Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну

З метою дослідження ціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення амілоїдних фібрил вивчено спектрально люмінесцентні властивості серії моно- і триметинціанінів у вільному стані та у присутності нативного і фібрилярного модельного білка β-лактоглобуліну. Досліджено залежність між хімі...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2008
Main Authors:	Волкова, К.Д., Ковальська, В.Б., Баланда, А.О., Сломінський, Ю.Л., Толмачов, О.І., Субраманіам, В., Ярмолюк, С.М.
Format:	Article
Language:	Ukrainian
Published:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2008
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7345
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну / К.Д. Волкова, В.Б. Ковальська, А.О. Баланда, Ю.Л. Сломінський, О.І. Толмачов, В. Субраманіам, С.М. Ярмолюк // Ukrainica Bioorganica Acta. — 2008. — Т. 6, № 2. — С. 15-21. — Бібліогр.: 19 назв. — укp.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859640368569516032
author	Волкова, К.Д. Ковальська, В.Б. Баланда, А.О. Сломінський, Ю.Л. Толмачов, О.І. Субраманіам, В. Ярмолюк, С.М.
author_facet	Волкова, К.Д. Ковальська, В.Б. Баланда, А.О. Сломінський, Ю.Л. Толмачов, О.І. Субраманіам, В. Ярмолюк, С.М.
citation_txt	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну / К.Д. Волкова, В.Б. Ковальська, А.О. Баланда, Ю.Л. Сломінський, О.І. Толмачов, В. Субраманіам, С.М. Ярмолюк // Ukrainica Bioorganica Acta. — 2008. — Т. 6, № 2. — С. 15-21. — Бібліогр.: 19 назв. — укp.
collection	DSpace DC
description	З метою дослідження ціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення амілоїдних фібрил вивчено спектрально люмінесцентні властивості серії моно- і триметинціанінів у вільному стані та у присутності нативного і фібрилярного модельного білка β-лактоглобуліну. Досліджено залежність між хімічною будовою барвника та його здатністю специфічно підвищувати інтенсивність флуоресценції у присутності амілоїдних фібрил. Показано, що як для моно-, так і для триметинціанінів присутність аміногрупи в бензотіазольному гетероциклі збільшує інтенсивність флуоресценції барвників у присутності фібрил β-лактоглобуліну. З’ясовано, що введення замісників до поліметинового ланцюга триметинціанінів підвищує «чутливість» барвників до агрегованої форми β-лактоглобуліну. Триметинціаніни L-5, SH-21252 і монометинціанін Т-414 у присутності агрегованого β-лактоглобуліну демонструють істотне (до 24 разів) специфічне зростання інтенсивності флуоресценції і можуть бути запропоновані як зонди для визначення фібрилярних білків, зокрема β-лактоглобуліну. We ascertained the ability to detect fibrillar β-lactoglobulin (BLG) of a series of mono- and trimethinecyanines containing on benzothiazole heterocycles. Fluorescent properties of these dyes were studied in the unbound state and in the presence of monomeric and fibrillar BLG. The correlation between the chemical nature of the dye molecules and the ability of dyes to bind aggregated proteins was established. We found that cyanines with amino substituents in heterocycle in contrast to the corresponding unsubstituted dyes have a binding preference to fibrillar BLG and give noticeable fluorescence response in the presence of the aggregated protein. Also it was shown, that incorporation of substituents into polymethine chain of trimethinecyanines leads to the increasing of the dye/fibrillar BLG complex fluorescence intensity. The trimethinecyanines L-5, SH-21252 and monomethinecyanine Т-414 specifically increase emission (up to 24 times) in the presence of fibrillar BLG and could be proposed as probes for fluorescent detection of aggregated proteins.
