Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования
Методом ЯМР-спектроскопии изучена гидратация белковых молекул в присутствии сахаров – глюкозы, фруктозы и сахарозы. В широком диапазоне концентраций компонент определены параметры гидратации, рассчитаны концентрация связанной воды и межфазная энергия. На примере сывороточного альбумина показано, что...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2007 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69105 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования / А.А. Ругаль, В.Н. Барвинченко, Н.П. Галаган, И.В. Сиора, В.В. Туров // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 374-384. — Бібліогр.: 15 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859976197887229952 |
|---|---|
| author | Ругаль, А.А. Барвинченко, В.Н. Галаган, Н.П. Сиора, И.В. Туров, В.В. |
| author_facet | Ругаль, А.А. Барвинченко, В.Н. Галаган, Н.П. Сиора, И.В. Туров, В.В. |
| citation_txt | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования / А.А. Ругаль, В.Н. Барвинченко, Н.П. Галаган, И.В. Сиора, В.В. Туров // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 374-384. — Бібліогр.: 15 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Методом ЯМР-спектроскопии изучена гидратация белковых молекул в присутствии сахаров – глюкозы, фруктозы и сахарозы. В широком диапазоне концентраций компонент определены параметры гидратации, рассчитаны концентрация связанной воды и межфазная энергия. На примере сывороточного альбумина показано, что внутриглобульная вода может замещаться низкомолекулярными соединениями – сахарами. Наибольший эффект дегидратации установлен для сахарозы. При этом белковые молекулы изменяют свое свойство – способность к адсорбции на поверхности высокодисперсного кремнезема, которая снижается на 25 % вследствие образования комплексных соединений.
Методом ЯМР-спектроскопії вивчена гідратація білкових молекул в присутності цукрів – глюкози, фруктози та цукрози. В широкому діапазоні концентрацій компонент визначені параметри гідратації, розраховані концентрація зв’язаної води та міжфазна енергія. На прикладі сироваткового альбуміну показано, що внутрішньоглобульна вода може заміщуватись низькомолекулярними сполуками – цукрами. Найбільший ефект дегідратації встановлений для цукрози. При цьому білкові молекули змінюють свою властивість – здатність до адсорбції на поверхні високодисперсного кремнезему, яка знижується на 25 % внаслідок утворення комплексних сполук.
Protein molecules’ hydration in the presence of sugars: glucose, fructose and sucrose were studied by NMR-spectroscopy. The parameters of hydration, concentration of bound water and value of interfacial energy were determined over a wide range of component concentrations. It was shown with exemplifying using the serum albumin, that low-molecular compounds (sugars) could replace an intraglobular water. The maximal effect of dehydration was observed for sucrose. In this case protein molecules change their property and capability to be adsorbed on a surface of fine-grained silica, which is reduced by 25% as a result of the forming complexes.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:23:41Z |
| format | Article |
| fulltext |
374 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
УДК 544.723
А.А. РУГАЛЬ*, В.Н. БАРВИНЧЕНКО, Н.П. ГАЛАГАН, И.В. СИОРА, В.В. ТУРОВ
Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул
в процессе криоконсервирования
UDC 544.723
A.A. RUGAL*, V.N. BARVINCHENKO, N.P. GALAGAN, I.V. SIORA, V.V. TUROV
Effect of Sugars on Dehydration of Biopolymer Molecules
During Cryopreservation
Методом ЯМР-спектроскопии изучена гидратация белковых молекул в присутствии сахаров – глюкозы, фруктозы и
сахарозы. В широком диапазоне концентраций компонент определены параметры гидратации, рассчитаны концентрация
связанной воды и межфазная энергия. На примере сывороточного альбумина показано, что внутриглобульная вода может
замещаться низкомолекулярными соединениями – сахарами. Наибольший эффект дегидратации установлен для сахарозы. При
этом белковые молекулы изменяют свое свойство – способность к адсорбции на поверхности высокодисперсного кремнезема,
которая снижается на 25 % вследствие образования комплексных соединений.
Ключевые слова: криоконсервирование, криопротекторы, ЯМР-спектроскопия, гидратация, связанная вода, межфазная
энергия.
Методом ЯМР-спектроскопії вивчена гідратація білкових молекул в присутності цукрів – глюкози, фруктози та цукрози.
В широкому діапазоні концентрацій компонент визначені параметри гідратації, розраховані концентрація зв’язаної води та
міжфазна енергія. На прикладі сироваткового альбуміну показано, що внутрішньоглобульна вода може заміщуватись
низькомолекулярними сполуками – цукрами. Найбільший ефект дегідратації встановлений для цукрози. При цьому білкові
молекули змінюють свою властивість – здатність до адсорбції на поверхні високодисперсного кремнезему, яка знижується на
25 % внаслідок утворення комплексних сполук.
Ключові слова: кріоконсервування, кріопротектори, ЯМР-спектроскопія, гідратація, зв’язана вода, міжфазна енергія.
Protein molecules’ hydration in the presence of sugars: glucose, fructose and sucrose were studied by NMR-spectroscopy. The
parameters of hydration, concentration of bound water and value of interfacial energy were determined over a wide range of component
concentrations. It was shown with exemplifying using the serum albumin, that low-molecular compounds (sugars) could replace an
intraglobular water. The maximal effect of dehydration was observed for sucrose. In this case protein molecules change their property
and capability to be adsorbed on a surface of fine-grained silica, which is reduced by 25% as a result of the forming complexes.
Key-words: cryopreservation, cryoprotectants, NMR-spectroscopy, hydration ability, bound water, interfacial energy.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Ген. Наумова, 17, Киев, Украина 03164; тел.:+38 (044)
422-96-68, электронная почта: ankluchko@rambler.ru
* To whom correspondence should be addressed: 17, General
Naumov str., Kiev, Ukraine, 03164; tel.: +380 44 422 9668, e-mail:
ankluchko@rambler.ru
Institute of Surface Chemistry named by A.A. Chuyko of the
National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine
Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной
академии наук Украины, г. Киев
Практически все способы долговременного
хранения клеточного материала и тканей основаны
на использовании разных методов криоконсерви-
рования [7, 10, 11]. Криоконсервированный биоло-
гический материал, хранящийся при температуре
жидкого азота (–196°C), используют для научных
и практических целей. Однако в настоящее время
не существует универсального способа, гаранти-
рующего полное сохранение (восстановление)
структуры и функций биологического объекта.
Проницаемость клеточных мембран зависит от
типа клеток и условий замораживания. При
переходе температуры от физиологической к более
низкой, чем температура стеклования воды (около
–90°C), в клетках происходят физические и
биологические процессы, которые должны быть
обратимыми при последующем размораживании.
