Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a
Транскрипційні фактори родини STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)
 є ключовими регуляторами експресії генів стимульованих цитокінами, що впливають на різні клітинні процеси. Транскрипційний фактор STAT5a опосередковує
 стимуляцію клітинного росту, проліферації та...
Saved in:
| Published in: | Праці наукового товариства ім. Шевченка |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Західний науковий центр НАН України і МОН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/74473 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a / А. Цирульник, В. Снітинський, Р. Стойка // Праці Наукового товариства ім. Шевченка. — Л., 2010. — Т. XXV: Хемія і біохемія. — С. 243-249. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860081936946429952 |
|---|---|
| author | Цирульник, А. Снітинський, В. Стойка, Р. |
| author_facet | Цирульник, А. Снітинський, В. Стойка, Р. |
| citation_txt | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a / А. Цирульник, В. Снітинський, Р. Стойка // Праці Наукового товариства ім. Шевченка. — Л., 2010. — Т. XXV: Хемія і біохемія. — С. 243-249. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Праці наукового товариства ім. Шевченка |
| description | Транскрипційні фактори родини STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)
є ключовими регуляторами експресії генів стимульованих цитокінами, що впливають на різні клітинні процеси. Транскрипційний фактор STAT5a опосередковує
стимуляцію клітинного росту, проліферації та ангіогенезу. Сучасні дослідження
біологічної ролі білків STAT проводять шляхом створення експериментальних моделей мишей, що містять у геномі штучно синтезовані та модифіковані форми генів
відповідних транскрипційних факторів. Метою даної роботи був синтез модифікованого гена STAT5a. Введення цього гена у геном миші дозволяє моделювати процеси активації STAT5a in vivo та досліджувати його роль у забезпеченні патологічних
змін в організмі.
Ключові слова: синтез ДНК, транскрипційні фактори STAT, модифікація генів.
Cytokines are small secreted proteins which mediate cell growth, proliferation, survival and apoptosis.
They are crucial regulators of immunity and hematopoiesis. Cytokines generally act at very low concentration
and short time spans. The JAK-STAT signaling pathway is one of the most important mechanisms of cell
response to the cytokines. Binding of cytokine to the specific membrane receptor on the cell activates the JAK
(Janus Kinase) kinase which adds a phosphate group to the STAT (Signal Transducer and Activator of
Transcription) proteins. After posphorylation, STAT proteins form via their SH2 domain the active dimers.
The dimers move into the cell nucleus via importin a/b and RanGDP complex and bind to DNA-recognition
region called gamma activated sites (GAS) in the promoter region of cytokine inducible genes and activates
transcription of these genes. Then, nuclear phosphatases dephosphorylate the STATs which leads to their
inactivation and transportation from the nucleus by exportin crm1/RanGTP complex. There are seven members
of STAT protein family: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a STAT5b and STAT6. STAT1 and STAT2
become activated in response to the interferons and can form the homodimers or heterodimers with other
STATs. STAT3 is activated by interleukin 5, interleukin-6, hepatocyte growth factor, interferons, epidermal
growth factor and leukemia inhibitory factor (LIF). STAT3 regulates cell growth and apoptosis. Since it has
anti-apoptotic and proliferative effects, hyperactivation of this transcription factor is associated with various
tumors, such as chronic lymphocytic leukemia, Burkitt's lymphoma, cutaneous T cell lymphoma, Hodgkin
desease, malignant melanoma, lung cancer, prostate carcinoma and renal cell carcinoma. STAT4 and STAT6
become phosphorylated in response to interleukin-4 and interleukin-12, respectively. They are involved in
regulation of immune response and lymphocyte activation. The transcription factor STAT5b is activated by
interleukin 2, interleikin 4 and CSF1. It mediates apoptosis, TCR signaling and liver gene expression. Our
studies we focused on STAT5a, since it plays a crutial role in basic cell functions, like cell growth,
proliferation, angiogenesis and additionally, serves as powerful anti-apoptotic factor through activation of
BCL2L1/BCL-X(L) expression in the cell. JAK kinase phosphorylates STAT5a in response to interleukin 2,
interleukin 3, interleukin 7 GM-CSF, erythropoietin and thrombopoietin. The high level of activated STAT5a
was found in erythroleukemia, acute lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic
myelogenous leukemia, megakaryocytic leukemia, sezary syndrome, anaplastic large T cell lymphoma, B cell
lymphoma, head and neck cancer, cerebral menangiomas, neuroendocrine tumors, pancreatic carcinoma,
ovarian carcinoma and colon cancer. Detection of hyperactivated STAT5a protein serves as one of the
diagnotic markers of these tumors. Investigation of the role of STAT5a in tumor development is a very
perspective direction of biology and medicine since it can help in designing a new effective diagnotic and
therapeutic approaches. Modern investigations of the biological role of STATs in tumor formation are mainly
performed by generation of transgenic animal models with modified genes of appropriate transcription factor.
