Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс
Исследовано влияние условий криоконсервирования (концентрация криопротектора, инкубация клеток с криопротектором перед замораживанием, скорости охлаждения образцов в различных температурных интервалах) на сохранность стероидогенных клеток в суспензии клеток интерстиция (СКИ) тестисов. Результатом эт...
Gespeichert in:
| Datum: | 2007 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69107 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс / Т.М. Гурина, А.В. Пахомов, Г.А. Божок // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 394-402. — Бібліогр.: 14 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-69107 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-691072025-02-09T13:44:06Z Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс Effect of Cooling Rate under Various Temperature Intervals on Survival of Steroidogenic Potential of Suspension of Interstitial Cells of Adult Rat’s Testes Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. Божок, Г.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология Исследовано влияние условий криоконсервирования (концентрация криопротектора, инкубация клеток с криопротектором перед замораживанием, скорости охлаждения образцов в различных температурных интервалах) на сохранность стероидогенных клеток в суспензии клеток интерстиция (СКИ) тестисов. Результатом этого явилась разработка режима криоконсервирования СКИ, который дает наилучшую сохранность и функциональную активность стероидогенных клеток по сравнению с уже существующими режимами для биологического материала тестисов. Досліджено вплив умов кріоконсервування (концентрація кріопротектора, інкубація клітин з кріопротектором перед заморожуванням, швидкості охолодження зразків в різних температурних інтервалах) на збереженість стероїдогенних клітин в суспензії клітин інтерстицію (СКІ) тестисів. Результатом цього була розробка режиму кріоконсервування СКІ, який дає найкращу збереженість і функціональну активність стероїдогенних клітин порівняно з режимами, які вже існують для біологічного матеріалу тестисів. The effect of cryopreservation conditions (cryoprotectant concentration, cell incubation with cryoprotectants prior to freezing, cooling of samples with various temperature intervals) on survival of steroidogenic cells in the testscular interstitium cell suspension (ICS) has been investigated. This resulted in designing of cryopreservation protocol for ICS, which provided the highest survival and functional activity of steroidogenic cells if compared with the protocols already existing for testicular biological material. 2007 Article Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс / Т.М. Гурина, А.В. Пахомов, Г.А. Божок // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 394-402. — Бібліогр.: 14 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69107 57.043:591.463.2.085 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. Божок, Г.А. Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследовано влияние условий криоконсервирования (концентрация криопротектора, инкубация клеток с криопротектором перед замораживанием, скорости охлаждения образцов в различных температурных интервалах) на сохранность стероидогенных клеток в суспензии клеток интерстиция (СКИ) тестисов. Результатом этого явилась разработка режима криоконсервирования СКИ, который дает наилучшую сохранность и функциональную активность стероидогенных клеток по сравнению с уже существующими режимами для биологического материала тестисов. |
| format |
Article |
| author |
Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. Божок, Г.А. |
| author_facet |
Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. Божок, Г.А. |
| author_sort |
Гурина, Т.М. |
| title |
Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс |
| title_short |
Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс |
| title_full |
Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс |
| title_fullStr |
Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс |
| title_full_unstemmed |
Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс |
| title_sort |
влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2007 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/69107 |
| citation_txt |
Влияние скорости охлаждения в различных температурных интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии интерстициальных клеток семенников взрослых крыс / Т.М. Гурина, А.В. Пахомов, Г.А. Божок // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 4. — С. 394-402. — Бібліогр.: 14 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT gurinatm vliânieskorostiohlaždeniâvrazličnyhtemperaturnyhintervalahnasohrannostʹsteroidogennogopotencialasuspenziiintersticialʹnyhkletoksemennikovvzroslyhkrys AT pahomovav vliânieskorostiohlaždeniâvrazličnyhtemperaturnyhintervalahnasohrannostʹsteroidogennogopotencialasuspenziiintersticialʹnyhkletoksemennikovvzroslyhkrys AT božokga vliânieskorostiohlaždeniâvrazličnyhtemperaturnyhintervalahnasohrannostʹsteroidogennogopotencialasuspenziiintersticialʹnyhkletoksemennikovvzroslyhkrys AT gurinatm effectofcoolingrateundervarioustemperatureintervalsonsurvivalofsteroidogenicpotentialofsuspensionofinterstitialcellsofadultratstestes AT pahomovav effectofcoolingrateundervarioustemperatureintervalsonsurvivalofsteroidogenicpotentialofsuspensionofinterstitialcellsofadultratstestes AT božokga effectofcoolingrateundervarioustemperatureintervalsonsurvivalofsteroidogenicpotentialofsuspensionofinterstitialcellsofadultratstestes |
| first_indexed |
2025-11-26T11:31:30Z |
| last_indexed |
2025-11-26T11:31:30Z |
| _version_ |
1849852370463227904 |
| fulltext |
394 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
УДК 57.043:591.463.2.085
Т.М. ГУРИНА, А.В. ПАХОМОВ*, Г.А. БОЖОК
Влияние скорости охлаждения в различных температурных
интервалах на сохранность стероидогенного потенциала суспензии
интерстициальных клеток семенников взрослых крыс
UDC 57.043:591.463.2.085
T.M. GURINA, A.V. PAKHOMOV*, G.A. BOZHOK
Effect of Cooling Rate under Various Temperature Intervals on Survival
of Steroidogenic Potential of Suspension of Interstitial Cells
of Adult Rat’s Testes
Исследовано влияние условий криоконсервирования (концентрация криопротектора, инкубация клеток с криопротектором
перед замораживанием, скорости охлаждения образцов в различных температурных интервалах) на сохранность стероидогенных
клеток в суспензии клеток интерстиция (СКИ) тестисов. Результатом этого явилась разработка режима криоконсервирования
СКИ, который дает наилучшую сохранность и функциональную активность стероидогенных клеток по сравнению с уже
существующими режимами для биологического материала тестисов.