Основные повреждения в клетках наблюдаются
при 15...–90°С. Однако следует отметить, что при
температурах 30...0°С большая часть клеток
Practically all methods of the long-term storage of
cell material and tissues have been based on the
application of different cryopreservation methods [7,
10, 11]. Cryopreserved biological material stored at
liquid nitrogen temperature (–196°C) is used for
scientific and practical purposes. However, now there
is no all-purpose method which may guarantee a comp-
lete preservation (recovery) of the structure and func-
tions of biological object. Cell membrane permeability
depends on the cell type and freezing conditions. During
temperature transition from physiological to lower one
than water vitrification temperature (about –90°C) the
physical and biological processes proceed in cells which
must be reversible during following thawing. The main
damages of cells are recorded at 15...–90°C. However
it should be noted that at 0...30°C the major part of
cells preserve the membrane integrity, intracellular
composition and ability to self-recovery of damages,
stipulated by the presence of free radicals [6, 12]. The
risk of cell damage at the temperatures lower than 0
375
сохраняет целостность мембран, внутриклеточный
состав и способность к самовосстановлению
некоторых повреждений, в частности обуслов-
ленных присутствием свободных радикалов [6, 12].
Риск повреждения клеток при температуре ниже
0°С повышается из-за образования внутри-
клеточных кристаллов льда [13]. Установлено, что
при –40°С в каждой клетке суспензии образуются
кристаллы льда [12].
При размораживании для предотвращения
формирования внутриклеточных кристаллов льда
и минимизации количества поврежденных клеток
используют специальный протокол криоконсер-
вирования, который обеспечивает определенный
уровень дегидратации клеток или тканей. Обычно
для этого применяют растворы криопротекторов
высоких концентраций. В случае медленного
охлаждения эффект обезвоживания достигается
при переносе клеток в раствор криопротектора с
определенной концентрацией [10]. При образова-
нии кристаллов льда и дальнейшем увеличении
объема замерзшей воды повышается концентра-
ция внеклеточного раствора, что способствует
дальнейшей дегидратации клеток.
Оптимальным для выживаемости клеток при
криоконсервировании является условие, когда
объем воды, выходящей из клеток, совпадает с
объемом, переходящим в твердую фазу льда. Для
обеспечения квазиравновесных условий замора-
живания охлаждение проводят со скоростью
3–5°С/мин до –30...–40°С с последующим погруже-
нием в жидкий азот. В результате в клетках ос-
тается небольшое количество жидкой воды, кото-
рая при переходе в твердое состояние не повреж-
дает клеточные мембраны.
Для ускорения дегидратации при заморажи-
вании в криосреду добавляют сахара [9]. В таких
растворах обеспечивается практически полная
дегидратация клеток до их замораживания, что
позволяет помещать материал непосредственно в
жидкий азот или его пары. Одним из механизмов
дегидратации клеток в присутствии сахаров может
быть уменьшение количества воды, связанной с
белковыми молекулами, находящимися в составе
клеточных структур.
Цель работы – изучение дегидратации белко-
вых молекул на примере транспортного белка –
сывороточного альбумина [1-3, 7] в присутствии
сахарозы, фруктозы и глюкозы.
Материалы и методы
Основным методом исследования была
1Н ЯМР-спектроскопия в условиях послойного
вымораживания жидкой фазы [8, 14, 15], с помощью
которого измеряли концентрацию связанной воды
increases due to the formation in them of intracellular
ice crystals [13]. It has been found that at –40°C in
each cell of the suspension the ice crystals are formed
[12].
During thawing for preventing the formation of
intracellular ice crystals and minimization of damaged
cells a special cryopreservation protocol providing the
certain level of dehydration of cells and tissue, is used.
Usually with this aim the cryoprotectant solutions under
high concentrations are applied. So, at slow cooling
the dehydration effect is achieved at cell transfer into
the solution of cryoprotectant under certain concen-
tration [10]. With the ice crystal formation and following
increase in the volume of frozen water there is the
augmentation of extracellular solution concentration,
that contributes to further cell dehydration.
Optimal for cell survival during cryopreservation is
the condition when water volume releasing out of cells
coincides with the one transforming into solid ice phase.
For providing quasi-equilibrium conditions of freezing
the cooling is performed with the rate of 3...5°C/min
down to –30...–40°C with following immersion into
liquid nitrogen. In the result, small amount of non-frozen
water remains in cells, which does not damage cell
membranes during transition into solid state.
For acceleration of dehydration during freezing the
sugars are added into cryoprotective medium [9]. In
such solutions quite a complete dehydration of cells
prior to their freezing is provided, that enables to place
the material into liquid nitrogen or its vapors. One of
mechanisms of cell dehydration in presence of sugars
may be the reduced amount of water bound with protein
molecules, being a part of cell structures.
The research aim was to study the dehydration of
protein molecules on the example of transport protein:
serum albumin [1-3, 7] in presence of sucrose, fructose
and glucose.
Materials and methods
The basic research methods was 1H NMR spectro-
scopy under conditions of layer-by-layer freezing-out
of liquid phase [8, 14, 15], by means of which the
concentration of bound water at T<0°C and thermo-
dynamic characteristics of water layers undergoing an
excitation effect from the side of protein molecules
were found.
Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, USA),
human serum albumin (HSA) (“Biofarma”, Ukraine),
fructose (Fr), glucose (Gl) and sucrose (Sucr) (all of
“chemically pure” grade) (Merck, Germany) were
used in the research. Solutions of proteins and sugars
were prepared on the base of physiological solution
(0.9 % NaCl).
NMR spectra were obtained with NMR-spectro-
meter of high resolution WP-10 SY (“Bruker”,
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
376
при температурах T<0°C и рассчитывали термоди-
намические характеристики слоев воды, испы-
тывающих возмущающее воздействие со стороны
белковых молекул.
В работе использовали бычий сывороточный
альбумин (БСА, Sigma, США), сывороточный
альбумин человека (САЧ, Биофарма, Украина),
фруктозу (Fr), глюкозу (Gl) и сахарозу (Sucr) (все
х. ч.) (Merck, Германия). Растворы белков и саха-
ров готовили на основе физиологического раствора
(0,9% NaCl).
Спектры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре
высокого разрешения WP-100 SY (Bruker, Герма-
ния) с рабочей частотой 100 МГц и максимальной
полосой пропускания 50 кГц, а также Varian
Merkury (США) с рабочей частотой 400 МГц.
Использовали зондирующий импульс 90° длитель-
ностью 4 мкс при частоте 100 МГц и 2 мкс при
400 МГц. Температуру в датчиках спектрометров
регулировали термоприставкой Bruker VT-1000
(Германия) с точностью ±1°С. Интенсивность
сигналов определяли электронным интегратором
с точностью ±10%. Для предотвращения переох-
лаждения воды в исследуемых объектах опреде-
ление интенсивности сигнала незамерзающей
воды проводили при нагревании образцов, предва-
рительно охлажденных до температуры –63°С.
Адсорбцию белка проводили в статических
условиях из водного раствора при температуре
20°C. Исходная концентрация белка 1–15 мг/мл.
Отношение массы сорбента к массе раствора
1:200 (0,1 г адсорбента на 20 мл раствора белка).