The main goal of this work was to synthesize modified STAT5a gene. We used classic methods for DNA
synthesis and purification including polymerase chain reaction, site direct mutagenesis and electrophoresis in
agarose gele. The cloning was performed with using various endonucleases and T4-ligase. All steps of DNA
synthesis and cloning were analyzed by DNA sequencing. We also tested functional activity of modified
STAT5a by transformation of NIH 3T3 cells. Our data confirmed synthesis of the modified STAT5a gene. The protein of this gene is expressed at high level and possesses a specific DNA binding activity. Introduction of
modified gene of STAT5a into mouse genome allows to modulate the process of STAT5a hyperactivation in
vivo and to investigate the role of this transcription factor in the mechanisms of tumor development.
Key words: DNA syntesis, STAT transcription factors, gene modification
Транскрипционные факторы семейства STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)
являются ключевыми регуляторами експрессии генов, стимулированных цитокинами, влияющими на
разные клеточные процессы. Транскрипционный фактор STAT5a способствует стимуляции клеточного
роста, пролиферации и ангиогенезу. Современные исследования биологической роли белков STAT проводят с использованием експериментальных мышиных моделей, имеющих в составе своего генома
искусственно синтезированные и модифицированные гены транскрипционных факторов. Целью данной работы был синтез модифицированного гена STAT5a. Введение этого гена в геном мыши позволит
моделировать процесс активации STAT5a in vivo и проводить исследование его роли в процессах развития патологических процессов в организме.
Ключевые слова: синтез ДНК, транскрипционные факторы STAT, модификация генов.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:17:09Z |
| format | Article |
| fulltext |
Праці НТШ
Хем. Біохем. 2010. Т. 25. C. 243–249
Proc. Sevchenko Sci. Soc.
Chem. Biochem. 2010. Vol. 25. P. 243–249
УДК 577.113
Андрій ЦИРУЛЬНИК1, Володимир СНІТИНСЬКИЙ1, Ростислав СТОЙКА2†
СИНТЕЗ МОДИФІКОВАНОГО ГЕНА ТРАНСКРИПЦІЙНОГО
ФАКТОРА STAT5A
1Львівський Національний Аграрний Університет,
вул. В.Великого, 1, 80381 Львів-Дубляни, Україна
2Інститут Біології Клітини Національної Академії Наук України,
вул. Драгоманова, 14/16, 79005 Львів, Україна
e-mail: stoika@cellbiol.lviv.ua
Транскрипційні фактори родини STAT (Signal Transducer and Activator of Transcrip-
tion) є ключовими регуляторами експресії генів стимульованих цитокінами, що впли-
вають на різні клітинні процеси. Транскрипційний фактор STAT5a опосередковує
стимуляцію клітинного росту, проліферації та ангіогенезу. Сучасні дослідження
біологічної ролі білків STAT проводять шляхом створення експериментальних моде-
лей мишей, що містять у геномі штучно синтезовані та модифіковані форми генів
відповідних транскрипційних факторів. Метою даної роботи був синтез модифіко-
ваного гена STAT5a. Введення цього гена у геном миші дозволяє моделювати проце-
си активації STAT5a in vivo та досліджувати його роль у забезпеченні патологічних
змін в організмі.
Ключові слова: синтез ДНК, транскрипційні фактори STAT, модифікація генів.
Дослідження біохімічних процесів, що лежать в основі росту, поділу, диферен-
ціації та загибелі клітини є актуальним напрямком сучасної біології. Ключовими
внутрішніми регуляторами цих процесів є транскрипційні фактори родини STAT
(Signal Transducers and Activator of Transcription), що забезпечують регуляцію та-
ких процесів на генетичному рівні [1, 2, 3].
