Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши
Исследовано влияние различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на морфологическую сохранность и жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши. Показано, что данная процедура позволяет сохранить жизнеспособными более 70% эмбрионов. Основной вклад в криопо...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2007 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69106 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши / Е.И. Смольянинова, О.В. Пишко, Е.Г. Лисина, А.А. Колесникова, Л.Ф. Розанов // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 385-393. — Бібліогр.: 27 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859984688357048320 |
|---|---|
| author | Смольянинова, Е.И. Пишко, О.В. Лисина, Е.Г. Колесникова, А.А. Розанов, Л.Ф. |
| author_facet | Смольянинова, Е.И. Пишко, О.В. Лисина, Е.Г. Колесникова, А.А. Розанов, Л.Ф. |
| citation_txt | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши / Е.И. Смольянинова, О.В. Пишко, Е.Г. Лисина, А.А. Колесникова, Л.Ф. Розанов // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 385-393. — Бібліогр.: 27 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Исследовано влияние различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на морфологическую сохранность и жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши. Показано, что данная процедура позволяет сохранить жизнеспособными более 70% эмбрионов. Основной вклад в криоповреждение эмбрионов вносят этапы экспозиции в среде замораживания и замораживания-отогрева. На основе литературных и полученных в работе данных обсуждается роль осмотического и механического факторов в повреждении клеток на этапах быстрого замораживания.
Досліджено вплив різних етапів кріоконсервування за методом вітрифікації у этиленгліколь-сахарозному середовищі на морфологічну збереженість та життєздатність 2-клітинних ембріонів миші. Показано, що ця процедура дозволяє зберегти життєздатними більш, ніж 70% ембріонів. Основний внесок у кріопошкодження ембріонів належить этапам экспозиції у середовищі заморожування та заморожування-відігріву. На підставі літературних та отриманих в роботі даних обговорюється роль осмотичного та механічного факторів у пошкодженні клітин на етапах швидкого заморожування.
The effect of different stages of vitrification protocol for cryopreservation with ethylene glycol-sucrose medium on morphological integrity and viability of 2-cell murine embryos has been studied. This procedure was shown as enabling to preserve viable more than 70% embryos. The stages of exposure in freezing medium and freeze-thawing are mostly responsible for embryo cryoinjury. Basing on the literature reports and own data the role of osmotic and mechanical factors in cell injury at the rapid freezing stages is discussed.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:27:35Z |
| format | Article |
| fulltext |
385 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
УДК 57.043.085:547.422
Е.И. СМОЛЬЯНИНОВА1*, О.В. ПИШКО1, Е.Г. ЛИСИНА2, А.А. КОЛЕСНИКОВА2, Л.Ф. РОЗАНОВ1
Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом
витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность
2-клеточных эмбрионов мыши
UDC 57.043.085:547.422
YE.I. SMOLYANINOVA1*, O.V. PISHKO1, E.G. LISINA2, A.A. KOLESNIKOVA2, L.F. ROZANOV1
Analysis of Effect of Different Steps of Vitrification Protocol for
Cryopreservation in Ethylene Glycol-Sucrose Medium
on 2-Cell Murine Embryo Viability
Исследовано влияние различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной
среде на морфологическую сохранность и жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши. Показано, что данная
процедура позволяет сохранить жизнеспособными более 70% эмбрионов. Основной вклад в криоповреждение эмбрионов
вносят этапы экспозиции в среде замораживания и замораживания-отогрева. На основе литературных и полученных в
работе данных обсуждается роль осмотического и механического факторов в повреждении клеток на этапах быстрого
замораживания.
Ключевые слова: витрификация, 2-клеточный эмбрион мыши, этиленгликоль, сахароза, криоконсервирование.
Досліджено вплив різних етапів кріоконсервування за методом вітрифікації у этиленгліколь-сахарозному середовищі
на морфологічну збереженість та життєздатність 2-клітинних ембріонів миші. Показано, що ця процедура дозволяє
зберегти життєздатними більш, ніж 70% ембріонів. Основний внесок у кріопошкодження ембріонів належить этапам
экспозиції у середовищі заморожування та заморожування-відігріву. На підставі літературних та отриманих в роботі
даних обговорюється роль осмотичного та механічного факторів у пошкодженні клітин на етапах швидкого заморожування.
Ключові слова: вітрифікація, 2-клітинний ембріон миші, етиленгліколь, сахароза, кріоконсервування.
The effect of different stages of vitrification protocol for cryopreservation with ethylene glycol-sucrose medium on morphological
integrity and viability of 2-cell murine embryos has been studied. This procedure was shown as enabling to preserve viable more than
70% embryos. The stages of exposure in freezing medium and freeze-thawing are mostly responsible for embryo cryoinjury. Basing
on the literature reports and own data the role of osmotic and mechanical factors in cell injury at the rapid freezing stages is discussed.
Key-words: vitrification, 2-cell murine embryo, ethylene glycol, sucrose, cryopreservation.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-38-71, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3871, fax: +380 57
373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Institute of Cattle Breeding of Ukrainian Academy of Agrarian
Sciences, Kharkov, Ukraine
1Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
2Институт животноводства УААН
В отличие от медленного программного замо-
раживания криоконсервирование методом вит-
рификации с использованием высоких концен-
траций криопротекторов позволяет не только
сократить длительность цикла криоконсервиро-
вания, но и свести к минимуму изменения
объема клеток на этапах замораживания и оттаи-
вания. В связи с этим изучение физико-хими-
ческих факторов, действующих на клетки на
этапах добавления и удаления криопротекторов,
имеет особое значение [6, 12, 19]. Традиционно
при витрификации в качестве криопротекторов
применяются глицерин, диметилсульфоксид и
1,2-пропандиол [20–22, 25, 27]. В последнее деся-
тилетие с ними начал конкурировать этилен-
гликоль (ЭГ) [15, 17, 19, 24]. В работах [19, 20,
24, 27] показано, что этиленгликоль-сахарозная
In contrast to a slow programmed freezing the
cryopreservation with vitrification method using high
concentrated cryoprotectant solutions enables not only
reducing the cryopreservation cycle duration but
minimising the changes in cell volume at freezing and
freeze-thawing stages as well. Due to this fact studying
the physical and chemical factors affecting cells at
the stages of cryoprotectant addition and removal is
of special importance [6, 12, 19]. Glycerol, dimethyl
sulfoxide and 1,2-propane diol are traditionally used
as cryoprotectants for vitrification [20–22, 25, 27].
