Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758
Исследовали выживаемость эмбрионов вьюна на стадии поздней бластулы после микроинъекции криопротекторов ДМСО, ПЭО-100, ПЭО-1500 и формамида (ФА) в область перивителлинового пространства (ПП) и желточного мешка (ЖМ). Установлено, что при введении ДМСО, ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях 10, 50 и 95%...
Gespeichert in:
| Datum: | 2008 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69080 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 / К.Б. Миксон, Е.Ф. Копейка, В.И. Грищенко // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 509-514. — Бібліогр.: 33 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69080 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-690802025-02-09T14:15:18Z Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 Effect of Microinjection of Cryoprotective Agents on Survival of Misgurnus Fossilis L. Loach Embryos, 1758 Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Грищенко, В.И. Секция «Новые репродуктивные криотехнологии в медицине и животноводстве» Исследовали выживаемость эмбрионов вьюна на стадии поздней бластулы после микроинъекции криопротекторов ДМСО, ПЭО-100, ПЭО-1500 и формамида (ФА) в область перивителлинового пространства (ПП) и желточного мешка (ЖМ). Установлено, что при введении ДМСО, ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях 10, 50 и 95% в область ПП и при последующей 30-минутной инкубации в 0,88 и 0,29 М сахарозе уровень выживаемости снижался: 58,4–48,5, 74,4–53,9 и 79,63–59,6% соответственно. У ФА уровень выживаемости при тех же условиях снижался с 7 до 3,6%. При введении ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях 10, 50 и 95% в область ЖМ при 30-минутной инкубации в 0,88 и 0,29 М сахарозе уровень выживаемости не имел статистически значимых отличий и был выше, чем при введении ДМСО и ФА. Досліджували виживаність ембріонів в’юна на стадії пізньої бластули після мікроін’єкції кріопротекторів ДМСО, ПЕО-100, ПЕО-1500 і формаміду (ФА) в зону перивітелінового простору (ПП) та жовткового мішка (ЖМ). Встановлено, що при введенні ДМСО, ПЕО-100 і ПЕО-1500 в концентраціях 10, 50 і 95% в зону ПП і при подальшій 30-хвилинній інкубації в 0,88 і 0,29 М сахарозі рівень виживаності знижувався: 58,4–48,5, 74,4–53,9 і 79,63–59,6% відповідно. У ФА рівень виживаності за тих же умов знижувався з 7 до 3,6%. При введенні ПЕО-100 і ПЕО-1500 в концентраціях 10, 50 і 95% в зону ЖМ і при 30-хвилинній інкубації в 0,88 і 0,29 М сахарозі рівень виживаності не мав статистично значних відмінностей і був вище, ніж при введенні ДМСО і ФА. Investigated survival rate of loach embryos at a stage late epibole after a microinjection of DMSO, PEG-100, PEG-1500 and formamide (FA) cryoprotectants in area of perivitelline spaces (PS) and yolk sac (YS). It is established that at introduction of DMSO, PEG-100 and PEG-1500 in concentration of 10, 50 and 95 % in area of PS and at the subsequent 30-minute incubation in 0,88 and 0,29 M to sucrose, survival rate level decreased: 58,4–48,5, 74,4–53,9 and 79,63–59,6 % accordingly. At FA survival rate level under the same conditions decreased from 7 to 3,6 %. At introduction of PEG-100 and PEG-1500 in concentration 10, 50 and 95 % in YS area at 30-minute incubation in 0,88 and 0,29 M to sucrose level of survival rate had no statistically significant differences and was higher, than at introduction of DMSO and FA. 2008 Article Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 / К.Б. Миксон, Е.Ф. Копейка, В.И. Грищенко // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 509-514. — Бібліогр.: 33 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69080 547.569.2:597.554.3 – 131.7 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Секция «Новые репродуктивные криотехнологии в медицине и животноводстве» Секция «Новые репродуктивные криотехнологии в медицине и животноводстве» |
| spellingShingle |