Ключевые слова: тестостерон, клетки Лейдига, скорость замораживания, 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, переохлаждение.
Досліджено вплив умов кріоконсервування (концентрація кріопротектора, інкубація клітин з кріопротектором перед
заморожуванням, швидкості охолодження зразків в різних температурних інтервалах) на збереженість стероїдогенних клітин
в суспензії клітин інтерстицію (СКІ) тестисів. Результатом цього була розробка режиму кріоконсервування СКІ, який дає
найкращу збереженість і функціональну активність стероїдогенних клітин порівняно з режимами, які вже існують для
біологічного матеріалу тестисів.
Ключові слова: тестостерон, клітини Лейдига, швидкість охолодження, 3β-гідроксистероїддегідрогеназа, переохолодження.
The effect of cryopreservation conditions (cryoprotectant concentration, cell incubation with cryoprotectants prior to freezing,
cooling of samples with various temperature intervals) on survival of steroidogenic cells in the testscular interstitium cell suspension
(ICS) has been investigated. This resulted in designing of cryopreservation protocol for ICS, which provided the highest survival and
functional activity of steroidogenic cells if compared with the protocols already existing for testicular biological material.
Key-words: testosterone, Leydig cells, cooling rate, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, overcooling.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-30-07, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57
373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Трансплантация биологического материала
мужских половых желез, ответственных за синтез
андрогенов, при коррекции различных заболеваний,
приводящих к гормональной недостаточности, ши-
роко распространяется в настоящее время. Соглас-
но статистике ежегодно наблюдается тенденция
к увеличению количества заболеваний, связанных
с недостаточной выработкой тестостерона [7].
На сегодняшний день известны эксперимен-
тальные модели по трансплантации целых тести-
сов, их фрагментов и органотипических культур, а
также изолированных клеток Лейдига для компен-
сации гипогонадизма [2, 6]. Однако для эффек-
тивного использования метода трансплантации
необходимо создать банк полноценного донорского
материала, который обеспечил бы его долгосроч-
ное хранение. Криобиология в этом отношении
открывает широкие перспективы. Существует ряд
способов криоконсервирования тестикулярных
тканей и клеток с использованием криопротекторов
Transplantation of biological material of male sexual
glands responsible for the synthesis of androgens when
correcting different diseases, resulting in hormonal
insufficiency, is widely spread nowadays. According
to the statistics annually the tendency to a rise of the
number of diseases associated to insufficient production
of testosterone [7] is observed.
Up today there are known experimental models on
transplantation of the whole testes, their fragments and
organotypic cultures as well as of isolated Leydig cells
for compensation of hypogonadism [2, 6]. However
for efficient use of transplantation method it is
necessary to establish the bank of valuable donor’s
material, which will provide its long-term storage.
There are some cryopreservation protocols of testicular
tissue and cells using cryoprotectants: dimethyl
sulfoxide (DMSO), 1-2-propanediol, ethylene glycol,
glycerol with relatively low cooling rate of the samples
(1-2°C/min) [10, 12, 14]. However they are related to
significant reduction of viability and functional activity
395 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
диметилсульфоксида (ДМСО), 1,2-пропандиола,
этиленгликоля, глицерина с относительно низкой
скоростью охлаждения образцов (1-2°С/мин) [10,
12, 14]. Однако они связаны со значительным
снижением жизнеспособности и функциональной
активности материала семенников. Так как одним
из важнейших результатов криоконсервирования
семенников является сохранность тестостеронпро-
дуцирующих клеток Лейдига, необходимы иссле-
дования, направленные на изучение влияния
отдельных факторов криоконсервирования на сох-
ранность стероидогенных клеток, их функцио-
нальной способности и разработку режима,
позволяющего максимально сохранить гормоно-
продуцирующую составляющую тестисов.
Цель работы – исследовать влияние скорости
охлаждения в температурном интервале кристал-
лизации биологической системы и диапазоне суб-
эвтектических температур раствора криопро-
тектора ДМСО, применяемого в качестве криопро-
тектора, на общую сохранность суспензии клеток
интерстиция (СКИ) семенников и на сохранность
отдельной популяции клеток в СКИ, обладающей
высокой активностью 3β-гидроксистероидде-
гидрогенезы (ГСД(+)-клеток). Фермент 3β-ГСД
играет одну из ключевых ролей в реакциях прев-
ращения холестерина в тестостерон. Он является
маркером тестостеронпродуцирующих клеток
Лейдига в тестисах. Было исследовано влияние
скоростей охлаждения в различных темпе-
ратурных интервалах на изменение базальной и
стимулированной секреции тестостерона интер-
стициальными клетками.
На основе полученных данных предпринята
попытка создать наиболее оптимальный режим
криоконсервирования СКИ, учитывающий зависи-
мость сохранности тестостеронпродуцирующих
клеток от скорости охлаждения в различных
температурных интервалах.
Материалы и методы
Эксперименты проведены в соответствии с
«Общими принципами экспериментов на живот-
ных», одобренными I Национальным конгрессом
по биоэтике (20.09.01 г., Киев, Украина) и согласо-
ванными с положениями «Европейской Конвенции
о защите позвоночных животных, используемых
для экспериментальных и других научных целей»
(Страсбург, 1985).
Суспензии клеток интерстиция семенников
взрослых крыс получали следующим образом.
После экстирпации семенники освобождали от
оболочки, подвергали мягкой обработке кол-
лагеназой (4 мг/мл) на среде 199 с 20 мМ Hepes
(рН 7,4) при 32–34°C и непрерывном помешивании
на протяжении 15 мин. Перед разделением полу-
of testes material. Since one of the most important
cryo-preservation results for testes is the survival of
testosterone-producing Leydig cells, there is a need in
the studies directed to investigation of the effect of
certain factors of cryopreservation on survival of
steroidogenic cells, their functional ability and the
designing of the regimen enabling to maximally
preserve hormone-producing component of testes.