Within recent decades, ethylene glycol (EG) has been
competitive with them [15, 17, 19, 24]. As reported in
the papers [19, 20, 24, 27] ethylene glycol-sucrose
medium may be used for oocyte and early murine
embryo cryopreservation. At the same time such
parameters as cryoprotectant and non-penetrative
386 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
среда может быть использована для криоконсер-
вирования ооцитов и ранних эмбрионов мыши.
Вместе с тем такие параметры, как концентра-
ции криопротектора и непроникающей добавки,
продолжительность экспозиции в среде замора-
живания, условия добавления и удаления крио-
протектора, подбираются, главным образом,
эмпирически. Кроме того, для оптимизации раз-
личных этапов быстрого замораживания ранних
эмбрионов млекопитающих необходимо учиты-
вать, что эмбрионы разных стадий деления
(дробления) обладают различной устойчивостью
к отдельным этапам цикла криоконсервирования
[17].
Цель данного исследования – оценить перс-
пективы использования этиленгликоль-сахароз-
ной среды для криоконсервирования методом
витрификации 2-клеточных эмбрионов мыши
менее устойчивых к замораживанию по срав-
нению с эмбрионами других стадий.
Материалы и методы
Объектом исследования служили 2-клеточные
эмбрионы мышей линии СВА возраста 6-8 недель.
Для стимуляции суперовуляции самок мышей
подвергали гормональной обработке путем вну-
трибрюшинного введения гонадотропных гормо-
нов: folligon (5 МЕ) и chоrulon (7,5 МЕ) с интер-
валом 46–48 ч [1]. Двухклеточные эмбрионы
получали промыванием отпрепарированных
яйцеводов забитых животных физиологической
средой при комнатной температуре по стандартной
методике [1]. Затем клетки трижды отмывали
физиологической средой и немедленно использо-
вали в экспериментах.
В первой серии экспериментов было исследо-
вано осмотическое поведение эмбрионов мыши в
процессе последовательной смены растворов,
моделирующем условия добавления криопро-
тектора, эквилибрации в среде замораживания и
отмывания клеток от криозащитной среды.
Обработка эмбрионов в выбранном методе
замораживания включает следующие этапы:
10-минутную эквилибрацию в 10%-м растворе ЭГ;
инкубацию в среде замораживания (30% ЭГ и
0,7 М сахарозы); удаление криопротектора в
растворе сахарозы 0,5 М; перенос эмбрионов в
физиологическую среду. Отдельный эмбрион в
малой капле среды Дюльбекко (10–15 мкл)
помещали в пластиковую чашку Петри на предмет-
ном столике инвертированного биологического
микроскопа МБИ-13 и фиксировали с помощью
стеклянной микропипетки, закрепленной в
микроманипуляторе.
Исходное состояние объекта и кинетику осмо-
тического поведения эмбриона в процессе экспо-
additive concentrations, exposure duration in freezing
medium, conditions for cryoprotectant addition and
removal are mostly empirically selected. In addition,
the fact, that embryos of different cleavage stages have
various resistance to some steps of cryopreservation
cycle, should be taken into account to optimise different
stages for early mammalian embryo rapid freezing [17].
This research was aimed to evaluate the per-
spectives of ethylene glycol-sucrose medium use for
cryopreservation by vitrification method of 2-cell
murine embryos, being less resistant to freezing.
Materials and methods
The 6-8 week aged CBA mouse 2-cell embryos
served as the research object. The mouse females were
hormonally treated via intraperitoneal introduction of
gonadotrophic hormones: folligon (5 IU) and chorulon
(7.5 IU) with 46–48 hrs interval for stimulating
superovulation [1]. The 2-cell embryos were derived
by washing the prepared oviducts of perished animals
with physiological solution at room temperature
according to the standard technique [1]. Then cells
were thrice washed-out with physiological medium
and used at once in the experiments.
In the first experimental session there was
investigated an osmotic behaviour of murine embryos
during successive change of solutions, modelling
conditions for cryoprotectant addition, equilibration
in freezing medium and cell washing out of cryopro-
tective medium.
Embryo treatment in the selected freezing method
comprises the following steps: a 10-min equilibration
in 10% EG solution; incubation in freezing medium
(30% EG and 0.7 M sucrose); cryoprotectant removal
in 0.5 M sucrose solution; embryo transfer into
physiological solution. A separate embryo in a small
drop of Dulbecco’s medium (10–15 µl) was placed
into a plastic Petri dish on an objective table of MBI-13
inverted biological microscope and fixed using the
attached in micromanipulator glass micropipette.
Initial state of an object and kinetics of embryo
osmotic behaviour during exposure in studied
solutions were photo-recorded. After processing the
images, the experimental dependencies of a relative
volume of some embryo blastomeres on the exposure
duration in the studied solutions have been obtained.
In the second experimental session the effect of
incubation time in freezing medium on the murine
embryo integrity and viability was investigated. The
embryos were divided into three groups: one control
and two experimental ones. The embryos of experi-
mental groups were subjected to a 10-min treatment
with 10% EG solution, then transferred into freezing
medium (30% EG + 0.7 M sucrose) and exposed in it
for 1.5 and 3 min, correspondingly. Afterwards
embryos were placed into drops of 0.5 M sucrose
387 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
зиции в исследуемых растворах регистрировали
фотографически. После обработки изображений
были получены экспериментальные зависимости
относительного объема отдельных бластомеров
эмбриона от продолжительности экспозиции в
исследуемых растворах.
Во второй серии экспериментов исследовали
влияние времени инкубации в среде заморажи-
вания на сохранность и жизнеспособность
эмбрионов мыши. Эмбрионы разделяли на три
группы: одну контрольную (n=52) и две экспери-
ментальные (n=58 и n=53). Эмбрионы экспери-
ментальных групп подвергали 10-минутной
обработке 10%-м раствором ЭГ, после чего перено-
сили в среду замораживания (30% ЭГ + 0,7 М
сахарозы) и выдерживали в ней в течение 1,5 и
3 мин соответственно. Затем эмбрионы помещали
в капли раствора сахарозы 0,5 М на 10 мин с
последующим переносом в физиологическую сре-
ду Дюльбекко. После трехкратного отмывания
эмбрионов культуральной средой М16 их немед-
ленно переносили в СО2-инкубатор для культи-
вирования. Эмбрионы контрольной группы
переносили в СО2-инкубатор после 25-минутной
экспозиции их в физиологической среде при
комнатной температуре. Жизнеспособность
эмбрионов оценивали по их способности разви-
ваться in vitro до стадии расширенной бластоцисты
на 5-е сутки культивирования.