Для достижения адсорбционного равновесия
систему инкубировали при комнатной температуре
в течение 2 ч, затем центрифугировали 10 мин при
8000 об/мин и рассчитывали равновесную концен-
трацию САЧ спектрофотометрическим методом,
исходя из значений молярных коэффициентов
поглощения
Ср = А278-320/ε⋅l,
где А278-320 – светопоглощение раствора при 278 нм
с учетом поправки на мутность при 320 нм; ε –
молярный коэффициент поглощения при 278 нм; l –
толщина стенки кюветы.
Величину адсорбции белка на поверхности
высокодисперсного кремнезема (ВДК) определяли
по формуле
а = (С0 – СР)V/m [мг/г],
где С0, Ср – исходная и равновесная концентрации
белка в растворе соответственно; V – объем раст-
вора; m – масса сорбента.
Germany) with operating frequency of 100 MHz and
maximum band pass of 50 kHz as well as Varian
Merkury (USA) with operating frequency of 400 MHz.
The probe impulse (90°) with the duration of 2 and 4
ms at frequency of 400 MHz and 100 MHz, correspon-
dingly, was used. Temperature in gauges of spectro-
meters was regulated with temperature controller
Bruker VT-1000 (Germany) with an accuracy of
±1°C. Intensity of signals was determined by electron
integrator with an accuracy of ±10%. For preventing
the overcooling if water in the samples under study
the intensity of signal form non-frozen water was
determined when heating the samples, pre-cooled
down to –63°C.
Protein adsorption was performed in static
conditions from aqueous solution at 20°C. Initial
concentration of protein is 1-15 mg/ml. A ratio of
absorbent mass to the solution one is 1:200 (0.1 g
adsorbent per 20 ml protein solution). To achieve
adsorbent balance the system was incubated at room
temperature for 2 hrs, then centrifuged for 10 min at
8,000 rot/min and equilibrium concentration of HSA
was calculated spectrophotometricaly on the values
of molar adsorption coefficient
Ср = А278-320/ε⋅l,
where A278-320 – solution light adsorption at 278 nm
with taking into account the correction for turbidity at
320 nm; ε – molar coefficient of adsorption at 278 nm;
l – cuvette wall width.
Adsorption value of protein on the surface of fine-
grained silica (FGS) was determined on the formula
а = (С0 – СР)V/m [mg/g],
where C0, Cp – initial and equilibrium protein
concentrations in a solution, correspondently; V –
solution volume; m – adsorbent mass.
Viscosity of solutions of protein and the one in
presence of sucrose were measured with VPZh-3
capillary glass viscosimeter (Soyuznauchpribor,
Leningrad) at 25°C and were calculated with the
formula
η=k⋅t⋅d [Pa⋅s],
where k – viscosimeter constant, mSt/s; t – time of
solution flow, s; d – solution density, g/cm3.
Results and discussion
Typical 1H NMR spectra of non-frozen water,
presented in Fig. 1 permit to define the following
regularities: under high resolution the spectrum of non-
frozen water represents broadened non-symmetric
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
377
Вязкость растворов белка и белка в присутст-
вии сахарозы измеряли с помощью вискозиметра
капиллярного стеклянного ВПЖ-3 (Союзнауч-
прибор, Россия) при температуре 25°С и рассчи-
тывали по формуле:
η = k⋅t⋅d [Па⋅с],
где k – константа вискозиметра, мСт/c; t – время
вытекания раствора, с; d – плотность раствора,
г/см3.
Результаты и обсуждение
Типичные спектры 1Н ЯМР незамерзающей
воды (рис. 1) позволяют выделить следующие
закономерности: при высоком разрешении спектр
незамерзающей воды представляет собой уширен-
ный несимметричный сигнал, ширина которого
увеличивается с понижением температуры ввиду
уменьшения подвижности молекул воды [4].
Химический сдвиг δ сигнала такой воды находится
в диапазоне 4-5 м.д. В растворах белка при низких
температурах симметричность сигнала увеличи-
вается и он смещается в область слабых магнитных
полей (рис. 1, а). В присутствии сахаров вместо
одного несимметричного регистрируется два сиг-
нала воды, для которых разница химических
сдвигов не превышает 1 м. д. (рис. 1, б, в).
Изменение формы спектра 1Н ЯМР незамер-
зающей воды свидетельствует о наличии несколь-
ких ее форм, между которыми при разных усло-
виях проведения эксперимента происходит быст-
рый или медленный (в шкале времени ЯМР)
молекулярный обмен. В соответствии с современ-
ными представлениями [14] структурная диффе-
ренциация воды в белковой глобуле может проис-
ходить из-за существования в ней гидрофобных
полостей, заполненных водой. Структура воды
определяется средним числом водородных связей,
в которых участвует каждая молекула воды [15].
Поэтому снижение способности к образованию
водородных связей сопровождается смещением
сигнала воды в область сильных магнитных полей
и наоборот. Установлено, что сигнал с меньшим
значением химического сдвига соответствует
менее упорядоченной сетке водородных связей
межфазной воды.
Общей закономерностью системы альбумин-
сахара является наличие концентрационного
интервала, при котором добавление в раствор
сахаров сопровождается уменьшением интенсив-
ности сигнала незамерзающей воды. Эта зависи-
мость характерна для растворов САЧ, содержащих
сахарозу (рис. 1, в). При –23°С введение в раствор
1% сахарозы приводит к уменьшению интенсив-
ности сигнала воды более чем в пять раз. Получен-
signal, the width of which increases with temperature
decrease due to lessening motility of water molecules
[4]. Chemical shift d of signal for such a water is within
the range of 4-5 ppm. In the solutions of protein under
low temperatures the signal symmetry increases and
it is shifted toward the area of weak magnetic fields
(Fig. 1, a). In presence of sugars instead of one non-
symmetric signal of water there are recorded two
signals, for those the difference of chemical shifts does
not exceed 1 ppm (Fig. 1, b, c).
The changed shape of 1H NMR spectrum of non-
frozen water testifies to the presence of its several
forms, between which under different conditions of
experiment there is either rapid or slow (according to
NMR time scale) molecular exchange. According to
contemporary notions [14] structural differentiation
of water in protein globule may occur due to the exi-
stence of water-filled hydrophobic cavities in it. Water
structure is determined by an average number of
hydrogen bonds, where each water molecule partici-
pates [15]. Therefore reduced ability to the formation
of hydrogen bonds is accompanied by shifting of water
signal into the area of strong magnetic fields and vice
versa. It has been established that the signal with lower
value of chemical shift corresponds to less ordered
net of hydrogen bonds of interfacial water.
General regularity of albumin-sugar system is the
presence of the concentration interval, wherein the
adding of sugars to a solution is accompanied with a
reduction in signal intensity for non-frozen water. This
dependence is characteristic for HSA solutions,
containing sucrose. At –23°C introduction of 1%
sucrose into the solution leads to decrease of water
signal intensity more than fivefold. The obtained
dependence testifies to an effective interaction of
sucrose with protein molecules. The same effect is
explained by the substituting of a part of the molecules
of bound water in hydrate coat of protein molecules
with sucrose [6]. In this research the concentration
Cuw of non-frozen water was not determined, so the
estimation of efficiency of the observed process was
impossible.