Секция «Новые репродуктивные криотехнологии в медицине и животноводстве» Секция «Новые репродуктивные криотехнологии в медицине и животноводстве» Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Грищенко, В.И. Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследовали выживаемость эмбрионов вьюна на стадии поздней бластулы после микроинъекции криопротекторов ДМСО, ПЭО-100, ПЭО-1500 и формамида (ФА) в область перивителлинового пространства (ПП) и желточного мешка (ЖМ). Установлено, что при введении ДМСО, ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях 10, 50 и 95% в область ПП и при последующей 30-минутной инкубации в 0,88 и 0,29 М сахарозе уровень выживаемости снижался: 58,4–48,5, 74,4–53,9 и 79,63–59,6% соответственно. У ФА уровень выживаемости при тех же условиях снижался с 7 до 3,6%. При введении ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях 10, 50 и 95% в область ЖМ при 30-минутной инкубации в 0,88 и 0,29 М сахарозе уровень выживаемости не имел статистически значимых отличий и был выше, чем при введении ДМСО и ФА. |
| format |
Article |
| author |
Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Грищенко, В.И. |
| author_facet |
Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Грищенко, В.И. |
| author_sort |
Миксон, К.Б. |
| title |
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 |
| title_short |
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 |
| title_full |
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 |
| title_fullStr |
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 |
| title_full_unstemmed |
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 |
| title_sort |
влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна misgurnus fossilis l., 1758 |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2008 |
| topic_facet |
Секция «Новые репродуктивные криотехнологии в медицине и животноводстве» |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69080 |
| citation_txt |
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758 / К.Б. Миксон, Е.Ф. Копейка, В.И. Грищенко // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 509-514. — Бібліогр.: 33 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT miksonkb vliâniemikroinʺekcijkrioprotektorovnavyživaemostʹémbrionovvʹûnamisgurnusfossilisl1758 AT kopejkaef vliâniemikroinʺekcijkrioprotektorovnavyživaemostʹémbrionovvʹûnamisgurnusfossilisl1758 AT griŝenkovi vliâniemikroinʺekcijkrioprotektorovnavyživaemostʹémbrionovvʹûnamisgurnusfossilisl1758 AT miksonkb effectofmicroinjectionofcryoprotectiveagentsonsurvivalofmisgurnusfossilislloachembryos1758 AT kopejkaef effectofmicroinjectionofcryoprotectiveagentsonsurvivalofmisgurnusfossilislloachembryos1758 AT griŝenkovi effectofmicroinjectionofcryoprotectiveagentsonsurvivalofmisgurnusfossilislloachembryos1758 |
| first_indexed |
2025-11-26T18:35:07Z |
| last_indexed |
2025-11-26T18:35:07Z |
| _version_ |
1849879026932383744 |
| fulltext |
509 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
УДК 547.569.2:597.554.3 – 131.7
К.Б. МИКСОН*, Е.Ф. КОПЕЙКА, В.И. ГРИЩЕНКО
Влияние микроинъекций криопротекторов на выживаемость
эмбрионов вьюна Misgurnus fossilis L., 1758
UDC 547.569.2:597.554.3 – 131.7
K.B. MIKSON*, YE. F. KOPEYKA, V.I. GRISCHENKO
Effect of Microinjection of Cryoprotective Agents on Survival
of Misgurnus Fossilis L. Loach Embryos, 1758
Исследовали выживаемость эмбрионов вьюна на стадии поздней бластулы после микроинъекции криопротекторов ДМСО,
ПЭО-100, ПЭО-1500 и формамида (ФА) в область перивителлинового пространства (ПП) и желточного мешка (ЖМ).
Установлено, что при введении ДМСО, ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях 10, 50 и 95% в область ПП и при последующей
30-минутной инкубации в 0,88 и 0,29 М сахарозе уровень выживаемости снижался: 58,4–48,5, 74,4–53,9 и 79,63–59,6%
соответственно. У ФА уровень выживаемости при тех же условиях снижался с 7 до 3,6%. При введении ПЭО-100 и ПЭО-1500
в концентрациях 10, 50 и 95% в область ЖМ при 30-минутной инкубации в 0,88 и 0,29 М сахарозе уровень выживаемости не
имел статистически значимых отличий и был выше, чем при введении ДМСО и ФА.
Ключевые слова: эмбрион, вьюн (Misgurnus fossilis L.), микроинъекция, криопротекторы.
Досліджували виживаність ембріонів в’юна на стадії пізньої бластули після мікроін’єкції кріопротекторів ДМСО, ПЕО-100,
ПЕО-1500 і формаміду (ФА) в зону перивітелінового простору (ПП) та жовткового мішка (ЖМ). Встановлено, що при
введенні ДМСО, ПЕО-100 і ПЕО-1500 в концентраціях 10, 50 і 95% в зону ПП і при подальшій 30-хвилинній інкубації в 0,88
і 0,29 М сахарозі рівень виживаності знижувався: 58,4–48,5, 74,4–53,9 і 79,63–59,6% відповідно. У ФА рівень виживаності за
тих же умов знижувався з 7 до 3,6%. При введенні ПЕО-100 і ПЕО-1500 в концентраціях 10, 50 і 95% в зону ЖМ і при 30-
хвилинній інкубації в 0,88 і 0,29 М сахарозі рівень виживаності не мав статистично значних відмінностей і був вище, ніж при
введенні ДМСО і ФА.