first_indexed	2025-12-07T13:20:54Z
format	Article
fulltext	Вступ. Критичним етапом розвитку нейро� дегенеративних розладів, до яких належать хвороби Альцгеймера і Паркінсона, є накопи� чення в мозку людини нерозчинних агрегатів білкової природи, так званих амілоїдних фібрил. У літературі фібрили описані як довгі (~100�1000 нм) нерозгалужені філаменти. Незважаючи на те, що фібрили можуть утво� рюватися білками різного амінокислотного складу, для них характерна β�складчастість просторової структури [1�4]. Амілоїдні фібрили, як правило, визначають за допомогою флуоресцентних барвників — Тіофлавіну T [5�6] чи Конго Ред [7�9]. Ці сполу� ки специфічно підвищують інтенсивність флуо� ресценції і змінюють положення максимумів збудження та емісії у присутності фібриляр� них протеїнів. Окрім Тіофлавіну Т і Конго Ред, на сьогодні існує обмежена кількість барв� ників, які селективно розпізнають β�складчас� ті амілоїдні фібрили. Однак відомі на сьогодні флуоресцентні барвники мають певні недолі� ки, зокрема низьку відтворюваність резуль� татів (Тіофлавін Т), яка ускладнює кількісне визначення агрегованого протеїну, та низьку специфічність зв’язування з фібрилами [10]. До того ж барвник Конго Ред зв’язується не 15 Дослідження серії моно� і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β�лактоглобуліну К.Д. Волкова1, В.Б. Ковальська1, А.О. Баланда1, Ю.Л. Сломінський2, О.І. Толмачов2, В. Субраманіам3, С.М. Ярмолюк1* 1 Інститут молекулярної біології і генетики НАН України вул. Акад. Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна 2 Iнститут органiчної хiмiї НАН України вул. Мурманська, 5, Київ, 02094, Україна 3 MESA+ Інститут нанотехнологій, Університет Твенте, Нідерланди Резюме. З метою дослідження ціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення амілоїдних фібрил вивчено спектрально�люмінесцентні властивості серії моно� і триметинціанінів у вільно� му стані та у присутності нативного і фібрилярного модельного білка β�лактоглобуліну. Досліджено за� лежність між хімічною будовою барвника та його здатністю специфічно підвищувати інтенсивність флуо� ресценції у присутності амілоїдних фібрил. Показано, що як для моно�, так і для триметинціанінів при� сутність аміногрупи в бензотіазольному гетероциклі збільшує інтенсивність флуоресценції барвників у при� сутності фібрил β�лактоглобуліну. З’ясовано, що введення замісників до поліметинового ланцюга триме� тинціанінів підвищує «чутливість» барвників до агрегованої форми β�лактоглобуліну. Триметинціаніни L�5, SH�21252 і монометинціанін Т�414 у присутності агрегованого β�лактоглобуліну демонструють істотне (до 24 разів) специфічне зростання інтенсивності флуоресценції і можуть бути запропоновані як зонди для визна� чення фібрилярних білків, зокрема β�лактоглобуліну. Ключові слова: ціанінові барвники, амілоїдні білки, флуоресцентні зонди. o www.bioorganica.org.ua Ukrainica Bioorganica Acta 2 (2008) 15—21 *Corresponding author. Tel./fax: +38044�5222458 E�mail address: sergiy@yarmoluk.org.ua © К.Д. Волкова, В.Б. Ковальська, А.О. Баланда, Ю.Л. Сломінський, О.І. Толмачов, В. Субраманіам, С.М. Ярмолюк, 2008 К.Д. Волкова та ін. 16 Ukrainica Bioorganica Acta 2 (2008) лише з амілоїдними утвореннями, а й з деяки� ми мономерними α�спіральними білками [11]. Отже, існує потреба в розробці нових висо� кочутливих флуоресцентних барвників, що специфічно зв’язуються з амілоїдними утво� реннями. Такі барвники можуть бути застосо� вані для вивчення морфології та кінетики фібрилогенезу іn vitro, а в подальшому — для виявлення потенційних активаторів та інгібі� торів процесу агрегатоутворення. Деякі білки, що не пов’язані з патогенезом нейродегенеративних захворювань, також мо� жуть агрегувати, утворюючи амілоїд�подібні фібрили. До них належить білок сироватки мо� лока β�лактоглобулін (БЛГ), який за певних умов формує β�складчасті філаменти [12]. Фібрили БЛГ за властивостями й морфологією подібні до амілоїдних фібрил, які утворюються при нейродегенеративних захворюваннях, то� му агрегований БЛГ є одним із найбільш роз� повсюджених комерційно доступних модель� них білків для дослідження процесу фібрило� генезу [13]. Основним завданням нашої роботи було дослідження можливості використання