Відомо 7 білків родини STAT: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5а,
STAT5b та STAT6. Ці транскрипційні фактори містяться у цитоплазмі клітини у
неактивній формі. Ряд цитокінів, таких як ІL2, IL3, IL5, IL6, IL7, BMP2I, GM-CSF,
IFNs, EGF, HGF, LIF, зв’язуючись із специфічними клітинними рецепторами, акти-
вують JAK протеїнкіназу (Janus Kinase), яка активує білки STAT шляхом фосфор-
рилювання. Після активації білки STAT утворюють димери і транспортуються у
ядро, де вони зв’язуюються із специфічними ділянками ДНК і регулюють експре-
†Кореспондуючий автор: stoika@cellbiol.lviv.ua
mailto:stoika@cellbiol.lviv.ua
mailto:stoika@cellbiol.lviv.ua
244 АНДРІЙ ЦИРУЛЬНИК, ВОЛОДИМИР СНІТИНСЬКИЙ, РОСТИСЛАВ СТОЙКА
сію певних генів. Деактивація білків STAT у ядрі відбувається шляхом їх дефосфо-
рилювання, після чого вони видаляються із ядра [4, 5].
Порушення процесів фосфорилювання та дефосфорилювання білків STAT
впливає на різні біологічні процеси на усіх організаційних рівнях [6, 7].
Встановлено, що при таких типах онкологічних захворювань як лейкемія, рак
легені і печінки, трансформовані клітини містять конститутивно активну форму
транскрипційного фактору STAT5a [8, 9, 10]. Гіперактивація STAT5a забезпечує
стимуляцію росту і проліферації пухлинних клітин, активує ангіогенез пухлин і діє
як імуносупресорний чинник. Виявлення конститутивно активної форми STAT5a в
онкохворих вказує на важкість захворювання і підвищений ризик для цих хворих.
Дослідження механізмів розвитку захворювань, що виникають за умов викли-
каних гіперактивації білків STAT, у більшості випадків проводяться шляхом ство-
рення експериментальних моделей трансгенних мишей, які містять у геномі штуч-
но синтезовані конститутивно активні форми генів відповідних транс крипційних
факторів [11, 12, 13]. Синтез конститутивно активної форми гена STAT5a та його
введення в у геном миші дозволяє створити ефективну модель in vivo для вивчення
ролі цього транскрипційного фактора у розвитку різних патологічних процесів.
Метою роботи був синтез фрагменту ДНК, що містить конститутивно активну
форму гена STAT5a (саSTAT5a) і гена поверхневого маркера CD2. Введення штуч-
но створеної ДНК у геном миші дозволяє моделювати процес гіперактивації
STAT5a in vivo і досліджувати індуковані зміни біологічних процесів.
Синтез конститутивно активної форми STAT5a
Синтезовано конститутивно активну форму гена транскрипційного фактора
STAT5a. Встановлено, що його білковий продукт із заміною залишка серину на
фенілаланін ((Ser711→Phe711) володіє конститутивною активністю і забезпечує
стимулювання клітинного росту та проліферації за відсутності дії цитокінів [14].
Для експресування in vivo конститутивно активної форми білка STAT5a було
синтезовано ген цього транскрипційного фактора із заміною відповідної нуклео-
тидної послідовності (TCC→TTC/Ser→Phe711). Синтез ДНК був проведений із
використанням класичних методик (Site-Directed Mutagenesis/QuikChange Site-
Directed Mutagenesis Kit та Polymerase Chain Reaction/Fermentas High Fidelity PCR
Kit). Для ефективної транскрипції гена STAT5a, а також зв’язування мРНК із рибо-
сомою і трансляції білкової молекули, перед СТАРТ-кодоном (ATG) цього гена
введено послідовність 5′-UTR гена β-глобіну (GACTCACAACCCCAGAAACA) і
оптимальну послідовність KOZAK (ССАСС) (рис. 1).
Синтез допоміжних генетичних елементів IRES, CD2, PolyA
На наступному етапі було синтезовано та влючено допоміжні генетичні еле-
менти IRES, CD2, PolyA та гена резистентності у плазміду-носій PMSCV-типу.
Послідовність IRES забезпечує експресію гена поверхневого маркера CD2 а послі-
довність PolyA необхідна для завершення зчитування фрагмента ДНК [15]. Ген
резистентності до ампіциліну дозволяє проводити селекцію клітин, трансформова-
них модифікованою ДНК. Фрагменти ДНК синтезували із використанням специ-
фічних олігонуклеотидів і клонували у плазміду використовуючи класичні методи.