Ключові слова: ембріон, в’юн (Misgurnus fossilis L.), мікроін’єкція, кріопротектори.
Investigated survival rate of loach embryos at a stage late epibole after a microinjection of DMSO, PEG-100, PEG-1500 and
formamide (FA) cryoprotectants in area of perivitelline spaces (PS) and yolk sac (YS). It is established that at introduction of DMSO,
PEG-100 and PEG-1500 in concentration of 10, 50 and 95 % in area of PS and at the subsequent 30-minute incubation in 0,88 and 0,29 M
to sucrose, survival rate level decreased: 58,4–48,5, 74,4–53,9 and 79,63–59,6 % accordingly. At FA survival rate level under the same
conditions decreased from 7 to 3,6 %. At introduction of PEG-100 and PEG-1500 in concentration 10, 50 and 95 % in YS area at 30-
minute incubation in 0,88 and 0,29 M to sucrose level of survival rate had no statistically significant differences and was higher, than
at introduction of DMSO and FA.
Key-words: embryo, loach (Misgurnus fossilis L.), microinjection, cryoprotective agents.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-31-19, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3119, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Криоконсервирование эмбрионов рыб поможет
сохранить виды, находящиеся под угрозой исчез-
новения, а также поддержать ценные и высокопро-
дуктивные линии в аквакультуре [32]. В настоящее
время криоконсервируют сперму около 200 видов
рыб [26, 11]. Однако методы криоконсервирования
эмбрионов рыб не разработаны [13, 31, 33], так как
они имеют большие размеры и сложную структуру,
состоящую из эмбриональных клеток и желточного
мешка (ЖМ) с низкой проницаемостью мембран
[15].
Для криоконсервирования эмбрионов рыб необ-
ходимы проникновение и насыщение криопротек-
тором всех эмбриональных структур [21, 25]. Тра-
диционные методы не способны обеспечить за-
щиту всех тканей и органов эмбрионов рыб, особен-
но ЖМ [17, 22]. Перибласт (желточный синцитий),
окружающий ЖМ, является барьером между
желтком и бластодермой, препятствующим сво-
бодному перемещению воды и криопротекторов
[15]. Замораживание эмбрионов рыб невозможно
без преодоления этого барьера [14]. Для предот-
вращения образования внутриклеточного и меж-
клеточного льда все структурные элементы эмб-
риона должны быть насыщены криопротектором
[25]. Авторы [19, 27] предложили использовать
микроинъекцию как эффективный способ преодо-
ления трудно проницаемых мембран эмбрионов
рыб. Этот метод обычно используется в генной
инженерии и уже применялся при удалении желтка
у эмбрионов данио рерио (Brachydanio rerio) [23,
24], введении белков антифриза в эмбрионы тюрбо
(Scophthalmus maximus) [27] и введении криопро-
текторов в эмбрионы данио рерио [16, 19]. Микро-
510 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
инъекция имеет преимущества перед электрапо-
рацией или ультразвуковой обработкой не только с
точки зрения эффективности, но и выживаемости
эмбрионов [8].
Цель работы – исследование влияния криопро-
текторов ДМСО, ПЭО-100, ПЭО-1500 и ФА, вве-
денных в области ПП и ЖМ на выживаемость эмб-
рионов вьюна и возможности использования мето-
да микроинъекции для насыщения их криопро-
текторами.
Материалы и методы
Рыбу добывали из природных водоемов во
время ледостава. Отбирали 4–6-летних произво-
дителей размером 18–26 см, которых содержали
в пластиковых контейнерах объемом 30 л при
температуре 4–5°С. Перед экспериментом отоб-
ранных производителей помещали в такие же
контейнеры. Температуру плавно поднимали в
течение суток до 21–22°С, что инициировало
дальнейшее созревание половых продуктов до 4-й
стадии зрелости. После инъекции хорионического
гонадотропина (Прегнил – производство “Н.В. Ор-
ганон”, Нидерланды) самкам по 300 ед., самцам
по 100 ед. производителей помещали в пласти-
ковые контейнеры с отстоянной водой объемом 10 л
и содержали при температуре 21°С. Созревание
наступало через 30–36 ч.
Эмбрионы вьюна были получены по методу
Нейфаха [4]. После получения половых продуктов
Концентрации криопротекторов внутри ЖМ и ПП
икру самки осеменяли смесью
измельченных семенников несколь-
ких самцов и распределяли по чаш-
кам Петри (по ~200 штук) для
инкубации при 21°С, pH 7,2, dGH
6,7 мг-экв/л. Воду меняли 3–4 раза
в сутки. Неоплодотворенные побе-
левшие икринки и неразвивающиеся
эмбрионы удаляли из общей груп-
пы. Развивающиеся эмбрионы
оценивали по картам эмбриональ-
ного развития [2]. Эмбрионы, нахо-
дящиеся на стадии развития 8–9 ч
(поздняя бластула), отбирали для
каждого эксперимента от трех са-
мок (n=6).