В третьей серии экспериментов исследовали
влияние полного цикла низкотемпературного кон-
сервирования 2-клеточных эмбрионов мыши на их
морфологическую сохранность и жизнеспособ-
ность с учетом данных, полученных в предыдущей
серии экспериментов. Криоконсервирование осу-
ществляли методом быстрого замораживания,
успешно применяемого ранее для 8-клеточных
эмбрионов мыши, крыс и коров [2, 3]. Эмбрионы
разделяли на две экспериментальные (n=98 и n=74)
группы. Клетки обеих экспериментальных групп
после предварительной эквилибрации в 10%-м
растворе ЭГ отмывали в капле среды заморажи-
вания и затем немедленно переносили (по 5–7 кле-
ток) в заранее подготовленные пластиковые соло-
минки, содержащие 5 мкл среды замораживания.
Соломинки погружали в жидкий азот и хранили в
течение 3-7 суток. Время экспозиции в этиленгли-
коль-сахарозной среде перед замораживанием
составило 45 с и 1,5 мин для 1-й и 2-й эксперимен-
тальных групп соответственно. Соломинки
отогревали в водяной бане (38°С). Для удаления
криопротектора эмбрионы, извлеченные из соло-
минок, переносили в раствор сахарозы 0,5 М и
выдерживали в нем в течение 10 мин, а затем
трижды отмывали физиологической средой при
комнатной температуре. Сохранность деконсерви-
solution for 10 min with following transfer into Dulbecco
physiological medium. After a three-fold embryo
washing-out with M16 culturing medium they were
immediately transferred into CO2 incubator for
culturing. The control group embryos were transferred
into CO2 incubator after their 25-min exposure into
physiological medium at room temperature. Embryo
viability was estimated by their capability of in vitro
development up to an extended blastocyst stage to the
5th day of culturing.
In the third experimental session there was
investigated the effect of a complete cycle of low
temperature preservation of 2-cell murine embryos on
their morphological integrity and viability taking into
account the data, obtained in the previous experimental
sessions. Cryopreservation was done using the method
of a rapid freezing, successfully applied previously
for murine, rat’s and bovine 8-cell embryos [2, 3].
Embryos were divided into two experimental groups.
Cells of both experimental groups after preliminary
equilibration in 10% EG solution were washed out in
a drop of freezing medium with following immediate
transfer (by 5–7 cells) in previously prepared plastic
straws with 5 µl freezing medium. Straws were
immersed into liquid nitrogen and stored for 3–7 days.
Exposure time in ethylene glycol-sucrose medium
before freezing was 45 sec and 1.5 min for the 1st and
2nd experimental groups, correspondingly. The straws
were thawed on water bath (38°C). For cryoprotectant
removal the embryos, removed from straws were
transferred into 0.5 M sucrose solution and exposed
in it for 10 min with following three-fold washing-out
with physiological solution at room temperature. The
integrity and viability of frozen-thawed cells were
estimated by morphological signs and by embryo
capability for in vitro development up to the extended
blastocyst stage, correspondingly.
Cryoprotectant solution and freezing medium were
prepared on phosphate-saline physiological Dulbecco’s
medium base [1].
The results obtained were statistically processed
using the Student’s method [8].
Results and discussion
The Figure shows a typical change in a relative
blastomere volume of 2-cell murine embryo at a
successive change of solutions: 10% EG solution,
freezing medium, 0.5 M sucrose solution and Dulbec-
co’s physiological medium.
During exposure in 10% EG solution a relative
volume of blastomere primarily decreases down to
0.38 V0 ± 0.01 V0 (n=5) as a result of dehydration
with following gradual increase up to 0.7 V0 ± 0.02 V0
(n=5) during 10-min equilibration. Transfer into freezing
medium results in an additional cell dehydration and
cell volume reduction down to 0.41 V0 ± 0.02 V0, in
388 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
рованных клеток оценивали по морфологическим
признакам, жизнеспособность – по способности
эмбрионов развиваться в условиях in vitro до
стадии расширенной бластоцисты.
Раствор криопротектора и среду заморажи-
вания готовили на основе фосфатно-солевой
физиологической среды Дюльбекко [1].
Статистическую обработку полученных резуль-
татов проводили по методу Стьюдента [8].
Результаты и обсуждение
На рисунке показано характерное изменение
относительного объема бластомера 2-клеточного
эмбриона мыши при последовательной смене
растворов: 10%-го раствора ЭГ, среды заморажи-
вания, раствора сахарозы 0,5 М и физиологической
среды Дюльбекко.
При экспозиции в 10%-м растворе ЭГ относи-
тельный объем бластомера сначала уменьшается
до значений 0,38V0 ± 0,01V0 (n=5) в результате обез-
воживания, а затем в процессе 10-минутной
эквилибрации постепенно увеличивается до 0,7V0 ±
0,02V0 (n=5). Перенос в среду замораживания
приводит к дополнительной дегидратации клетки
и уменьшению клеточного объема в среднем до
0,41V0 ± 0,02V0. Бластомеры после завершения
этого этапа остаются обезвоженными, что являет-
ся одним из условий предотвращения внутри-
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 500 1000 1500 2000
Характерная зависимость относительного объема бластомера 2-клеточного
эмбриона мыши от времени инкубации при последовательной смене
растворов: 1 – 10%-й раствор ЭГ на физиологической среде Дюльбекко; 2 –
cреда замораживания (30% ЭГ и 0,7 М сахарозы); 3 – 0,5 М раствор саха-
розы; 4 –физиологическая среда Дюльбекко.
Characteristic dependence of a relative volume of blastomere of 2-cell murine
embryo on incubation time at a successive solution change: 1 – 10% EG solu-
tion with Dulbecco’s physiological medium; 2 – freezing medium (30% EG and
0.7 M sucrose); 3 – 0.5 M sucrose solution; 4 – Dulbecco’s physiological me-
dium.
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
N
or
m
al
is
ed
v
ol
um
e
Продолжительность инкубации, с
Incubation duration, sec
клеточной кристаллизации при
быстром замораживании. На
этапе удаления криопротектора
из клетки в растворе сахарозы
0,5 М сначала наблюдается
увеличение клеточного объема
в результате потока воды внутрь
бластомеров, а по мере выхода
из клетки ЭГ клеточный объем
уменьшается. При возвращении
эмбриона в физиологическую
среду объем бластомеров посте-
пенно восстанавливается до ис-
ходного значения. Представлен-
ные зависимости наглядно де-
монстрируют отсутствие резких
и значительных изменений кле-
точного объема в процессе пос-
ледовательной смены растворов,
что свидетельствует об осмоти-
ческой устойчивости 2-клеточ-
ных эмбрионов мыши к выбран-
ной процедуре добавления раст-
воров ЭГ и его удаления.