Одержані фрагменти ДНК було додатково очищено за допомогою електрофорезу у
агарозному гелі. Для введення цих фрагментів у плазміду проведено лігацію із
використанням Т4-лігази. Синтезований фрагмент містить специфічний сайт роз-
СИНТЕЗ МОДИФІКОВАНОГО ГЕНА ТРАНСКРИПЦІЙНОГО ФАКТОРА STAT5a 245
щеплення ендонулеазою BamHI. Це дозволило швидко проводити пошук і біотес-
тування позитивних бактерійних колоній за допомогою розщеплення створеної
плазміди цією ендонуклеазою. Виявлено чотири колонії бактерій, що містили
модифіковану плазміду (рис. 2).
Рис. 1. Синтез конститутивно активної форми гена STAT5a, із заміною нуклеотидної
послідовності (TCC→TTC/Ser→Phe711). Зміну у нуклеотидній послідовності гена STAT5a
та ампліфікацію його модифікованої форми проведено класичними методами (Site-Directed
Mutagenesis та Polymerаse Сhain Reaction). Одержаний ДНК (1) продукт очищено
ектрофорезом у гелі агарози.
Рис. 2. Модифікована плазміда PMSCV, що містить допоміжні генетичні елементи IRES-
CD2–PolyA та ген резистентності до ампіциліну. Аналіз проведено шляхом розщеплення
ДНК ендонуклеазою BamHI та електрофорезу одержаних фрагментів у гелі агарози
(стрілками вказано позитивні колонії).
У створену плазміду шляхом лігування введено синтезований ген caSTAT5a.
Пошук позитивних колоній проведено шляхом розщеплення із використанням
ендонуклеази XhoI, сайт якої міститься у фрагменті caSTAT5a. Три бактерійні ко-
лонії містили нову модифіковану плазміду із усіма генетичними елементами
(caSTAT5a, IRES, CD2 та PolyA) у своєму складі (рис. 3).
Перевірку нуклеотидних послідовностей усіх синтезованих та клонованих еле-
ментів ДНК здійснено шляхом секвенування. Одержані результати засвідчили що
плазміда PMSCV містить caSTAT5a-IRES-CD2–PolyA фрагменти. Невиявлені жод-
ні неспецифічні зміни у нуклеотидних послідовностях синтезованих генів.
М 1
246 АНДРІЙ ЦИРУЛЬНИК, ВОЛОДИМИР СНІТИНСЬКИЙ, РОСТИСЛАВ СТОЙКА
Рис. 3. Модифікована плазміда PMSCV, що містить caSTAT5a-IRES-CD2–PolyA фрагменти
та ген резистентності до ампіциліну. Аналіз проведено шляхом розщеплення ДНК
ендонуклеазою XhoI та електрофорезу одержаних фрагментів у гелі агарози (стрілками
вказано позитивні колонії).
Тестування функціональної активності саSTAT5a
Функціональну активність синтезованого гена вивчали із застосуванням методу
ДНК-зв’язування (DNA binding assay). Для цього плазміду PMSCV очищено
електрофорезом у гелі агарози. Клітини лінії NIH3T3 трансформували плазмідами
PMSCV, що містять нативну форму STAT5a (контроль) і синтезований фрагмент
саSTAT5a-IRES-CD2-PolyA. Культивування клітин проводили з їх стимуляцією
еритропоетином та без неї. На відміну від нативної форми, конститутивно активна
форма STAT5a експресувалася в клітині й володіла ДНК зв’язувальною активніс-
тю до STAT5а-специфічного олігонуклеотида. Використано антитіла анти-STAT5a,
що дозволило підтвердити що саме білок STAT5a утворює комплекс із ДНК (рис. 4).
Рис. 4. Тестування функціональної активності конститутивно активної форми STAT5a
методом ДНК-звязування (DNA binding assay). Конститутивно активна форма STAT5a
здатна зв’язуватись із специфічною ділянкою ДНК-проби за відсутності стимуляції
трансформованих клітин цитокінами.
- - + - - + α-Stat5 антитіла
- + + - + + Epo стимуляція
СИНТЕЗ МОДИФІКОВАНОГО ГЕНА ТРАНСКРИПЦІЙНОГО ФАКТОРА STAT5a 247
Проведене дослідження дозволяє стверджувати, що створена модифікована
форма STAT5a у складі плазміди PMSCV володіє конститутивною активністю у
клітині без стимуляції цитокінами і тому може бути використана для створення
ефективної трансгенної моделі гіперактивації транскрипційного фактора STAT5a
in vivo.