Микроинъекции проводили с
помощью поршневого микроинъек-
тора, установленного на микрома-
нипулятор КМ-2 (производство
ИБП РАН, РФ). Иглы для микро-
инъекций изготавливали из стеклян-
ных капилляров (наружный диа-
метр 1 мм, внутренний 0,6 мм) с
помощью вертикальной микрокуз-
ницы (производство ИБП РАН,
Россия). Наружный диаметр изготовленной иглы,
измеренный микрометром, составлял 20 мкм и
внутренний – 12 мкм. Для получения острых концов
иглы обрезали лезвием микротома под углом 45°
под бинокулярным микроскопом МБС-9 (ПО
“Рубин”, Россия).
Эмбрионы помещали в чашках Петри с водой
на рабочий стол микроскопа “Olympus SZ”
(Olympus Optical, Germany) с установленной
цифровой фотокамерой “Olympus SP-350” и фикси-
ровали с помощью вакуумного манипулятора.
Общий объем эмбриона с хорионом и объем ЖМ
рассчитывали по формуле: 4/3(D/2)3π [10], объем ПП
определяли как разницу объемов: VПП = VЭ – VЖМ,
где VПП – объем ПП; VЭ – общий объем эмбриона
с хорионом; VЖМ – объем ЖМ.
Конечные концентрации криопротекторов внут-
ри ЖМ и ПП были определены как отношение
объема микроинъецированного криопротектора с
данной концентрацией к объему ЖМ или ПП [8]
(таблица).
В экспериментах эмбрионы прокалывали мик-
роиглой для определения влияния механических
повреждений на их способность к дальнейшему
развитию, количество выживших эмбрионов учи-
тывали по отношению к контролю.
Растворы криопротекторов ДМСО, ПЭО-100,
ПЭО-1500 и ФА в концентрациях 10, 50, 95% вво-
дили внутрь ЖМ и ПП эмбрионов без красителя.
Объем вводимого криопротектора определяли как
роткеторпоирКЌЌ
огоннедеввяицартнецноК
ароткеторпоирк
яицартнецноК
иртунвароткеторпоирк
% M МЖ ПП
ОСМД 01 14,1 24,0 82,0
ОСМД 05 40,7 21,2 24,1
ОСМД 59 83,31 20,4 07,2
ОЭП - 001 01 21,1 43,0 622,0
ОЭП - 001 05 06,5 86,1 31,1
ОЭП - 001 59 46,01 02,3 941,2
ОЭП - 0051 01 670,0 320,0 510,0
ОЭП - 0051 05 83,0 411,0 770,0
ОЭП - 0051 05 83,0 411,0 770,0
АФ 01 15,2 557,0 705,0
АФ 05 45,21 77,3 35,2
АФ 59 38,32 761,7 418,4
511 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
VКр= hπ(D/2)2 и составил 0,40 ± 0,02 мм3. Контроль
осуществляли шкалой микрометра.
В каждой серии эксперимента (n=6) исполь-
зовали 10–15 инъецированных эмбрионов. После
микроинъекций эмбрионы помещали в чашки Пет-
ри с 30%-м раствором сахарозы на 30 мин, затем
в 10%-й раствор сахарозы – на 30 мин и отстоян-
ную воду. Воду меняли 3 раза в сутки. В конце
экспериментов подсчитывали общее количество
выживших эмбрионов, прошедших все стадии эмб-
рионального развития до стадии выклева.
Статистический анализ результатов был прове-
ден с помощью пакета прикладных программ “Sta-
tistica” [6]. Для определения статистически значи-
мых различий в сравниваемых группах эмбрионов
на выживаемость использовали тесты Тюки и
Манна-Уитни. Статистически значимыми разли-
чия считали при р<0,05. Результаты представлены
в виде среднего ± стандартная ошибка.
Результаты и обсуждение
Линейные характеристики эмбрионов соответ-
ствовали данным [2]. Получены следующие линей-
ные и объемные характеристики эмбрионов вьюна
на стадии развития поздней бластулы (среднее ±
стандартное отклонение): наружный диаметр эмб-
риона с хорионом (1,7 ± 0,1 мм); диаметр ЖМ
(1,24 ± 0,07 мм); общий объем (2,57 ± 0,45 мм3);
объем ЖМ (0,99 ± 0,16 мм3); VПП – объем ПП
(1,58 ± 0,31 мм3).