Во второй серии эксперимен-
тов определяли влияние экспо-
зиции в среде замораживания и
последующего отмывания
2-клеточных эмбрионов от крио-
average. After this stage completed, the blastomeres
remain dehydrated, that is one of the conditions for
preventing intracellular crystallisation at a rapid free-
zing. At the stage of cryoprotectant removal out of
cell in 0.5 M sucrose solution there is firstly observed
an increase in cell volume, resulted from water efflux
inside blastomeres, but with EG release out of cell there
is cell volume reduction. When placing embryo back
into physiological medium the blastomere volume
recovers gradually up to the initial value. The shown
dependencies visibly demonstrate the absence of any
sharp and significant changes in cell volume during
successive solution change, that testifies to an osmotic
resistance of 2-cell murine embryos to a selected
procedure of EG solution adding/removal.
In the second experimental series we have
determined the exposure effect in freezing medium
and following 2-cell embryo washing-out from a
cryoprotectant on their viability. The exposure time
effect in freezing medium may be particularly stipulated
by cell sensibilization to a post-hypertonic lysis, resulted
from additional cryoprotectant entering into them under
exposure augmentation.
Experimental results on studying the incubation time
in ethylene glycol-sucrose medium on viability of 2-
cell murine embryos are presented in the Table 1.
The viability level of 2-cell murine embryos after
1.5 min exposure in freezing medium does not
389 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
протектора на их жизнеспособ-
ность. Влияние времени экс-
позиции в среде заморажива-
ния может быть обусловлено,
в частности, сенсибилизацией
клеток к постгипертоничес-
кому лизису в результате до-
полнительного поступления в
них криопротектора при увели-
чении экспозиции.
Результаты экспериментов
по изучению влияния времени
инкубации в этиленгликоль-
сахарозной среде на жизне-
способность 2-клеточных эм-
брионов мыши представлены
в табл. 1.
Уровень жизнеспособнос-
ти 2-клеточных эмбрионов
мыши после 1,5-минутной
экспозиции в среде замора-
живания практически не отли-
чается от уровня жизнеспо-
practically differ from that in the control group. With
enhancing the exposure time in freezing medium up to
3 min, a decrease in embryo viability was observed,
being statistically and significantly lower than for the
control group. We obtained the similar results when
investigating the effect of equilibration time on
viability of 8-cell murine embryos, cryopreserved in
ethylene glycol-sucrose and glycerol-sucrose media
[3, 12]. The data obtained may be explained by the
effect of cell exposure duration in hypertonic
concentrated medium on embryo ion homeostasis.
Using the method of electron-probe microanalysis we
demonstrated an increase in equilibration time of 2-
cell murine embryos in ethylene glycol-sucrose medi-
um from 1.5 to 3 min as causing a three-fold decrease
in cytoplasm content of the principal inorganic
elements: potassium and sodium [9, 11, 23]. Potassium
intracellular concentration was established as a non-
constant value even in the norm, by undergoing
cyclical changes at cell cycle stages. The maximum
and minimum are reached at interphase (130±6 mM)
and mitosis (47±3 mM) stages, correspondingly [9, 10].
Such changes in potassium concentration are evidently
of great physiological importance and correlate with
cyclic change in activity of 240 pS K+-channel as well
as with synchronic molecular rearrangements in
cytoplasm (so-called “cytoplasmic clock”) during
cleavage [18]. Of note is the fact that in our
experiments all 2-cell embryos are at G1/S cell cycle
stage with corresponding content of intracellular
potassium (130 mM). Reduction of potassium intra-
cellular concentration down to 47 mM apparently
causes an artificial “shift” of embryo blastomere cyto-
Таблица 1. Влияние времени экспозиции в среде замораживания (30%
ЭГ и 0,7 М сахарозы) на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов
мыши
Table 1. Effect of exposure time in freezing medium (30% EG and 0.7 M
sucrose) on 2-cell murine embryo viability
Примечания: 1 – 25 мин экспозиции 2-клеточных эмбрионов в физиологической
среде Дюльбекко при комнатной температуре; 2 – статистически достоверное отличие
в сравнении с контролем, p<0,05.
Notes: 1 – 25 min of 2- cell embryo exposure in Dulbecco’s physiological medium at room
temperature; 2 – statistically significant difference compared to the control, p<0.05.
собности эмбрионов контрольной группы. При
увеличении времени экспозиции в среде замо-
раживания до 3-х минут наблюдалось снижение
жизнеспособности эмбрионов, она была достовер-
но ниже, чем в контрольной группе. Подобные
результаты были получены при исследовании
влияния времени эквилибрации на жизнеспособ-
ность криоконсервированных 8-клеточных эмбрио-
нов мыши в этиленгликоль-сахарозной и глицерин-
сахарозной средах [3, 12]. Полученные данные
можно объяснить влиянием продолжительности
экспозиции клеток в гипертонической концен-
трированной среде на ионный гомеостаз эмбрио-
нов. С помощью метода электронно-зондового
микроанализа нами было показано, что увеличе-
ние времени эквилибрации 2-клеточных эмбрионов
мыши в этиленгликоль-сахарозной среде с 1,5 до
3 мин вызывает трехкратное снижение цитоплаз-
матического содержания основных неорганичес-
ких элементов – калия и натрия [9, 11, 23]. Было
установлено, что внутриклеточная концентрация
калия и в норме не является постоянной величиной,
претерпевая циклические изменения на стадиях
клеточного цикла. Максимум достигается на
стадии интерфазы (130±6) мМ, а минимум на
стадии митоза (47±3) мМ [9, 10]. Такие изменения
концентрации калия имеют, по-видимому, важное
физиологическое значение и коррелируют с
циклическим изменением активности 240 pS
К+-канала, а также синхронными молекулярными
перестройками в цитоплазме (так называемые
“цитоплазматические часы”) в процессе дробле-
ния [18]. Следует отметить, что в наших экспери-
ыппурГ
spuorG
иицизопскэямерВ
едерсввоноирбмэ
ним,яинавижаромаз
oyrbmefoemiT
gnizeerfnierusopxe
nim,muidem
овтсечилоK
n,воноирбмэ
n,soyrbmeforebmuN
овтсечилоK
,воноирбмэ
иидатсхишгитсод
)n(%,ытсицотсалб
,soyrbmeforebmuN
tsycotsalbgnihcaorppa
)n(%,egats
I ьлортноK 1
lortnoC 1 25
1,4±4,09
)74(
II 5,1 85 0,4±7,98 )25(
III 3 35 3,6±5,57
2
)83(
390 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
ментах все 2-клеточные эмбрионы находились на
стадии G1/S клеточного цикла с соответствующим
содержанием внутриклеточного калия (130 мМ).