The research aim was to study the effect of cooling
rate within temperature interval of crystallization of
biological system and within the range of sub-eutectic
temperatures of the solution of DMSO, applied as
cryoprotectants on total survival of interstitium cell
suspension (ICS) of testes and the survival of separate
cell population in ICS, having a high activity of 3β-
hydroxysteroid dehydrogenase (HSD(+)-cells).
Enzyme 3β-HSD plays one of key roles in transfor-
mation reactions of cholesterol into testosterone. It is
the marker of testosterone-producing Leydig cells in
testes. The effect of cooling rates within various
temperature intervals on the change of basal and
stimulated secretion of testosterone by interstitial cells
has been studied.
With basing on the obtained results there was the
attempts to create the most optimal regimen of
cryopreservation for ICS, taking into account the
dependence of testosterone-producing cells on the
cooling rate within different temperature intervals.
Materials and methods
The experiments were performed in accordance
with “General principles of the experiments in animals”,
adopted by the 1st National Congress on Bioethics
(20.09.01, Kyiv, Ukraine) and coordinated with the
statements of “European Convention on the protection
of vertebrate animals, used for experimental and other
scientific purposes” (Strasbourg, 1985).
Cell suspensions of testes interstitium of adult rats
were obtained as follows. After extirpation the testes
were de-coated and subjected to a mild treatment with
collagenase (4 mg/ml) in medium 199 with 20mM
Hepes (pH 7.4) at 32–34°C and constant mixing for
15 min. Prior to separation of the resulted cell
suspension in density gradients of sucrose a primary
sedimentation of tubular structures was performed.
After its separation the cell fraction with the density
of 1.127–1.176 g/cm3 was washed-out by medium 199
with 20 mM Hepes (pH 7.4). The obtained cells were
used in experiments.
ICS were cryopreserved with DMSO cryopro-
tectant under final concentration of 10%. DMSO
solution was prepared in medium 199 with 20 mM
Hepes and added to cells in 1:1 ratio. The volume of
the sample to be frozen is 1 ml.
After adding the cryoprotectant solution the samp-
les were frozen with programmable freezer (Cryoson,
396 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
ченной суспензии клеток в градиентах плотности
сахарозы осуществляли первичное осаждение
тубулярных структур. После ее разделения фрак-
ция клеток плотностью 1,127–1,176 г/см3 была от-
мыта средой 199 с 20 мМ Hepes (рН 7,4). Получен-
ные клетки использовали в экспериментах.
Криоконсервирование СКИ проводили с крио-
протектором ДМСО в конечной концентрации 10%.
Раствор ДМСО готовили на среде 199 с 20 мМ
Hepes и добавляли к клеткам в соотношении 1:1.
Объем замораживаемого образца составлял 1 мл.
После добавления раствора криопротектора
образцы замораживали на программном замо-
раживателе «Cryoson» (Германия) в криоампулах
(фирма «Nunс») объемом 1,8 мл. Регистрацию
программы замораживания проводили при помощи
установленной в криоампулах медь-констан-
тановой термопары и самописца типа «Endim»
622.01.
При исследовании влияния скоростей охлажде-
ния образцов в температурном интервале кристал-
лизации криобиологической системы на общую
сохранность СКИ и сохранность популяции
ГСД+-клеток использовали следующие програм-
мы.
Программа 1: образцы охлаждали от 20–22 до
–40°С с постоянной скоростью 1–2°С/мин и
последующим их погружением в жидкий азот.
Скорость, используемая для замораживания в
данной программе, рекомендована для клеток
Лейдига [10, 14].
Программа 2: образцы охлаждали аналогично
программе 1, но дополнительно вводили процедуру
программного снятия переохлаждения путем
температурной инициации кристаллообразования,
предусмотренную возможностями заморажи-
вателя “Cryoson”.
Программа 3: образцы охлаждали от 20-22°С
со скоростью 1°С/мин, однако после программного
снятия переохлаждения скорость охлаждения в
интервале температур кристаллизации биоло-
гической системы увеличивали до 15-20°С/мин.
После достижения температуры –40°С образцы
погружали в жидкий азот. При реализации прог-
рамм замораживания с температурной инициацией
кристаллообразования величина переохлаждения
не превышала 0,5-1°С.
При исследовании влияния скорости охлаждения
образцов в диапазоне температур от –40 до –70°С,
в который входит точка эвтектики растворов
ДМСО (66,7°С), на общую сохранность СКИ, сох-
ранность ГСД+-клеток, а также на способность
СКИ к синтезу и секреции тестостерона, исполь-
зовали следующие программы:
Программа 4: образцы охлаждали от 20–22 до
–40°С с постоянной скоростью 1–2°С/мин. В
Germany) in 1.8 ml cryovials (Nunc). Freezing prog-
rams were recorded with adjusted on cryovials copper-
constantan thermocouple and “Endim” 622.01 recor-
der.
When studying the effect of cooling rates within
temperature interval of cryobiological system
crystallization on total integrity of ICS and the survival
of population of HSD+-cells the following programs
were used:
Program 1: the samples were cooled from 20–22°C
down to –40°C with constant rate of 1–2°C/min and
following their submerging into liquid nitrogen. The rate
used for freezing in this program is recommended for
Leydig cells [10, 14].
Program 2: the samples were cooled the same as
for Program 1, but additionally the procedure of
programmable withdrawal of overcooling by means
of temperature initiation of crystal formation, foreseen
by the “Cryoson” freezer resources was introduced.
Program 3: the samples were cooled from 20-22°C
with the rate of 1°C/min, however after programmable
withdrawal of overcooling the cooling rate within
temperature interval of biological system crystallization
increased up to 15-20°C/min. After achieving the
temperature of –40°C the samples were submerged
into liquid nitrogen. When realizing the freezing prog-
rams with temperature initiation of crystal formation
the overcooling value did not exceed 0.5–1°C.