низки моно� і триметинціанінових барвників для спе� цифічної флуоресцентної детекції амілоїдних фібрил. З цією метою вивчалися спектрально� люмінесцентні властивості серії моно� і триме� тинціанінових барвників похідних бензотіазо� лу у вільному стані та у присутності нативного (мономерного) і фібрилярного модельного біл� ка БЛГ. Також було досліджено залежність між хімічною будовою барвника та його здат� ністю специфічно підвищувати інтенсивність флуоресценції у присутності амілоїдних фіб� рил. Матеріали і методи. РРееааггееннттии.. HEPES, мо� номерний β�лактоглобулін, барвники ТО, РО і Тіофлавін Т було отримано із «Sigma�Aldrich» (США). Монометинціаніновий барвник L�43 синтезовано згідно з [14], Cyan�40 — згідно з [15], SH�21305 — згідно з [16]. Триметинціаніни Т�33 і Т�364 отримано відповідно до [17]. Три� метинціаніни Т�248, у ході синтезу якого було використано алкілування п�толуолсульфамі� нопохідного етиленхлоргідрином, і Т�336 одер� жано подібно до Т�364, а Т�165 — подібно до його незаміщеного у хромофор аналога [17] із застосуванням ортооцтового ефіру замість ор� томурашиного. Монометинціанін T�414 одер� жано подібно до незаміщеного аналога [14] із використанням попереднього захисту аміног� рупи тозилуванням із подальшим омиленням тозильного похідного барвника, як описано в [17]. Триметинціанінові барвники L�34, L�16, L�5, L�22 і SH�21252 синтезовано за методика� ми, наведеними у [18�19]. ССппееккттррааллььнноо��ллююммііннеессццееннттнніі ддоосслліідджжеенн�� нняя.. Для реєстрації спектрів флуоресценції та збудження флуоресценції використовували флуоресцентний спектрофотометр «Cary Ec� lipse» («Varian», Австралія). Виміри проводи� лись у кварцовій кюветі (10x10 мм). Для збу� дження флуоресценції використовували ви� промінювання ксенонової лампи (150 Вт). Дов� жину хвилі збудження флуоресценції вважа� ли рівною довжині хвилі максимуму смуги збудження флуоресценції барвника у відпо� відному розчині. Похибка визначення довжи� ни хвилі флуоресценції та збудження флуо� ресценції становила 1 нм. ООттррииммаанннняя ффііббрриилляяррннооггоо ББЛЛГГ.. Мономер� ний β�лактоглобулін розчиняли в деіонізова� ній воді (концентрація білка 790 мкМ), доводи� ли рН до 2,0, додаючи невеликі об’єми 1 М HCl, та інкубували при 80 °С за постійного перемі� шування (300 обертів на хвилину) у скляних пробірках на 500 мкл у термоміксері («Eppen� dorf»). Загальний об’єм реакційної суміші в кожній пробірці становив 500 мкл. Кожну ре� акцію агрегації здійснювали у трьох повторен� нях. Процес фібрилоутворення вважався за� вершеним, коли зі збільшенням часу інкубації інтенсивність флуоресценції Тіофлавіну Т не збільшувалася (приблизно 3 год). Наявність фібрил підтверджено методом атомної силової мікроскопії. ППррииггооттуувваанннняя ссттооккооввиихх ррооззччиинніівв.. Стокові розчини барвників (2x10�3 M) готували, розчи� няючи наважки барвників у диметилсульфок� сиді (ДМСО). Стоковий розчин мономерного БЛГ готували, розчиняючи його наважку в 10 мМ Tris�HCl буфері (pH 7,4). Концентрація мономерного і фібрилярного БЛГ у розчині становила 790 мкМ. ППррииггооттуувваанннняя ррооббооччиихх ррооззччиинніівв.. Робочі розчини барвників готували, розводячи сто� кові розчини барвників у буфері. Концент� рація барвників і БЛГ у робочих розчинах становила відповідно 5x10�6 і 7,9x10�6 M. Результати й обговорення. ССппееккттррааллььнноо�� ллююммііннеессццееннттнніі ввллаассттииввооссттіі ммооннооммееттииннццііаа�� ннііннооввиихх ббааррввннииккіівв вв ііннддииввііддууааллььннооммуу ссттаанніі ттаа уу ппррииссууттннооссттіі ББЛЛГГ.. Спектральні харак� теристики монометинціанінових барвників, що містять бензотіазольне, хінолінове і піридино� ве гетероциклічні ядра у вільному стані та у присутності мономерного та фібрилярного БЛГ, представлено в табл. 1. Флуоресцентний барвник Тіофлавін Т (Тіо�Т), що широко за� стосовується для визначення амілоїдних утво� рень, використовували для порівняння. Максимуми спектрів збудження тіа� і тіапіридомонометинціанінів у вільному стані в буфері розташовані між 400 і 447 нм. Для тіахіномонометинціанінів SH�21305 і TO мак� симуми λзбф знаходились у межах 470�500 нм. Для всіх цих барвників максимуми спектрів емісії розміщені між 470�558 нм. Для більшості барвників у вільному стані спостерігали низькі значення інтенсивності флуоресценції (І0) — 0,66�7,2 у.