Снижение внутриклеточной концентрации калия до
47 мМ, по-видимому, вызывает искусственный
“перевод” цитоплазмы бластомеров эмбриона из
состояния, характерного для стадии интерфазы, в
состояние, характерное для митоза, минуя соот-
ветствующие молекулярные перестройки в цито-
плазме и нарушая, тем самым, согласованность
процессов карио- и цитокинеза. Согласно нашим
данным, эмбрионы мыши на стадии митоза содер-
жат минимальную цитоплазматическую концен-
трацию калия. Следовательно, потеря этого эле-
мента под действием осмотического фактора
среды может существенно сказаться на криоустой-
чивости клеток. В пользу этого предположения
свидетельствуют результаты работ [13, 14, 16], в
которых было показано, что жизнеспособность
эмбрионов мыши, выделенных на стадии интер-
фазы, была значительно выше после криокон-
сервирования, чем эмбрионов, находившихся на
стадии митоза.
В третьей серии экспериментов изучали влия-
ние полного цикла криоконсервирования методом
витрификации на жизнеспособность 2-кле-
точных эмбрионов мыши при использовании ЭГ
в качестве проникающего криопротектора. Крио-
консервирование с использованием метода
быстрого замораживания проводили согласно [2,
3]. Оптимизацию некоторых режимных парамет-
ров выполняли на основе проведенных ранее
исследований [5-7]. Времена экспозиции эмбрио-
нов в среде замораживания составили 45 с и
1,5 мин. Время экспозиции 3 мин было исключено
как не оптимальное на основе полученных резуль-
татов во второй серии экспериментов. Время
эквилибрации в 10%-м растворе ЭГ было сокра-
щено до 5 мин. Известно, что ступенчатое добав-
ление криопротектора к клеткам перед замора-
живанием является одним из ключевых подходов
в режимах быстрого замораживания, что позволяет
избежать появления резких концентрационных
перепадов на клеточной мембране при контакте
со средой замораживания [12, 19, 26, 27]. Однако
время эквилибрации в растворах криопротектора,
как правило, подбирается эмпирически. На основе
проведенных ранее исследований по определению
транспортных характеристик плазматических
мембран эмбрионов мыши нами было показано,
что насыщение 2-клеточных эмбрионов мыши
этиленгликолем в его 10%-м растворе на 95-100%
происходит в течение 3 мин эквилибрации [5–7].
В табл. 2 представлены результаты оценки
уровня морфологической сохранности и жизне-
способности деконсервированных 2-клеточных
эмбрионов мыши.
plasm from the state, inherent to the interphase stage
towards that, typical for mitosis, by omitting the
corresponding molecular rearrangements in cytoplasm
and breaking the conformity in kario- and cytokinesis
processes. According to our data, the murine embryos
at mitotic stage contain the minimum cytoplasm con-
centration of potassium. Consequently, this element loss
under the medium osmotic factor effect may signi-
ficantly affect cell cryoresistance. This is testified by
the research results [13, 14, 16], where the viability of
frozen-thawed murine embryos, isolated at interphase
stage was shown as significantly higher than those,
being at a mitotic stage.
In the third experimental session we have studied
the effect of a complete cryopreservation cycle by
vitrification on 2-cell murine embryo viability when
using EG as a penetrating cryoprotectant. Cryo-
preservation with the method of rapid freezing was
carried-out according to the papers [2, 3]. The
optimisation of some regimen parameters was
performed basing on the previous researches [5-7].
Time of embryo exposure in freezing medium was 45
sec and 1.5 min. Exposure time of 3 min was excluded
as a non-optimal one basing on the results obtained
during the second experimental session. Equilibration
time in 10% EG solution was reduced to 5 min. Step-
like cryoprotectant addition into cells before freezing
is one of the key approaches in rapid freezing regimens,
enabling to avoid the occurrence of sharp concentrated
differentials on cell membrane when contacting with
freezing medium [12, 19, 26, 27]. However as a rule
the equilibration time in cryoprotec-tant solution is
empirically selected. Basing on the previous research
on determining transport characte-ristics of murine
embryo plasmatic membranes we have demonstrated
that the saturation of 2-cell murine embryos with
ethylene glycol in its 10% solution occurs by 95-100%
within 3 min’s equilibration [5–7].
The Table 2 shows the results of estimation of the
level of morphological integrity and viability of frozen-
thawed 2-cell murine embryos.
Enhancing exposure time in ethylene glycol-sucrose
medium from 45 sec to 1.5 min does not result in a
visible decrease in the level of morphological integrity
of frozen-thawed 2-cell murine embryos but results in
a statistically significant reduction of their viability level.
The typical embryo injuries after cryopreservation were
cracks and ruptures in zona pellucida, blastomere lysis.
The contribution in these damages may be assumed
as resulted from by both osmotic and mechanical
factors, in particular, ice re-crystallisation processes,
occurring after devitrification at thawing stage. The
vitrification possibility of extra- and intracellular content
in the studied ethylene glycol-sucrose medium at the
freezing stage even with 5°C/min freezing rate has
been cryomicroscopically shown. An appearance of
crystallisation structure was noted at thawing stage
391 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
Увеличение времени экспозиции в этилен-
гликоль-сахарозной среде от 45 с до 1,5 мин не
приводит к заметному снижению уровня морфоло-
гической сохранности деконсервированных 2-кле-
точных эмбрионов мыши, однако уровень их
жизнеспособности достоверно снижается. Харак-
терными повреждениями эмбрионов после крио-
консервирования были трещины и разрывы zona
pellucida, лизис бластомеров. Можно предполо-
жить, что вклад в эти повреждения наряду с
осмотическим фактором могут вносить механи-
ческие факторы, в частности, процессы рекристал-
лизации льда, имеющие место после девитрифи-
кации на этапе отогрева. Криомикроскопическими
исследованиями показана возможность витрифика-
ции вне- и внутриклеточного содержимого в
исследуемой этиленгликоль-сахарозной среде на
этапе замораживания даже при скорости замора-
живания 5°С/мин. На этапе отогрева отмечалось
появление кристаллизационной структуры [4]. Не
исключено также, что причиной трещин и разрывов
могут стать термомеханические напряжения, воз-
никающие в витрифицированной фазе при охлаж-
дении или нагреве.