При прокалывании микроиглой различных
областей эмбрионов без введения криопротекторов
наблюдали механические повреждения, влияющие
на выживаемость (рис. 1).
Эмбрионы в экспериментах на выживаемость
50
60
70
80
90
100
Рис. 1. Влияние механических повреждений на выжи-
ваемость эмбрионов вьюна. К – нативные эмбрионы
контрольной группы (статистически значимые различия
обозначены символами, тест Anova, p<0,05, n=6).
Ко
ли
че
ст
во
в
ы
жи
вш
их
э
м
бр
ио
но
в,
%
ЖМ ПП К
Ко
ли
че
ст
во
в
ы
жи
вш
их
э
м
бр
ио
но
в,
%
Рис. 2. Выживаемость эмбрионов вьюна при введении криопротекторов в
область желточного мешка. ЖМ – желточный мешок с проколом без
введения криопротектора (статистически значимые различия обозначены
символами, тест Anova, p< 0,05, n=6, ± стандартная ошибка). – 10%; –
50%; – 95%; 1212 – 0 %.
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
����������
0
20
40
60
80
100
с проколотым хорионом не име-
ли статистически значимых от-
личий от контрольной группы
(95,7±2,4 и 97,8±1,9%, p< 0,05).
Эмбрионы, проколотые в об-
ласть ЖМ через хорион и пери-
бласт, имели высокий процент
выживаемости и существенно
не отличались от тех, у которых
был проколот лишь хорион.
При введении криопротек-
торов ДМСО, ПЭО-100, ПЭО-
1500 и ФА в концентрациях 10,
50 и 95% в область ЖМ наблю-
дался высокий уровень выжива-
емости эмбрионов (рис. 2).
Микроинъекции криопро-
текторов ПЭО-100 и ПЭО-1500
в ЖМ во всех концентрациях не
влияли на выживаемость и не
отличались от групп, в которых
ЖМ эмбрионов прокалывали микроиглой без
введения криопротекторов. В микроинъекции уве-
личение концентрации криопротектора ФА до 95%
приводило к повышению уровня смертности эмб-
рионов по сравнению с концентрациями ФА 10 и
50%. Количество выживших эмбрионов при этом
уменьшалось с 54,1 ± 3,1 (концентрация 10%) до
31,7 ± 2,4% (концентрация 95%).
Влияние криопротекторов на выживаемость
эмбрионов вьюна при введении микроинъекции в
область ПП представлено на рис. 3.
Наименьшее негативное влияние на выжива-
емость эмбрионов наблюдалось при микроинъе-
цировании ПЭО-100 и ПЭО-1500 в концентрациях
до 50%. Но при увеличении концентрации криопро-
ДМСО ПЭО-100 ПЭО-1500 ФА ЖМ
a
b b
c c c
d d d d
d d
bc
b
a
d
512 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������
���������0
20
40
60
80
100
Ко
ли
че
ст
во
в
ы
жи
вш
их
э
м
бр
ио
но
в,
%
ДМСО ПЭО-100 ПЭО-1500 ФА ПП
Рис. 3. Выживаемость эмбрионов вьюна при введении криопротекторов в
область перивителлинового пространства. ПП – перивителлиновое
пространство с проколом без введения криопротектора (статистически
значимые различия обозначены символами, тест Anova, p< 0,05, n=6,
± стандартная ошибка). – 10%; – 50%; – 95%;
123
123
123 – 0 %. .
текторов до 95% количество погибших эмбрионов
увеличивалось и было сравнимо при использовании
ДМСО. Криопротектор ФА оказывал наибольшее
влияние на уровень смертности эмбрионов в тех
случаях, когда даже 10%-я концентрация вводимого
вещества вызывала гибель всех эмбрионов в
исследуемых группах.
В [19, 27] сообщалось о методе микроинъекции
как об адекватной технике при насыщении эмбрио-
нов рыб криопротекторами. В этой работе мы
показали, что микроинъекция может служить удоб-
ным способом введения криопротекторов внутрь
ЖМ эмбрионов вьюна на стадии поздней бластулы
без существенного негативного влияния на их
жизнеспособность. При этом допустима 4 М кон-
центрация проникающих криопротекторов, что,
возможно, усилит положительный эффект микро-
инъекций при создании методов криоконсерви-
рования эмбрионов на основе их витрификации.