Висновки
Введення створеного нами фрагмента саSTAT5a-IRES-CD2-PolyA у геном ми-
ші дозволить одержати експресію конститутивно активної форми гена STAT5a in
vivo і дослідити роль гіперактивації цього фактора у порушеннях клітинних проце-
сів та функціонування організму в цілому. Ген маркерного поверхневого антигена
CD2 забезпечує виявлення трансформованих клітин і визначення рівня експресії у
них модифікованої ДНК.
ЛІТЕРАТУРА
1. Takeda K., Akira S. STAT family of transcription factors in cytokine-mediated biological
responses // Cytokine Growth Factor Reviews. – 2000. – Vol. 11. – P. 199-207.
2. Li WX. Canonical and non-canonical JAK-STAT signaling // Trends Cell Biol. – 2008. –
Vol. 18. – P. 545-551.
3. Murray P.J. The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration // J Immunol. –
2007. – Vol. 178. – P. 2623-2629.
4. Hebenstreit D., Horejs-Hoeck J., Duschl A. JAK/STAT-dependent gene regulation by
cytokines // Drug News Perspect. – 2005. – V. 18, N. 4. – P. 243-249.
5. Rawlings J.S., Rosler K.M., Harrison D.A. The JAK/STAT signaling pathway // J Cell Sci. –
2004. – Vol. 15. – P.1281-1283.
6. O'Sullivan L., Liongue C., Lewis R., Stephenson S., Ward A.C. Cytokine receptor signaling
through the Jak-Stat-Socs pathway in disease // Mol Immunol. – 2007. – Vol. 44. – P. 2497-
2506.
7. Touw I., De Koning J., Ward A., Hermans M. Signaling mechanisms of cytokine receptors
and their perturbances in disease // Mol Cell Endocrinol. – 2000. – Vol. 25. – P. 1-9.
8. Tan S., Nevalainen M. Signal transducer and activator of transcription 5A/B in prostate and
breast cancers // Endocr Relat Cancer. – 2008. – Vol. 15. – P. 367-390.
9. Moriggl R., Sexl V., Kenner L., Duntsch C., Stangl K., Gingras S., Hoffmeyer A., Bauer A.,
Piekorz R., Wang D., Bunting K., Wagner E., Sonneck K., Valent P., Ihle J., Beug H. Stat5
tetramer formation is associated with leukemogenesis // Cancer Cell. – 2005. – Vol. 7. –
P. 87-99.
10. De Groot R., Raaijmakers J., Lammers J., Jove R., Koenderman L. STAT5 activation by
BCR-Abl contributes to transformation of K562 leukemia cells // Blood. – 1999. – Vol. 1. –
P. 1108-1112.
11. Ye D., Wolff N., Li L., Zhang S., Ilaria R. STAT5 signaling is required for the efficient induc-
tion and maintenance of CML in mice // Blood. – 2006. – Vol. 15. – P. 4917-4925.
12. Hiai H., Tsuruyama T., Yamada Y. Pre-B lymphomas in SL/Kh mice: a multifactorial disease
model // Cancer Sci. – 2003. – Vol. 94. – P. 847-850.
13. Tsuruyama T., Nakamura T., Jin G., Ozeki M., Yamada Y., Hiai H. Constitutive activation of
Stat5a by retrovirus integration in early pre-B lymphomas of SL/Kh strain mice // Proc Natl
Acad Sci U S A. – 2002. – Vol. 11. – P. 8253-8258.
248 АНДРІЙ ЦИРУЛЬНИК, ВОЛОДИМИР СНІТИНСЬКИЙ, РОСТИСЛАВ СТОЙКА
14. Grebien F., Kerenyi M., Kovacic B., Kolbe T., Becker V., Dolznig H., Pfeffer K., Klingmüller
U., Müller M., Beug H., Müllner E., Moriggl R. Stat5 activation enables erythropoiesis in the
absence of EpoR and Jak2 // Blood. – 2008. – Vol. 1. – P. 4511-4522.
15. Filbin M., Kieft J. Toward a structural understanding of IRES RNA function // Current
Opinion in Structural Biology. – 2009. – Vol. 19. – P. 267-276.
SUMMARY
Andriy TSYRULNYK1, Volodymyr SNITYNSKY1, Rostyslav STOIKA2
SYNTESIS OF MODIFIED GENE OF TRANSCRIPTION FACTOR STAT5A
1Lviv National Agricultural University,
V.Velikiy str., 1, 80381 Lviv-Dubljany, Ukraine
2Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences,
Dragomanov str., 14/16, 79005 Lviv, Ukraine
stoika@cellbiol.lviv.ua
Cytokines are small secreted proteins which mediate cell growth, proliferation, survival and apoptosis.