Detailed description of layer-by-layer freezing-out
method of liquid phase has been shown in [8, 14, 15].
For obtaining the characteristics of bound water layers
the temperature dependences of integral intensities of
signal I of non-frozen water were measured, using
which the dependence of Gibbs differential energy ∆G
on concentration of non-frozen water was calculated.
Since a condition of water freezing on bioobject/water
interface is the parity of free energies of absorbed
water and ice, decreasing of freezing temperature of
absorbed water determines the reduction of free
energy of water, caused by adsorptional interactions
(∆G = G0 – G, where G0 – ice free energy at 0°C)
[15]. Since ice free energy with a reduction of
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
б b
a a
378
ная зависимость свидетельствует об эффективном
взаимодействии сахаров с белковыми молекулами.
Подобный эффект объясняется замещением части
молекул связанной воды в гидратной оболочке
молекул белка молекулами сахарозы [6]. В этой
работе не определялась концентрация незамер-
зающей воды Cuw, поэтому невозможно судить об
эффективности наблюдаемого процесса .
Подробное описание метода послойного
вымораживания жидкой фазы приведено в [8, 14,
15]. Для получения характеристик слоев связанной
воды измеряли температурные зависимости интег-
ральных интенсивностей сигнала I незамерзающей
воды, по которым рассчитывалась зависимость
дифференциальной энергии Гиббса ∆G от концен-
трации незамерзающей воды. Поскольку условием
замерзания воды на межфазной границе био-
объект/вода является равенство свободных энергий
адсорбированной воды и льда, понижение темпе-
ратуры замерзания адсорбированной воды опреде-
ляет уменьшение свободной энергии воды,
вызванное адсорбционными взаимодействиями
(∆G=Go–G, где Go – свободная энергия льда при
0°С) [15]. Поскольку свободная энергия льда с
понижением температуры изменяется по прибли-
зительно линейному закону [5], то величину ∆G
можно рассчитать по формуле
∆G = –0,036(273 – Т).
Межфазную энергию биологического объекта
γS в водной среде определяли по площади под
кривой ∆G(Сuw):
∫ ∆=γ
max
uw
2
C
0
OH1S )C(GdK ,
maxгде Сuw – толщина слоя незамерзающей воды при
Т→0°С.
Если в растворе, кроме молекул белка, содер-
жатся низкомолекулярные соединения, то на
величину Сuw может влиять вода сконцентрирован-
ного в микрополостях ледяной матрицы бинарного
раствора. Если такой раствор образуется, то на
зависимостях I(Сuw) присутствует участок линей-
ного роста интенсивности сигнала с увеличением
Сuw [6]. Однако при небольшой концентрации, все
вещество органической добавки в процессе
замораживания может быть сконцентрировано в
гидратных оболочках белковых молекул [8].
На рис. 2 приведены зависимости Сuw от
концентрации сахаров при разных температурах.
Величину Сuw определяли сравнением интенсив-
ностей сигнала 1Н ЯМР воды до и после заморажи-
вания. Во всех изученных системах при добавле-
нии небольших количеств сахаров регистрируется
7 6 5 4 3 2 1 0
7 6 5 4
103,5
104,0
104,5
105,0
105,5
106,0
106,5
107,0
107,5
108,0
108,5
109,0
109,5
110,0
110,5
111,0
111,5
112,0
12 10 8 6 4 2 0 -2
Рис. 1. Зависимость формы спектров 1Н ЯМР незамер-
зающей воды в растворах БСА-вода (а) и БСА-вода-
фруктоза (б) от температуры (при 400 МГц) и от CSucr в
1%-м растворе САЧ (в) при –23°С (при 100 МГц).
Fig. 1. Dependence of 1H NMR spectra shapes of non-
frozen water in BSA-water solutions (a) and BSA-water-
fructose (b) on temperature (at 400 MHz) and on Csucr in 1%
HSA solution (c) at –23ºC (at 100 MHz).
Химический сдвиг δ, м.д. Chemical shift δ, ppm
БСА 2%
BSA 2%
–5°C
–10°C
–20°C
–30°C
–40°C
БСА 1,5% + Fr 0,37%
BSA 1.5% + Fr 0.37%
0°C
–5°C
–20°C
–30°C
–40°C
CSucr =1%
–23°C
CSucr =0,1%
CSucr =0%
Химический сдвиг δ, м.д. Chemical shift δ, ppm
Химический сдвиг δ, м.д. Chemical shift δ, ppm
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
в c
379
участок уменьшения концентрации незамерзаю-
щей воды. Для фруктозы этот участок явно выра-
жен на узком диапазоне изменения СFr, а участок
прямо пропорционального роста зависимости
Сuw(СFr) не наблюдается (рис. 2, а). Для глюкозы
при CGl < 0,38% установлено значительное умень-
шение Сuw лишь при температурах близких к 0°С
(рис. 2, б). Участок пропорционального роста
зависимости Сuw(СGl) находится в широком диа-
пазоне концентраций и температур. Наибольшие
изменения концентрации незамерзающей воды
наблюдаются при добавлении сахарозы (рис. 2, в).
В этом случае эффект тем больше, чем ниже темпе-
ратура. Так, при –23°С и CSucr > 1% сигнал незамер-
зающей воды не регистрируется в спектрах ЯМР.
Установлено, что добавление небольшого коли-
чества сахаров при определенных температурах
может приводить к уменьшению Сuw в несколько
раз.
На рис. 3 приведены зависимости межфазной
энергии от концентрации белка в бинарном
растворе БСА-вода и растворах, содержащих
добавки фруктозы и глюкозы. Межфазная энергия
temperature varies according to approximately linear
law [5], then the value ∆G may be calculated on the
formula:
∆G = –0,036(273 – Т).
Interfacial energy of biological object γS in aqueous
medium was found on the area under the curve ∆G
(Cuw) :
∫ ∆=γ
max
uw
2
C
0
OH1S )C(GdK ,
maxwhere Сuw is non-frozen water layer width at T→0°C
If in the solution, except protein molecules, low-
molecular compounds appear, then the Cuw value may
be affected by water of binary solution concentrated
in microcavities, containing as the inclusions into ice
matrix. If this solution is formed then the site of linear
growth of signal intensity is present on dependences
I(Cuw) with a rise in Cuw [6]. However at a low
concentration all the substance of organic additive
during freezing may be concentrated in hydrate coats
of protein molecules [8].