Согласно данным [18] степень проницаемости
каждого криопротектора обратно пропорциональна
его молекулярной массе. Хотя желток не содержит
клеток с ядерным аппаратом и не участвует в деле-
нии эмбриональных клеток, но он активно участвует
в метаболизме веществ, поддерживая рост и разви-
тие эмбриона [1, 3]. Криопротекторы, введенные в
ЖМ, должны преодолеть желточный синцитий,
чтобы проникнуть в клетки эмбриона. Проницае-
мость этого слоя очень низка и считается, что
криопротекторы не в состоянии снаружи преодо-
леть этот барьер. Поэтому, кроме ранее описанного
влияния некоторых криопротекторов на развиваю-
щийся эмбрион рыб [17, 19], в эксперименты был
включен ФА, имеющий наименьшую молекуляр-
ную массу (45,04) и, вероятно, более высокую спо-
собность проникать через био-
мембраны. Установлено, что из
исследованных нами криопротек-
торов ФА обладает наиболее
высокой проникающей способ-
ностью. Однако этот криопротек-
тор оказывает негативное влия-
ние на дальнейшее развитие эмб-
рионов вьюна и, возможно, имеет
тератогенные свойства, что не
позволяет использовать его в
чистом виде. Мы предполагаем,
что низкая выживаемость эмб-
рионов при микроинъекциях ФА
в концентрациях от 10 до 95% в
областях ПП (7–3,6%) и ЖМ
(54,1–31,7%) связана с его актив-
ным проникновением в клеточные
структуры бластомеров через
все мембранные комплексы. Ве-
роятно, этот криопротектор мо-
жет быть включен в определенных концентрациях
в состав криозащитных сред.
Установлено, что при инкубации эмбрионов в
средах с различными концентрациями ДМСО
уровень смертности повышается с увеличением
концентрации [30]. Однако в нашем случае вве-
дение фиксированного объема ДМСО (0,4 мм3)
внутрь ЖМ с максимальной концентрацией (95%)
не приводило к статистически значимым отли-
чиям и не влияло на уровень смертности эмбрио-
нов.
Объем вводимых криопротекторов в нашей
работе был больше и их конечная концентрация
была выше, чем в экспериментах, проведенных
ранее на эмбрионах морского карася (Sparus
aurata) и тюрбо (Scophthalmus maximus) [8, 27].
Несмотря на то, что устойчивость к криопротек-
торам у морских видов выше, в нашем случае бы-
ло показано, что уровень выживаемости эмбрио-
нов вьюна при введении ДМСО в область ЖМ был
несколько больше при максимальной концентрации
и достигал 70%. Возможно, причина этого в том,
что после микроинъекции мы переносили эмбрионы
в среду с 0,88 М сахарозы, в которой, вероятно,
ДМСО перемещался по эмбриону и частично вы-
ходил за пределы ЖМ. В работе [27] было пока-
зано, что микроинъецированные антифризные бел-
ки в ЖМ эмбрионов тюрбо не проникают за его
пределы, а в работе [19] установлено, что микро-
инъекции ДМСО и этиленгликоля в ЖМ в концент-
рациях 2,4 и 5,2 М оказали влияние на уровень
смертности эмбрионов данио рерио на стадии мо-
рулы, при этом их выживаемость составила 60 и
14% соответственно. Увеличение концентрации
ДМСО до 6,1 М, введенного эмбрионам данио
a a
a
b ab
a
bc b
a
* * *
c
рерио на стадии развития хвостовой почки, не
оказало влияния на уровень смертности, что, по
мнению авторов [19], свидетельствует о его низкой
проницаемости через желточный синцитий. Однако
в экспериментах [9] показано, что введение ДМСО
в ЖМ в концентрациях 6 и 4 М на 10 и 30 мин при
инкубации в этих же концентрациях криопротектора
соответственно приводило к полной гибели всех
эмбрионов морского карася на стадии развития
хвостовой почки. Поэтому рекомендовано [9]
использовать ДМСО в концентрации 3 М при
введении внутрь ЖМ и инкубации эмбрионов в этой
же концентрации криопротектора в течение 30 мин,
при которой выживаемость эмбрионов составила
35–72%.
В результате использования криопротекторов
группы ПЭО мы предположили, что большая моле-
кулярная масса не позволит им за короткий период
преодолеть желточный синцитий и повредить
клетки эмбриона [29]. Осмотическое давление
водных растворов ПЭО-криопротекторов близко
к изоосмотическому и не должно вызывать
значительных повреждений биологических струк-
тур [5]. При этом выживаемость эмбрионов у
ПЭО-100 составила 89,7–87,3% и ПЭО-1500 –
90,6–87% в концентрациях 10–95%. Введение этих
криопротекторов в ПП несколько снизило общий
уровень выживаемости эмбрионов в течение
последующей 30-минутной инкубации в растворе
сахарозы 30 и 10%. Допускается, что ПЭО-
криопротекторы благодаря наличию низкомо-
лекулярных фракций частично могут проникать в
клетки, снижая общий уровень выживаемости, но
остальное количество адсорбируется на клеточной
мембране [5]. Угнетение функциональной актив-
ности биологических объектов после действия
ПЭО обратимо и полностью снимается после
удаления криопротектора [7]. Поэтому снижение
уровня выживаемости, с одной стороны, можно
объяснить специфическим влиянием криопротек-
торов на биологические структуры [12] и непос-
редственным взаимодействием клеток бласто-
дермы с этими криопротекторами [19], с другой
стороны, неоднозначной реакцией различных
структурных комплексов развивающегося эмб-
риона на криопротекторы, что усложняет общее
насыщение развивающегося эмбриона криоза-
щитной средой [17].