о. (табл. 1). Для симетричного бензотіазольного барвника L�43 інтенсивність емісії (І0~34 у.о.) була дещо ви� щою, ніж для решти барвників. Максимуми збудження та флуоресценції монометинціанінів у присутності мономерного БЛГ залишалися незмінними чи зсувались у довгохвильову область спектра на 2�10 нм відносно відповідних максимумів вільних барвників у буфері. У присутності мономерного БЛГ інтен� Дослідження серії моно� і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів 17www.bioorganica.org.ua Таблиця 1 Спектральні характеристики монометинціанінових барвників у вільному стані та у присутності β�лактоглобуліну Вільний барвник БЛГ [M] БЛГ [Ф] Барвник Структура �збф, нм �ем, нм І0 �ем, нм IМ, у.о. �ем, нм IФ, у.о. IФ/IМ L�43 N S N + S O S O OO 400 478 34,4 475 37 472 139 3,8 T�414 N S N + S N I 438 520 3,3 525 7,4 532 114 16,4 PO I N N + S 447 475 1,43 475 2,56 475 32,5 12,7 Cyan 40 N N + S O Cl O OO 440 470 7,24 470 12,2 470 81 6,64 SH�21305 I NN + S 470 558 0,66 560 2,04 554 21,4 9,7 TO S O O O N N + S 500 530 1,08 530 5,7 535 40,5 7,1 Тіо�Т Cl N + S N 442 480 1,2 479 3,3 479 23,8 7,2 Примітки: λзбф (λем) — максимум збудження флуоресценції (максимум емісії) барвника; І0 — інтен� сивність флуоресценції барвника в буфері; IМ (IФ) — інтенсивність флуоресценції барвника у при� сутності мономерного (фібрилярного) білка; IФ/IМ — співвідношення значення інтенсивності емісії барвника у присутності фібрилярного БЛГ до значення інтенсивності емісії у присутності моно� мерного білка. сивність флуоресценції більшості мономе� тинціанінів змінювалася незначно чи зростала до 3,1 раза. Для барвника ТО таке підвищення було дещо більшим (до ~5,3 раза), ніж для інших монометинціанінів. У процесі додавання агрегованого у фібри� ли БЛГ положення λзбф і λем залишалися незмінними чи зсувалися у довгохвильову об� ласть спектра до 16 нм, відносно до макси� мумів у присутності мономерного білка. Для бензотіазольного барвника L�43 положення максимуму збудження флуоресценції бато� хромно зсувалося на 29 нм у порівнянні з мо� номерним білком. Виняток становив мономе� тинціанін SH�21305, для якого спостерігали зсув максимумів збудження і флуоресценції в К.Д. Волкова та ін. 18 Ukrainica Bioorganica Acta 2 (2008) Таблиця 2 Спектрально�люмінесцентні властивості триметинціанінових барвників у вільному стані та у присутності β�лактоглобуліну Вільний барвник БЛГ [M] БЛГ [Ф] Барвник Структура �збф, нм �ем, нм І0 �ем, нм IМ, у.о. �ем, нм IФ, у.о. IФ/IМ L�34 I N + N SS 554 569 420 569 377 569 320 0,85 Т�364 N + N SS NN Br 582 629 18 628 9 653 49 5,4 Т�248 N + N SS NN OO I 564 578 54 578 50 578 49 1 Т�33 N + N SS NN I 594 654 13 660 19 663 30 2 L�16 I N + N SS F F F 586 595 0,5 593 3 593 29 9,7 L�5 I N + N SS O 554 565 5 574 6,3 574 103 23 T�336 N + N SS NN I 579 623 4 632 10 640 150 15 T�165 N + N SSN N I 581 624 1 634 6,2 636 86 14 L�22 I N N + S 640 653 0,5 659 4,5 665 44 7,9 SH� 21252 Br N + N SS 591 642 4,2 644 6,9 641 168 24,3 короткохвильовий регіон на 9 і 6 нм відповідно у присутності фібрил БЛГ. При додаванні фібрилярного БЛГ відмічено підвищення інтенсивності флуоресценції май� же всіх монометинових барвників у 11�38 разів. Лише для симетричного бензотіазольно� го барвника L�43 значення ІФ/І0~4. Найбільше збільшення інтенсивності емісії у присутності фібрилярного білка (ІФ/І0~32�38) продемон� стрували тіахіномонометинціаніни ТО і SH� 21305, а особливо барвник — похідний бен� зотіазолу Т�414, що містить аміногрупу в 6�му положенні гетероциклу. Майже для всіх ціа� нінів у присутності фібрил інтенсивність флу� оресценції була вищою (~32,5�139 у.о.), ніж для Тіо�Т (~24 у.