Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий
Экспериментально обоснованы условия криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий разных родов. Максимальную жизнеспособность в условиях экспериментов обеспечивала среда Н3ТА с добавлением ДМСО и тиомочевины. Хранение образцов при температуре жидкого азота в течение 5 лет (срок наблюдения) не...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2008 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69059 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий / И.П. Высеканцев, Т.М. Гурина, А.Л. Кирилюк, Е.В. Кудокоцева, С.В. Бирюкова // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 423-425. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859706162460491776 |
|---|---|
| author | Высеканцев, И.П. Гурина, Т.М. Кирилюк, А.Л. Кудокоцева, Е.В. Бирюкова, С.В. |
| author_facet | Высеканцев, И.П. Гурина, Т.М. Кирилюк, А.Л. Кудокоцева, Е.В. Бирюкова, С.В. |
| citation_txt | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий / И.П. Высеканцев, Т.М. Гурина, А.Л. Кирилюк, Е.В. Кудокоцева, С.В. Бирюкова // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 423-425. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Экспериментально обоснованы условия криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий разных родов. Максимальную жизнеспособность в условиях экспериментов обеспечивала среда Н3ТА с добавлением ДМСО и тиомочевины. Хранение образцов при температуре жидкого азота в течение 5 лет (срок наблюдения) не влияло на исходные биологические свойства бактерий.
Експериментально обгрунтовані умови кріоконсервування аспорогенних анаеробних бактерій різних родів. Максимальну життєздатність в умовах експериментів забезпечувало середовище Н3ТА з додаванням ДМСО і тіомочевини. Зберігання зразків при температурі рідкого азоту протягом 5 років (термін спостереження) не впливало на вихідні біологічні властивості бактерій.
The cryopreservation conditions for asporogenic anaerobic bacteria of different genera have been experimentally established. The H3TA medium provides a high viability at experimental conditions with adding DMSO and thiourea. The storage of samples at temperature of liquid nitrogen during 5 years (observation term) had no effect on initial biological properties of bacteria.
|
| first_indexed | 2025-12-01T03:14:02Z |
| format | Article |
| fulltext |
423 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
УДК 57.043:579.61
И.П. ВЫСЕКАНЦЕВ1*, Т.М. ГУРИНА1, А.Л. КИРИЛЮК1, Е.В. КУДОКОЦЕВА1, С.В. БИРЮКОВА2
Современное состояние проблемы криоконсервирования
аспорогенных анаэробных бактерий
UDC 57.043:579.61
I.P. VYSEKANTSEV1*, T.M. GURINA1, A.L. KIRILYUK1, E.V. KUDOKOTSEVA1, S.V. BIRYUKOVA2
Current State in Cryopreservation
of Asporogenic and Anaerobic Bacteria
Экспериментально обоснованы условия криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий разных родов. Макси-
мальную жизнеспособность в условиях экспериментов обеспечивала среда Н3ТА с добавлением ДМСО и тиомочевины. Хра-
нение образцов при температуре жидкого азота в течение 5 лет (срок наблюдения) не влияло на исходные биологические
свойства бактерий.
Ключевые слова: криоконсервирование, анаэробные бактерии.
Експериментально обгрунтовані умови кріоконсервування аспорогенних анаеробних бактерій різних родів. Максимальну
життєздатність в умовах експериментів забезпечувало середовище Н3ТА з додаванням ДМСО і тіомочевини. Зберігання
зразків при температурі рідкого азоту протягом 5 років (термін спостереження) не впливало на вихідні біологічні властивості
бактерій.
Ключові слова: кріоконсервування, анаеробні бактерії.
The cryopreservation conditions for asporogenic anaerobic bacteria of different genera have been experimentally established. The
H3TA medium provides a high viability at experimental conditions with adding DMSO and thiourea. The storage of samples at
temperature of liquid nitrogen during 5 years (observation term) had no effect on initial biological properties of bacteria.
Key-words: cryopreservation, anaerobic bacteria.