Fig. 2. shows the Cuw dependences on sucrose
concentration recorded at different temperatures. Cuw
value was found by comparison of the intensities of
1H NMR signal of water prior to and after freezing. In
all the studied systems when adding small amounts of
sugars the site of reduced concentration of non-frozen
water is observed. For fructose this site is vividly
manifested within narrow range of changes of CFr ,
and the site of directly-proportional growth for Cuw
(CFr) dependence is not observed (Fig.2, a). At CGl <
0.38% significant decrease of Cuw has been found only
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
5000
10000
15000
20000
25000
0oC
-5oC
-8oC
-20oC
-30oC
-40oC
-50oC
Концентрация фруктозы, %
Fructose concentration, %
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
н
ез
ам
ер
за
ю
щ
ей
в
од
ы
C
uw
, м
г/г
N
on
-fr
oz
en
w
at
er
c
on
ce
nt
ra
tio
n
C
uw
, m
g/
g
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
5000
10000
15000
20000
0oC
-10oC
-15oC
-20oC
-30oC
-40oC
-50oC
-60oC
Концентрация глюкозы, %
Glucose concentration, %
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
н
ез
ам
ер
за
ю
щ
ей
в
од
ы
C
uw
, м
г/г
N
on
-fr
oz
en
w
at
er
c
on
ce
nt
ra
tio
n
C
uw
, m
g/
g
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2
3000
6000
9000
12000
0oC
-13oC
-23oC
Концентрация сахарозы, %
Sucrose concentration, %
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
н
ез
ам
ер
за
ю
щ
ей
в
од
ы
C
uw
, м
г/г
N
on
-fr
oz
en
w
at
er
c
on
ce
nt
ra
tio
n
C
uw
, m
g/
g
Рис.2. Зависимость концентрации незамерзшей воды
Сuw от концентрации сахаров при разных температурах:
а – фруктоза; б – глюкоза; в – сахароза.
Fig. 2. Dependence of non-frozen water concentration Cuw
on concentration of sugars at different temperatures: a –
fructose; b – glucose; c – sucrose.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
a a б b
в c
380
является интегральной величиной, позволяющей
определить суммарное понижение свободной
энергии гетерофазной системы (в нашем случае
присутствуют фазы белка и воды), обусловленное
наличием границы раздела фаз. В многокомпо-
нентных растворах, содержащих вещества, кото-
рые не связаны с границей раздела, величина γS
будет содержать также вклад от изменения сво-
бодной энергии, обусловленного разницей свобод-
ной энергии воды и бинарного раствора вещества.
Из рис. 3, а следует, что межфазная энергия
увеличивается обратно пропорционально концент-
рации белка. Аналогичные зависимости характер-
ны и для других белковых систем [8, 15]. Измене-
ние γS обусловлено самоассоциацией белковых
молекул: молекулы белка сильно гидратированы,
поэтому для их контакта в водной среде из межмо-
лекулярного зазора должно быть удалено опреде-
ленное количество молекул связанной воды.
Затраты энергии на взаимодействие белок-белок
должны компенсироваться переходом части воды
из связанного состояния в свободное. Тогда
разница величины γS при разбавлении или концен-
трировании раствора белка определяет свободную
энергию ассоциативных процессов. Экстраполи-
руя зависимость γS(СБСА) к нулевой концентрации
белка, получим межфазную энергию неассоцииро-
ванных молекул альбумина.
Зависимость γS(CGl(Fr)) в целом отражает основ-
ные тенденции зависимостей Cuw(CGl(Fr)). Расчеты
показывают, что в 2%-м растворе альбумина на
каждую молекулу белка приходится 8,8×105
молекул воды, из которых 104 молекул являются
связанными (см. рис. 2). В концентрационной
области, отвечающей быстрому изменению вели-
чины γS, каждая молекула добавки приводит к
уменьшению количества связанной воды на тыся-
at the temperatures close to 0°C (Fig. 2, b). Site of
proportional growth for Cuw (CFr) dependence is within
wide range of concentrations and temperatures. The
highest changes of concentration for non-frozen water
are observed when adding sucrose (Fig. 2, c). In this
case the higher the effect, the lower the temperature.
So, at –23°C and CSucr > 1% the signal of non-frozen
water is not registered in NMR-spectra. It has been
found that adding of small amount of sugars under
certain temperatures may result in several-times’
reduction of Cuw.
Fig. 3 demonstrates the dependences of interfacial
energy on protein concentration in binary solution of
BSA-water and the solutions containing fructose and
glucose additives. The interfacial energy is integral
value enabling to determine total decreasing of free
energy of heterofacial system (in our case the phases
of protein and water are present) due to interface
boundary. In multicomponent solutions, containing
components, not bound with interface, the γS value will
depend on change of free energy due to the difference
of water free energy and binary solution of an additive.
From Fig. 3 one can see that interfacial energy
increases in an inverse proportion to protein concen-
tration. The same dependences are charac-teristic also
for other protein systems [8, 15]. Change of γS is
stipulated by self-association of protein molecules.
Protein molecules are strongly dehydrated, therefore
for their contact in aqueous medium from inter-
molecular interspace a certain number of molecules
of bound water should be removed. The energy
expenditures for protein-protein interaction should be
compensated by the transition of a part of water from
bound state into a free one. Then the difference of the
value γS during dilution or concentrating of protein
solution determines a free energy of associative
processes. By extrapolation of γS dependence (CBSA)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0
100
200
300
400
500
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
100
200
300
400
500
Рис.3. Зависимость межфазной энергии от концентрации БСА в бинарном растворе (а) и концентрации сахаров в
тройных системах БСА-сахар-вода (б): 1 – 1,5% БСА + фруктоза; 2 – 2% БСА + глюкоза.
Fig. 3. Dependence of interfacial energy on BSA concentration in binary solution (a) and on sugar concentration in
BSA-sugar-water complex (b): 1 – 1.5% BSA + fructose; 2 – 2% BSA + glucose.
Концентрация БСА, %
BSA concentration, %
М
еж
ф
аз
на
я
эн
ер
ги
я
γ s,
Дж
/г
In
te
rfa
ci
al
e
ne
rg
y
γ s,
J/
g
Концентрация сахара, %
Sugar concentration, %
М
еж
ф
аз
на
я
эн
ер
ги
я
γ s,
Дж
/г
In
te
rfa
ci
al
e
ne
rg
y
γ s,
J/
g
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
a a б b
381
чу и более молекул. Столь высокую дегидратацию
нельзя объяснить простым замещением межфаз-
ной воды молекулами сахаров. Возможно, при свя-
зывании сахаров с белковыми молекулами проис-
ходит такое изменение их конформации, которое
соответствует значительно меньшему количеству
связанной воды. Вероятно, молекулы белка ста-
новятся более компактными или менее гидро-
фильными, а взаимодействие между близко рас-
положенными белковыми фрагментами – более
эффективным, причем молекулы сахаров могут его
интермедиатами. Возможно, эти изменения в бел-
ковых глобулах под влиянием связанных с ними
низкомолекулярных веществ необходимы для
распознавания свободных и нагруженных метабо-
литами (или токсинами) молекул альбумина.