When investigating the effect of cooling rate of the
samples within the temperature range from –40 down
to –70°C, wherein the eutectics point of DMSO
solutions (66.7°C) is also comprised, on total survival
of ICS, that of HSD+-cells as well as the ability of ICS
to synthesize and secrete testosterone, the following
programs were used:
Program 4: the samples were cooled from 20-22
down to –40°C with constant rate of 1-2°C/min. Within
the range of temperatures from –40 down to –70°C
there was preserved the same cooling rate (1°C/min).
After reaching the temperature of –70°C the samples
were immersed into liquid nitrogen.
Program 5: the samples were cooled from 20-22
down to –40°C with the rate of 1-2°C/min. Within the
range of temperatures from –40 down to –70°C the
cooling rate was increased up to 20-25°C/min. After-
wards the samples were immersed into liquid nitrogen.
When creating the most optimal cryopreservation
regimen (Program 6) the dependence of ICS integrity
and that of HSD+-cells on cooling rate within different
temperature intervals was taken into account, where-
fore the results on cryopreservation of samples
according to programs 2 and 3 were compared with
those obtained when using program 1, and for programs
4 and 5 this was done by comparing them with each
other and program 1. Distinctive feature of the program
1 is rapid non-controlled cooling of the samples when
397 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
submerging into liquid nitrogen within the temperature
range from –40°C and lower.
Program 6: the samples were cooled from 20–22
down to –40°C with the rate of 1°C/min. After
programmable withdrawal of overcooling the cooling
rate within the temperature interval of biological system
crystallization (down to –40°C) was increased up to
15–20°C/min and within the temperature range from
–40 down to –70°C up to 20–25°C/min.
The samples were thawed on water bath (32–
34°C), washed-out from DMSO by gradual reduction
of its concentration in the medium.
Basal and stimulated secretions of cells were
examined using cell incubation in the medium 199 with
20 mM Hepes for an hour at 32–34°C. Chorionic
gonadotropin (CG) in concentration of 1 IU/ml (Orga-
non, the Netherlands) was used as the stimulator of
steroidogenesis. Testosterone content in incubation
medium was measured by radio immunologic method
using the kits “RIA ST-testosteron” (Belarus) and
counted in respect of the number of cells prior to
freezing.
Histochemical staining for revealing the activity of
3β-HSD was done by the described method [11]
according to that 2-4×106 cells/ml were incubated in
2.5 ml of buffered physiological solution (pH 7.4),
containing 0.2 mg/ml of nitroblue tetrasolium (NBT),
1mg/ml NAD (Sigma) and 0.12 mg/ml dehydro-
epiandrosterone (Sigma) for 90 min at 32–34°C.
Positively stained cells were light violet. HSD+-cells
were counted within microscope vision field.
Cell survival was controlled with the method of
supravital staining with trypan blue [8]. Total cell
survival after cryopreservation with different freezing
protocols was expressed in percentage to interstitium
cells prior to freezing, the survival of HSD+-cells after
cryopreservation was found on the ratio to the number
of HSD+-cells in the samples prior to freezing.
For statistical processing of the results single-factor
analysis of variance and Student’s τ-criterion was used
by means of Excel software.
Results and discussion
Cryopreservation factor affects significantly ICS
integrity. So, the total number of cells of interstitium
cryopreserved according to program 1, sharply reduced
down to 55% (Fig. 1) and down to 30% for HSD+-
cells. The ability for synthesis and secretion of testo-
sterone at cooling rate of 1-2°C/min down to –40°C
with following submersion of the samples into liquid
nitrogen was decreased. As Fig 2. shows the use of
this cooling rate results in a significant reduction of
basal and stimulated by CG of ICS steroidogenesis.
Especially sharp reduction of their ability to respond
to tropic stimulation was found.
During freezing the conditions and rate of crystal-
like structure formation significantly affect the survival
диапазоне температур от –40 до –70°С сохраняли
ту же скорость охлаждения – 1°С/мин. После
достижения температуры –70°С образцы погружа-
ли в жидкий азот.
Программа 5: образцы охлаждали от 20–22 до
–40°С со скоростью 1–2°С/мин. В диапазоне тем-
ператур –40...–70°С скорость охлаждения увеличи-
вали до 20–25°С/мин. После этого образцы погру-
жали в жидкий азот.
При создании наиболее оптимального режима
криоконсервирования (программа 6) учитывали
зависимость сохранности СКИ и ГСД+-клеток от
скорости охлаждения в различных температурных
интервалах, для чего результаты по криоконсерви-
рованию образцов согласно программам 2 и 3
сравнивали с результатами, полученными при
использовании программы 1, а программ 4 и 5 –
между собой и с результатами программы 1.
Отличительной особенностью программы 1 яв-
ляется быстрое неконтролируемое охлаждение
образцов при погружении в жидкий азот в диапа-
зоне температур от –40°С и ниже.
Программа 6: образцы охлаждали от 20–22°С
со скоростью 1°С/мин. После программного сня-
тия переохлаждения скорость охлаждения в интер-
вале температур кристаллизации биологической
системы (до –40°С) увеличивали до 15–20°С/мин,
а в диапазоне температур от –40 до –70°С – до
20–25°С/мин.
Образцы отогревали на водяной бане (32-34°С),
отмывали от ДМСО путем постепенного снижения
его концентрации в среде.
Базальную и стимулированную секрецию кле-
ток исследовали при помощи инкубации клеток в
среде 199 с 20 мМ Hepes в течение часа при 32–
34°C. Как стимулятор стероидогенеза использо-
вали хорионический гонадотропин (ХГ) в кон-
центрации 1 МЕ/мл («Organon», Нидерланды). Со-
держание тестостерона в инкубационной среде
измеряли радиоиммунологическим методом с
использованием наборов «РИА СТ-тестостерон»
(Беларусь) и рассчитывали на количество клеток
до замораживания.