Проблема гнойно-воспалительных инфекций
приобрела социальную значимость в связи с их зна-
чительным распространением, трудностями диаг-
ностики, этиотропной терапии и специфической про-
филактики. Этиологическими агентами гнойно-
воспалительных заболеваний наиболее часто яв-
ляются аспорогенные анаэробные бактерии. Преи-
мущественное количество анаэробных инфекций
имеет эндогенный характер. Это обусловлено сни-
жением иммунной реактивности макроорганизма
и повышением множественной лекарственной
устойчивости среди клинически значимых видов
аспорогенных анаэробных бактерий [2, 5]. В связи
с этим возросла необходимость создания коллекций
клинических изолятов аспорогенных анаэробных
бактерий, с помощью которых проводится эпиде-
миологический анализ участия разных родов и ви-
дов бактерий в заболеваемости населения, изу-
чаются факторы вирулентности, патогенности и
антибиотикорезистентности, исследуются меха-
низмы патогенеза, разрабатываются рациональ-
ные схемы этиотропной терапии и специфической
профилактики.
Наиболее распространенные методы хранения
аспорогенных анаэробных бактерий – периодичес-
кие пересевы с последующим хранением в усло-
виях гипотермии под слоем минерального масла и
лиофилизация [5]. Указанные методы имеют не-
достатки, приводящие к потере штаммов и конта-
минации хранящихся культур. Кроме того, срок
хранения культур при использовании этих методов
может быть ограничен. Для хранения аспороген-
ных анаэробных бактерий более перспективно
криоконсервирование. Однако до настоящего вре-
мени технология криоконсервирования данных
бактерий не разработана и недостаточно экспери-
ментально обоснована вследствие сложности куль-
тивирования, необходимости соблюдения анаэро-
биоза при всех манипуляциях во время экспе-
риментов. К тому же анаэробные бактерии не вы-
рабатывают ферменты, расщепляющие токсичес-
кие соединения кислорода, что является допол-
нительным повреждающим фактором.
Цель исследования – изучение влияния режи-
мов охлаждения и состава защитной среды на
жизнеспособность аспорогенных анаэробных бак-
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
1Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
2Харьковская медицинская академия последипломного
образования АМН Украины
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Kharkov Medical Academy of Post-Diploma Education of
Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
424 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
терий различных родов; исследование жизне-
способности и сохранности их биологических
свойств в процессе низкотемпературного хранения.
Материалы и методы
Объектом исследования служили клинические
изоляты бактерий Bacteroides fragilis, Pepto-
streptococcus anaerobius, Fusobacterium necro-
forum. Бактерии культивировали в течение 4 суток
при 37° C на агаризированных средах [1] в анаэрос-
тате. Газовая среда культивирования содержала
80% N2, 10% H2, 10% CO2. Жизнеспособность бак-
терий определяли чашечным методом Коха [2]. В
качестве среды консервирования применяли рос-
товую среду НЗТА с добавками менадиона, геми-
на, твина-80 [1]. При исследовании антиоксидант-
ного действия тиомочевины последнюю добавляли
в концентрации 2%. В экспериментах использовали
ДМСО с конечной концентрацией 5, 10, 15%.
Образцы охлаждали по трем программам: 1 –
охлаждение со скоростью 2°С/мин от 20 до –30°С
с последующим погружением в жидкий азот; 2 –
охлаждение со скоростью 2°С/мин от 20 до –30°С,
затем со средней скоростью 20–25°С/мин от –30
до –80°С и погружение в жидкий азот; 3 – охлаж-
дение со скоростью 2°С/мин от 20 до –30°С, затем
со скоростью 1°С/мин от –30 до –80°С и погруже-
ние в жидкий азот.
Образцы замораживали в криопробирках (Nunc,
США) объемом 1,8 мл на программном заморажи-
вателе “Cryoson” (Германия), отогревали на водя-
ной бане при температуре 40°С.
Биологические свойства бактерий изучали по
методикам, описанным в [1, 3–5].
При изучении возможного влияния колебаний
температуры хранения на жизнеспособность крио-
консервированных бактерий часть замороженных
до –196°С образцов подвергали циклическому из-
менению температуры хранения. Один цикл – хра-
нение образцов в течение 16 ч в жидком азоте с
последующим переносом на 8 ч в пары жидкого
азота при температуре –150 или –130, или –100°С,
затем перенос образцов в жидкий азот.
Статистическую обработку полученных резуль-
татов проводили по общепринятым методам [6].
Результаты и обсуждение
Установлено, что наиболее высокой исходной
криоустойчивостью обладают бактерии P. аnaero-
bius. Количество жизнеспособных бактерий B.
fragilis и F. necroforum после замораживания было
достоверно ниже. При добавлении в среду консер-
вирования НЗТА криопротектора ДМСО во всех
использовавшихся концентрациях достоверно
повышалась жизнеспособность бактерий изучав-
щихся родов. Добавление в среду консервирования
антиоксиданта тиомочевины также обеспечивало
повышение жизнеспособности бактерий после
криоконсервирования. В экспериментах с использо-
ванием криопротектора ДМСО наиболее высокая
жизнеспособность отмечена после охлаждения по
программе 2. Количество жизнеспособных бакте-
рий, охлажденных по программе 3, было достовер-
но ниже. Минимальные показатели жизнеспособ-
ности получены после охлаждения по программе 1.