Выводы
Таким образом, криоконсервирование методом
витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде
позволяет сохранить жизнеспособными более 70%
2-клеточных эмбрионов мыши. Основную ответ-
ственность за повреждение бластомеров в этой
процедуре несут этапы экспозиции в среде замора-
живания и замораживания-оттаивания. Снижение
жизнеспособности эмбрионов с увеличением
времени экспозиции в среде замораживания может
быть следствием сенсибилизации эмбрионов к
постгипертоническому лизису в результате
дополнительного поступления в них криопро-
Таблица 2. Влияние полного цикла криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной
среде (30% ЭГ и 0,7 М сахарозы) на морфологическую сохранность и жизнеспособность 2-клеточных
эмбрионов мыши
Table 2. Effect of a complete cryopreservation cycle with vitrification method in ethylene glycol-sucrose medium
(30% EG and 0.7 M sucrose) on morphological integrity and viability of 2-cell murine embryos
Примечание: * – р < 0,05.
Notes: * – p < 0.05.
[4]. Thermomechanical tensions, occurring in vitrified
phase under cooling down or thawing are not excluded
as causing cracks and ruptures as well.
Conclusions
Thus, the vitrification procedure for cryopreser-
vation in ethylene glycol-sucrose medium enables to
preserve viable more than 70% of 2-cell murine
embryos. The principal responsibility for blastomere
damaging during this procedure belongs to stages of
exposure in freezing medium and freeze-thawing. A
decrease in embryo viability with exposure time
increase in freezing medium may result from embryos
sensibilization to a post-hypertonic lysis due to additio-
nal cryoprotectant entering into them and cell ion
homeostasis disorder under osmotic factor effect.
The character of embryo morphologic injuries after
a complete cryopreservation cycle testifies to a signi-
ficant contribution in cell damaging of mechanical
factors such as: ice re-crystallisation process at thaw-
ing stage and thermomechanical tensions in a sample.
References
Biology of mammalian development. Methods: Translated
from English / Ed. by M. Mank.– Moscow: Mir, 1990.– 406 p.
Isachenko V.V., Grischenko V.I., Ostashko F.I. et al. Ultrarapid
freezing of rat and cow embryos without “standard equilibra-
tion” // Problems of Cryobiology.– 1994.– N3.– P. 3-6.
Krivokharchenko A.S., Vilianovich L.I., Serobyan G.A. et al.
Murine embryo survival after ultrarapid freezing using different
ways and various cryoprotectants // Problemy Reproduktsii.–
1995.– N4.– P. 13-18.
Kuleshova L.G., Pishko O.V. Cryomicroscope analysis of
murine embryo freezing of early development stages //
Problems of Cryobiology.– 2005.– Vol. 15, N2.– P. 119-128.
Pishko O.V. Effect of ethylene glycol concentration on mem-
brane permeability of one- and two-cell murine embryos //
Problems of Cryobiology.– 2004.– N2.– P. 56-61.
Pishko O.V., Smolyaninova E.I., Rozanov L.F. Osmotic
behaviour of murine oocytes and embryos in ethylene glycol
1.
2.
3.
4.
5.
6.
ыппурГ
spuorG
воноирбмэовтсечилоK
soyrbmeforebmuN
виицизопскэямерВ
с,яинавижаромазедерс
gnizeerfniemiterusopxE
ces,muidem
овтсечилоK
хыннаворивреснокед
зебвоноирбмэ
хиксечиголофром
)n(%,йинешуран
nezorfforebmuN - dewaht
onhtiwsoyrbme
,sredrosidlacigolohprom
)n(%
,воноирбмэовтсечилоK
иидатсхишгитсод
)n(%,ытсицотсалб
,soyrbmeforebmuN
tsycotsalbgnihcaorppa
)n(%,egats
I 89 54 )28(1,31±6,87 )16(*6,3±4,47
II 47 09 )65(2,7±1,37 )13(*6,7±4,55
392 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
тектора и нарушения клеточного ионного гомео-
стаза под действием осмотического фактора.
Характер морфологических нарушений эм-
брионов после полного цикла криоконсерви-
рования свидетельствует о значительном вкладе в
повреждение клеток механических факторов:
процесса рекристаллизации льда на этапе отогрева
и термомеханических напряжений в образце.
Литература
Биология развития млекопитающих. Методы: пер. с англ.
/ Под ред. М. Манк.– М.: Мир, 1990.– 406 с.
Исаченко В.В., Грищенко В.И., Осташко Ф.И. и др.
Сверхбыстрое замораживание эмбрионов крыс и коров без
“классической эквилибрации” // Пробл. криобиологии.-
1994.– №3.– С. 3-6.
Кривохарченко А.С., Вильянович Л.И., Серобян Г.А. и др.
Выживаемость эмбрионов мышей после сверхбыстрого
замораживания разными способами с использованием
различных криопротекторов // Пробл. репродукции.– 1995.–
№4.– С.13-18.
Кулешова Л.Г., Пишко О.В. Криомикроскопический анализ
замораживания эмбрионов мыши ранних стадий разви-
тия // Пробл. криобиологии.– 2005.– Т. 15, №2.– С. 119-128.
Пишко О.В. Влияние концентрации этиленгликоля на
проницаемость мембран одно-и двухклеточных эмбрионов
мыши // Пробл. криобиологии.– 2004.– №2.– С. 56-61.
Пішко О.В., Смольянінова Є.I., Розанов Л.Ф. Осмотична
поведінка ооцитів та ембріонів миші в гіпертонічних
розчинах етиленгліколю // Біологія тварин.– 2004.–
Т. 6,№1-2.– С. 373-377.
Пишко О.В., Смольянинова Е.И., Коваленко И.Ф. и др.
Прогнозирование осмотического поведения эмбрионов
мыши на основных этапах криоконсервирования //
Пробл. криобиологии.– 2004.– №3.– С. 3-8.
Плохинский Н.А. Алгоритм биометрии.– М.: Изд-во Моск.
ун-та.– 1980.– 150 с.
Погорелов А.Г., Смольянинова Е.И., Погорелова В.Н.,
Гольдштейн Д.В. Электронно-зондовый микроанализ
калия и фосфора в ооцитах и зиготах мыши // Онтогенез.–
2005.– Т. 36, №2.– С. 123-127.
Погорелов А.Г., Гольдштейн Д.В., Смольянинова Е.И.,
Сахарова Н.Ю. Электронно-зондовый микроанализ
внутриклеточной концентрации калия в ранних эмбрио-
нах мыши // ДАН.– 2005.– Т. 400.– С. 38-39.
Смольянинова Е.И., Погорелов А.Г., Лисина Е.Г. и др.
Влияние среды замораживания на жизнеспособность и
катионный состав ранних эмбрионов мыши // Пробл.
криобиологии.– 2005.– №3.– С. 3-10.
Смольянинова Е.И., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В.,
Пишко О.В. Влияние эквилибрации в среде заморажива-
ния на осмотическую устойчивость и жизнеспособность
8-клеточных эмбрионов мыши // Пробл. криобиологии.–
2004.– №1.– С. 3-11.
