Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3
Исследован гемолиз эритроцитов под воздействием ионных (ЦТАБ, ДСН) и неионных (твин-20, тритон-Х-100) детергентов в присутствии криопротекторов (сахароза, декстран, ПЭГ-1500) и модификатора агрегатного состояния белка полосы 3 (ДИДС). Показано, что криопротекторы существенно снижают чувствительность...
Збережено в:
| Дата: | 2007 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69101 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 / В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 335-346. — Бібліогр.: 20 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69101 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-691012025-02-09T14:10:05Z Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 Cryoprotectant Effect on Erythrocyte Resistance to Detergents Under Band 3 Protein Aggregate State Modification Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология Исследован гемолиз эритроцитов под воздействием ионных (ЦТАБ, ДСН) и неионных (твин-20, тритон-Х-100) детергентов в присутствии криопротекторов (сахароза, декстран, ПЭГ-1500) и модификатора агрегатного состояния белка полосы 3 (ДИДС). Показано, что криопротекторы существенно снижают чувствительность эритроцитов к действию ЦТАБ и ДСН. Присутствие в среде ДИДС нейтрализует защитное действие криопротекторов от гемолиза ЦТАБ. Однако при использовании твин-20 ДИДС проявляет блокирующее действие на лизис эритроцитов независимо от состава среды. Установлено, что гемолиз эритроцитов под действием тритон-Х-100 блокируется ПЭГ-1500, а не сахарозой, и присутствие в среде ДИДС не влияет на степень гемолиза. При сравнении действия твин-20 и тритон-Х-100 можно предположить, что защитный эффект сахарозы ограничен её модифицирующим действием на белковые компоненты мембраны. Анализ полученных результатов позволяет предположить, что криопротекторы стабилизируют тетрамерные формы белка полосы 3. Досліджено гемоліз еритроцитів під впливом іонних (ЦТАБ, ДСН) і неіонних (твін-20, тритон-Х-100) детергентів у присутності кріопротекторів (сахароза, декстран, ПЕГ-1500) та модифікатора агрегатного стану білка смуги 3 (ДІДС). Показано, що кріопротектори істотно знижують чутливість еритроцитів до дії ЦТАБ і ДСН. Присутність в середовищі ДІДС усуває захисну дію кріопротекторів від ЦТАБ. Проте при використанні твін-20 ДІДС виявляє блокуючу дію на лізис еритроцитів незалежно від складу середовища. Встановлено, що гемоліз еритроцитів під впливом тритон-Х-100 блокується ПЕГ-1500, а не сахарозою, і присутність ДІДС не впливає на ступінь гемолізу. При порівнянні дії твін-20 і тритон-Х-100 можна припустити, що захисний ефект сахарози обмежується ії модифікуючою дією на білкові компоненти мембрани. Аналіз отриманих результатів дозволяє припустити, що кріопротектори стабілізують тетрамірні форми білка смуги 3. The erythrocyte hemolysis under the effect of ionic (CTAB, SDS) and non-ionic (Tween 20, Triton X-100) detergents in the presence of cryoprotectants (sucrose, dextran, PEG-1500) and band 3 protein aggregate state modifier (DIDS) was investigated. Cryoprotectants were shown as significantly decreasing erythrocyte sensitivity to CTAB and SDS effect. Protective effect of cryoprotectants against CTAB hemolysis is neutralised by DIDS presence in the medium. However when using Tween 20 DIDS manifests a blocking effect on erythrocyte lysis independently on medium composition. Erythrocyte hemolysis under triton X-100 effect was established as blocked by PEO-1500 but not sucrose, with no influence of DIDS presence in the medium on hemolysis extent. If comparing the Tween 20 and Triton X-100 effects, a protective effect of sucrose may be assumed as limited by its modifying effect on protein membrane components. The analysis of the results obtained enables the concluding about a stabilising effect of cryoprotectants on band 3 protein tetrameric forms. 2007 Article Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 / В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 335-346. — Бібліогр.: 20 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69101 547.42: 612.111 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследован гемолиз эритроцитов под воздействием ионных (ЦТАБ, ДСН) и неионных (твин-20, тритон-Х-100) детергентов в присутствии криопротекторов (сахароза, декстран, ПЭГ-1500) и модификатора агрегатного состояния белка полосы 3 (ДИДС). Показано, что криопротекторы существенно снижают чувствительность эритроцитов к действию ЦТАБ и ДСН. Присутствие в среде ДИДС нейтрализует защитное действие криопротекторов от гемолиза ЦТАБ. Однако при использовании твин-20 ДИДС проявляет блокирующее действие на лизис эритроцитов независимо от состава среды. Установлено, что гемолиз эритроцитов под действием тритон-Х-100 блокируется ПЭГ-1500, а не сахарозой, и присутствие в среде ДИДС не влияет на степень гемолиза. При сравнении действия твин-20 и тритон-Х-100 можно предположить, что защитный эффект сахарозы ограничен её модифицирующим действием на белковые компоненты мембраны. Анализ полученных результатов позволяет предположить, что криопротекторы стабилизируют тетрамерные формы белка полосы 3. |
| format |
Article |
| author |
Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. |
| author_facet |
Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. |
| author_sort |
Рамазанов, В.В. |
| title |
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 |
| title_short |
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 |
| title_full |
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 |
| title_fullStr |
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 |
| title_full_unstemmed |
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 |
| title_sort |
влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2007 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69101 |
| citation_txt |
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к детергентам при модификации агрегатного состояния белка полосы 3 / В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 335-346. — Бібліогр.: 20 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT ramazanovvv vliâniekrioprotektorovnaustojčivostʹéritrocitovkdetergentamprimodifikaciiagregatnogosostoâniâbelkapolosy3 AT bondarenkova vliâniekrioprotektorovnaustojčivostʹéritrocitovkdetergentamprimodifikaciiagregatnogosostoâniâbelkapolosy3 AT ramazanovvv cryoprotectanteffectonerythrocyteresistancetodetergentsunderband3proteinaggregatestatemodification AT bondarenkova cryoprotectanteffectonerythrocyteresistancetodetergentsunderband3proteinaggregatestatemodification |
| first_indexed |
2025-11-26T17:26:40Z |
| last_indexed |
2025-11-26T17:26:40Z |
| _version_ |
1849874716211281920 |
| fulltext |
335 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
УДК 547.42: 612.111.
В.В. РАМАЗАНОВ*, В.А. БОНДАРЕНКО
Влияние криопротекторов на устойчивость эритроцитов к
детергентам при модификации агрегатного
состояния белка полосы 3
UDC 547.42: 612.111.
V.V. RAMAZANOV*, V.A. BONDARENKO
Cryoprotectant Effect on Erythrocyte Resistance to Detergents
Under Band 3 Protein Aggregate State Modification
Исследован гемолиз эритроцитов под воздействием ионных (ЦТАБ, ДСН) и неионных (твин-20, тритон-Х-100) детергентов
в присутствии криопротекторов (сахароза, декстран, ПЭГ-1500) и модификатора агрегатного состояния белка полосы 3
(ДИДС). Показано, что криопротекторы существенно снижают чувствительность эритроцитов к действию ЦТАБ и ДСН.
