Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования
Разработана технология криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови, которая позволяет снизить концентрацию ДМСО до 5%, обеспечить высокую сохранность и структурно-функциональную полноценность в препарате фракции мононуклеаров, в том числе и гемопоэтических стволовых CD34⁺-клеток. Розроб...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2008 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69083 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования / Л.А. Бабийчук, О.В. Кудокоцева, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев, О.Л. Зубова, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 524-526. — Бібліогр.: 3 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859784930789163008 |
|---|---|
| author | Бабийчук, Л.А. Кудокоцева, О.В. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. Гурина, Т.М. |
| author_facet | Бабийчук, Л.А. Кудокоцева, О.В. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. Гурина, Т.М. |
| citation_txt | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования / Л.А. Бабийчук, О.В. Кудокоцева, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев, О.Л. Зубова, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 524-526. — Бібліогр.: 3 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Разработана технология криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови, которая позволяет снизить концентрацию ДМСО до 5%, обеспечить высокую сохранность и структурно-функциональную полноценность в препарате фракции мононуклеаров, в том числе и гемопоэтических стволовых CD34⁺-клеток.
Розроблена технологія кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, яка дозволяє знизити концентрацію ДМСО до 5%, забезпечити високу збереженість та структурно-функціональну повноцінність в препараті фракції мононуклеарів, у тому числі і гемопоетичних стовбурових CD34⁺-клітин.
There was developed the technology of the cord blood nucleated cell cryopreservation which allowed to reduce DMSO concentration till 5% and provide the high recovery and structural and functional integrity of the mononuclear cell fraction in the preparation including the hemopoietic CD34⁺-stem cells.
|
| first_indexed | 2025-12-02T10:02:49Z |
| format | Article |
| fulltext |
524 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
УДК 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42
Л.А. БАБИЙчУК*, О.В. КУДОКОЦЕВА, П.М. ЗУБОВ, В.В. РЯЗАНЦЕВ, О.Л. ЗУБОВА, Т.М. ГУРИНА
Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования
и тестирования
UDC 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42
L.A. BABIJCHUK*, O.V. KUDOKOTSEVA, P.M. ZUBOV, V.V. RYAZANSEV, O.L. ZUBOVA, T.M. GURINA
Cord Blood Autobanks: Cryopreservation and Testing Methods
Разработана технология криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови, которая позволяет снизить
концентрацию ДМСО до 5%, обеспечить высокую сохранность и структурно-функциональную полноценность в препарате
фракции мононуклеаров, в том числе и гемопоэтических стволовых CD34+-клеток.
Ключевые слова: пуповинная кровь, криоконсервирование, ядросодержащие клетки, гемопоэтические стволовые клетки.
Розроблена технологія кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, яка дозволяє знизити концентрацію
ДМСО до 5%, забезпечити високу збереженість та структурно-функціональну повноцінність в препараті фракції мононуклеарів,
у тому числі і гемопоетичних стовбурових CD34+-клітин.
Ключові слова: пуповинна кров, кріоконсервування, ядровмісні клітини, гемопоетичні стволові клітини.
There was developed the technology of the cord blood nucleated cell cryopreservation which allowed to reduce DMSO concentration
till 5% and provide the high recovery and structural and functional integrity of the mononuclear cell fraction in the preparation
including the hemopoietic CD34+-stem cells.
Key-words: cord blood, cryopreservation, nucleated cells, hemopoietic stem cells.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Первая трансплантация клеток пуповинной
крови (ПК) в 1988 году стала началом ее клини-
ческого применения. В настоящее время транс-
плантация гемопоэтических стволовых клеток
(ГСК) пуповинной крови является общепринятым
методом лечения многих онкологических и незло-
качественных заболеваний системы крови. Спектр
исследований клинического применения ПК
достаточно широк при негематологических забо-
леваниях: инфаркт миокарда, инсульт, “ишемия”
нижних конечностей, болезни Паркинсона и
Альцгеймера, сахарный диабет и др. Идея такого
нетрадиционного клинического применения воз-
никла в связи с выявлением среди ядросодер-
жащих клеток (ЯСК) пуповинной крови помимо
ГСК (CD34+), определенной доли мультипотентных
клеток (CD133+), которые можно индуцировать и
дифференцировать в нейрональном, остеогенном,
хондрогенном и гепатоцитарном направлениях [2].