Гистохимическое окрашивание на выявление
активности 3β-ГСД проводили методом, описан-
ным в [11], согласно которому 2-4×106 кл/мл
инкубировали в 2,5 мл физиологического раствора
с буфером (рН 7,4), содержащего 0,2 мг/мл нитро-
синего тетразолия (НСТ), 1мг/мл НАД («Sigma»)
и 0,12 мг/мл дегидроэпиандростерона («Sigma») в
течение 90 мин при 32–34°C. Позитивно окра-
шенные клетки имели светло-фиолетовую окраску.
Подсчет ГСД+-клеток осуществляли в поле зрения
микроскопа.
Сохранность клеток контролировали методом
суправитального окрашивания трипановым синим
[8]. Общую сохранность клеток после криоконсер-
398 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
вирования по различным программам замора-
живания выражали в процентном отношении к
клеткам интерстиция до замораживания, сохран-
ность ГСД+-клеток после криоконсервирования –
по отношению к количеству ГСД+-клеток в образ-
цах до замораживания.
При статистической обработке результатов
использовали однофакторный дисперсионный
анализ и t-критерий Стьюдента с помощью пакета
программ Excel.
Результаты и обсуждение
Фактор криоконсервирования значительно
влияет на сохранность СКИ. Так, общее коли-
чество клеток интерстиция, криоконсервированных
согласно программе 1, резко снижалось до 55%
(рис. 1), а ГСД+-клеток – до 30%. Способность к
синтезу и секреции тестостерона при скорости
охлаждения 1–2°С/мин до –40°С, с дальнейшим
погружением образцов в жидкий азот, была сниже-
на. Как показано на рис. 2, использование данной
скорости охлаждения приводит к значительному
снижению базального и стимулированного ХГ
стероидогенеза СКИ. Особенно резко уменьша-
лась их способность отвечать на тропную стиму-
ляцию ХГ.
На сохранность клеточных суспензий при
замораживании существенно влияют условия и
скорость образования кристаллообразной струк-
туры [1, 3, 9]. Конечный результат кристаллизации
будет определяться взаимосвязью скорости
появления новых центров кристаллизации и
скорости роста образовавшихся кристаллов. Каж-
дый из этих факторов может по-разному влиять
на сохранность тех или иных клеток в клеточной
суспензии.
Уменьшение величины переохлаждения спо-
собствует увеличению сохранности различных
клеток после замораживания [5].
При исследовании сохранности клеток в
температурном интервале кристаллизации системы
было показано, что программное снятие переох-
лаждения образцов при замораживании СКИ
(программа 2) приводило к увеличению общей
сохранности клеток до 64% и сохранности ГСД+-
клеток до 47% от нативных ГСД+-клеток (см. рис.
1). При этом увеличение скорости охлаждения
после программного снятия переохлаждения (прог-
рамма 3) значительно повышало сохранность
популяции ГСД+-клеток (см. рис. 1). Способность
к синтезу и секреции тестостерона СКИ, особенно
в ответ на стимуляцию ХГ, также увеличивалась
(рис. 2) по сравнению со способностью клеток,
криоконсервированных по программе 1.
Эти результаты свидетельствуют о преиму-
ществе использования после снятия переохлаж-
of cell suspensions [1, 3, 9]. Final result of crystal-
lization will be determined by interaction of the rate of
new crystallization centers’ appearance and growth
rate of the formed crystals. Each of these factors may
differently affect the integrity of any cells in cell suspen-
sion.
Reduction of overcooling value contributes to a rise
in survival of different cells after freezing [5].
When investigating the cell integrity within the
temperature interval of system crystallization there was
shown that programmable withdrawal of overcooling
of the samples during ICS freezing (program 2) resulted
in an increases total integrity of cells up to 64% and
that for HDS+-cells up to 47% from native HSD+-cells
(see Fig. 1). Herewith a rise in the cooling rate after
programmable withdrawal of overcooling (program
3) considerably increased the survival of HSD+-cells
population (see Fig. 1). The ability for synthesis and
secretion of ICS testosterone by ICS especially the
response to CG stimulation also enhanced (Fig. 2) if
compared with the ability of the cells cryopreserved
on program 1.
These results testify to the advantage of using after
overcooling withdrawal higher freezing rates at the
stage of biological system crystallization. In addition,
maximum reduction of overcooling which frequently
determines the further character of system crystal-
lization and rate of re-crystallization processes at
thawing stage will positively affect the survival of
steroidogenic testes cells.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6
Рис. 1. Общая сохранность ( ) и сохранность ГСД+-клеток
в СКИ ( ) при различных программах замораживания;
* – различия достоверны по отношению к программе 1;
# – различия достоверны по отношению к программе 4
(р<0,05).
Fig. 1. Total survival ( ) and that for HSD+-cells in ICS ( )
at different freezing programs. * – differences are statisti-
cally significant in respect of the program 1; # – differences
are statistically significant in respect of the program 4
(p<0.05).
Программы охлаждения
Сooling programs
С
ох
ра
нн
ос
ть
,%
Su
rv
iv
al
, %
*
*
#*
#*
399 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
0
20
40
60
80
100
120
Натив 1 2 3 4 5 6
Программы охлаждения
Сooling programs
Те
ст
ос
те
ро
н,
н
м
ол
ь/
кл
×1
012
Te
st
os
te
ro
ne
,
nM
/c
el
ls
×
10
12
дения более высоких скоростей замораживания на
этапе кристаллизации биологической системы.
Кроме того, максимальное снижение переохлаж-
дения, которое зачастую определяет дальнейший
характер кристаллизации системы и скорость ре-
кристаллизационных процессов на этапе отогрева,
будет позитивно сказываться на сохранности
стероидогенных клеток семенников.