о.). У більшості in vitro досліджень процесу фібрилоутворення, наприклад, у процесі моні� торингу кінетики агрегації амілоїдних білків, важливим є кількісне визначення утворених фібрил по відношенню до білка, що залишився у мономерній формі. Саме завдяки цьому зонди, що також флуоресціюють у присутності неагре� гованого білка, є непридатними для специфічно� го визначення фібрил. Тому для оцінювання по� тенційної можливості використання барвника для специфічного визначення фібрилярного БЛГ in vitro нами використано співвідношення IФ/IМ, що є показником збільшення інтенсив� ності емісії барвника у присутності фібрил по відношенню до неагрегованого білка. Для бензотіазольного монометинціаніну L� 43 співвідношення ІФ/Ім було вдвічі нижчим, ніж для Тіо�Т (відповідно ~3,8 і ~7,2). Уведення в молекулу барвника аміногрупи в 6�те поло� ження гетероциклу (Т�414) збільшує «чутли� вість» барвника до фібрилярного білка у порів� нянні з незаміщеним L�43 (ІФ/Ім — відповідно ~16,4 і ~3,8 ). Несиметричні тіамонометинціаніни, що міс� тили піридинове (РО, Cyan 40) чи хінолінове (SH�21305, ТО) ядра, демонстрували значення ІФ/Ім (від ~7 до ~12,7) вищі, ніж симетричний бензотіазольний барвник L�43. Для тіапіридомонометинціаніну РО спосте� рігали досить високе значення ІФ/Ім — 12,7, то� ді як присутність у піридиновому ядрі метиль� них замісників (Cyan 40) призводила до зни� ження величини ІФ/Ім майже вдвічі (до 6,6 ра� за). Для несиметричних барвників, які, окрім бензотіазольного, містили хіноліновий�2 (SН� 21305) чи хіноліновий�4 залишки (ТО), значен� ня ІФ/Ім були близькими (у межах 7�9,7). ССппееккттррааллььнноо��ллююммііннеессццееннттнніі ххааррааккттееррии�� ссттииккии ттррииммееттииннццііааннііннооввиихх ббааррввннииккіівв вв іінн�� ддииввііддууааллььннооммуу ссттаанніі ттаа уу ппррииссууттннооссттіі ББЛЛГГ.. Спектральні характеристики триметинціані� нових барвників в індивідуальному стані та у присутності мономерного і фібрилярного БЛГ представлено в табл. 2. Для більшості триметинціанінів у вільному стані максимуми збудження емісії спостеріга� ли в діапазоні від 554 до 640 нм. Максимуми флуоресценції для них були розташовані між 569 і 654 нм. Для більшості триметинціаніно� вих барвників інтенсивність флуоресценції у вільному стані була низькою (І0 ~0,5�5 у.о.) чи помірною (І0 ~13�54 у.о. для Т�33, Т�364 і Т�248). Найбільш високе значення інтенсивності ви� промінювання спостерігалося для незаміще� ного триметинціаніну L�34 (І0 ~420 у.о). При додаванні мономерного БЛГ максиму� ми збудження та флуоресценції барвників за� лишалися незмінними чи зсувалися до 5 нм відносно відповідних максимумів у буфері. Ви� няток становив триметинціанін Т�165, для якого положення λзбф було зсунутим на 24 нм. Значення Ім для більшості триметинціанінів були близькими до інтенсивності їх флуорес� ценції у вільному стані. Для барвників, що містили метильні замісники в поліметиновому ланцюзі (T�336, T�165 і L�22), у присутності мономерного БЛГ інтенсивність зростала у 2,5�4,5 раза. У присутності фібрилярного БЛГ положен� ня максимумів спектрів збудження та флуо� ресценції для триметинціанінів L�34, Т�284, L�16 і SH�21252 незначно змінювалися у порівнянні з мономерним білком. Для барв� ників із метиламінними замісниками в гетеро� залишках (Т�364 і Т�336) під час додавання аг� регованого білка положення λзбф зсувалися на 45 і 34 нм, λем — відповідно на 24 і 17 нм. Для інших барвників максимуми збудження та флуоресценції зсунуті в довгохвильовий регі� он до 15 нм. У присутності фібрилярного БЛГ інтен� сивність флуоресценції триметинціанінів без замісників у поліметиновому ланцюзі зроста� ла незначно (до 2,7 раза) або навіть знижува� Дослідження серії моно� і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів 19www.bioorganica.org.ua лася (L�34). Окрім того, значення ІФ/Ім для цих барвників були низькими (у межах від ~1 до ~2,7), що свідчить про неефективність викори� стання цих сполук для специфічного визна� чення агрегованого у фібрили БЛГ. Для всіх мезо�заміщених барвників у при� сутності агрегованого білка спостерігалося зростання інтенсивності флуоресценції у 20� 88 разів по відношенню до вільних барвників, а значення ІФ були вищими (~29�168 у.о.), ніж для Тіо�Т (~24 у.