Открытие уникальной способности дендритных
клеток (ДК) пуповинной крови инициировать
антигенспецифический иммунный ответ обуслови-
ло интерес к ним с точки зрения терапии заболева-
ний, протекающих с участием иммунной системы.
Говоря о ДК и их роли в противоопухолевом над-
зоре, нельзя не отметить в этом процессе функцио-
нальной активности лимфоцитов, макрофагов, а
также нейтрофилов.
Установлено, что ГСК пуповинной крови, вы-
шедшие из фазы покоя, способны отвечать на диф-
ференцировочные сигналы и давать начало гемопо-
этическим и мезенхимальным предшественникам,
требуя как непосредственных контактов со стро-
мальными элементами, так и опосредованных
через гуморальные регуляторы (цитокины, гликоз-
аминогликаны), вырабатываемые клетками гемо-
поэзиндуцирующего микроокружения (лимфоци-
тами, макрофагами, нейтрофилами и т.п.) [3].
В этой связи возникает необходимость полно-
ценного выделения всех ЯСК пуповинной крови и
долгосрочного хранения как стволовых, так и
гемопоэзиндуцирующих клеток ПК.
До настоящего времени исследователи ста-
рались сохранить только мононуклеарные клетки,
в состав которых входили и CD34+-клетки. Это
связано с тем, что приживление аллогенного транс-
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
КРИОБАНКИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ
ПУПОВИННОЙ КРОВИ В МЕДИЦИНЕ
CRYOBANKS OF CORD BLOOD.
PROSPECTS OF USING
CRYOPRESERVED PREPARATIONS
OF CORD BLOOD IN MEDICINE
525 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
плантата во многом зависит от присутствия в нем
клеток с незрелым фенотипом, т. е. со сниженным
абсолютным содержанием CD4+, CD8+, CD3+ Т-
клеток и повышенным содержанием СD45RА+
клеток, характеризующим их низкую иммуно-
генную активность [2].
Однако, принимая во внимание возрастающий
интерес к аутотрансплантации и к созданию ауто-
банков, на наш взгляд, необходимо выработать
методы, позволяющие выделить максимальное
количество всех ЯСК (СК и клеток гемопоэз-
индуцирующего окружения) и сохранить в жизне-
способном состоянии гетерогенную по составу
популяцию этих клеток после криоконсервирования.
Цель данной работы – разработка оптимальных
для аутобанков способов выделения, криокон-
сервирования и тестирования ЯСК пуповинной
крови.
Материалы и методы
Сбор ПК производили после получения инфор-
мированного согласия у беременной, которая про-
ходила тщательный дородовой скрининг на нали-
чие противопоказаний к донорству ПК. Эксфузию
крови осуществляли закрытым способом в сис-
тему для забора крови с 25 мл антикоагулянта из
пупочной вены при естественных родах после рож-
дения ребенка и отделения его от плаценты зажи-
мом.
Выделение фракции ЯСК из ПК проводили
методом седиментации c последующим центри-
фугированием. В качестве криопротектора исполь-
зовали ДМСО в конечной концентрации 5%. Замо-
раживали клетки на программном замораживателе
(Kryoson, Германия) по четырехэтапной програм-
ме [1]. Количественный состав сохранных ЯСК
кордовой крови оценивали стандартным методом.
Фенотипирование ЯСК (CD45+) пуповинной крови,
в том числе и гемопоэтических (CD34+) клеток до
и после криоконсервирования проводили методом
проточной цитофлуориметрии на проточ-ном
цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США)
с использованием реагентов Becton Dickinson по
международному ISHAGE протоколу. Жизнеспо-
собность ЯСК до и после криоконсервирования
оценивали с помощью флуоресцентного ДНК
красителя 7AAD (BD), используя метод проточной
цитометрии. Оценку клоногенной активности ГСК
пуповинной крови проводили в среде Methocult
H4434 (Stem Cell Technologies,Канада) согласно
стандартной методике.