Исследовано явление низкотемпературного
эвтектического расслоения растворов криопротек-
торов [4, 13] и значение для криоконсервирования
диапазона субэвтектических температур раство-
ров криопротекторов. Сделано допущение, что про-
цессы, связанные со структурными изменениями
образцов в данном температурном интервале,
могут значительно снижать сохранность криокон-
сервируемых клеток. Из-за незаконченного процес-
са кристаллообразования в этих температурных
интервалах высока вероятность различных рекри-
сталлизационных процессов, которые могут суще-
ственно снижать сохранность клеток, особенно на
этапе отогрева [1, 3]. Это ставит под сомнение
эффективность быстрого неконтролируемого замо-
раживания образцов путем погружения их в жидкий
азот при достижении температуры –40°С (прог-
раммы 1, 2 и 3).
Дальнейшим этапом работы было исследова-
ние общей сохранности СКИ и сохранности ГСД+-
клеток в СКИ при охлаждении с различной скоро-
стью в диапазоне температур от –40 до –70°С, в
котором может происходить низкотемпературное
эвтектическое расслоение раствора криопротек-
тора и наиболее вероятны дальнейшие перестройки
структуры межкристаллических прослоек в замо-
раживаемой биологической системе [13].
Охлаждение в данном интервале температур с
постоянной скоростью 1–2°С/мин (программа 4)
не приводило к заметному увеличению как общей
клеточной сохранности (см. рис. 1), так и сохран-
ности ГСД+-клеток. Содержание тестостерона в
среде инкубации, как и ответ СКИ на тропную сти-
муляцию после замораживания по программе 4
оставались довольно низкими и сравнимы были с
аналогичными показателями для клеток, криокон-
сервированных по программе 1 (рис. 2). Такой же
результат по стероидной продукции был получен и
при увеличении скорости охлаждения до 20–
25°С/мин в интервале температур от –40 до –70°С
(программа 5, рис. 2). Однако при этом возрастали
общая сохранность клеток и сохранность ГСД+-
клеток (программа 5, см. рис. 1), что свидетельст-
вует о положительном эффекте более высоких
скоростей охлаждения в данном интервале темпе-
ратур при криоконсервировании.
Таким образом, охлаждение в интервале темпе-
ратур от –40 до –70°С при замораживании СКИ
Рис. 2. Базальная ( ) и стимулированная секреция ( )
тестостерона СКИ после различных программ охлаж-
дения. * – различия достоверны по отношению к
программе 1 (р<0,05).
Fig. 2. Basal ( ) and stimulated ( ) secretions of ICS testo-
sterone after different cooling programs. * – differences are
statistically significant in respect of the program 1 (p< 0.05).
Low-temperature eutectic stratification of cryopro-
tectant’s solutions [4, 13] and the values for cryo-
preservation of the range of sub-eutectic temperatures
of cryoprotectants solutions have been shown. It was
assumed that the processes related to structural chan-
ges of samples within this temperature interval may
significantly reduce the survival of the cells under
cryopreservation. Due to formation of incompleted ice
crystals within these temperature intervals the probabi-
lity of different recrystallization processes capable to
reduce the cell survival especially at thawing stage is
quite high [1, 3]. This fact prejudices the efficiency of
rapid non-controlled freezing of the samples by sub-
merging them into liquid nitrogen when reaching the
temperature of –40°C (programs 1, 2 and 3).
The following research stage there was the study
of total survival of ICS during cooling with various
rate within the temperature range from –40 down to
–70°C wherein low-temperature eutectic stratification
of cryoprotectant solution may occur and further rear-
rangements of the structure of intercrystal interlayers
in the biological system under freezing are very pro-
bable [13].
Cooling within this temperature interval with
constant rate of 1-2°C/min (program 4) did not result
in marked rise in both total cell survival (see Fig. 1)
and that for HSD+-cells. Content of testosterone in
incubation medium as well as a response of ICS on
tropic stimulation after freezing on program 4 have
remained quite low and were comparable with the same
* *
*
Native
400 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
indices for cells cryopreserved on program 1 (Fig. 2).
The same result on steroid production was obtained
when increasing the cooling rate up to 20–25°C/min
within temperature interval from –40 to –70°C
(program 5, Fig. 2). However herewith total cell survival
and that for HSD+-cells increased (program 5, see
Fig. 2), testifying to a positive effect of more rapid
cooling rates within given temperature interval during
cryopreservation.
Thus cooling within the temperature interval of
–40 down to –70°C during freezing of ICS should take
place with certain rate (20–25°C/min) with no
admission of uncontrolled cooling by sample submerging
into liquid nitrogen after achieving the temperature of
–40°C (program 1).
The effect of increasing the indices of cell survival
when using relatively rapid cooling rates (15-20°C/min)
after overcooling withdrawal when cooling down to
the temperature –40°C (program 3) was higher than
when rising the cooling rate within the temperature
interval –40 to –70°C (program 5).
The attention should be paid to the fact that cooling
of the samples for programs 4 and 5 down to –40°C
was performed similarly with the constant rate of 1–
2°C/min to determine the dependency of cell survival
only on cooling within sub-eutectic temperature
interval. Herewith the absence of significant rise in
synthesis of testosterone secretion particularly in
response to CG when using programs 4 and 5 once
again confirms the failure of application of slow cooling
rates namely at biological system crystallization stages
(to –40°C). But a rise in the survival of HSD+-cells
when using the program 5 testifies to a need in control-
ling the rates at cooling stages lower than –40°C when
further building-up of crystal structures takes place.
Taking into account the mentioned above effect of
cooling rates at various stage of cryopreservation on
survival and steroidogenic potential of ICS for adult
rats, it would be expedient to design new cryopreser-
vation protocol. For further researches with ICS the
program 6 was used, it comprised a programmable
with drawal of overcooling, rapid in comparison with
program 1 cooling of samples within temperature
interval of biological system re-crystallization and the
one in comparison with program 4, freezing within the
range of sub-eutectic temperatures of DMSO solu-
tions.