Хранение при постоянной температуре жидкого
азота образцов исследуемых видов бактерий в
среде НЗТА и в среде НЗТА с добавлением ди-
мексида или тиомочевины дополнительной гибели
бактерий в течение 5 лет (срок наблюдения) не
вызывало.
При искусственно созданном циклическом
колебании температуры хранения показано, что
неоднократные циклы повышения температуры до
–130 и –100°С приводили к дополнительной гибели
клеток. Количество погибших клеток увеличива-
лось с повышением температурного градиента и
возрастанием числа циклов колебания темпера-
туры. Изменение температуры хранения от –196
до –150°С к дополнительной гибели клеток не при-
водило.
Хранение образцов при постоянной температуре
–196°С в течение 5 лет обеспечивало сохранность
исходных генетически детерминированных свойств
бактерий. Не изменялись способность к флюорес-
ценции бактерий, характер роста на селективных
средах, антибиотикочувствительность, а также
синтез ферментов, которые участвуют в утилиза-
ции сахаров и многоатомных спиртов, продукции
индола, сероводорода, каталазы, уреазы, редукции
нитратов, гидролизе эскулина, крахмала и обеспе-
чивают свертывание молока.
Полученные результаты свидетельствуют о
высокой эффективности технологии криоконсер-
вирования при долгосрочном хранении аспороген-
ных анаэробных бактерий. Жизнеспособность
аспорогенных анаэробных бактерий в процессе
криоконсервирования зависит от исходных морфо-
функциональных свойств клеток, обусловленных
принадлежностью к определенному роду или виду,
а также от режима охлаждения, состава среды
консервирования. Ростовая среда НЗТА обеспе-
чивает высокие показатели жизнеспособности
аспорогенных анаэробных бактерий в процессе
криоконсервирования. При добавлении в эту среду
антиоксиданта тиомочевины или криопротектора
ДМСО увеличивается количество жизнеспособных
криоконсервированных бактерий. В представ-
ленных исследованиях установлено, что режим
охлаждения влияет на жизнеспособность бактерий
при температуре ниже –40°С. Предполагается, что
в субэвтектическом интервале температур воз-
425 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
можна кристаллизация раствора криопротектора
эвтектической концентрации, в нашем случае
раствора ДМСО. Скорость охлаждения в этом тем-
пературном интервале также влияет на форми-
рование конечной структуры замораживаемого
объекта и сохранность криоконсервированных
клеток [7]. Колебания температуры хранения от
–130°С и выше приводят к дополнительной гибели
криоконсервированных клеток.
Выводы
1. Криоконсервирование обеспечивает высокую
жизнеспособность и сохранность исходных биоло-
гических свойств аспорогенных анаэробных бакте-
рий в течение срока наблюдения (не менее 5 лет).
2. На жизнеспособность криоконсервированных
аспорогенных анаэробных бактерий влияют состав
среды консервирования, режим охлаждения, родо-
вые и видовые особенности строения и функцио-
нальной активности клеток. Высокие показатели
сохранности исследованных криоконсервирован-
ных бактерий обеспечивала среда консервирова-
ния НЗТА с добавлением ДМСО в концентрации
5–10% и тиомочевины.
3. Достоверное влияние на жизнеспособность
аспорогенных анаэробных бактерий оказывает
скорость охлаждения в субэвтектическом интерва-
ле температур растворов криопротектора ДМСО.
Наиболее высокая жизнеспособность бактерий
была получена при охлаждении в этом интервале
со скоростью 20–25°С/мин.
Литература
Дяченко В.Ф., Бірюкова С.В., Старобінець З.Т. та інш.
Лабораторна діагностика гнійно-запалювальних захво-
рювань, обумовлених аспорогенними анаеробними
мікрорганізмами: Методичні рекомендації.– Харків, 2000.–
35 с.
Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспо-
собности микроорганизмов.– Пущино: ОНТИ НЦБИ АН
СССР, 1990.– 186 с.
Определитель бактерий Берджи. Т.1 / Под ред.