Присутствие в среде ДИДС нейтрализует защитное действие криопротекторов от гемолиза ЦТАБ. Однако при использовании
твин-20 ДИДС проявляет блокирующее действие на лизис эритроцитов независимо от состава среды. Установлено, что
гемолиз эритроцитов под действием тритон-Х-100 блокируется ПЭГ-1500, а не сахарозой, и присутствие в среде ДИДС не
влияет на степень гемолиза. При сравнении действия твин-20 и тритон-Х-100 можно предположить, что защитный эффект
сахарозы ограничен её модифицирующим действием на белковые компоненты мембраны. Анализ полученных результатов
позволяет предположить, что криопротекторы стабилизируют тетрамерные формы белка полосы 3.
Ключевые слова: эритроциты, криопротекторы, детергенты.
Досліджено гемоліз еритроцитів під впливом іонних (ЦТАБ, ДСН) і неіонних (твін-20, тритон-Х-100) детергентів у
присутності кріопротекторів (сахароза, декстран, ПЕГ-1500) та модифікатора агрегатного стану білка смуги 3 (ДІДС). Показано,
що кріопротектори істотно знижують чутливість еритроцитів до дії ЦТАБ і ДСН. Присутність в середовищі ДІДС усуває
захисну дію кріопротекторів від ЦТАБ. Проте при використанні твін-20 ДІДС виявляє блокуючу дію на лізис еритроцитів
незалежно від складу середовища. Встановлено, що гемоліз еритроцитів під впливом тритон-Х-100 блокується ПЕГ-1500, а не
сахарозою, і присутність ДІДС не впливає на ступінь гемолізу. При порівнянні дії твін-20 і тритон-Х-100 можна припустити,
що захисний ефект сахарози обмежується ії модифікуючою дією на білкові компоненти мембрани. Аналіз отриманих результатів
дозволяє припустити, що кріопротектори стабілізують тетрамірні форми білка смуги 3.
Ключові слова: еритроцити, кріопротектори, детергенти.
The erythrocyte hemolysis under the effect of ionic (CTAB, SDS) and non-ionic (Tween 20, Triton X-100) detergents in the
presence of cryoprotectants (sucrose, dextran, PEG-1500) and band 3 protein aggregate state modifier (DIDS) was investigated.
Cryoprotectants were shown as significantly decreasing erythrocyte sensitivity to CTAB and SDS effect. Protective effect of
cryoprotectants against CTAB hemolysis is neutralised by DIDS presence in the medium. However when using Tween 20 DIDS
manifests a blocking effect on erythrocyte lysis independently on medium composition. Erythrocyte hemolysis under triton X-100
effect was established as blocked by PEO-1500 but not sucrose, with no influence of DIDS presence in the medium on hemolysis
extent. If comparing the Tween 20 and Triton X-100 effects, a protective effect of sucrose may be assumed as limited by its modifying
effect on protein membrane components. The analysis of the results obtained enables the concluding about a stabilising effect of
cryoprotectants on band 3 protein tetrameric forms.
Key-words:erythrocytes, cryoprotectants, detergents.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-41-35, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 4135XX, fax: +380
57 373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
При осмотическом лизисе эритроцитов образо-
вание гемолитической поры сопровождается
латеральной кластеризацией белка полосы 3, тогда
как при детергентном лизисе разрушается липид-
ный бислой мембраны [14]. В работе использовали
анионный детергент ДСН (додецил-сульфат
натрия), который в отличие от осмотического лизи-
са не вызывал ассоциативных изменений белка
полосы 3 при действии на мембрану. Экстракция
белков из мембран ДСН происходит до разруше-
ния бислоя [5], при этом ДСН экстрагирует
Under erythrocyte osmotic lysis the hemolytic pore
formation is accompanied with band 3 protein lateral
clasterisation, meanwhile membrane lipid bilayer is
destroyed during detergent lysis [14]. In research we
used the anion detergent SDS (sodium dodecyl sul-
phate), that, in contrast to osmotic lysis, when affecting
membrane caused no associative changes in band 3
protein. Protein extraction from SDS membranes
occurs before bilayer destruction [5], SDS thereby
extracting a greater number of proteins from
membrane, than non-ionic detergents [10]. Of note is
336 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
большее количество белков из мембраны, чем
неионные детергенты [10]. Важно отметить, что
при получении из мембран эритроцитов белка
полосы 3 с использованием тритон Х-100 сохра-
няются транспортные свойства белка после вклю-
чения в липосомы [8]. Таким образом, установ-
лены существенные различия в действии ионных
и неионных детергентов на мембранные белки.
Белок полосы 3 высоко структурирован и пронизы-
вает мембрану до 14 раз, образуя α-спиральные
гидрофобные участки [3], объединенные гидро-
фильными внутри- и внеклеточными поверхност-
ными петлями [4], одна из которых связана с
углеводной компонентой и является антигенным
детерминантом [11]. Остальные петли выполняют
неопределенные функции [3, 4]. В мембране белок
полосы 3 существует в димерных и тетрамерных
формах [12]. Диссоциация тетрамеров на димеры
при связывании ДИДС (4,4-диизотиоциано-
стильбен-2,2’-дисульфонат динатриевая соль)
приводит к увеличению площади гидрофобного
контакта белка полосы 3 с липидами, что прак-
тически не влияет на деформацию и стабильность
мембраны [16].
Учитывая приведенные факты, можно иссле-
довать влияние модификации гидрофобных взаимо-
действий белка полосы 3 в мембране на гемоли-
тическое действие детергентов в присутствии
различных криопротекторов.
Цель работы – исследование влияния модифи-
катора белка полосы 3 ДИДС и криопротекторов
на чувствительность эритроцитов к действию
ионных и неионных детергентов.
Материалы и методы
В работе использовали NaCl (х.ч.), сахарозу
(ч.д.а.), полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной
массой 1500 (Merck) и декстран с молекулярной
массой 10000 (Serva), ДИДС (Sigma) детергенты:
ЦТАБ (цетилтриметиламмонийбромид), (Sigma),
ДСН (Sigma); тритон Х-100 (Serva); твин-20
(Ferak).
Эритроциты человека получали из донорской
крови при четырехкратном отмывании раствором,
содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ трис, рН 7,4.
Растворы криопротекторов в концентрации 15%
готовили на среде для отмывания клеток.
Эритроциты подвергали действию детергентов
при температуре 17±1°С в течение 10 мин.
Концентрация клеток в экспериментальных средах
(1 мл) составляла 0,35%. Оставшиеся клетки
осаждали центрифугированием в течение 3-х ми-
нут при 3000 об/мин.
Раствор ДИДС в концентрации 4 ммоль/л гото-
вили на дистиллированной воде и вносили за 2 мин
до добавления детергентов в экспериментальную
среду с конечной концентрацией 20 мкмоль/л.
the fact that when obtaining the band 3 protein from
erythrocytes membranes with Triton X-100 use the
protein transport properties are kept after inclusion into
liposomes [8]. Thus, the significant differences in ionic
and non-ionic detergent effects on membrane proteins
were established. Band 3 protein is highly structured
and penetrates membranes up to 14 times by forming
α-spiral hydrophobic sites [3], united by hydrophilic
intra- and extracellular surface loops [4], one of which
is related to hydrocarbon component and is an antigen
determi-nant [11]. The rest loops accomplish uncertain
functions [3, 4]. Band 3 protein exists in membrane in
dimeric and tetrameric forms [12]. Tetramer
dissociation into dimers during DIDS (4,4’-diisothio-
cyano-stilbene-2,2’-disulfonic acid) binding results in
an increase in hydrophobic contact area of band 3
protein with lipids, that does not practically affect the
membrane deformation and stability [16].