When using program 6 there was obtained the
highest survival of HSD+-cells, 83% (Fig. 1) , which
were responsible for production of androgens. The cells
of interstitium after use of this freezing program
possessed the highest ability both to basal and sti-
mulated synthesis of testosterone (Fig. 2). The level
of testosterone in incubation medium after CG stimu-
lation was (75±6) nM/cells×1012, that makes about
70% from the control. At quite low values of total
survival (see Fig. 1) these data testify to cryoselective
должно происходить с определенной ско-ростью
(20–25°С/мин), не допуская быстрого неконтроли-
руемого охлаждения погружением образца в
жидкий азот после достижения температуры –40°С
(программа 1).
Эффект увеличения показателей сохранности
клеток при использовании относительно быстрых
скоростей охлаждения (15–20°С/мин) после снятия
переохлаждения при охлаждении до температуры
–40°С (программа 3) был выше, чем при увели-
чении скорости охлаждения в температурном
интервале –40…–70°С (программа 5).
Следует обратить внимание, что охлаждение
образцов в программах 4 и 5 до –40°С проводили
одинаково с постоянной скоростью 1–2°С/мин для
того, чтобы выделить зависимость сохранности
клеток только от охлаждения в субэвтектическом
интервале температур. При этом отсутствие значи-
тельного увеличения синтеза и секреции тесто-
стерона, особенно в ответ на стимуляцию ХГ, при
использовании программ 4 и 5 еще раз подтверж-
дает несостоятельность использования медленных
скоростей охлаждения именно на этапах кристал-
лизации биологической системы (до –40°С).
Однако увеличение сохранности ГСД+-клеток при
использовании программы 5 свидетельствует о
необходимости контроля скоростей на этапах ох-
лаждения ниже –40°С, когда происходит дальней-
шее достраивание кристаллических структур.
Учитывая вышеописанное влияние скоростей
охлаждения на различных этапах криокон-
сервирования на сохранность и стероидогенный
потенциал СКИ взрослых крыс, уместно было
разработать новый режим криоконсервирования.
При дальнейшей работе с СКИ использовали
программу 6, которая включала программное
снятие переохлаждения, быстрое, по сравнению с
программой 1, охлаждение образцов в темпера-
турном интервале кристаллизации биологической
системы и быстрое, по сравнению с программой
4, замораживание в диапазоне субэвтектических
температур растворов ДМСО.
При использовании программы 6 получена
наибольшая сохранность ГСД+-клеток – 83%
(рис. 1), которые ответственны за продукцию ан-
дрогенов. Клетки интерстиция после исполь-
зования данной программы замораживания обла-
дали наибольшей способностью как к базальному,
так и к стимулированному синтезу тестостерона
(рис. 2). Уровень тестостерона в среде инкубации
после стимуляции ХГ был (75±6) нмоль/кл×1012,
что составляет около 70% от контроля. При до-
вольно низких значениях общей сохранности (см.
рис. 1) эти данные свидетельствуют о криоселек-
тивном действии программы, направленном на
сохранение именно стероидпродуцирующих клеток
в СКИ.
401 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
action of the program, directed to preservation of
exactly steroid-producing cells in ICS.
Conclusions
1. The obtained results confirms the value of effect
of different cooling rates of biological objects and
necessity of their controlling within various temperature
intervals, namely within the one of biological system
crystallization and that for sub-eutectic temperatures
of cryoprotectants’ solution.
2. Effect of the increase of total survival and that
for HSD+-cells when using relatively rapid cooling rates
after overcooling withdrawal (program 3) was higher
than during a rise in cooling rate within sub-eutectic
temperature interval (program 5).
3. Combination of programmed withdrawal of
overcooling and rise in cooling rates within temperature
intervals of biological system crystallization up to 15-
20°C/min (program 6) resulted in significant increased
survival of HSD+-cells in ICS and their ability to basal
and stimulated synthesis and testosterone secretion.
4. The effect of cooling rates under various
temperature intervals directed to the survival of namely
steroid-producing cells in ICS of adult rats has been
demonstrated.
Выводы
1. Полученные результаты подтверждают
значение влияния различных скоростей охлаждения
биологических объектов и необходимости их
контролирования в различных температурных
интервалах, а именно в интервале кристаллизации
биологической системы и диапазоне субэвтек-
тических температур раствора криопротектора.
2. Эффект повышения общей сохранности и
сохранности ГСД+-клеток при использовании
относительно быстрых скоростей охлаждения в
интервале температур кристаллизации биологичес-
кой системы после снятия переохлаждения (прог-
рамма 3) был выше, чем при увеличении скорости
охлаждения в субэвтектическом температурном
интервале (программа 5).
3. Сочетание программного снятия переох-
лаждения и увеличения скоростей охлаждения в
интервалах температур кристаллизации биоло-
гической системы до 15-20°С/мин и субэвтек-
тическом диапазоне температур до 20-25°С/мин
(программа 6) приводило к значительному увели-
чению сохранности ГСД+-клеток в СКИ и их
способности к базальному и стимулированному
синтезу и секреции тестостерона.
4. Показано действие скоростей охлаждения в
различных температурных интервалах нап-
равленное на сохранность именно стероидпро-
дуцирующих клеток в СКИ взрослых крыс.
References
Belous A.M., Gordienko E.A., Rozanov L.F. Freezing and
cryoprotection.– Moscow: Vysshaya shkola, 1987.– 80p.
Bondarenko T.P., Saleh J. M. Abu Jajab, Bozhok G.A. etc.
Correction of hormonal status of castrated rats and those
with hypogonadism by means of allo- and xenotransplantation
of organotypic cultures.// Problemy Ekologii ta Meditsyny.–
2003.– Vol. 7, N1-2.– P. 3-7.
Water and aqueous solutions at temperatures below 0°C/
ed. by A.M. Belous, V.D. Zinchenko.– Kiev: Naukova dumka.–
1985.– 387 p.