Дж. Хоулта и др.– М.: Мир, 1997.– 432 с.
Определитель бактерий Берджи. Т.2 / Под ред. Дж. Хоулта
и др.– М.: Мир, 1997.– 368 с.
Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. акад.
В.И. Покровского.– М.: ГЭОТАР – МЕД, 2001.– 768 с.
Статистична обробка результатів біологічних
експериментів: Навч. посібник.– Донецьк, 1999.– 186 с.
Kyryliuk A.L., Osetsky A.I., Gurina T.M. Psysical substan-
tiation of thee-step freeze-thawing as optimal regimen for
changing temperature during biological system cryope-
rservation // Proceedings of the 43rd Annual Meeting of the
Society for Cryobiology CRYO 2006.– Hamburg, 2006.– Р. 15.
Поступила 01.07.2008
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
4. Для долгосрочного хранения криолабильных
бактерий необходимо поддержание стабильной
температуры –196...–150°С.
Исследование выполнено в рамках проекта Госу-
дарственного фонда фундаментальных исследований
Украины №14.4/027.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69059 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-01T03:14:02Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Высеканцев, И.П. Гурина, Т.М. Кирилюк, А.Л. Кудокоцева, Е.В. Бирюкова, С.В. 2014-10-04T14:53:03Z 2014-10-04T14:53:03Z 2008 Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий / И.П. Высеканцев, Т.М. Гурина, А.Л. Кирилюк, Е.В. Кудокоцева, С.В. Бирюкова // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 423-425. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69059 57.043:579.61 Экспериментально обоснованы условия криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий разных родов. Максимальную жизнеспособность в условиях экспериментов обеспечивала среда Н3ТА с добавлением ДМСО и тиомочевины. Хранение образцов при температуре жидкого азота в течение 5 лет (срок наблюдения) не влияло на исходные биологические свойства бактерий. Експериментально обгрунтовані умови кріоконсервування аспорогенних анаеробних бактерій різних родів. Максимальну життєздатність в умовах експериментів забезпечувало середовище Н3ТА з додаванням ДМСО і тіомочевини. Зберігання зразків при температурі рідкого азоту протягом 5 років (термін спостереження) не впливало на вихідні біологічні властивості бактерій. The cryopreservation conditions for asporogenic anaerobic bacteria of different genera have been experimentally established. The H3TA medium provides a high viability at experimental conditions with adding DMSO and thiourea. The storage of samples at temperature of liquid nitrogen during 5 years (observation term) had no effect on initial biological properties of bacteria. Исследование выполнено в рамках проекта Государственного фонда фундаментальных исследований Украины №14.4/027. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий Current State of Cryopreservation Problem of Asporogenic and Anaerobic Bacteria Article published earlier |
| spellingShingle | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий Высеканцев, И.П. Гурина, Т.М. Кирилюк, А.Л. Кудокоцева, Е.В. Бирюкова, С.В. Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| title | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий |
| title_alt | Current State of Cryopreservation Problem of Asporogenic and Anaerobic Bacteria |
| title_full | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий |
| title_fullStr | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий |
| title_full_unstemmed | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий |
| title_short | Современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий |
| title_sort | современное состояние проблемы криоконсервирования аспорогенных анаэробных бактерий |
| topic | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| topic_facet | Секция «Низкотемпературное консервирование биологических объектов» |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69059 |
| work_keys_str_mv | AT vysekancevip sovremennoesostoânieproblemykriokonservirovaniâasporogennyhanaérobnyhbakterii AT gurinatm sovremennoesostoânieproblemykriokonservirovaniâasporogennyhanaérobnyhbakterii AT kirilûkal sovremennoesostoânieproblemykriokonservirovaniâasporogennyhanaérobnyhbakterii AT kudokocevaev sovremennoesostoânieproblemykriokonservirovaniâasporogennyhanaérobnyhbakterii AT birûkovasv sovremennoesostoânieproblemykriokonservirovaniâasporogennyhanaérobnyhbakterii AT vysekancevip currentstateofcryopreservationproblemofasporogenicandanaerobicbacteria AT gurinatm currentstateofcryopreservationproblemofasporogenicandanaerobicbacteria AT kirilûkal currentstateofcryopreservationproblemofasporogenicandanaerobicbacteria AT kudokocevaev currentstateofcryopreservationproblemofasporogenicandanaerobicbacteria AT birûkovasv currentstateofcryopreservationproblemofasporogenicandanaerobicbacteria |