Высокий уровень выживаемости эмбрионов
вьюна в наших экспериментах при введении ПЭО-
криопротекторов в область ЖМ при концентрациях
от 10 до 95% (выживаемость 90,6–87% соответст-
венно) показал, что после инъекции инкубация мо-
жет проводиться в криопротекторах с минимальной
токсичностью, например в сахарозе или других
аналогичных криопротекторах. Сахаросодержащие
криопротекторные среды понижают уровень
смертности биологических объектов [20, 28]. При
замораживании эмбрионов необходимо учитывать,
что возможные микроповреждения при инъекции
могут влиять на общий уровень выживаемости
[19], а изменение осмотического давления, сопро-
вождающее отогрев, может вызвать повреждение
биологических структур, поэтому необходимо учи-
тывать индивидуальную чувствительность объек-
та [5].
Мы предполагаем, что дальнейшие исследо-
вания многокомпонентных криозащитных сред на
основе проникающих и непроникающих криопро-
текторов – эффективное направление криобиоло-
гических исследований эмбрионов рыб.
Выводы
Микроинъекция может быть методом введения
криопротекторов в различные области эмбрионов
вьюна на стадии поздней бластулы. Выживаемость
эмбрионов вьюна зависит от химического состава
вводимой криозащитной среды и области вве-
дения.
При микроинъекции криопротекторов в желточ-
ный мешок установлен минимальный уровень
смертности эмбрионов вьюна.
Введение непроникающих криопротекторов
оказывает наименьшее повреждающее действие
при микроинъекции в эмбрионы вьюна, а введение
проникающих криопротекторов позволяет достичь
высоких концентраций внутри эмбриональных
структур.
Литература
Игнатьева Г.М. Ранний эмбриогенез рыб и амфибий.–
М.: Наука, 1979.– 176 с.
Костомарова А.А. Вьюн Misgurnus fossilis L. Объекты
биологии развития // Под ред. Т.А. Детлаф.– М.: Наука,
1975.– C. 308–323.
Макеева А.П. Эмбриология рыб.– М.: МГУ, 1992.– 216 с.
Нейфах А.А. Использование метода радиоактивной
инактивации ядер для исследования их функций в ран-
нем развитии рыб // Журн. общей биологии.– 1959.–
Т. 20.– C. 202–213.
Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В.
Криопротекторы.– Киев: Наук. думка, 1978.– 204 с.
Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских дан-
ных. Применение пакета прикладных программ Statistica.–
М.: МедиаСфера, 2002.– 312 с.
Сафонова Т.С., Микулинский Ю.Е. Изучение действия
низких температур и криофилактика на выживаемость
и метаболическую активность некоторых видов бак-
терий / В кн.: Современные вопросы криобиологии.–
Киев: Наук. думка, 1976.– С. 69–70.
Beirao J., Robles V., Herraez M.P. et al. Cryoprotectant
microinjection toxicity and chilling sensitivity in gilthead
seabream (Sparus aurata) embryos // Aquaculture.– 2006.–
N 261.– Р. 897–903.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
513
Cabrita E., Robles V., Wallace J.C. et al. Preliminary studies on
the cryopreservation of gilthead sea bream (Sparus aurata)
embryos // Aquaculture.– 2006.– Vol. 251, N2–4.– P. 245–255.
Cabrita E., Robles V., Chereguini O. et al. Dimethyl sulfoxid
influx in turbot embryos to a vitrif ication protocol //
Theriogenology.– 2003.– Vol. 60, N3.– P. 463–473.
Cryopreservation in aquatic species / Eds: T.R. Tiersch and
P.M. Mazik.– Baton Rouge: The World Aquaculture Society,
2000.– 441 p.
Fahy G.M., Lilley T.H., Linsdell H. et al. Cryoprotectant toxicity
and cryoprotectant toxicity reduction: In search of molecular
mechanisms // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N3.– P. 247–268.