Taking into account the mentioned facts the effect
of modifications in band 3 protein hydrophobic inter-
actions in a membrane on hemolytic effect of deter-
gents at the presence of different cryoprotectants may
be under study.
The research was aimed to investigate the effect
of band 3 protein modifier DIDS and cryoprotectants
on erythrocyte sensitivity to the effect of ionic and
non-ionic detergents.
Materials and methods
NaCl (chemically pure grade), sucrose (chemically
pure for analysis grade), polyethylene glycol (PEG)
with 1500 molecular mass (Merck) and dextran with
10000 molecular mass (Serva); DIDS (Sigma),
detergents: cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)
(Sigma); SDS (sigma); Triton X-100 (Serva); Tween
20 (Ferak) have been used in the research.
Human erythrocytes were procured from donor
blood with a fourfold washing-out with solution,
containing 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4.
Cryoprotectant solutions of 15% concentration were
prepared with medium for cell washing-out.
Erythrocytes were undergone the detergent effect
at 17±1°C for 10 min. Cell concentration in experi-
mental media (1 ml) was 0.35%. The rest cells were
precipitated with 3 min centrifugation at 3000 rot/min.
DIDS solution in 4 mmol/l concentration was
prepared with distilled water and introduced 2 min
before detergent adding into experimental medium with
20 µmol/l final concentration.
Erythrocyte hemolysis (%) was determined after
spectrophotometric analysis of optical density of
supernatant liquid at 543 nm wavelength: Hemolysis =
[A1/A2]×100, where A1 is optical density of super-
natant liquid of experimental sample; A2 is an optical
density at a complete hemolysis of control sample.
The results are presented as mean ± standard
deviation. The Mann-Whitney’s non-parametric
337 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
Гемолиз эритроцитов (%) определяли после
спектрофотометрического анализа оптической
плотности надосадочной жидкости при длине вол-
ны 543 нм: Гемолиз = [А1/А2]×100, где А1 –
оптическая плотность надосадочной жидкости экс-
периментального образца; А2 – оптическая плот-
ность при полном гемолизе контрольного образца.
Результаты представлены как среднее значение
± среднее квадратическое отклонение. Для опре-
деления статистической достоверности резуль-
татов использовали непараметрический метод
Манна-Уитни при P < 0,05 (n=5).
Результаты и обсуждение
При исследовании лизиса под воздействием
катионного детергента ЦТАБ установлено, что
сахароза, декстран или ПЭГ существенно снижают
чувствительность клеток к детергенту, а ингибитор
анионного канала ДИДС повышает чувстви-
тельность эритроцитов к действию ЦТАБ неза-
висимо от состава среды (рис. 1). В результате
использования анионного детергента ДСН установ-
лено, что сахароза и ПЭГ подавляют гемолиз
эритроцитов, а гемолиз, вызванный ДСН, усили-
вается в присутствии ДИДС в солевой среде
(рис. 2). Однако в средах с указанными неэлектро-
литами ингибитор анионного канала слабо влияет
на гемолиз. Лизис с ДСН, по сравнению с ЦТАБ,
меньше усиливается в присутствии ДИДС, что,
возможно, обусловлено отрицательным зарядом
ДСН. В данном случае ДИДС как отрицательно
заряженная молекула нейтрализует при связы-
вании положительные заряды у входа в анионный
канал, тем самым уменьшая положительный заряд
белка полосы 3. В связи с этим можно предпо-
ложить, что концентрация ДСН у поверхности
мембраны в присутствии ДИДС понизится, а в
присутствии ЦТАБ – повысится.
В нашей работе исследовано действие неион-
ных детергентов твин-20 и тритон Х-100, которые
относятся к ряду полиоксиэтилен – производных
детергентов [7]. При использовании твин-20
установлено, что сахароза и декстран, по срав-
нению с ПЭГ, незначительно влияют на чувстви-
тельность клеток к детергенту. Присутствие в
среде ингибитора анионного канала ДИДС снижает
чувствительность клеток к лизису с твин-20
независимо от состава среды. По сравнению с
твин-20 (рис. 3) лизис с тритон Х-100 существенно
не изменяется в присутствии ДИДС (рис. 4).
Наличие в среде сахарозы не оказывает протек-
тирующего действия и несколько усиливает лизис,
в то же время ПЭГ значительно блокирует дейст-
вие тритон Х-100 (рис. 4) и твин-20 (см. рис. 3).
Возможно, что такое действие ПЭГ на лизис
эритроцитов с тритон Х-100 связано с уменьше-
method at P < 0.05 (n=5) was used to determine a
statistical significance of the results.
Results and discussion
When investigating lysis under CTAB cation
detergent effect the sucrose, dextran or PEG were
established as significantly decreasing cell sensitivity
to detergent, but the anion channel inhibitor DIDS
increases the erythrocyte sensitivity to CTAB effect
independently on medium composition (Fig. 1). As a
result of SDS anion detergent use the sucrose and PEG
were established as suppressing erythrocyte hemolysis,
but SDS-caused hemolysis strengthened at DIDS
presence in saline medium (Fig. 2). However in the
media with the mentioned non-electrolytes the anion
channel inhibitor slightly affects hemolysis. The lysis
with SDS compared to CTAB strengthens in a less
extent in DIDS presence, that is possibly stipulated
with DSD negative charge. In this case DIDS as a
negatively charged molecule neutralises the positive
charges at the entry into anion channel during binding,
thereby reducing positive charge of band 3 protein.
Due to this fact we may assume that SDS concentration
will decrease near membrane surface at DIDS
presence but will increase in CTAB one.
In our research we have investigated the effect of
Tween 20 and Triton X-100 non-ionic detergents,
referred to the polyoxyethylene-derivative detergent
series [7]. When using Tween 20 the sucrose and
dextran were established as slightly affecting cell
sensitivity to detergent compared to PEG. The presence
of DIDS anion channel inhibitor in the medium reduces
cell sensitivity to lysis with Tween 20 independently
on medium composition (Fig. 3). If comparing with
Tween 20 (Fig. 3) the lysis with Triton X-100 does not
significantly change in DIDS presence (Fig. 4). The
sucrose presence in the medium has no protective
effect and slightly strengthens lysis, meanwhile PEG
significantly blocks the Triton X-100 (Fig. 4) and Tween
20 effects (Fig. 3). This PEG effect on erythrocyte
lysis with Triton X-100 is possibly associated to a
decrease in detergent molecule number inclusion into
membrane. Probably, with PEG use the detergent
solubility increases, but the sucrose presence in the
medium was established as reducing non-ionic and
zwitterionic detergent solubility and consequently
decreasing critical concentration of micelle formation
(CCM) [18]. These literature data enable the assuming
that the sucrose inhibiting effect on lysis with ionic
detergents (see Fig. 1, 2) is stipulated with its
interactions with membrane.