They are crucial regulators of immunity and hematopoiesis. Cytokines generally act at very low concentration
and short time spans. The JAK-STAT signaling pathway is one of the most important mechanisms of cell
response to the cytokines. Binding of cytokine to the specific membrane receptor on the cell activates the JAK
(Janus Kinase) kinase which adds a phosphate group to the STAT (Signal Transducer and Activator of
Transcription) proteins. After posphorylation, STAT proteins form via their SH2 domain the active dimers.
The dimers move into the cell nucleus via importin a/b and RanGDP complex and bind to DNA-recognition
region called gamma activated sites (GAS) in the promoter region of cytokine inducible genes and activates
transcription of these genes. Then, nuclear phosphatases dephosphorylate the STATs which leads to their
inactivation and transportation from the nucleus by exportin crm1/RanGTP complex. There are seven members
of STAT protein family: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a STAT5b and STAT6. STAT1 and STAT2
become activated in response to the interferons and can form the homodimers or heterodimers with other
STATs. STAT3 is activated by interleukin 5, interleukin-6, hepatocyte growth factor, interferons, epidermal
growth factor and leukemia inhibitory factor (LIF). STAT3 regulates cell growth and apoptosis. Since it has
anti-apoptotic and proliferative effects, hyperactivation of this transcription factor is associated with various
tumors, such as chronic lymphocytic leukemia, Burkitt's lymphoma, cutaneous T cell lymphoma, Hodgkin
desease, malignant melanoma, lung cancer, prostate carcinoma and renal cell carcinoma. STAT4 and STAT6
become phosphorylated in response to interleukin-4 and interleukin-12, respectively. They are involved in
regulation of immune response and lymphocyte activation. The transcription factor STAT5b is activated by
interleukin 2, interleikin 4 and CSF1. It mediates apoptosis, TCR signaling and liver gene expression. Our
studies we focused on STAT5a, since it plays a crutial role in basic cell functions, like cell growth,
proliferation, angiogenesis and additionally, serves as powerful anti-apoptotic factor through activation of
BCL2L1/BCL-X(L) expression in the cell. JAK kinase phosphorylates STAT5a in response to interleukin 2,
interleukin 3, interleukin 7 GM-CSF, erythropoietin and thrombopoietin. The high level of activated STAT5a
was found in erythroleukemia, acute lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic
myelogenous leukemia, megakaryocytic leukemia, sezary syndrome, anaplastic large T cell lymphoma, B cell
lymphoma, head and neck cancer, cerebral menangiomas, neuroendocrine tumors, pancreatic carcinoma,
ovarian carcinoma and colon cancer. Detection of hyperactivated STAT5a protein serves as one of the
diagnotic markers of these tumors. Investigation of the role of STAT5a in tumor development is a very
perspective direction of biology and medicine since it can help in designing a new effective diagnotic and
therapeutic approaches. Modern investigations of the biological role of STATs in tumor formation are mainly
performed by generation of transgenic animal models with modified genes of appropriate transcription factor.
The main goal of this work was to synthesize modified STAT5a gene. We used classic methods for DNA
synthesis and purification including polymerase chain reaction, site direct mutagenesis and electrophoresis in
agarose gele. The cloning was performed with using various endonucleases and T4-ligase. All steps of DNA
synthesis and cloning were analyzed by DNA sequencing. We also tested functional activity of modified
STAT5a by transformation of NIH 3T3 cells. Our data confirmed synthesis of the modified STAT5a gene. The
mailto:stoika@cellbiol.lviv.ua
СИНТЕЗ МОДИФІКОВАНОГО ГЕНА ТРАНСКРИПЦІЙНОГО ФАКТОРА STAT5a 249
protein of this gene is expressed at high level and possesses a specific DNA binding activity. Introduction of
modified gene of STAT5a into mouse genome allows to modulate the process of STAT5a hyperactivation in
vivo and to investigate the role of this transcription factor in the mechanisms of tumor development.
Key words: DNA syntesis, STAT transcription factors, gene modification.