Результаты и обсуждение
Исходя из современного опыта научно-иссле-
довательских работ по долгосрочному культи-
вированию СК пуповинной крови как для наращи-
вания общего количества ЯСК, так и получения
клеточных популяций определенного типа диф-
ференцировки (нейроклетки, остеобласты, гепа-
тоциты и т.п.), можно установить степень необ-
ходимости присутствия в среде культивирования
биологически активных веществ аутологичной для
СК пуповинной крови плазмы (гормонов, цито-
кинов) и дифференцированных клеток, относя-
щихся к клеткам кроветворного микроокружения
и являющихся индукторами гемопоэза посредст-
вом межклеточных взаимодействий или опосре-
дованных гуморальных контактов [3]. В связи с
этим для аутобанков ПК необходимо разработать
методы криоконсервирования и долгосрочного
хранения не только ГСК, но и всех присутствующих
в кордовой крови (КК) ядросодержащих клеток, а
также аутологичной плазмы.
Разработанный нами способ выделения ЯСК
пуповинной крови позволяет выделять до 80% всех
ЯСК, сохраняя при этом их исходное процентное
соотношение как в цельной ПК. Так, качественный
состав выделенной взвеси ЯСК представлен сле-
дующими клетками: лимфоциты – 37±4; моноциты –
13±2, гранулоциты – 46±6%.
Важная задача аутобанков ПК – сохранение в
жизнеспособном состоянии после криоконсер-
вирования гетерогенной по составу популяции ЯСК
пуповинной крови.
В настоящее время для криоконсервирования
ядросодержащих клеток ПК используется в ка-
честве криопротектора ДМСО в конечной концент-
рации 7,5–10%, который должен быть удален до
инфузии в силу своей токсичности. Удаление
криопротектора после размораживания клеточной
взвеси существенно усложняет процедуру полу-
чения качественных деконсервированных клеток
и приводит к потере части клеток в процессе от-
мывания, что снижает клиническую эффектив-
ность препаратов КК. Установлено, что основная
токсичность, связанная с трансфузией ЯСК пупо-
винной крови, криоконсервированных с ДМСО,
обусловлена дозозависимыми эффектами перели-
ваемого ДМСО.
В связи с вышеизложенным, для криоконсер-
вирования ЯСК пуповинной крови необходимо
использовать ДМСО в минимально допустимых
концентрациях (максимум 5%) при минимальном
объеме инфузируемой суспензии ЯСК пуповинной
крови, что позволит вводить клеточную суспензию
реципиентам без отмывания от криопротектора.
Предлагаемый нами метод криоконсервиро-
вания ЯСК пуповинной крови заключается в
предварительном концентрировании путем щадя-
щего центрифугирования клеточной суспензии в
объеме не более 3–5 мл и медленном добавлении
на холоде раствора ДМСО на полиглюкине. Четы-
526 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 18, 2008, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 18, 2008, №4
рехэтапная программа замораживания в сочетании
с предлагаемым методом предобработки суспен-
зии клеток позволяет снизить концентрацию ДМСО
до 5% и получить после размораживания высокий
процент жизнеспособных клеток (до 85% CD45+
7ААD–- и до 99% CD34+ 7ААD–- клеток). Следует
отметить, что жизнеспособность общей популяции
CD45+-клеток снижается в основном за счет грану-
лоцитов, жизнеспособность которых составляла
69,8±3,7%, мононуклеаров – 94–98% (рисунок).
При культивировании в полутвердой среде
выявлен рост колоний всех типов (СFU-E, BFU-E,
CFU-G, CFU-M, CFU-GM, CFU-GEMM). Сум-
марное количество колоний составляло 387±106,
что коррелировало с процентом СD34+-клеток в
образцах ПК.
Вывод
Разработана технология криоконсервирования
ЯСК пуповинной крови, которая позволяет снизить
концентрацию ДМСО до 5%, обеспечить высокую
Жизнеспособность фракций ядросодержащих клеток: а – лимфоцитов; б – моноцитов; в – гранулоцитов.