Thus, the direction of cryoprotectant and DIDS
effects during erythrocyte lysis depends on detergent
type. The lysis suppression by cryoprotectants is
revealed when using ionic detergents. As a result of
Tween 20 effect the cryoprotectants insignificantly
338 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
0
20
40
60
80
100
0 7 14 21 28
0
20
40
60
80
100
0 7 14 21 28
0
20
40
60
80
100
0 7 14 21 28
0
20
40
60
80
100
0 7 14 21 28
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Концентрация ЦТАБ, мкмоль/л
CTAB concentration, µmol/l
Концентрация ЦТАБ, мкмоль/л
CTAB concentration, µmol/l
Концентрация ЦТАБ, мкмоль/л
CTAB concentration, µmol/l
Концентрация ЦТАБ, мкмоль/л
CTAB concentration, µmol/l
Рис. 1. Влияние криопротекторов на чувствительность эритроцитов к действию ЦТАБ в присутствии ДИДС в средах:
а) 0,15 М NaCl+10 мМ трис (рН 7,4); б) 0,15 М NaCl+10 мМ трис (рН 7,4) + 15% сахарозы; в) 0,15 М NaCl + 10 мМ трис
(рН 7,4) + 15% декстранa; г) 0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4) + 15% ПЭГ-1500; 1 – контроль; 2 – ДИДС (20 мкМ).
Fig. 1. Cryoprotectant effect on erythrocyte sensitivity to CTAB in DIDS presence in the media: a) 0.15 M NaCl + 10 mM
Tris (pH 7.4); b) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% sucrose; c) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% dextran;
d) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% PEG-1500; 1 – control; 2 – DIDS (20 µM).
нием включения количества молекул детергента
в мембрану. Вероятно, при использовании ПЭГ
повышается растворимость детергентов, однако
установлено, что присутствие в среде сахарозы
снижает растворимость неионных и цвиттерион-
ных детергентов и соответственно уменьшает
критические концентрации мицеллообразования
(ККМ) [18]. Эти данные литературы позволяют
предположить, что ингибирующее действие саха-
розы на лизис с ионными детергентами (см. рис. 1,
2) обусловлено её взаимодействием с мембраной.
Таким образом, направленность действия
криопротекторов и ДИДС при лизисе эритроцитов
зависит от вида детергента. При использовании
ионных детергентов выявляется подавление лизиса
криопротекторами. В результате действия твин-
reduce lysis with this non-ionic detergent. DIDS
presence in the medium eliminates an inhibiting effect
of cryoprotectants on CTAB, but not SDS. When using
Tween 20 DIDS manifests an inhibiting effect on lysis
independently on medium composition, but at Triton
X-100 presence its effect is insignificant.
There are known two models of membrane
solubilisation and fragmentation with detergents. The
first one is a cooperative binding of detergent mole-
cules with membrane at following transfer inside a cell
and binding with internal monolayer; the second one is
lipid extraction from external membrane monolayer by
a direct transfer into detergent micelles [7]. In both
cases the membranes are fragmented with forming
mixed vesicles, containing detergent and lipid molecules
or detergent and proteins ones [7].
а а б b
в с г d
2
1
2
2
2
1
1
1
339 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Концентрация ДСН, мкмоль/л
SDS concentration, µmol/l
Концентрация ДСН, мкмоль/л
SDS concentration, µmol/l
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Рис. 2. Влияние криопротекторов на чувствительность
эритроцитов к действию ДСН в присутствии ДИДС в
средах: а) 0,15 М NaCl+10 мМ трис (рН 7,4); б) 0,15 М
NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4) + 15% сахарозы; в) 0,15 М
NaCl + 10 мМ трис (рН7,4) + 15% ПЭГ-1500; 1 – контроль;
2 – ДИДС (20 мкМ).
Fig. 2. Cryoprotectant effect on erythrocyte sensitivity to
SDS at DIDS presence in the media: a) 0.15 M NaCl + 10 mM
Tris (pH 7.4); b) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15%
sucrose; c) 0.15 M NaCl+10 mM Tris (pH 7.4) + 15%
PEG-1500; 1 – control; 2 – DIDS (20 µM).
Концентрация ДСН, мкмоль/л
SDS concentration, µmol/l
20 криопротекторы незначительно уменьшают
лизис с данным неионным детергентом. Присутст-
вие в среде ДИДС устраняет ингибирующее
действие криопротекторов на ЦТАБ, но не ДСН.
При использовании твин-20 ДИДС выявляет
ингибирующее действие на лизис независимо от
состава среды, а в присутствии тритон-Х-100 он
влияет незначительно.
Известны две модели солюбилизации и фраг-
ментации мембран детергентами: первая – коо-
перативное связывание молекул детергентов с
мембраной при последующем переносе внутрь
клетки и связывании с внутренним монослоем;
вторая – экстракция липидов из внешнего монослоя
мембраны прямым переносом в детергентные
мицеллы [7]. В обоих случаях мембраны фрагмен-
тируются с образованием смешанных везикул,
содержащих молекулы детергентов и липидов или
детергентов и белков [7].
Существует мнение, что лизофосфатидилхолин
(ЛФХ) проявляет свое литическое действие в
There is an opinion, that lysophosphatidyl-choline
(LPC) manifests its lytic effect in monomer form [1],
but LPC monomers cause no hemolysis when including
into erythrocyte membrane, since it is possible under
LPC concentration higher than CCM [15]. Lipid
membrane solubilisation with SDS and Tween 20 was
established as realising via detergent micelle forms [7].
Under 0.015% Triton 100 concentration, corresponding
to CCM, the protein extraction and membrane lipid
bilayer liquefaction occur, herewith the detergent does
not change the polarity of membrane hydrophobic areas
[20]. Lipid bilayer destruction into mixed micelles with
dividing lipids and proteins begins after Triton X-100
monomer inclusion into membranes [9]. The maximum
binding of Triton X-100 with Ca2+-ATPase in
membranes is noted under detergent concentrations
lower than CCM, that indicates an non-micelle
mechanism of detergent interaction with proteins [6].
Tween 20 and Trtiton X-100 were shown to solubilise
less proteins from erythrocyte ghosts than SDS [10].
Non-ionic detergents in concentrations lower than CCM
mostly interact with Ca2+-ATPase-containing
membrane lipid components, meanwhile SDS extracts
the Ca2+-ATPase prior to lipid solubilisation. Non-ionic
detergents when passing to a cooperative binding induce
the small unilamellar liposome fusion with forming large
vesicles before solubilisation. The solubilisation of Ca2+-
ATPase-containing membranes is mostly accompanied
with membrane fragmentation and aggregation of its
а а б b
в с
1
1
1
2
2
2
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6
340 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6
Концентрация Твин-20, ммоль/л
Tween 20 concentration, mmol/l
Концентрация Твин-20, ммоль/л
Tween 20 concentration, mmol/l
Концентрация Твин-20, ммоль/л
Tween 20 concentration, mmol/l
Рис. 3. Влияние криопротекторов на чувствительность эритроцитов к действию твин-20 в присутствии ДИДС в
средах: а) 0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4); б) 0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4) + 15% сахарозы; в) 0,15 М NaCl +
10 мМ трис (рН 7,4) + 15% декстрана; г) 0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4) + 15% ПЭГ-1500; 1 – контроль, 2 – ДИДС
(20 мкМ).