РЕЗЮМЕ
Андрей ЦИРУЛЬНИК1, Влодимир СНИТИНСКИЙ1, Ростислав СТОЙКА2
СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННОГО ГЕНА ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА STAT5A
1Львовский Национальный аграрный университет,
ул. В. Великого, 1, 80381 Львов-Дубляны, Украина
2Институт биологии клетки Национальной академии наук Украины,
ул. Драгоманова, 14/16, 79005 Львов, Украина
stoika@cellbiol.lviv.ua
Транскрипционные факторы семейства STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)
являются ключевыми регуляторами експрессии генов, стимулированных цитокинами, влияющими на
разные клеточные процессы. Транскрипционный фактор STAT5a способствует стимуляции клеточного
роста, пролиферации и ангиогенезу. Современные исследования биологической роли белков STAT про-
водят с использованием експериментальных мышиных моделей, имеющих в составе своего генома
искусственно синтезированные и модифицированные гены транскрипционных факторов. Целью дан-
ной работы был синтез модифицированного гена STAT5a. Введение этого гена в геном мыши позволит
моделировать процесс активации STAT5a in vivo и проводить исследование его роли в процессах раз-
вития патологических процессов в организме.
Ключевые слова: синтез ДНК, транскрипционные факторы STAT, модификация генов.
Надійшла 20.03.2010.
Після доопрацювання 06.05.2010.
Прийнята до друку 12.05.2010.
mailto:stoika@cellbiol.lviv.ua
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-74473 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1563-3569 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:17:09Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Західний науковий центр НАН України і МОН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Цирульник, А. Снітинський, В. Стойка, Р. 2015-01-20T22:06:19Z 2015-01-20T22:06:19Z 2010 Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a / А. Цирульник, В. Снітинський, Р. Стойка // Праці Наукового товариства ім. Шевченка. — Л., 2010. — Т. XXV: Хемія і біохемія. — С. 243-249. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1563-3569 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/74473 577.113 Транскрипційні фактори родини STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)
 є ключовими регуляторами експресії генів стимульованих цитокінами, що впливають на різні клітинні процеси. Транскрипційний фактор STAT5a опосередковує
 стимуляцію клітинного росту, проліферації та ангіогенезу. Сучасні дослідження
 біологічної ролі білків STAT проводять шляхом створення експериментальних моделей мишей, що містять у геномі штучно синтезовані та модифіковані форми генів
 відповідних транскрипційних факторів. Метою даної роботи був синтез модифікованого гена STAT5a. Введення цього гена у геном миші дозволяє моделювати процеси активації STAT5a in vivo та досліджувати його роль у забезпеченні патологічних
 змін в організмі.
 Ключові слова: синтез ДНК, транскрипційні фактори STAT, модифікація генів. Cytokines are small secreted proteins which mediate cell growth, proliferation, survival and apoptosis.
 They are crucial regulators of immunity and hematopoiesis. Cytokines generally act at very low concentration
 and short time spans. The JAK-STAT signaling pathway is one of the most important mechanisms of cell
 response to the cytokines. Binding of cytokine to the specific membrane receptor on the cell activates the JAK
 (Janus Kinase) kinase which adds a phosphate group to the STAT (Signal Transducer and Activator of
 Transcription) proteins. After posphorylation, STAT proteins form via their SH2 domain the active dimers.
 The dimers move into the cell nucleus via importin a/b and RanGDP complex and bind to DNA-recognition
 region called gamma activated sites (GAS) in the promoter region of cytokine inducible genes and activates
 transcription of these genes. Then, nuclear phosphatases dephosphorylate the STATs which leads to their
 inactivation and transportation from the nucleus by exportin crm1/RanGTP complex. There are seven members
 of STAT protein family: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a STAT5b and STAT6. STAT1 and STAT2
 become activated in response to the interferons and can form the homodimers or heterodimers with other
 STATs. STAT3 is activated by interleukin 5, interleukin-6, hepatocyte growth factor, interferons, epidermal
 growth factor and leukemia inhibitory factor (LIF). STAT3 regulates cell growth and apoptosis. Since it has
 anti-apoptotic and proliferative effects, hyperactivation of this transcription factor is associated with various
 tumors, such as chronic lymphocytic leukemia, Burkitt's lymphoma, cutaneous T cell lymphoma, Hodgkin
 desease, malignant melanoma, lung cancer, prostate carcinoma and renal cell carcinoma. STAT4 and STAT6
 become phosphorylated in response to interleukin-4 and interleukin-12, respectively. They are involved in
 regulation of immune response and lymphocyte activation. The transcription factor STAT5b is activated by
 interleukin 2, interleikin 4 and CSF1. It mediates apoptosis, TCR signaling and liver gene expression. Our
 studies we focused on STAT5a, since it plays a crutial role in basic cell functions, like cell growth,
 proliferation, angiogenesis and additionally, serves as powerful anti-apoptotic factor through activation of
 BCL2L1/BCL-X(L) expression in the cell. JAK kinase phosphorylates STAT5a in response to interleukin 2,
 interleukin 3, interleukin 7 GM-CSF, erythropoietin and thrombopoietin. The high level of activated STAT5a
 was found in erythroleukemia, acute lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic
 myelogenous leukemia, megakaryocytic leukemia, sezary syndrome, anaplastic large T cell lymphoma, B cell
 lymphoma, head and neck cancer, cerebral menangiomas, neuroendocrine tumors, pancreatic carcinoma,
 ovarian carcinoma and colon cancer. Detection of hyperactivated STAT5a protein serves as one of the
 diagnotic markers of these tumors. Investigation of the role of STAT5a in tumor development is a very
 perspective direction of biology and medicine since it can help in designing a new effective diagnotic and
 therapeutic approaches. Modern investigations of the biological role of STATs in tumor formation are mainly
 performed by generation of transgenic animal models with modified genes of appropriate transcription factor.
