с добавлением
10% димексида не обеспечивало сохранности ин-
фицированных клеток выше 30%. Максимальная
сохранность инфицированных клеток, криоконсер-
вированных с применением быстрой программы и
среды консервирования, включающей 199 пита-
тельную среду с добавлением 10% инактивирован-
ной сыворотки крови к.р.с. и 10% димексида, сос-
тавляла 33,7%. В таблице представлены данные,
полученные в результате проведенных экспери-
ментов с применением двухступенчатой програм-
мы замораживания и вышеупомянутой криозащит-
ной среды, включающей 10% инактивированной
сыворотки крови к.р.с. и 10% димексида. Приме-
нение димексида в концентрации 15% в составе
той же криозащитной среды вызывало тенденцию
снижения инфекционной активности вируса. Как
видно из данных таблицы, применение двухэтап-
ного режима замораживания и среды консервиро-
вания, включающей 199 питательную среду с
добавлением 10% инактивированной сыворотки
крови к.р.с. и 10% димексида, позволяет получить
сохранность инфицированных клеток (не ниже
40%), которая обеспечивает инфекционную актив-
ность вакцинных штаммов ВБМ согласно ТУ У
24.4-00497087-015:2005.
Выводы
Разработан способ консервирования вируса
болезни Марека (декларативный патент на полез-
ную модель [9]), который заключается в примене-
нии двухэтапного режима замораживания: до –30°С
со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со
Инфекционная активность вакцинных штаммов ВБМ и сохранность инфицированных клеток ФЭК,
криоконсервированных с применением двухэтапного режима замораживания
Примечание: уровень значимости – p<0,005.
Литература
Криоконсервирование клеточных суспензий / Под общ.
ред. А.А. Цуцаевой и др.– Киев: Наук. думка, 1983.– 240 с.
Лукина В.А., Соловьёв Б.В., Быкова Н.Н. Современное
состояние и перспективы вакцинопрофилактики болезни
Марека // Научные основы производства ветеринарных
биологических препаратов: Тезисы докладов. – Щёлково,
2000.– С. 6–8.
Лярски З. Диагностика вирусных болезней животных /
Под ред. В.Н. Сюрина.– М.: Колос, 1980.– 399 с.
Самуйленко А.Я., Непоклонов Е.А., Соловьев Б.В. Инфек-
ционная патология животных. Т. 1.– М.: ИКЦ «Академ-
книга», 2006.– 1911 с.
Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии
и биотехнологии.– Киев: Урожай, 1993.– 151 с.
Стегний Б.Т. Сравнительное изучение криозащитного
эффекта различных криопротекторов для культур и
тканей // Актуальные проблемы ветеринарной виру-
сологии: Тезисы доклада научной конференции.– Вла-
димир, 1986.– С. 50–52.
Стегний М.Ю., Дикий И.Л., Стегний Б.Т. Особенности
криоконсервирования клеток, инфицированных виру-
сами // Експериментальна і клінічна медицина.– 1999.–
№2.– С. 111–113.
Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. Вирусные
болезни животных.– М., 1998.– 928 с.
Фрешни Р. Культура животных клеток: Методы. – М.: Мир,
1989.– 332 с.
Патент України на к/м № 4912, МПК7 С12 N7/00. Спосіб
консервування вірусу хвороби Марека / М.Ю. Стегній,
Б.Т. Стегній, О.В. Заремба. Заявлено 24.05.04; Опубл.
15.02.2005.– Бюл. №2.
Поступила 22.08.2008
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
скоростью 5–10 град/мин с последующим погруже-
нием в жидкий азот (–196°С) в таком составе
защитной среды: 80% питательной среды 199, 10%
инактивированной сыворотки крови к.р.с. и 10%
диметилсульфоксида.
МБВамматшеинавзаН елсопиктелкеыннархоС
%,яинавижаромзар
йонноицкефниртиТ
одМБВитсонвитка
мс/ЕОФ,яинавижаромаз 3
йонноицкефниртиТ
елсопитсонвитка
мс/ЕОФ,яинавижаромзар 3
GBS
57,0±7,24
52,1±7,34
52,1±2,74
52,1±2,14
4× 01 6
4× 01 6
6× 01 6
5× 01 6
71,1±39811
52,1±98811
52,1±08811
52,1±64811
621-CF
04,1±7,48
74,1±4,87
74,1±8,77
04,1±3,08
3,5 × 01 6
3,5 × 01 6
5,5 × 01 6
3,3 × 01 6
52,1±0463
52,1±0963
52,1±0063
71,1±9763
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69057 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-27T16:35:28Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. 2014-10-04T14:47:33Z 2014-10-04T14:47:33Z 2008 Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека / М.Ю. Стегний, Б.Т. Стегний, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 417-419. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69057 57.043;578.71 Разработан способ консервирования вируса болезни Марека, который заключается в применении двухэтапного режима замораживания до –30°С со скоростью 1 град/мин; от –30 до –70°С со скоростью 5–10 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (–196°С) в таком составе защитной среды: 80% питательной среды 199 с добавлением 10% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Розроблено спосіб консервування вірусу хвороби Марека, що полягає в застосуванні двохетапного режиму заморожування до –30°С зі швидкістю 1 град/хв; від –30 до –70°С зі швидкістю 5–10 град/хв з наступним зануренням у рідкий азот (–196°С) у такому складі захисного середовища: 80% живильного середовища 199 з додаванням 10% інактивованої сироватки крові великої рогатої худоби і 10% диметилсульфоксиду. The cryopreservation method, consisting in application of two-stage freezing regimen down to -30°C with 1°C/min rate, from -30 down to –70°C with 5–10°C/min rate with following plunging into liquid nitrogen (–196°C) at that composition of protective media 199 nutrient media 80% with adding of inactivated serum of cattle blood 10% and dimethyl sulfoxide 10% has been developed for Marek’s disease virus. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека Developing of Cryopreservation Method of Marek’s Disease Virus Article published earlier |
| spellingShingle | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека Стегний, М.Ю. Стегний, Б.Т. Гольцев, А.Н. Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| title | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_alt | Developing of Cryopreservation Method of Marek’s Disease Virus |
| title_full | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_fullStr | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_full_unstemmed | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_short | Разработка способа криоконсервирования вируса болезни Марека |
| title_sort | разработка способа криоконсервирования вируса болезни марека |
| topic | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| topic_facet | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69057 |
| work_keys_str_mv | AT stegniimû razrabotkasposobakriokonservirovaniâvirusaboleznimareka AT stegniibt razrabotkasposobakriokonservirovaniâvirusaboleznimareka AT golʹcevan razrabotkasposobakriokonservirovaniâvirusaboleznimareka AT stegniimû developingofcryopreservationmethodofmareksdiseasevirus AT stegniibt developingofcryopreservationmethodofmareksdiseasevirus AT golʹcevan developingofcryopreservationmethodofmareksdiseasevirus |