Balakier H., Zenzes M., Wang P. et al. The effect of
cryopreservation on the development of S- and G2 –phase
mouse embryos// J. In Vitro Fert. Embryo Transf.– 1991.–
Vol. 8, N2.– P. 89-95.
Bautista J.A., Takahashi Y., Kanagava H. In vitro viability of
mouse zygotes vitrified in ethylene glycol // Jpn. J. Vet. Res.–
1998.– Vol. 45, N4.– P. 193-198.
Bautista J.A., Takahashi Y., Kanagava H. In vitro viability of
mouse 8-cell embryos vitrified in mole solution ethylene
glycol // Jpn. J. Vet. Res.–1997.– Vol. 45, N2.– P. 67-73.
Chedid S., Van den Abel E., Vansteirteghen B.C. Effects of
cryopreservation on survival and development of interphase-
hypertonic solutions // Biologiya Tvaryn.– 2004.– Vol. 6, N1-2.–
P.373-377.
Pishko O.V., Smolyaninova E.I., Kovalenko I.F. et al.
Forecasting of osmotic behaviour of murine embryos at the
main stages of cryopreservation // Problems of Cryobiology.–
2004.– N3.– P. 3-8.
Plokhinsky N.A. Biometry algorithm.– Moscow: Publishing
House of Moscow University, 1980.– 150 p.
Pogorelov A.G., Smolyaninova E.I., Pogorelova V.N.,
Goldshtein D.V. Electron-probe microanalysis of potassium
and phosphor in murine oocytes and zygotes // Ontogenesis.–
2005.– Vol. 36, N2.- P.123-127.
Pogorelov A.G., Goldshtein D.V., Smolyaninova E.I.,
Sakharova N.Yu. Electron-probe microanalysis of intracellular
potassium concentration in early murine embryos // Doklady
Akademii Nauk.– 2005.– Vol. 400.– P. 38-39.
Smolyaninova E.I., Pogorelov A.G., Lisina E.G. et al. Effect
of freezing medium of viability and cation composition and
early murine embryos // Problems of Cryobiology.– 2005.–
N3.– P. 3-10.
Smolyaninova E.I., Khromenkova O.B., Zhernoklev G.V.,
Pishko O.V. Equilibration effect in freezing medium on osmotic
resistance and viability and 8-cell murine embryos // Problems
of Cryobiology.– 2004.– N1.– P. 3-11.
Balakier H., Zenzes M., Wang P. et al. The effect of
cryopreservation on the development of S- and G2 –phase
mouse embryos// J. In Vitro Fert. Embryo Transf.– 1991.–
Vol. 8, N2.– P. 89-95.
Bautista J.A., Takahashi Y., Kanagava H. In vitro viability of
mouse zygotes vitrified in ethylene glycol // Jpn. J. Vet. Res.–
1998.– Vol. 45, N4.– P. 193-198.
Bautista J.A., Takahashi Y., Kanagava H. In vitro viability of
mouse 8-cell embryos vitrified in mole solution ethylene
glycol // Jpn. J. Vet. Res.–1997.– Vol. 45, N2.– P. 67-73.
Chedid S., Van den Abel E., Vansteirteghen B.C. Effects of
cryopreservation on survival and development of interphase-
and mitotic-stage 1-cell mouse embryos // Hum. Reprod.–
1992.– Vol. 7, N10.– P. 1451-1456.
Cseh S., Wang G., Corselli J. et al. Rapid freezing of mouse
embryos in ethylene glycol at different preimplantation stages //
Acta Vet. Hungarica.–1996.– Vol. 44, N4.– P. 457-465.
Day M.L., Johnson M.H., Cook D.J. A cytoplasmic cell cycle
controls the activity of a K+ channel in preimplantation mouse
embryos // The EMBO J.– 1998.– Vol. 17, N7.– P. 1952-1960.
de la Pena E.C., Takahashi Y., Atabay E.C. et al. Vitrfication
of mouse oocytes in ethylene glycol-raffinose solution:
effects of preexposure of ethylene glycol or rafinose on
oocyte viability// Cryobiology.– 2001.– Vol. 42, N2.– P.103-111.
Friedler S., Ciudice L.C., Lamb E.I. Cryopreservation of
embryos and ova // Fertil. Steril.– 1988.– Vol. 49, N5.–
P. 743-764.
Leibo S.P., Songsasen V. Cryopreservation of gametes and
embryos of non-domestic species // Theriogenology.– 2002.–
Vol. 57, N1.– P. 303-326.
Nakao K., Nakagata N., Katsuki M. Simple and efficient
vitrification procedure for cryopreservation of mouse embry-
os // Exp. Anim.– 1997.– Vol. 46, N3.– P. 231-234.
Pogorelov A.G., Katkov I.I., Smolyaninova E.I. Goldshtein D.V.
Changes in intracellular potassium and sodium content of 2-
cell mouse embryos induced by exposition to vitrification
concentrations of ethylene glycol // Cryo-Letters.– 2006.–
Vol. 27, N2.– P. 87-98.
Shaw J.M., Ward C., Trounson A.O. Evaluation of propanediol,
ethylene glycole, sucrose and antifreeze proteins on the
survival of slow-cooled mouse pronucleare and 4-cell embry-
os // Hum. Reprod.– 1995.– Vol. 10, N2.– P. 396-402.
Trounson A.O., Peura A., Kirby C. Ultrarapid freezing a new
low-cost and effective method of embryo cryopreservation //
Fertil. Steril.– 1987.– Vol. 48, N5.– P. 843-850.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
393 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
and mitotic-stage 1-cell mouse embryos // Hum. Reprod.–
1992.– Vol. 7, N10.– P. 1451-1456.
Cseh S., Wang G., Corselli J. et al. Rapid freezing of mouse
embryos in ethylene glycol at different preimplantation stages //
Acta Vet. Hungarica.–1996.– Vol. 44, N4.– P. 457-465.
Day M.L., Johnson M.H., Cook D.J. A cytoplasmic cell cycle
controls the activity of a K+ channel in preimplantation mouse
embryos // The EMBO J.– 1998.– Vol. 17, N7.– P. 1952-1960.
de la Pena E.C., Takahashi Y., Atabay E.C. et al. Vitrfication
of mouse oocytes in ethylene glycol-raffinose solution:
effects of preexposure of ethylene glycol or rafinose on
oocyte viability// Cryobiology.– 2001.– Vol. 42, N2.– P.103-111.