о.). Барвник Т�336 із 6,6’�метиламіно замісни� ками демонстрував високе значення ІФ/Ім — ~15. Для барвника Т�165 із 5,5’�диметиламіно замісниками підвищення інтенсивності флуо� ресценції у присутності фібрил БЛГ було близьким до Т�336 (ІФ/Ім ~14). Обидва барвники з об’ємними замісниками в поліметиновому ланцюзі демонстрували ви� сокі значення ІФ/Ім: ~9,7 (мезо�трифторметил� заміщений L�16) і ~23 (феноксиметилзаміще� ний L�5). Значне підвищення інтенсивності флуоресценції барвника L�5 у присутності аг� регованого білка дає змогу припустити, що на� явність феноксиметильного замісника в полі� метиновому ланцюзі сприяє специфічній вза� ємодії барвник/фібрила БЛГ. Для тіахінокарбоціаніну L�22 підвищення інтенсивності емісії в присутності фібрилярно� го БЛГ було близьким до Тіо�Т (~7,9). Для іншого несиметричного барвника SH�21252, що містить залишки бензотіазолу і 4,5�бензо� бензотіазолу (нафтотіазолу), значення ІФ/Ім було найбільшим серед усіх триметинціанінів і в кілька разів перевищувало відповідний по� казник для Тіо�Т (~24,3). Висновки. Досліджено спектрально�люмі� несцентні властивості серії моно� і триметин� ціанінових барвників у присутності нативного та фібрилярного β�лактоглобуліну. Як для моно�, так і для триметинціанінів показано, що присутність аміногрупи у 5� чи 6�му положенні бензотіазольного гетероциклу збільшує інтенсивність флуоресценції барв� ників у присутності фібрил β�лактоглобуліну. Уведення до поліметинового ланцюга три� метинціанінів метильних, трифторметильних і феноксиметильних мезо�замісників збільшує «чутливість» барвників до агрегованої форми β�лактоглобуліну. Триметинціаніни L�5, SH�21252 і мономе� тинціанін Т�414 у присутності агрегованого БЛГ демонструють істотне (до 24 разів) спе� цифічне зростання інтенсивності флуорес� ценції. Інтенсивність випромінювання цих барвників у комплексах із фібрилярним БЛГ є значно вищою, ніж для Тіо�Т. Таким чином, ці барвники можуть бути запропоновані як висо� кочутливі зонди для визначення фібрилярних білків, зокрема β�лактоглобуліну. Робота виконана за підтримки Міжнарод� ного наукового фонду УНТЦ (грант № 4936). Надійшла в редакцію 19.09.2008 р. К.Д. Волкова та ін. 20 Ukrainica Bioorganica Acta 2 (2008) 400 450 500 550 600 650 700 0 20 40 60 80 100 120 , . . , -414 ( ) -414 ( ) + [M] ( ) + [M] ( ) + [ ] ( ) + [ ] ( ) 580 600 620 640 660 680 700 720 740 0 5 10 15 20 25 SH-21252 + , . . , Рис. 1. Спектри флуоресценції барвника T�414 у вільному стані та у присутності мономерного і фібрилярного БЛГ. Рис. 2. Спектри флуоресценції барвника SH� 21252 у вільному стані та у присутності фібрилярного БЛГ. Дослідження серії моно� і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів 21www.bioorganica.org.ua Studies of mono� and trimethine cyanine dyes as specific fluorescent probes for fibrillar ββ�lactoglobulin detection K.D. Volkova1, V.B. Kovalska1, A.O. Balanda1, Yu.L. Slominskii2, O.I. Tolmachev2, V. Subramaniam3 and S.M. Yarmoluk1 1 Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine 150 Zabolotnogo Str., Kyiv, 03143, Ukraine 2 Institute of Organic Chemistry, NAS of Ukraine 5 Murmanska Str., Kyiv, 02660, Ukraine 3 MESA+ Institute for Nanotechnology, Biophysical Engineering Group, University of Twente, The Netherlands Summary. We ascertained the ability to detect fibrillar β�lactoglobulin (BLG) of a series of mono� and trime� thinecyanines containing on benzothiazole heterocycles. Fluorescent properties of these dyes were studied in the unbound state and in the presence of monomeric and fibrillar BLG. The correlation between the chemical nature of the dye molecules and the ability of dyes to bind aggregated proteins was established. We found that cyanines with amino substituents in heterocycle in contrast to the corresponding unsubstituted dyes have a binding preference to fibrillar BLG and give noticeable fluorescence response in the presence of the aggregated protein. Also it was shown, that incorporation of substituents into polymethine chain of trimethinecyanines leads to the increasing of the dye/fibrillar BLG complex fluorescence intensity. The trimethinecyanines L�5, SH�21252 and monomethinecyanine Т�414 specifi� cally increase emission (up to 24 times) in the presence of fibrillar BLG and could be proposed as probes for fluorescent detection of aggregated proteins. Keywords: cyanine dyes, amyloid proteins, fluorescent detection. 1. Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96. — P. 3590�3594. 2. West M.W., Wang W., Patterson J., Mancias J.D., Beasley J.R., Hecht M.H. De novo amyloid proteins from designed combinatorial libraries // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96. — P. 11211�11216. 