Fig. 3. Cryoprotectant effect on erythrocyte sensitivity to Tween 20 in DIDS presence in the media: a) 0.15 M NaCl + 10 mM
Tris (pH 7.4); b) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% sucrose; c) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% dextran;
d) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% PEG-1500; 1 – control; 2 – DIDS (20 µM).
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
мономерной форме [1], однако мономеры ЛФХ,
включаясь в мембрану эритроцитов, не вызывают
гемолиз, поскольку он возможен при концентрации
ЛФХ выше ККМ [15]. Установлено, что солюби-
лизация липидов мембран с ДСН и твин-20
осуществляется посредством мицеллярных форм
детергентов [7]. При концентрации тритон Х-100
0,015%, которая соответствует ККМ, происходят
экстракция белков и разжижение липидного бислоя
мембраны, при этом детергент не изменяет по-
лярность гидрофобных областей мембраны [20].
Разрушение липидного бислоя в смешанные
мицеллы с разделением липидов и белков начи-
нается после включения в мембраны мономеров
тритон Х-100 [9]. Максимальное связывание в
components, than vesicle fusion. At the same time the
SDS slowly destroys the liposome membranes without
any fusion [5].
Thus, during membrane solubilisation and memb-
rane protein extraction the non-ionic detergents may
act in monomer and micelle forms. The SDS ionic
detergent solubilises membrane lipids in micelle form,
but protein extraction from membranes occurs before
lipid bilayer destruction. In addition, SDS extracts more
proteins from membranes, than Triton X-100 and
Tween 20.
Taking into account a difference in action mecha-
nisms of ionic and non-ionic detergents, as well as struc-
tural changes in membrane and anion channel during
DIDS binding, we may assume the following, since
а а б b
в с г d
2
2
2
2
1
1
1
1
Концентрация Твин-20, ммоль/л
Tween 20 concentration, mmol/l
341 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
0
20
40
60
80
100
0 135 270
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Концентрация тритон Х-100, мкмоль/л
Triton X-100 concentration, µmol/l
Концентрация тритон Х-100, мкмоль/л
Triton X-100 concentration, µmol/l
0
20
40
60
80
100
0 135 270
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Концентрация тритон Х-100, мкмоль/л
Triton X-100 concentration, µmol/l
Рис. 4. Чувствительность эритроцитов к действию тритон
Х-100 в средах: а) 0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4); б)
0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4) + 15% сахарозы; в)
0,15 М NaCl + 10 мМ трис (рН 7,4) + 15% ПЭГ-1500; 1 –
контроль; 2 – ДИДС (20 мкМ).
Fig. 4. Erythrocyte sensitivity to Triton X-100 effect in the
media: a) 0.15 M NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4); b) 0.15 M
NaCl + 10 mM Tris (pH 7.4) + 15% sucrose; c) 0.15 M NaCl +
10 mM Tris (pH 7.4) + 15% PEG-1500; 1 – control; 2 – DIDS
(20 µM).
мембранах тритон Х-100 с Са2+-АТФазой отме-
чается при концентрациях детергента ниже ККМ,
что указывает на немицеллярный механизм взаи-
модействия детергента с белками [6]. Показано,
что твин-20 и тритон-Х-100 солюбилизируют из
теней эритроцитов меньшее количество белков,
чем ДСН [10]. Неионные детергенты в концентра-
циях, которые ниже их ККМ, преимущественно
взаимодействуют с липидными компонентами
мембран, содержащих Са2+-АТФазу, тогда как
ДСН экстрагирует Са2+-АТФазу перед солюби-
лизацией липидов. Неионные детергенты при пере-
ходе к кооперативному связыванию индуцируют
слияние маленьких униламеллярных липосом с
образованием больших везикул перед солюбили-
зацией. Солюбилизация мембран, содержащих
Са2+-АТФазу, сопровождается в большей степени
фрагментацией мембран и агрегацией её компонен-
тов, чем слиянием везикул. При этом ДСН медлен-
но разрушает липосомальные мембраны, не вызы-
вая их слияния [5].
DIDS causes the band 3 protein tetramer dissociation
into dimers [17] when binding with erythrocyte
membranes, it contributes to the ionic detergent effect,
which solubilises membrane proteins [10]. With
augmentation of the protein-lipid contact area [16] the
effect of non-ionic detergent on membrane is
weakened. Since DIDS strengthens the effect of ionic
detergent not only in isotonic medium, but in
cryoprotectant-containing ones as well, herewith the
lysis suppression by cryoprotectants (see Fig. 1), we
may assume that the latter stabilises the band 3 protein
tetramer forms to CTAB effect, that insignificantly
affects the Tween 20 non-ionic detergent effect. In
last case DIDS in contrast weakens a lytic effect (see
Fig. 3). According to the results obtained we may assu-
me the following. When stabilising band 3 protein tetra-
mer forms with cryoprotectants, there is not permanent
increase in erythrocyte resistance to the effects, resul-
ting in a change of hydrophobic interactions in mem-
brane. Owing this of note is the fact that during band 3
protein tetramer disintegration into dimers under DIDS
binding there is an increase in hydrophobic contact area
of this protein and lipids in a membrane [16]. In one
case this stabilises cells (see Fig. 3), in another one it
destabilises them (see Fig. 1). However the mecha-
nism of a protective effect in cryoprotectants is not
associated to their direct contact with proteins. With
temperature decrease there are a change in hydro-
philic-hydrophobic balance of cryoprotectants and their
а а б b
в с
1
1
2
2
0
20
40
60
80
100
0 135 270
2
1
342 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
Таким образом, при солюбилизации мембран и
экстракции мембранных белков неионные детер-
генты могут действовать в мономерных и мицел-
лярных формах. Ионный детергент ДСН солюби-
лизирует липиды мембран в мицеллярной форме,
однако экстракция белков из мембран происходит
перед разрушением липидного бислоя. Кроме того,
ДСН экстрагирует из мембран больше белков, чем
тритон Х-100 и твин-20.
Учитывая различие механизмов действия
ионных и неионных детергентов, а также структур-
ные изменения в мембране и анионном канале при
связывании ДИДС, можно предположить следую-
щее. Поскольку при связывании с мембранами
эритроцитов ДИДС вызывает диссоциацию тетра-
меров белка полосы 3 на димеры [17], он способ-
ствует действию ионного детергента, который
солюбилизирует мембранные белки [10]. При
увеличении площади контактов белок-липид [16]
действие неионного детергента на мембрану
ослабляется. Поскольку ДИДС усиливает эффект
ионного детергента не только в изотонической сре-
де, но и в средах, содержащих криопротекторы,
при этом криопротекторы подавляют лизис (см.
рис. 1), то можно предположить, что последние
стабилизируют тетрамерные формы белка поло-
сы 3 к действию ЦТАБ, а это существенно не влия-
ет на действие неионного детергента твин-20. В
последнем случае ДИДС напротив ослабляет
литическое действие (см. рис. 3). По полученным
результатам можно сделать предположение. При
стабилизации криопротекторами тетрамерных
форм белка полосы 3 не всегда повышается устой-
чивость эритроцитов к воздействиям, которые
приводят к изменению гидрофобных взаимодейст-
вий в мембранах. В связи с этим следует отметить,
что при распаде тетрамеров белка полосы 3 на
димеры при связывании ДИДС увеличивается
площадь гидрофобного контакта данного белка и
липидов в мембране [16]. В одном случае это
стабилизирует клетки (см. рис. 3), в другом –
дестабилизирует (см. рис. 1). Однако механизм
защитного действия криопротекторов не связан с
их прямым контактом с белками. При снижении
температуры изменяется гидрофильно-гидрофоб-
ный баланс криопротекторов и происходит их
отделение от белковых доменов, что способствует
поддержанию белка в нативном состоянии [2].