Как было показано на рис. 1-3, молекулы
сахаров могут замещать молекулы воды в систе-
мах, содержащих такие компоненты, как сахар и
белок. Этот процесс может сопровождаться обра-
зованием комплексов в растворах и изменениями
вязкости данных систем. Поскольку максимальный
эффект дегидратации молекул САЧ был установлен
в растворах сахарозы, мы исследовали водные
растворы с разным количеством сахарозы и
постоянным значением концентрации белка при
температуре 25°С. Величина вязкости белка в
зависимости от концентрации сахарозы изменя-
лась незначительно по сравнению с величинами
вязкости раствора САЧ и раствора сахарозы, что
свидетельствало о невозможности регистрации
изменений в указанных системах методом вискози-
метрии.
Анализ спектров поглощения (рис. 4) растворов
САЧ (кривая 1), сахарозы (кривая 2), а также
to zero concentration of the protein one obtains the
interfacial energy of non-associated molecules of
albumin.
Dependence of γS(CGl(Fr)) in a whole reflects main
tendencies of Cuw(CGl(Fr)) dependences. Calculations
show that in 2% albumin solution per each protein
molecule is 8.8×105 water molecules, among those 104
molecules are bound ones (see Fig. 2). In concentration
range correspondent to rapid change of γS value, each
additive molecule results in a decrease of bound water
amount by thousand or more molecules. Such quite a
high dehydration can not be explained by simple
substitution of interphase water by sugar molecules. It
is possible that during binding of sugars with protein
molecules there is the change of their conformation,
corresponding to significantly less amount of bound
water. Protein molecules are getting likely more
compact or less hydrophilic and the interaction
between closely located protein fragments becomes
more effective, moreover sugar molecules may
intermediate it. Perhaps these changes in protein
globules under the effect bound with them low
molecular substances are those factors essential for
recognizing of free and loaded with metabolites (or
toxins) albumin molecules.
As the figures 1-3 show, sugar molecules may
substitute the water ones in the systems containing
such components as sugar and protein. This process
may be accompanied with the formation of complexes
in the solutions and changes of viscosity of these
systems. Since the maximum effect of dehydration of
HSA molecules was established in sucrose solutions,
we had studied aqueous solutions with different
sucrose amounts and constant concentration of protein
at 25°C. Protein viscosity value depending on
concentration of Csucr slightly changed if compared with
the values of viscosity of HSA solution and the one of
sucrose, that testified to the failure of registration of
changes in the mentioned systems by viscosimetry
method.
Adsorption spectra of HSA solutions (curve 1),
sucrose (curve 2) as well as those of their binary
mixture (curves 3, 4) are presented in Fig. 4. In the
solutions of sugar-water-protein the formation of
complexes is observed, that is confirmed with the
deviation of optical density value for the sucrose-
containing solution from additivity rule:
АHSA + Sucr ≠ АHSA + АSucr;
АHSA + Sucr – (АHSA – АSucr) = ∆AHSA×Sucr,
where AHSA, Asucr, AHSA+Sucr – optical densities of HSA
solution, sucrose, HSA-sucrose complex, corres-
pondingly; ∆AHSA×Sucr – deviation of optical density
from additivity rule, characterizing the properties of
HSA-sucrose complex.
Рис. 4. Спектры поглощения раствора САЧ 1% (1),
раствора сахарозы 10% (2), а также растворов их
бинарных смесей (3, 4).
Fig. 4. Adsorption spectra of 1% HSA solution (1), 10%
sucrose solution (2), as well as their binary mixtures (3,4).
240 260 280 300 320 340
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
2
1
3
4
Длина волны, нм
Wavelength, nm
М
еж
ф
аз
на
я
эн
ер
ги
я
γ s,
Дж
/г
In
te
rfa
ci
al
e
ne
rg
y
γ s,
J/
g
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
382
растворов их бинарной смеси (кривые 3, 4) показал,
что в растворах сахар-вода-белок наблюдается
образование комплексов, о чем свидетельствует
отклонение значения оптической плотности раст-
вора, содержащего сахарозу от правила аддитив-
ности:
АСАЧ + Sucr ≠ АСАЧ + АSucr;
АСАЧ + Sucr – (АСАЧ – АSucr) = ∆AСАЧ×Sucr,
где АСАЧ, АSucr, АСАЧ + Sucr – оптическая плотность
растворов САЧ, сахарозы, комплекса САЧ-сахароза
соответственно; ∆AСАЧ×Sucr – отклонение оптической
плотности от правила аддитивности, которое
характеризует свойства комплекса САЧ-сахароза.
Для установления влияния сахарозы на адсорб-
цию белка мы изучили их адсорбцию из водных
растворов и проанализировали электронные
спектры отражения образцов после адсорбции.
На рис. 5 приведена зависимость величины
адсорбции САЧ (1%) из раствора, содержащего
разное количество сахарозы.
При адсорбции белка на поверхности ВДК из
бинарных растворов, содержащих САЧ и сахарозу,
наблюдается уменьшение величины адсорбции
белка уже при СSucr=0,1%. Дальнейшее повышение
концентрации сахарозы практически не влияет на
величину адсорбции белка. Дополнительным
аргументом уменьшения адсорбции САЧ в присут-
ствии сахарозы являются спектры отражения
(рис. 6, кривая 1). Присутствие сахарозы умень-
шает величину адсорбции белка, причем величина
оптической плотности белка при 278 нм (А278)
практически не зависит от концентрации сахарозы,
For examining the effect of sucrose on protein
adsorption we have studied their adsorption from
aqueous solutions and analyzed electron reflection
spectra of the samples after adsorption.
Fig. 5 shows the dependence of HSA (1%) adsorp-
tion value from the solution, containing different amo-
unts of sucrose.
During protein adsorption on the surface of FGS
from binary solutions containing HSA and sucrose,
there is observed a decreased value of protein
adsorption even at Csucr = 0.1%. further increase of
sucrose concentration does not practically affect the
protein adsorption value. Additional arguments of redu-
ced HSA adsorption in sucrose presence are reflection
spectra (Fig. 6, curve 1). The presence of sucrose
diminishes the protein adsorption value, moreover the
value of protein optical density at 278 nm does not
practically depend on sucrose concentration, that is
confirmed by the data on adsorption from aqueous
solutions (Fig. 6, curves 2-5).
Thus, the complex of HSA and sucrose leads to
the reduction of protein sorbing ability.
BSA adsorption isoterms on FGS surface with no
sugars (curve 1) and with them (curves 2-4) are
presented in Fig. 7. The measurements were performed
in the area of protein concentrations, under which the
saturation of dependence a = f (Cp) (area of monolayer
covering) was observed. As the data mentioned show
the maximum adsorption amax is found for the system
BSA/FGS. The value amax reduces during introduction
of glucose and fructose into the solution by 5 and 10%,
correspondingly. Minimal value of adsorption (20%
less than with no sugars) is recorded for sucrose-
containing solutions. According to the data of Fig. 1-
3 the obtained effect may be stipulated by the change
0 2 4 6 8
90
100
110
120
130
140
240 260 280 300 320
0,0
0,1
0,2
0,3
53
4
1
2
Концентрация сахарозы, %
Sucrose concentration, %
Ад
со
рб
ци
я
a,
м
г/г
Ad
so
rp
tio
n
a,
m
g/
g
Длина волны, нм
Wavelength, nm
О
пт
ич
ес
ка
я
пл
от
но
ст
ь,
у
.е
д.