3. Prusiner S.B. Prion diseases and the BSE crisis // Science. — 1997. — Vol. 278. — P. 245�251. 4. Kelly J.F. Amyloid fibril formation and protein misassembly: a structural quest for insights into amyloid and prion diseases // Structure. — 1997. — Vol. 5. — P. 595�600. 5. Naiki H., Higuchi K., Hosokawa M. and Takeda T. Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1 // Anal. Bio� chem. — 1989. — Vol. 177. — P. 244�249. 6. LeVine H. 3rd. Thioflavine T interaction with syn� thetic Alzheimer’s disease beta�amyloid peptides: de� tection of amyloid aggregation in solution // Protein Sci. — 1993. — Vol. 2. — P. 404�410. 7. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quan� titative evaluation of Congo Red binding to amyloid�like proteins with a beta�pleated sheet conformation // J. Histochem. Cytochem. — 1989. — Vol. 37. — P. 1273� 1281. 8. Westermark G.T., Johnson K.H., Westermark P. Staining methods for identification of amyloid in tissue // Methods Enzymol. — 1999. — Vol. 309. — P. 3�25. 9. Glenner G.G., Page D.L. and Eanes E.D. The rela� tion of the properties of congo red�stained amyloid fib� rils to the β�conformation // J. Histochem. Cytochem. — 1972. — Vol. 20. — P. 821�826. 10. Murakami K., Irie K., Morimoto A., Ohigashi H., Shindo M., Nagao M., Shimizu T. and Shirasawa T. Neurotoxicity and physicochemical properties of Abeta mutant peptides from cerebral amyloid angiopathy: implication for the pathogenesis of cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. — P. 46179�46187. 11. Khurana R., Uversky V.N., Nielsen L., Fink A.L. Is Congo red an amyloid�specific dye? // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276. — P. 22715�22721. 12. Arnaudov L.N., de Vries R., Ippel H., van Mierlo C.P. Multiple steps during the formation of beta�lactoglobu� lin fibrils // Biomacromolecules. — 2003. — Vol. 4. — P. 1614�1622. 13. Bromley E.H.C., Krebs M.R.H. and Donald A.M. Aggregation across the length�scales in beta�lactoglobu� lin // Faraday Discuss. — 2005. — Vol. 128. — P. 13�27. 14. Киприанов А.И., Ушенко И.К. Цвет органичес� ких красителей и планарность их молекулы. І // ЖОХ. — 1950. — Т. 20. — С. 134�144. 15. Kelemen J., Wizinger R. Uber alkylsubstituirte pyrylo� und pyridino�cyanine. I. 2,6�dimethylpyrylo� und 2,6�dimethylpyridino�cyanine aus 2,6�dimethylpyron // Helv. Chim. Acta. — 1962. — Vol. 45. — P. 1908�1917. 16. Hamer F.M. XXXI. The ψ сyanine сondensation // J. Chem. Soc. — 1928. — P. 206�215. 17. Кіпріанов А.І., Сич К.Д. Будова і зафарблення ціанінових барвників. Амінотіаціаніни // Записки Інституту хімії Академії наук УРСР. — 1946. — Т. 8. — С. 104�128. 18. Лукашов С.С., Kачковський Г.О., Лосицький М.Ю., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нук� леїновими кислотами. 22. Карбоціанінові барвники, заміщені в поліметиновому ланцюзі, як можливі зонди для флуоресцентної детекції нуклеїнових кислот // Біополімери і клітина. — 2001. — T. 17. — C. 242�248. 19. Лукашов С.С., Маковенко І.Є., Сломінський Ю.Л., Ярмолюк С.М. Взаємодія ціанінових барвників з нук� леїновими кислотами. Мезо�метилзаміщені триме� тинціанінові барвники як можливі зонди для флуорес� центної детекції нуклеїнових кислот // Біополімери і клітина. — 2001. — T. 17. — C. 448�454. Перелік літератури
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-7345
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	1814-9758
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-07T13:20:54Z
publishDate	2008
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
record_format	dspace