Отсутствие влияния ДИДС на лизис тритон
Х-100, по сравнению с твин-20, свидетельствует о
том, что солюбилизация мембраны с тритонХ-100
не зависит от агрегатного состояния белка полосы
3. Различие действия ДИДС на лизис тритон Х-100
и твин-20 обусловлено их действующими концен-
трациями (см. рис. 3, 4). Влияние тритон Х-100
проявляется при концентрациях ниже ККМ
exclusion from protein domains, contributing for protein
maintenance in native state [2].
No DIDS effect on Triton X-100 lysis, compared
to Tween 20 testifies to the fact that the membrane
solubilisation with Triton X-100 does not depend on
the band 3 protein aggregate state. Difference in DIDS
effect on Triton X-100 and Tween 20 lysis is stipulated
by their current concentrations (see Fig. 3, 4). Triton
X-100 and Tween 20 effects are manifested under
concentrations lower (250 mmol/l) and higher
(50 mmol/l) than CCM, correspondingly (see Fig. 3,
4) [7]. During membrane solubilisation the protein state
is known as dependent on molecular or micelle form
of acting detergent. If the lipid solubilisation occurs
under detergent concentration lower than its CCM,
the isolated membrane proteins may preserve their
enzyme or transport properties [19]. Therefore during
lysis with Triton X-100 the band 3 protein as a part of
formed vesicles with this detergent will stay in a native
state.
Triton X-100 is the detergent, used for band 3
protein isolation from erythrocyte membranes with the
aim of transport function preservation [8]. These data
correlate well with the absence of DIDS effect on
lysis with Triton X-100 (see Fig. 4). This detergent
effect in molecular form is directed to lipid bilayer
destruction, therefore during DIDS binding with it the
change in aggregate state of band 3 protein does not
significantly affect the erythrocyte lysis curve (see
Fig. 4). Of note is that the elimination of DIDS effect
when passing from Tween 20 (see Fig. 3) to Triton
X-100 (see Fig. 4) the sucrose protective effect is lost.
When analysing the results obtained we may
conclude the following. Since sucrose does not
manifest its protective property in case of lipid matrix
solubilisation under lysis with Triton X-100, its effect
will be directed to membrane protein components. If
passing from Tween 20 (see Fig. 3) to Triton X-100
(see Fig. 4) PEG preserves its action, its effect should
be determined not only by the influence on membrane
protein state, but lipid bilayer as well. The results
obtained are stipulated by the fact that Triton X-100 is
the most optimal detergent for isolating band 3 proteins
form erythrocyte membrane [8]. Thus, the erythrocyte
lysis under Tween 20 and Triton X-100 effects depends
on aggregate state of band 3 protein and lipid matrix
state, correspondingly.
The results obtained shown a differently directed
DIDS effect as the band 3 protein aggregate state
modifier on lysis with detergents dependently on the
mechanism of their effect. The experimental data
confirm a different action mechanism of ionic and non-
ionic detergents. Structural state of band 3 protein
determines cell sensitivity to detergent and cryopro-
tectant effects, since a change in aggregate state of
this membrane protein eliminates a protective effect
343 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
(250 мкмоль/л), тогда как твин-20 – при концентра-
циях выше ККМ (50 мкмоль/л) (см. рис. 3, 4) [7].
Известно, что при солюбилизации мембран состоя-
ние белков зависит от молекулярной или мицел-
лярной формы действующего детергента. Если
солюбилизация липидов происходит при концентра-
ции детергента ниже его ККМ, то выделяемые
мембранные белки могут сохранять свои энзима-
тические или транспортные свойства [19]. Поэтому
при лизисе с тритон Х-100 белок полосы 3 в составе
образующихся везикул с данным детергентом бу-
дет оставаться в нативном состоянии.
Тритон Х-100 является детергентом, который
используется для выделения из мембран эритро-
цитов белка полосы 3 с целью сохранения транс-
портной функции [8]. Такие данные хорошо согла-
суются с отсутствием эффекта ДИДС на лизис с
тритон Х-100 (см. рис. 4). Действие этого детер-
гента в молекулярной форме направлено на разру-
шение липидного бислоя, поэтому при связывании
с ним ДИДС изменение агрегатного состояния
белка полосы 3 существенно не влияет на кривую
лизиса эритроцитов (см. рис.4). Важно отметить,
что устранение эффекта ДИДС при переходе от
твин-20 (см. рис. 3) к тритон Х-100 (см. рис. 4)
защитное действие сахарозы утрачивается.
На основе анализа полученных результатов
можно сделать следующие выводы. Поскольку
сахароза не выявляет свое защитное свойство в
случае солюбилизации липидного матрикса при
лизисе с тритон Х-100, то ее эффект будет направ-
лен на белковые компоненты мембраны. Если при
переходе от твин-20 (см. рис. 3) к тритон Х-100
(см. рис. 4) ПЭГ сохраняет свое действие, то его
эффект должен определяться не только влиянием
на состояние мембранных белков, но и на липидный
бислой. Полученные результаты обусловлены тем,
что тритон Х-100 является наиболее оптимальным
детергентом для выделения из мембран эритроци-
тов белка полосы 3 [8]. Таким образом, лизис
эритроцитов при действии твин-20 зависит от
агрегатного состояния белка полосы 3, а при дейст-
вии тритон Х-100 – от состояния липидного матрик-
са.
Полученные результаты показали разно-
направленное действие ДИДС как модификатора
агрегатного состояния белка полосы 3 на лизис с
детергентами в зависимости от механизма их
действия. Экспериментальные данные подтверж-
дают различный механизм действия ионных и
неионных детергентов. Структурное состояние
белка полосы 3 определяет чувствительность
клеток к действию детергентов и криопротекторов,
поскольку изменение агрегатного состояния
данного мембранного белка устраняет протекти-
of cryoprotectants during lysis with ionic detergent (see
Fig. 1). The similar experiments with non-ionic
detergent correlate well with DIDS effect on anion
channel aggregate state. In this case the cryo-
protectants slightly block detergent lysis (see Fig. 3).
Mechanisms of hemolytic pore formation under
osmotic and detergent lysis are shown as different
[14]. Using CD-spectroscopy no SDS effect (at 0–
250 µmol/l concentration) on erythrocyte ghost
membrane proteins was revealed, but an increase in
lipid bilayer hydrophobic fluidity was noted [14]. Under
osmotic lysis no change in membrane fluidity was
established, but conformational and/or associative
protein changes were revealed. At the same time the
band 3 protein modifiers were demonstrated as
increasing the erythrocyte osmotic fragility [14]. Basing
on the results obtained we assumed that under osmotic
and detergent lysis there were occurred the associative
changes in band 3 proteins and membrane lipid bilayer
destruction, correspondingly [14]. According to the
closed erythrocyte ghosts, labelled with eosin maleimide
and placed under hypertonic conditions a two-phase
change in fluorescence intensity due to the band 3
protein lateral clusterisation was revealed. This two-
phase intensity change testified to the hemolytic pore
formation with following its closing and lateral
distribution of band 3 protein inside membrane. After
the band 3 protein cytoplasmic domain splitting with
trypsin or SH-group blocking in it with N-ethyl-
maleimide the fluorescence intensity remained un-
changed. Consequently, the association and dissociation
of band 3 protein under hypotonic medium are
controlled with cytoplasmic domains. The revealed
growth and fall in eosin maleimide fluorescence
intensity as a part of erythrocyte ghost under hypotonic
conditions are well explained with a sequence of
hemolysis mechanism response: increase in cell volume;
band 3 protein clusterization; hemolytic pore formation
and its closing, accompanied with band 3 protein
redistribution [13].