O
pt
ic
al
d
en
si
ty
, r
el
. u
ni
ts
Рис. 6. Электронные спектры отражения образцов
адсорбированного САЧ из раствора без (1) и в присут-
ствии (2-5) сахарозы.
Fig. 6. Electron reflection spectra of the adsorbed from the
solution HSA with no (1) and in presence of sucrose (2-5).
Рис. 5. Зависимость величины адсорбции САЧ (1%) на
поверхности ВДК от концентрации сахарозы в растворе.
Fig. 5. Dependence of adsorption value of HSA (1%) on
sucrose concentration in solution on FGS surface.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
383
0 1 2 3 4 5
0
100
200
300
400
500
Равновесная концентрация белка Ср, мг/мл
Protein equilibrium concentration Ср, mg/ml
Ад
со
рб
ци
я
a,
м
г/г
Ad
so
rp
tio
n
a,
m
g/
g
1
2
3
4
Рис. 7. Изотермы адсорбции БСА на поверхности ВДК
без сахаров (1) и в присутствии глюкозы (2), фруктозы
(3) и сахарозы (4).
Fig. 7. Isotherms of BSA adsorption on FGS surface with
no (1) and in presence of glucose (2), fructose (3) and su-
crose (4).
что подтверждают данные по адсорбции из водных
растворов (рис. 6, кривые 2-5).
Таким образом, комплексообразование САЧ с
сахарозой приводит к уменьшению сорбируемости
белка.
Для получения изотерм адсорбции БСА на
поверхности ВДК (без сахаров (рис. 7, кривая 1))
и в присутствии сахаров (рис. 7, кривые 2-4))
измерения проводили в области концентрации бел-
ка, при которой наблюдается насыщение зависи-
мости а = f(Сp) (область монослойного покрытия).
Как видно из приведенных данных, максимальная
адсорбция amах наблюдается для системы БСА-
ВДК. Значение аmах уменьшается при введении в
раствор глюкозы и фруктозы на 5 и 10% соответ-
ственно. Минимальная величина адсорбции (на
20% меньше, чем без сахаров) регистрируется для
растворов, содержащих сахарозу. В соответствии
с данными рис. 1-3 полученный эффект может
быть обусловлен изменением конформационной
лабильности белковых молекул при замещении
сахарами молекул связанной воды. Вероятно, при
адсорбции частично дегидратированной молекулы
белка может осуществляться более полный
контакт полипептидных цепей с поверхностью
кремне-зема, что приводит к увеличению “поса-
дочной площадки” белковых молекул и, как след-
ствие, снижение величины аmах.
Выводы
Частичная дегидратация белковых молекул в
присутствии сахаров, особенно при низких темпе-
ратурах, может быть одним из основных факторов
улучшения криопротекторных свойств сред. Отно-
сительно небольшие молекулы сахаров способны
проникать через клеточные мембраны, они могут
облегчать дегидратацию внутриклеточных эле-
ментов белковой природы, вследствие чего умень-
шается вероятность формирования внутриклеточ-
ного льда. Кроме того, сахара не оказывают на
клетки патологического воздействия и могут легко
утилизироваться при клеточном метаболизме.
in conformation lability of protein molecules during
substitution of bound water molecules with sugars.
During adsorption of a partially dehydrated water
molecule more complete contact of polypeptide chains
with the surface of silica may be accomplished, that
results in an increase of “landing place” of protein
molecules and as a consequence to the reduction of
amax value.
Conclusions
Partial dehydration of protein molecules in presence
of sugars, especially under low temperatures may be
one of main factors of improving cryoprotective
properties of the media. Relatively small molecules are
capable of penetrating via cell membranes, therefore
they are able to facilitate dehydration of intracellular
elements of protein origin and thereby the probability
of intracellular ice formation is reduced. In addition,
sugars do not render pathological effect on cells and
may be easily utilized at cell metabolism.
Литература
Кениг С. Динамика взаимодействия в системе вода-
белок. Результаты, полученные из измерений ядерной
магнитной релаксацией // Вода в полимерах / Под ред.
С.М. Роуленда.– М.: Мир, 1984.– С. 159-182.
Ландау М.А. Молекулярная природа отдельных физиоло-
гических процессов.– М.: Наука, 1985.– 260 c.
Ленинджер А. Биохимия. – М.: Мир, 1976.– 957 с.
Манк В.В., Лебовка Н.И. Спектроскопия ядерного
магнитного резонанса в гетерогенных системах.– Киев:
Наук. думка, 1988.– 202 c.
Термодинамические свойства индивидуальных ве-
ществ / Под ред. В.П. Глушкова.– М.: Наука, 1978.– 140 с.
References
Koenig S. Dynamics of water-protein interaction. Results from
measurements of nuclear magnetic relaxation dispersion //
Water in polymers / Ed. by S. Rowland.– Moscow: Mir, 1984.–
P. 159-182.
Landau M.A. Molecular origin of certain physiological pro-
cesses.– Moscow: Nauka, 1985.– 260 p.
Lehninger A. Biochemistry.– Moscow: Mir, 1976.– 957 p.
Mank V.V., Lebovka N.I. Spectroscopy of nuclear magnetic
resonance in heterogenic systems. – Kiev: Naukova dumka,
1988. – 202 p.
Thermodynamic properties of individual substances / Ed.
by V.P. Glushkova.– Moscow: Nauka, 1978.– 140 p.
1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
4.
5.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
384
Туров В.В., Бакай Э.А. Туров А.В. и др. Изучение
взаимодействия сахарозы с молекулами сывороточного
альбумина методом ЯМР спектроскопии замороженных
водных растворов // Биофизика. –1990.– Т. 35, №5.–
С. 824-829.
Чегер С.И. Транспортная функция сывороточного альбу-
мина. – Бухарест: Изд-во Акад. наук СРР, 1975.– 184 c.
Gun’ko V.M., Turov V.V., Bogatyrev V.M. et al. Unusual
properties of water at hydrophilic/hydrophobic interfaces // Adv.
Colloid Interface Sci.– 2005.– Vol.118, N1-3.– P. 125-172.
Handbook of in vitro fertilization. Cryopreservation of oocytes
and embryos / Ed. by J.M. Shaw, A. Oranratnachai,
A.O. Trounson, D. Gardner.– Boca Raton: CRC press, 1999.–
P. 1-400.
Karlsson J.O.M., Toner M. Long-term storage of tissues by
cryopreservation: critical issues // Biomaterials.– 1996.–
Vol. 17, N3.– P. 243-256.
Reproductive tissue banking: Scientific principles / Ed. by
A.M. Karrow, J.K. Crister.– San-Diego: Academic Press,
1997.– 472 p.
Ruffing N.A., Steponkus P.L., Pitt. R.E., Parks J.A.