Gurina T.M., Kirilyuk A.L., Vysekantsev I.P. Effect of
controlled cooling rates at temperatures below –30°C on
viability of cryopreserved yeasts Saccharomyces cerevisiae//
Meditsyna segodnya i zavtra.– 2008.– N.1.– P. 81-84.
Gurina T.M., Knysh O.V., Kompaniets A.M. Studying the
cooling rate effect within different temperature range on
platelet damage extent // Problems of Cryobiology.– 2007.–
Vol.17, N1.– P 16-24.
Kirpatovsky I.D., Dendeberov E.S. Allotransplantation of
cultured neonatal androgen-producing Leydig cells// Vestnik
Ros. Akad. Nauk.– 1994.– N4.– P. 42-46.
Kirpatovsky I.D., Lubyako A.A., Kirpatovsky V.I. Problem of
protection of male reproductive health// Vestnylk Reabilitatsii
Organov i Tkaney.– 2004.– N1.– P. 44-49.
Menshikov V.V. Laboratory research methods: Reference
book. – Moscow: Meditsina, 1987.– 398p.
Osetsky A.I., Kirilyuk A.L., Gurina T.M., Vysekantsev I.P.
Application of plastic strain method to determine threshold
concentrations for cryoprotective substances during
Saccharomyces cerevisiae yeast cell cryopreservation //
Problems of Cryobiology.– 2007.– Vol. 17, N1.– P. 71-79.
Saleh J. Abu Jajab. Correction of androgen function in
experimental animals by means of transplantation of native
and cryopreserved organ cultures of testes: Thesis of the
cand.biol.sci.– Kharkov, 2004.– 129 p.
Литература
Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Заморажи-
вание и криопротекция.– М.: Высш. школа, 1987.– 80 с.
Бондаренко Т.П., Салех Дж. М. Абу Жаяб, Божок Г.А. и др.
Коррекция гормонального статуса у кастрированных и
с экспериментальным гипогонадизмом крыс путем алло-
и ксенотрансплантации органотипических культур //
Пробл. екології та медицини.– 2003.– Т.7, №1-2.– С. 3-7.
Вода и водные растворы при температурах ниже 0°С/
Под общей ред. А.М. Белоуса, В.Д. Зинченко.– Киев: Наук.
думка.– 1985.– 387 с.
Гурина Т.М., Кирилюк А.Л., Высеканцев И.П. Влияние
контролируемых скоростей охлаждения при темпе-
ратурах ниже –30°С на жизнеспособность криоконсер-
вированных дрожжей Saccharomyces cerevisiae //
Медицина сегодня и завтра.– 2008.– №1.– С. 81-84.
Гуріна Т.М., Книш О.В., Компанієць А.М. Дослідження
впливу швидкості охолодження в різних температурних
інтервалах на ступінь пошкодження тромбоцитів // Пробл.
криобиологии.– 2007.– Т.17, № 1.– С. 16-24.
Кирпатовский И.Д., Дендеберов Е.С. Аллотранс-
плантация культивированных неонатальных андроген-
продуцирующих клеток Лейдига // Вестник рос.акад. мед.
наук.– 1994.– №4.– С. 42-46.
Кирпатовский И.Д., Лубяко А.А., Кирпатовский В.И.
Проблема защиты репродуктивного здоровья мужчин //
Вестник реабилитации органов и тканей.– 2004.– №1.–
С. 44-49.
Меньшиков В.В. Лaбораторные методы исследования.
Справочник.– М.: Медицина, 1987.– 398 с.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
402 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №4
Benton L., Shan L.X., Hardy M.P. Differentiation of adult Leydig
cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol.– 1995.– Vol. 53, N1-6.–
Р. 61-68.
Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing
cryopreservation of human testicular tissue: comparison of
protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide
as cryoprotectants // Hum. Reprod.– 2005.– Vol. 20, N6.–
P. 1676-1687.
Kyryliuk G.L., Osetsky A.I., Gurina T.M. Physical substan-
tiation of three-step freeze-thawing as optimal rеgimen for
changing temperature during biological system cryopreser-
vation // Procedings of the 43rd Meeting of the Society for
Cryobiology.– Hamburg, 2006.– P. 15.
Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig
cells for in vitro and in vivo studies // Horm. Metab. Res.–
1994.– Vol. 26, N3.– P. 145-147.
Accepted in 11.12.2007.
Осецкий А.И., Кирилюк А.Л., Гурина Т.М., Высеканцев И.П.
Применение метода пластической деформации для
определения пороговых концентраций криопротекторных
веществ при криоконсервировании дрожжевых клеток
Saccharomyces cerevisiae // Пробл. криобиологии.– 2007.–
Т. 17, №1.– С. 71-79.
Салех Дж. М. Абу Жаяб Коррекция андрогенной функции
у экспериментальных животных путем трансплантации
нативных и криоконсервированных органных культур
семенников: Дис. … канд. биол. наук.– Харьков, 2004.–
129 с.
Benton L., Shan L.X., Hardy M.P. Differentiation of adult Leydig
cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol.– 1995.– Vol. 53, N1-6.–
Р. 61-68.
Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing cryo-
preservation of human testicular tissue: comparison of
protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide
as cryoprotectants // Hum. Reprod.– 2005.– Vol. 20, N6.–
P. 1676-1687.
Kyryliuk G.L., Osetsky A.I., Gurina T.M. Physical substan-
tiation of three-step freeze-thawing as optimal rеgimen for
changing temperature during biological system cryopreser-
vation // Procedings of the 43rd Meeting of the Society for
Cryobiology.– Hamburg, 2006.– P. 15.
Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig
cells for in vitro and in vivo studies // Horm. Metab. Res.–
1994.– Vol. 26, N3.– P. 145-147.
Поступила 11.12.2007
11.
12.
13.
14.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
|