In the papers [13, 14] the effect of band 3 protein
modifiers was not under study, but their usage is
indispensable for more complete study of detergent
lysis mechanism. The results obtained enable assuming
that the erythrocyte sensitivity to detergents and
protecting effect of cryoprotectants determine an
aggregate state of band 3 protein.
Conclusions
1. Cryoprotectants (sucrose, dextran, PEG-1500)
significantly suppress the erythrocyte lysis under ionic
detergent (CTAB, SDS) effect. DIDS presence in the
medium increases cell sensitivity to detergents in
isotonic medium and eliminates protective properties
of cryoprotectants to CTAB effect.
344 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
рующее действие криопротекторов при лизисе с
ионным детергентом (см. рис. 1). Подобные экс-
перименты с неионным детергентом вполне согла-
суются с действием ДИДС на агрегатное состоя-
ние анионного канала. В данном случае криопротек-
торы незначительно блокируют детергентный
лизис (см. рис. 3).
Показано, что механизмы образования гемоли-
тической поры при осмотическом и детергентном
лизисе различны [14]. С помощью КД-спектро-
скопии эффект ДСН (при концентрации 0–
250 мкмоль/л) на мембранные белки теней
эритроцитов не выявлен, однако отмечено повы-
шение текучести гидрофобной области липидного
бислоя [14]. При осмотическом лизисе изменение
текучести мембраны не установлено, но отмечены
конформационные и/или ассоциативные изменения
белков. При этом показано, что модификаторы
белка полосы 3 повышают осмотическую хруп-
кость эритроцитов [14]. На основе полученных
результатов было сделано предположение, что при
осмотическом лизисе происходят ассоциативные
изменения белка полосы 3, а при детергентном
лизисе – разрушение липидного бислоя мембраны
[14]. По замкнутым теням эритроцитов, меченных
эозинмалеимидом и помещенных в гипотонические
условия, выявлено двухфазное изменение интенсив-
ности флуоресценции вследствие латеральной
кластеризации белка полосы 3. Это двухфазное
изменение интенсивности свидетельствовало о
формировании гемолитической поры с после-
дующим ее замыканием и латеральным распре-
делением белка полосы 3 внутри мембраны. После
расщепления цитоплазматического домена белка
полосы 3 трипсином или блокирования SH-группы
в нем N-этилмалеимидом интенсивность флуорес-
ценции не изменялась. Следовательно, ассоциацию
и диссоциацию белка полосы 3 в гипотонической
среде контролируют цитоплазматические домены.
Выявленный рост и падение интенсивности
флуоресценции эозинмалеимида в составе теней
эритроцитов в гипотонических условиях хорошо
объясняет последовательность реакций механизма
гемолиза: увеличение объема клетки; кластери-
зация белка полосы 3; образование гемолитической
поры и ее замыкание, которое сопровождается
перераспределением белка полосы 3 [13].
В работах [13, 14] не было исследовано влияние
модификаторов белка полосы 3, но их исполь-
зование необходимо для более полного изучения
механизма детергентного лизиса. Полученные
результаты позволяют предположить, что чувстви-
тельность эритроцитов к детергентам и про-
тектирующее действие криопротекторов опреде-
ляются агрегатным состоянием белка полосы 3.
2. Erythrocyte lysis under Tween 20 non-ionic
detergent effect is slightly suppressed by sucrose and
dextran, but inhibited by PEG-1500. DIDS presence
in the medium reduces the cell sensitivity to this lytic
agent not only in isotonic medium, but cryoprotectant-
containing ones as well.
3. Erythrocyte lysis under Triton X-100 effect is
considerably suppressed with PEG-1500, but slightly
strengthened with sucrose. DIDS presence in the
media does not practically affect the lysis with this
detergent.
References
Ivkov V.G., Berestovsky G.N. Dynamic structure of lipid bilayer.–
Moscow: Nauka, 1981.– 294 p.
Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A., Crowe J.H. The basis
for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis //
Cryobiology.–1990.– Vol. 27, N4.– P. 401-415.
Fuginaga J., Tang X.B., Casey G.R. Topology of the
membrane domain of human erythrocyte anion exchange protein,
AE1 // J. Biol. Сhem.–1999.– Vol. 274, N10.– P. 6626-6633.
Hamasaki N., Kuma H., Ota K. et al. A new concept in
polytopic membrane proteins following from the study of band 3
protein // Biochem. Cell. Biol.– 1998.– Vol. 76, N5.– P. 729-733.
Kragh-Hansen U., le Maire M., Moller J.V. The mechanism of
detergent solubilization of liposomes and protein-containing
membranes // Biophys.J.– 1998.– Vol. 75, N6.– P. 2932-2946.
Le Maire M., Kwee S., Andersen J.P., Moller J.V. Mode of
interaction of polyoxyethyleneglycol detergents with
membrane proteins // Eur. J. Biochem.–1983.– Vol. 129, N3.–
P. 525-532.
Le Maire M., Champeil P., Moller J.V. Interaction of membrane
proteins and lipids with solubilizing detergents // Biochim.
Biophys. Acta.– 2000.– Vol. 1508.– P. 86-111.
Lukacovic M.F., Feinstein M.B., Shaafi R.I., Perrie S.
Purification of stabilized band 3 protein of the human erythrocyte
membrane and its reconstitution into liposomes // Bio-
chemistry.– 1981.– Vol. 20.– P. 3145-3151.
Macarulla J.M., Alonso A., Arrondo J.L. et al. Membrane
solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A
comparative study including model and cell membranes // Rev.
Exp. Fisiol.– 1989.– Vol. 45.– P. 1-8.
Matson R.S., Goheen S.C. Use of high-performance size
exclusion chromatography to determine the extent of detergent
solubilization of human erythrocyte ghosts // J. Chromatogr.–
1986.– Vol. 359.– P. 285-295.
Popov M., Tam L.Y., Li J., Reithmeier R.A. Mapping the ends
of transmembrane segments in a polytopic membrane protein/
Scanning N-glycosylation mutagenesis of extracytosolic loops
in the anion exchanger, band 3 // J. Biol. Chem.– 1997.– Vol. 272,
N29.– P. 18325-18332.
Sarabia V.E., Casey J.R., Reithmeier R.A. Molecular characteri-
zation of the band 3 protein from Southeast Asian ovalocytes //
J. Biol. Chem.– 1993.– Vol. 268, N14.– P. 10676-10680.
Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Mechanism of hypotonic
hemolysis of human erythrocytes // Biol. Pharm. Bull.–1993.–
Vol. 16, N5.– P. 506-512.
Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Participation of band 3 in
hypotonic hemolysis of human erythrocytes // Biol. Phar. Bull.–
1993.– Vol. 16, N2.– P. 188-194.
Utsumi H., Inoue K., Nojima S., Kwan T. Interaction of spin-
labeled lysophosphatidyl-choline with rabbit erythrocytes //
Biochemistry.– 1978.– Vol. 17, N10.– P. 1990-1996.
Van Dort H.M., Knowless D.W., Chasis J.A. et al. Analysis
of integral membrane protein contributions to the deformability
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
and stability of the human erythrocyte membrane // J. Biol.
Chem.– 2001.– Vol. 276, N50.– P. 46968-46974.
Van Dort H.M., Moriyama R., Low P.S. Effect of band 3 subunit
equilibrium on the kinetics and affinity of ankyrin binding to
erythrocyte membrane vesicles // J. Biol. Chem.– 1998.–
Vol. 273, N24.– P. 14819-14826.
Walter A., Kuehl G., Barnes K., Vander Waerdt G. The vesicle-
to-micelle transition of phosphatidylcholine vesicles induced
by nonionic detergents: effects of sodium chloride, sucrose
and urea // Biochim. Biophys. Acta.– 2000.– Vol. 1508, N1-2.–
P. 20-33.
Womack M.D., Kendall D.A., Macdonald R.C. Detergent
effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer
membranes // Biochim. Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 733.–
P. 210-215.
Yegutkin G.G. Effect of increasing concentrations of nonionic
detergent Triton X-100 on solubilization and structure of rat
liver and adipose plasma membranes // Membr. Cell. Biol.–
1997.– Vol. 10, N5.– P. 515-520.
Accepted in 26.11.2007
345 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
Выводы
1. Криопротекторы (сахароза, декстран,
ПЭГ-1500) значительно подавляют лизис эритро-
цитов под воздействием ионных детергентов
(ЦТАБ, ДСН). Присутствие в среде ДИДС вызы-
вает повышение чувствительности клеток к
детергентам в изотонической среде и устраняет
защитные свойства криопротекторов к действию
ЦТАБ.
2. Лизис эритроцитов под воздействием неион-
ного детергента твин-20 несущественно подав-
ляется сахарозой и декстраном, но ингибируется
ПЭГ-1500. Присутствие в среде ДИДС вызывает
снижение чувствительности клеток к действию
данного литического агента не только в изотони-
ческой среде, но и в средах, содержащих криопро-
текторы.
3. Лизис эритроцитов под действием тритон
X-100 существенно подавляется ПЭГ-1500, но
несколько усиливается сахарозой. Присутствие в
средах ДИДС практически не влияет на лизис с
данным детергентом.
Литература
Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура
липидного бислоя.– М.: Наука, 1981.– 294 с.
Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A., Crowe J.H. The basis
for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis //
Cryobiology.–1990.– Vol. 27, N4.– P. 401-415.
Fuginaga J., Tang X.B., Casey G.R. Topology of the
membrane domain of human erythrocyte anion exchange protein,
AE1 // J. Biol. Сhem.–1999.– Vol. 274, N10.– P. 6626-6633.
Hamasaki N., Kuma H., Ota K. et al. A new concept in
polytopic membrane proteins following from the study of band 3
protein // Biochem. Cell. Biol.– 1998.– Vol. 76, N5.– P. 729-733.
Kragh-Hansen U., le Maire M., Moller J.V. The mechanism of
detergent solubilization of liposomes and protein-containing
membranes // Biophys.J.– 1998.– Vol. 75, N6.– P. 2932-2946.
Le Maire M., Kwee S., Andersen J.P., Moller J.V. Mode of
interaction of polyoxyethyleneglycol detergents with
membrane proteins // Eur. J. Biochem.–1983.– Vol. 129, N3.–
P. 525-532.
Le Maire M., Champeil P., Moller J.V. Interaction of membrane
proteins and lipids with solubilizing detergents // Biochim.
Biophys. Acta.– 2000.– Vol. 1508.– P. 86-111.
Lukacovic M.F., Feinstein M.B., Shaafi R.I., Perrie S.
Purification of stabilized band 3 protein of the human erythrocyte
membrane and its reconstitution into liposomes // Bio-
chemistry.– 1981.– Vol. 20.– P. 3145-3151.
Macarulla J.M., Alonso A., Arrondo J.L. et al. Membrane
solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A
comparative study including model and cell membranes // Rev.
Exp. Fisiol.– 1989.– Vol. 45.– P. 1-8.
Matson R.S., Goheen S.C. Use of high-performance size
exclusion chromatography to determine the extent of detergent
solubilization of human erythrocyte ghosts // J. Chromatogr.–
1986.– Vol. 359.– P. 285-295.
Popov M., Tam L.Y., Li J., Reithmeier R.A. Mapping the ends
of transmembrane segments in a polytopic membrane protein/
Scanning N-glycosylation mutagenesis of extracytosolic loops
in the anion exchanger, band 3 // J. Biol. Chem.– 1997.– Vol. 272,
N 29.– P. 18325-18332.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
17.
18.
19.
20.
Sarabia V.E., Casey J.R., Reithmeier R.A. Molecular characteri-
zation of the band 3 protein from Southeast Asian ovalocytes //
J. Biol. Chem.– 1993.– Vol. 268, N14.– P. 10676-10680.
Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Mechanism of hypotonic
hemolysis of human erythrocytes // Biol. Pharm. Bull.–1993.–
Vol. 16, N5.– P. 506-512.
Sato Y., Yamakose H., Suzuki Y. Participation of band 3 in
hypotonic hemolysis of human erythrocytes // Biol. Phar. Bull.–
1993.– Vol. 16, N2.– P. 188-194.
Utsumi H., Inoue K., Nojima S., Kwan T. Interaction of spin-
labeled lysophosphatidyl-choline with rabbit erythrocytes //
Biochemistry.– 1978.– Vol. 17, N10.– P. 1990-1996.
Van Dort H.M., Knowless D.W., Chasis J.A. et al. Analysis
of integral membrane protein contributions to the deformability
and stability of the human erythrocyte membrane // J. Biol.
Chem.– 2001.– Vol. 276, N50.– P. 46968-46974.
Van Dort H.M., Moriyama R., Low P.S. Effect of band 3 subunit
equilibrium on the kinetics and affinity of ankyrin binding to
erythrocyte membrane vesicles // J. Biol. Chem.– 1998.–
Vol. 273, N24.– P. 14819-14826.
Walter A., Kuehl G., Barnes K., Vander Waerdt G. The vesicle-
to-micelle transition of phosphatidylcholine vesicles induced
by nonionic detergents: effects of sodium chloride, sucrose
and urea // Biochim. Biophys. Acta.– 2000.– Vol. 1508, N1-2.–
P. 20-33.
Womack M.D., Kendall D.A., Macdonald R.C. Detergent
effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer
membranes // Biochim. Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 733.–
P. 210-215.
Yegutkin G.G. Effect of increasing concentrations of nonionic
detergent Triton X-100 on solubilization and structure of rat
liver and adipose plasma membranes // Membr. Cell. Biol.–
1997.– Vol. 10, N5.– P. 515-520.
Поступила 26.11.2007
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
346
|