 The main goal of this work was to synthesize modified STAT5a gene. We used classic methods for DNA
 synthesis and purification including polymerase chain reaction, site direct mutagenesis and electrophoresis in
 agarose gele. The cloning was performed with using various endonucleases and T4-ligase. All steps of DNA
 synthesis and cloning were analyzed by DNA sequencing. We also tested functional activity of modified
 STAT5a by transformation of NIH 3T3 cells. Our data confirmed synthesis of the modified STAT5a gene. The protein of this gene is expressed at high level and possesses a specific DNA binding activity. Introduction of
 modified gene of STAT5a into mouse genome allows to modulate the process of STAT5a hyperactivation in
 vivo and to investigate the role of this transcription factor in the mechanisms of tumor development.
 Key words: DNA syntesis, STAT transcription factors, gene modification Транскрипционные факторы семейства STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)
 являются ключевыми регуляторами експрессии генов, стимулированных цитокинами, влияющими на
 разные клеточные процессы. Транскрипционный фактор STAT5a способствует стимуляции клеточного
 роста, пролиферации и ангиогенезу. Современные исследования биологической роли белков STAT проводят с использованием експериментальных мышиных моделей, имеющих в составе своего генома
 искусственно синтезированные и модифицированные гены транскрипционных факторов. Целью данной работы был синтез модифицированного гена STAT5a. Введение этого гена в геном мыши позволит
 моделировать процесс активации STAT5a in vivo и проводить исследование его роли в процессах развития патологических процессов в организме.
 Ключевые слова: синтез ДНК, транскрипционные факторы STAT, модификация генов. uk Західний науковий центр НАН України і МОН України Праці наукового товариства ім. Шевченка Біохемія Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a Syntesis of modified gene of transcription factor STAT5а Cинтез модифицированного гена транскрипционного фактора STAT5а Article published earlier |
| spellingShingle | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a Цирульник, А. Снітинський, В. Стойка, Р. Біохемія |
| title | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a |
| title_alt | Syntesis of modified gene of transcription factor STAT5а Cинтез модифицированного гена транскрипционного фактора STAT5а |
| title_full | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a |
| title_fullStr | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a |
| title_full_unstemmed | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a |
| title_short | Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a |
| title_sort | синтез модифікованого гена транскрипційного фактора stat5a |
| topic | Біохемія |
| topic_facet | Біохемія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/74473 |
| work_keys_str_mv | AT cirulʹnika sintezmodifíkovanogogenatranskripcíinogofaktorastat5a AT snítinsʹkiiv sintezmodifíkovanogogenatranskripcíinogofaktorastat5a AT stoikar sintezmodifíkovanogogenatranskripcíinogofaktorastat5a AT cirulʹnika syntesisofmodifiedgeneoftranscriptionfactorstat5a AT snítinsʹkiiv syntesisofmodifiedgeneoftranscriptionfactorstat5a AT stoikar syntesisofmodifiedgeneoftranscriptionfactorstat5a AT cirulʹnika cintezmodificirovannogogenatranskripcionnogofaktorastat5a AT snítinsʹkiiv cintezmodificirovannogogenatranskripcionnogofaktorastat5a AT stoikar cintezmodificirovannogogenatranskripcionnogofaktorastat5a |