spelling	Волкова, К.Д. Ковальська, В.Б. Баланда, А.О. Сломінський, Ю.Л. Толмачов, О.І. Субраманіам, В. Ярмолюк, С.М. 2010-03-29T11:07:08Z 2010-03-29T11:07:08Z 2008 Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну / К.Д. Волкова, В.Б. Ковальська, А.О. Баланда, Ю.Л. Сломінський, О.І. Толмачов, В. Субраманіам, С.М. Ярмолюк // Ukrainica Bioorganica Acta. — 2008. — Т. 6, № 2. — С. 15-21. — Бібліогр.: 19 назв. — укp. 1814-9758 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7345 З метою дослідження ціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення амілоїдних фібрил вивчено спектрально люмінесцентні властивості серії моно- і триметинціанінів у вільному стані та у присутності нативного і фібрилярного модельного білка β-лактоглобуліну. Досліджено залежність між хімічною будовою барвника та його здатністю специфічно підвищувати інтенсивність флуоресценції у присутності амілоїдних фібрил. Показано, що як для моно-, так і для триметинціанінів присутність аміногрупи в бензотіазольному гетероциклі збільшує інтенсивність флуоресценції барвників у присутності фібрил β-лактоглобуліну. З’ясовано, що введення замісників до поліметинового ланцюга триметинціанінів підвищує «чутливість» барвників до агрегованої форми β-лактоглобуліну. Триметинціаніни L-5, SH-21252 і монометинціанін Т-414 у присутності агрегованого β-лактоглобуліну демонструють істотне (до 24 разів) специфічне зростання інтенсивності флуоресценції і можуть бути запропоновані як зонди для визначення фібрилярних білків, зокрема β-лактоглобуліну. We ascertained the ability to detect fibrillar β-lactoglobulin (BLG) of a series of mono- and trimethinecyanines containing on benzothiazole heterocycles. Fluorescent properties of these dyes were studied in the unbound state and in the presence of monomeric and fibrillar BLG. The correlation between the chemical nature of the dye molecules and the ability of dyes to bind aggregated proteins was established. We found that cyanines with amino substituents in heterocycle in contrast to the corresponding unsubstituted dyes have a binding preference to fibrillar BLG and give noticeable fluorescence response in the presence of the aggregated protein. Also it was shown, that incorporation of substituents into polymethine chain of trimethinecyanines leads to the increasing of the dye/fibrillar BLG complex fluorescence intensity. The trimethinecyanines L-5, SH-21252 and monomethinecyanine Т-414 specifically increase emission (up to 24 times) in the presence of fibrillar BLG and could be proposed as probes for fluorescent detection of aggregated proteins. uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну Studies of mono- and trimethine cyanine dyes as specific fluorescent probes for fibrillar β-lactoglobulin detection Article published earlier
spellingShingle	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну Волкова, К.Д. Ковальська, В.Б. Баланда, А.О. Сломінський, Ю.Л. Толмачов, О.І. Субраманіам, В. Ярмолюк, С.М.
title	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну
title_alt	Studies of mono- and trimethine cyanine dyes as specific fluorescent probes for fibrillar β-lactoglobulin detection
title_full	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну
title_fullStr	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну
title_full_unstemmed	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну
title_short	Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну
title_sort	дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7345
work_keys_str_mv	AT volkovakd doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT kovalʹsʹkavb doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT balandaao doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT slomínsʹkiiûl doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT tolmačovoí doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT subramaníamv doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT ârmolûksm doslídžennâseríímonoítrimetincíanínovihbarvnikívâkfluorescentnihzondívdlâviznačennâfíbrilârnogoβlaktoglobulínu AT volkovakd studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection AT kovalʹsʹkavb studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection AT balandaao studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection AT slomínsʹkiiûl studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection AT tolmačovoí studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection AT subramaníamv studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection AT ârmolûksm studiesofmonoandtrimethinecyaninedyesasspecificfluorescentprobesforfibrillarβlactoglobulindetection

Дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного β-лактоглобуліну

Institution

Similar Items