Osmometric behavior, hydraulic conductivity, and incidence
of intracellular ice formation in bovine oocytes at different
developmental stages // Cryobiology. – 1993. – Vol. 30, N6.–
P. 562-580.
Shaw J.M., Oranratnachai A., Trounson A.O. Fundamental
cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue //
Theriogenology.– 2000.– Vol. 53, N1.– P. 59-72.
Turov V.V., Gun’ko V.M., Bogatyrev V.M. et al. Structured water
in partially dehydrated yeast cells and at partially hydropho-
bized fumed silica surface // J. Colloid Interface Sci.– 2005.–
Vol. 283, N2.– P. 329-343.
Turov V.V., Leboda R. Application of 1H NMR spectroscopy
method for determination of characteristics of thin layers of
water adsorbed on the surface of dispersed and porous
adsorbents // Adv. Colloid Interface Sci.– 1999.– Vol. 79,
N2-3.– P. 173-211.
Поступила 31.05.2007
Turov V.V., Bakay E.A., Turov A.V. et al. Investigation of
sucrose interaction with molecules of serum albumin with
NMR-spectroscopy method of frozen aqueous solutions //
Biofizika.– 1990.– Vol. 35, N5.– P. 824-829.
Cheger S.I. Transport function of serum albumin. – Bucha-
rest, 1975.– 184 p.
Gun’ko V.M., Turov V.V., Bogatyrev V.M. et al. Unusual
properties of water at hydrophilic/hydrophobic interfaces //
Adv. Colloid Interface Sci.– 2005.– Vol.118, N1-3.– P. 125-
172.
Handbook of in vitro fertilization. Cryopreservation of oocytes
and embryos / Ed. by J.M. Shaw, A. Oranratnachai,
A.O. Trounson, D. Gardner.– Boca Raton: CRC press, 1999.–
P. 1-400.
Karlsson J.O.M., Toner M. Long-term storage of tissues by
cryopreservation: critical issues // Biomaterials.– 1996.–
Vol. 17, N3.– P. 243-256.
Reproductive tissue banking: Scientific principles / Ed. by
A.M. Karrow, J.K. Crister.– San-Diego: Academic Press,
1997.– 472 p.
Ruffing N.A., Steponkus P.L., Pitt. R.E., Parks J.A.
Osmometric behavior, hydraulic conductivity, and incidence
of intracellular ice formation in bovine oocytes at different
developmental stages // Cryobiology. – 1993. – Vol. 30, N6.–
P. 562-580.
Shaw J.M., Oranratnachai A., Trounson A.O. Fundamental
cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue //
Theriogenology.– 2000.– Vol. 53, N1.– P. 59-72.
Turov V.V., Gun’ko V.M., Bogatyrev V.M. et al. Structured
water in partially dehydrated yeast cells and at partially
hydropho-bized fumed silica surface // J. Colloid Interface
Sci.– 2005.– Vol. 283, N2.– P. 329-343.
Turov V.V., Leboda R. Application of 1H NMR spectroscopy
method for determination of characteristics of thin layers of
water adsorbed on the surface of dispersed and porous
adsorbents // Adv. Colloid Interface Sci.– 1999.– Vol. 79,
N2-3.– P. 173-211.
Accepted in 31.05.2007
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69105 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:23:41Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Ругаль, А.А. Барвинченко, В.Н. Галаган, Н.П. Сиора, И.В. Туров, В.В. 2014-10-04T19:13:21Z 2014-10-04T19:13:21Z 2007 Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования / А.А. Ругаль, В.Н. Барвинченко, Н.П. Галаган, И.В. Сиора, В.В. Туров // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 374-384. — Бібліогр.: 15 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69105 544.723 Методом ЯМР-спектроскопии изучена гидратация белковых молекул в присутствии сахаров – глюкозы, фруктозы и сахарозы. В широком диапазоне концентраций компонент определены параметры гидратации, рассчитаны концентрация связанной воды и межфазная энергия. На примере сывороточного альбумина показано, что внутриглобульная вода может замещаться низкомолекулярными соединениями – сахарами. Наибольший эффект дегидратации установлен для сахарозы. При этом белковые молекулы изменяют свое свойство – способность к адсорбции на поверхности высокодисперсного кремнезема, которая снижается на 25 % вследствие образования комплексных соединений. Методом ЯМР-спектроскопії вивчена гідратація білкових молекул в присутності цукрів – глюкози, фруктози та цукрози. В широкому діапазоні концентрацій компонент визначені параметри гідратації, розраховані концентрація зв’язаної води та міжфазна енергія. На прикладі сироваткового альбуміну показано, що внутрішньоглобульна вода може заміщуватись низькомолекулярними сполуками – цукрами. Найбільший ефект дегідратації встановлений для цукрози. При цьому білкові молекули змінюють свою властивість – здатність до адсорбції на поверхні високодисперсного кремнезему, яка знижується на 25 % внаслідок утворення комплексних сполук. Protein molecules’ hydration in the presence of sugars: glucose, fructose and sucrose were studied by NMR-spectroscopy. The parameters of hydration, concentration of bound water and value of interfacial energy were determined over a wide range of component concentrations. It was shown with exemplifying using the serum albumin, that low-molecular compounds (sugars) could replace an intraglobular water. The maximal effect of dehydration was observed for sucrose. In this case protein molecules change their property and capability to be adsorbed on a surface of fine-grained silica, which is reduced by 25% as a result of the forming complexes. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования Effect of Sugars on Dehydration of Biopolymer Molecules During Cryopreservation Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования Ругаль, А.А. Барвинченко, В.Н. Галаган, Н.П. Сиора, И.В. Туров, В.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования |
| title_alt | Effect of Sugars on Dehydration of Biopolymer Molecules During Cryopreservation |
| title_full | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования |
| title_fullStr | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования |
| title_full_unstemmed | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования |
| title_short | Влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования |
| title_sort | влияние сахаров на дегидратацию биополимерных молекул в процессе криоконсервирования |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69105 |
| work_keys_str_mv | AT rugalʹaa vliâniesaharovnadegidrataciûbiopolimernyhmolekulvprocessekriokonservirovaniâ AT barvinčenkovn vliâniesaharovnadegidrataciûbiopolimernyhmolekulvprocessekriokonservirovaniâ AT galagannp vliâniesaharovnadegidrataciûbiopolimernyhmolekulvprocessekriokonservirovaniâ AT sioraiv vliâniesaharovnadegidrataciûbiopolimernyhmolekulvprocessekriokonservirovaniâ AT turovvv vliâniesaharovnadegidrataciûbiopolimernyhmolekulvprocessekriokonservirovaniâ AT rugalʹaa effectofsugarsondehydrationofbiopolymermoleculesduringcryopreservation AT barvinčenkovn effectofsugarsondehydrationofbiopolymermoleculesduringcryopreservation AT galagannp effectofsugarsondehydrationofbiopolymermoleculesduringcryopreservation AT sioraiv effectofsugarsondehydrationofbiopolymermoleculesduringcryopreservation AT turovvv effectofsugarsondehydrationofbiopolymermoleculesduringcryopreservation |