Friedler S., Ciudice L.C., Lamb E.I. Cryopreservation of
embryos and ova // Fertil. Steril.– 1988.– Vol. 49, N5.–
P. 743-764.
Leibo S.P., Songsasen V. Cryopreservation of gametes and
embryos of non-domestic species // Theriogenology.– 2002.–
Vol. 57, N1.– P. 303-326.
Nakao K., Nakagata N., Katsuki M. Simple and efficient
vitrification procedure for cryopreservation of mouse embry-
os // Exp. Anim.– 1997.– Vol. 46, N3.– P. 231-234.
Pogorelov A.G., Katkov I.I., Smolyaninova E.I. Goldshtein D.V.
Changes in intracellular potassium and sodium content of 2-
cell mouse embryos induced by exposition to vitrification
concentrations of ethylene glycol // Cryo-Letters.– 2006.–
Vol. 27, N2.– P. 87-98.
Shaw J.M., Ward C., Trounson A.O. Evaluation of propanediol,
ethylene glycole, sucrose and antifreeze proteins on the
survival of slow-cooled mouse pronucleare and 4-cell embry-
os // Hum. Reprod.– 1995.– Vol. 10, N2.– P. 396-402.
Trounson A.O., Peura A., Kirby C. Ultrarapid freezing a new
low-cost and effective method of embryo cryopreservation //
Fertil. Steril.– 1987.– Vol. 48, N5.– P. 843-850.
Uechi H., Tsutsumi O., Morita Y. et al. Comparison of the
effects of controlled- rate cryopreservation and vitrification on
2-cell mouse embryos and their subsequent development //
Hum. Reprod.– 1999.– Vol.14, N11.– P. 2827-2832.
Vasuthevan S., Ng S.C., Bongso A., Ratnam S.S. Embryonic
behavior of two-cell mouse embryos frozen by the one- and
two-step ultrarapid techniques // J. Assist. Reprod. Genot.-
1992.– Vol. 9, N2.– P. 545-550.
Поступила 16.11.2007
Uechi H., Tsutsumi O., Morita Y. et al. Comparison of the
effects of controlled- rate cryopreservation and vitrification on
2-cell mouse embryos and their subsequent development //
Hum. Reprod.– 1999.– Vol.14, N11.– P. 2827-2832.
Vasuthevan S., Ng S.C., Bongso A., Ratnam S.S. Embryonic
behavior of two-cell mouse embryos frozen by the one- and
two-step ultrarapid techniques // J. Assist. Reprod. Genot.-
1992.– Vol. 9, N2.– P. 545-550.
Accepted in 16.11.2007
26.
27.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69106 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:27:35Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Смольянинова, Е.И. Пишко, О.В. Лисина, Е.Г. Колесникова, А.А. Розанов, Л.Ф. 2014-10-04T19:15:57Z 2014-10-04T19:15:57Z 2007 Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши / Е.И. Смольянинова, О.В. Пишко, Е.Г. Лисина, А.А. Колесникова, Л.Ф. Розанов // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 385-393. — Бібліогр.: 27 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69106 57.043.085:547.422 Исследовано влияние различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на морфологическую сохранность и жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши. Показано, что данная процедура позволяет сохранить жизнеспособными более 70% эмбрионов. Основной вклад в криоповреждение эмбрионов вносят этапы экспозиции в среде замораживания и замораживания-отогрева. На основе литературных и полученных в работе данных обсуждается роль осмотического и механического факторов в повреждении клеток на этапах быстрого замораживания. Досліджено вплив різних етапів кріоконсервування за методом вітрифікації у этиленгліколь-сахарозному середовищі на морфологічну збереженість та життєздатність 2-клітинних ембріонів миші. Показано, що ця процедура дозволяє зберегти життєздатними більш, ніж 70% ембріонів. Основний внесок у кріопошкодження ембріонів належить этапам экспозиції у середовищі заморожування та заморожування-відігріву. На підставі літературних та отриманих в роботі даних обговорюється роль осмотичного та механічного факторів у пошкодженні клітин на етапах швидкого заморожування. The effect of different stages of vitrification protocol for cryopreservation with ethylene glycol-sucrose medium on morphological integrity and viability of 2-cell murine embryos has been studied. This procedure was shown as enabling to preserve viable more than 70% embryos. The stages of exposure in freezing medium and freeze-thawing are mostly responsible for embryo cryoinjury. Basing on the literature reports and own data the role of osmotic and mechanical factors in cell injury at the rapid freezing stages is discussed. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши Analysis of Effect of Different Steps of Vitrification Protocol for Cryopreservation with Ethylene Glycol-Sucrose Medium on 2-Cell Murine Embryo Viability Article published earlier |
| spellingShingle | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши Смольянинова, Е.И. Пишко, О.В. Лисина, Е.Г. Колесникова, А.А. Розанов, Л.Ф. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши |
| title_alt | Analysis of Effect of Different Steps of Vitrification Protocol for Cryopreservation with Ethylene Glycol-Sucrose Medium on 2-Cell Murine Embryo Viability |
| title_full | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши |
| title_fullStr | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши |
| title_full_unstemmed | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши |
| title_short | Анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши |
| title_sort | анализ влияния различных этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69106 |
| work_keys_str_mv | AT smolʹâninovaei analizvliâniârazličnyhétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenažiznesposobnostʹ2kletočnyhémbrionovmyši AT piškoov analizvliâniârazličnyhétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenažiznesposobnostʹ2kletočnyhémbrionovmyši AT lisinaeg analizvliâniârazličnyhétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenažiznesposobnostʹ2kletočnyhémbrionovmyši AT kolesnikovaaa analizvliâniârazličnyhétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenažiznesposobnostʹ2kletočnyhémbrionovmyši AT rozanovlf analizvliâniârazličnyhétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenažiznesposobnostʹ2kletočnyhémbrionovmyši AT smolʹâninovaei analysisofeffectofdifferentstepsofvitrificationprotocolforcryopreservationwithethyleneglycolsucrosemediumon2cellmurineembryoviability AT piškoov analysisofeffectofdifferentstepsofvitrificationprotocolforcryopreservationwithethyleneglycolsucrosemediumon2cellmurineembryoviability AT lisinaeg analysisofeffectofdifferentstepsofvitrificationprotocolforcryopreservationwithethyleneglycolsucrosemediumon2cellmurineembryoviability AT kolesnikovaaa analysisofeffectofdifferentstepsofvitrificationprotocolforcryopreservationwithethyleneglycolsucrosemediumon2cellmurineembryoviability AT rozanovlf analysisofeffectofdifferentstepsofvitrificationprotocolforcryopreservationwithethyleneglycolsucrosemediumon2cellmurineembryoviability |