Gwo J.C. Cryopreservation of eggs and embryos from aquatic
organisms / In: Cryopreservation in aquatic species / Eds:
T.R. Tiersch and P.M. Mazik.– Baton Rouge: The World
Aquaculture Society, 2000.– P. 211–229.
Hagedorn M., Kleinhans F.W., Artemov D. et al. Characteri-
zation of a major permeability barrier in the zebrafish embryo //
Biology of Reproduction.– 1998.– Vol. 59, N 5.– P. 1240–1250.
Hagedorn M., Kleinhans F.W., Freitas R. et al. Water
distribution and permeability of zebrafish embryos,
Brachydanio rerio // J. of Exper. Zoology.– 1997.– Vol. 278,
N6.– P. 356–371.
Hagedorn M., Kleinhans F.W., Wildt D.E. et al. Chilling
sensitivity and cryoprotectant permeability of dechorionated
zebrafish embryos, Brachydanio rerio // Cryobiology.– 1997.–
Vol. 34, N3.– P. 251–263.
Hagedorn M., Hsu E.W., Pilatus U. et al. Magnetic resonance
microscopy and spectroscopy reveal kinetics of cryopro-
tectant permeation in a multicompartment biological system //
Proc. Nati. Acad. Sci. USA.– 1996.– Vol. 93.– P. 7454–7459.
Harvey B., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotectant penetration
and suppercooling in the eggs of salmonid fishes //
Cryobiology.– 1982.– Vol. 19, N1.– P. 29–40.
Janik M., Kleinhans F.W., Hagedorn M. Overcoming a
permeability barrier by microinjecting of cryoprotectants into
the yolk of zebrafish embryos (Brachidanio rerio) //
Cryobiology.– 2000.– Vol. 41, N1.– P. 25–34.
Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M.
Sugar exert a major influence on the vitrification properties
of ethylene glycol-based solutions and have low toxity to
embryos and oocytes // Cryobiology.– 1999.– Vol 38, N2.– P.
119–130.
Leibo S.P. Cryopreservation of oocytes and embryos:
Optimization by theoretical versus empirical analysis //
Theriogenology.– 2008.– Vol. 69, N1.– P. 37–47.
Liu X.H., Zhang T.T., Rawson D.M. Differential scanning
calorimetry studies of intraembryonic freezing and cryo-
protectant penetration in zebrafish (Danio rerio) embryos // J.
of Exper. Zoology.– 2001.– Vol. 290.– P. 299–310.
Liu X.H., Zhang T., Rawson D.M. Effect of cooling rate and
partial removal of yolk on the chilling injury in zebrafish (Danio
rerio) embryos // Theriogenology.– 2001.– Vol. 55, N8.–
P. 1719–1731.
Liu X.H., Zhang T.T., Rawson D.M. The effect of partial
removal of yolk on the chilling sensitivity of zebrafish (Danio
rerio) embryos // Cryobiology.– 1999.– Vol. 39, N3.– P. 236–
242.
Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications //
Amer. J. of Physiology.– 1984.– Vol. 247, N3, Pt1.– P. 125–142.
Rana K.J., Gilmour A. Cryopreservation of fish spermatozoa:
effect of cooling methods on the reproducibility of cooling
rates and viability // Refrigeration and Aquaculture Confe-
rence.– Bordeaux, 1996.– P. 3–12.
Robles V., Cabrita E., Herraez M.P. Microinjection of anti-
freeze proteins into turbot embryos // Cryobiology.– 2004.–
Vol. 49., N3.– P. 317–318.
Sakkas D., Urned F., Menezo Y., Leppens G. Effects of
glucose and fructose on fertilization, cleavage and viability
of mouse embryos in vitro // Biol. Reprod.– 1993.– Vol. 49.–
P. 1288–1292.
Spiegel A.J., Nosenworthy M.M. Use of non-aqueous solvents
in parental products // J. Pharm. Sci.– 1963.– Vol. 52.– P. 917–
927.
Suzuki T., Komada H., Takai R. et al. Relation between toxicity
of cryoprotectant DMSO and its concentration in several fish
embryos // Fish Sci.– 1995.– Vol. 61.– P. 193–197.
Tian Y.S., Chen S.L., Yan A.S. et al. Studies on vitrification
method of sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos //
Acta Zoologica.– 2003.– Vol. 49.– P. 843–850.
Wildt D.E. Genetic resource banking for conserving wildlife
species justification, and becoming organized on a global
basis // Anim. Reprod. Sci.– 1992.– Vol. 28, N1.– P. 247–257.
Zhang T.T., Rawson D.M. Feasibility studies on vitrification
of intact zebrafish (Brachydanio rerio) embryos // Cryobio-
logy.– 1996.– Vol. 33, N1.– P. 1–13.
Поступила 23.09.2008
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
514
|