Quadrant statistica
X Parameter: 7AAD (Log)
Y Parameter: CD45 FITC (Log)
Quad % Gated______________________
UL 95.61
UR 4.39
LL 0.00
LR 0.00
Quadrant statistica
X Parameter: 7AAD (Log)
Y Parameter: CD45 FITC (Log)
Quad % Gated______________________
UL 94.71
UR 5.29
LL 0.00
LR 0.00
Quadrant statistica
X Parameter: 7AAD (Log)
Y Parameter: CD45 FITC (Log)
Quad % Gated______________________
UL 72.86
UR 27.14
LL 0.00
LR 0.00
а б в
Литература
Бабийчук Л.А., Кудокоцева О.В., Рязанцев В.В. и др. Новые
перспективы в криоконсервировании ядросодержащих
клеток кордовой крови // Гематологія і переливання крові
(міжвідомчий збірник).– 2008.– №34.– С. 17–21.
Исаев А.А., Мелихова В.С. Применение клеток пуповин-
ной крови в клинической практике // Клеточная тран-
сплантология и тканевая инженерия.– 2008.– Т. 3, №1.–
С. 34–43.
Цуцаева А.А., Кудокоцева О.В., Щеглов А.В., Тупчиенко Г.С.
Влияние моноцитов-макрофагов на колониеобразующую
активность нативных и криоконсервированных кровет-
ворных клеток // Гематология и трансфузиология.– 2002.–
№1.– С. 22–24.
Поступила 28.08.2008
1.
2.
3.
сохранность и структурно-функциональную полно-
ценность в препарате фракции мононуклеаров, в
том числе и гемопоэтических стволовых CD34+-
клеток.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69083 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-02T10:02:49Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Бабийчук, Л.А. Кудокоцева, О.В. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. Гурина, Т.М. 2014-10-04T15:54:44Z 2014-10-04T15:54:44Z 2008 Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования / Л.А. Бабийчук, О.В. Кудокоцева, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев, О.Л. Зубова, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 4. — С. 524-526. — Бібліогр.: 3 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69083 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42 Разработана технология криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови, которая позволяет снизить концентрацию ДМСО до 5%, обеспечить высокую сохранность и структурно-функциональную полноценность в препарате фракции мононуклеаров, в том числе и гемопоэтических стволовых CD34⁺-клеток. Розроблена технологія кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, яка дозволяє знизити концентрацію ДМСО до 5%, забезпечити високу збереженість та структурно-функціональну повноцінність в препараті фракції мононуклеарів, у тому числі і гемопоетичних стовбурових CD34⁺-клітин. There was developed the technology of the cord blood nucleated cell cryopreservation which allowed to reduce DMSO concentration till 5% and provide the high recovery and structural and functional integrity of the mononuclear cell fraction in the preparation including the hemopoietic CD34⁺-stem cells. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования Cord Blood Autobanks: Cryopreservation and Testing Methods Article published earlier |
| spellingShingle | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования Бабийчук, Л.А. Кудокоцева, О.В. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Зубова, О.Л. Гурина, Т.М. Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» |
| title | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования |
| title_alt | Cord Blood Autobanks: Cryopreservation and Testing Methods |
| title_full | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования |
| title_fullStr | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования |
| title_full_unstemmed | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования |
| title_short | Аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования |
| title_sort | аутобанки пуповинной крови: методы криоконсервирования и тестирования |
| topic | Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» |
| topic_facet | Секция «Криобанк пуповинной крови. Перспективы применения криоконсервированных препаратов пуповинной крови в медицине» |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69083 |
| work_keys_str_mv | AT babiičukla autobankipupovinnoikrovimetodykriokonservirovaniâitestirovaniâ AT kudokocevaov autobankipupovinnoikrovimetodykriokonservirovaniâitestirovaniâ AT zubovpm autobankipupovinnoikrovimetodykriokonservirovaniâitestirovaniâ AT râzancevvv autobankipupovinnoikrovimetodykriokonservirovaniâitestirovaniâ AT zubovaol autobankipupovinnoikrovimetodykriokonservirovaniâitestirovaniâ AT gurinatm autobankipupovinnoikrovimetodykriokonservirovaniâitestirovaniâ AT babiičukla cordbloodautobankscryopreservationandtestingmethods AT kudokocevaov cordbloodautobankscryopreservationandtestingmethods AT zubovpm cordbloodautobankscryopreservationandtestingmethods AT râzancevvv cordbloodautobankscryopreservationandtestingmethods AT zubovaol cordbloodautobankscryopreservationandtestingmethods AT gurinatm cordbloodautobankscryopreservationandtestingmethods |