Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками

Разработан метод синтеза таргетных, функционализированных фолатами и модифицированных полисахаридами наночастиц платины PtПС–ФК и исследовано их влияние на опухолевые клетки различного онкогенеза. Оптимальные условия синтеза PtПС–ФК установлены на основе электроповерхностн...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології
Date:	2013
Main Authors:	Эстрела-Льопис, В.Р., Чевычалова, А.В., Фесенко, Е.М., Довбешко, Г.И., Литвин, П.М.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України 2013
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/75933
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками / В.Р. Эстрела-Льопис, А.В. Чевычалова, Е.М. Фесенко, Г.И. Довбешко, П.М. Литвин // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології: Зб. наук. пр. — К.: РВВ ІМФ, 2013. — Т. 11, № 4. — С. 741-755. — Бібліогр.: 39 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860268828487843840
author	Эстрела-Льопис, В.Р. Чевычалова, А.В. Фесенко, Е.М. Довбешко, Г.И. Литвин, П.М.
author_facet	Эстрела-Льопис, В.Р. Чевычалова, А.В. Фесенко, Е.М. Довбешко, Г.И. Литвин, П.М.
citation_txt	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками / В.Р. Эстрела-Льопис, А.В. Чевычалова, Е.М. Фесенко, Г.И. Довбешко, П.М. Литвин // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології: Зб. наук. пр. — К.: РВВ ІМФ, 2013. — Т. 11, № 4. — С. 741-755. — Бібліогр.: 39 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології
description	Разработан метод синтеза таргетных, функционализированных фолатами и модифицированных полисахаридами наночастиц платины PtПС–ФК и исследовано их влияние на опухолевые клетки различного онкогенеза. Оптимальные условия синтеза PtПС–ФК установлены на основе электроповерхностных и спектральных исследований формирования адсорбционного слоя полисахаридов и фолатов на поверхности наночастиц. Установлена оптимальная концентрация реагентов, условия (время, температура, порядок смешивания) для синтеза нанокомпозитов PtПС–ФК. На основе исследований гетерокоагуляции PtПС–ФК с раковыми клетками и кинетики цитотоксического эффекта определено токсическое действие таких частиц на раковые клетки и селективность в сравнении со здоровыми клетками. При исследовании использованы методы атомносиловой, электронной и оптической микроскопии и ИК-спектроскопия. Розроблено метод синтезу тарґетних, функціоналізованих фолатами та модифікованих полісахаридами наночастинок платини PtПС–ФК, досліджено їх вплив на пухлинні клітини різного онкогенезу. Оптимальні умови синтезу PtПС–ФК встановлено на основі електроповерхневих і спектральних досліджень формування адсорбційного шару полісахаридів та фолатів на поверхні наночастинок. Встановлено оптимальну концентрацію реаґентів, умови (час, температура, порядок змішування) для синтезу нанокомпозитів PtПС–ФК. На основі досліджень гетерокоаґуляції PtПС–ФК з клітинами раку крові та кінетики цитотоксичного ефекту визначено токсичну дію таких частинок на ракові клітини та її селективність у порівнянні з впливом на здорові клітини. При досліджені використано методи атомно-силової, електронної й оптичної мікроскопії та ІЧ-спектроскопію. The method for synthesis of targeted platinum nanoparticles (PtPS–F) functionalized by folate and modified by polysaccharides is developed, and the effect of these polysaccharides on tumour cells of different carcinogenesis is studied. Optimal conditions for the PtPS–F synthesis are revealed, based on spectral and electrosurface studies of formation of the adsorption layer of polysaccharides and folate on the surface of nanoparticles. The optimum concentration of reactants and the conditions (time, temperature, sequence of mixing) for the synthesis of the PtPS–F nanocomposites are established. The toxic effect of nanocomposites on the cancer cells and its selectivity in comparison with healthy cells are determined by means of investigation of heterocoagulation and kinetics of cytotoxic effect. The methods of atomic force, electron and optical microscopies as well as IR-spectroscopy are used.
first_indexed	2025-12-07T19:04:24Z
format	Article
fulltext	741 PACS numbers: 81.07.Pr, 82.45.Tv, 83.80.Lz, 87.15.-v, 87.19.xj, 87.64.-t, 87.85.Rs Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками В. Р. Эстрела-Льопис, А. В. Чевычалова, Е. М. Фесенко, Г. И. Довбешко, П. М. Литвин** Институт биоколлоидной химии им. Ф. Д. Овчаренко НАН Украины, бульв. Акад. Вернадского, 42, 03680, ГСП, Киев-142, Украина Институт физики НАН Украины, просп. Науки, 46, 03028 Киев, Украина *Институт физики полупроводников им. В. Е. Лашкарёва НАН Украины, просп. Науки, 41, 03028 Киев, Украина Разработан метод синтеза таргетных, функционализированных фолатами и модифицированных полисахаридами наночастиц платины PtПС–ФК и исследовано их влияние на опухолевые клетки различного онкогенеза. Оптимальные условия синтеза PtПС–ФК установлены на основе электро- поверхностных и спектральных исследований формирования адсорбци- онного слоя полисахаридов и фолатов на поверхности наночастиц. Уста- новлена оптимальная концентрация реагентов, условия (время, темпера- тура, порядок смешивания) для синтеза нанокомпозитов PtПС–ФК. На ос- нове исследований гетерокоагуляции PtПС–ФК с раковыми клетками и кинетики цитотоксического эффекта определено токсическое действие таких частиц на раковые клетки и селективность в сравнении со здоро- выми клетками. При исследовании использованы методы атомно- силовой, электронной и оптической микроскопии и ИК-спектроскопия. Розроблено метод синтезу тарґетних, функціоналізованих фолатами та модифікованих полісахаридами наночастинок платини PtПС–ФК, дослі- джено їх вплив на пухлинні клітини різного онкогенезу. Оптимальні умо- ви синтезу PtПС–ФК встановлено на основі електроповерхневих і спектра- льних досліджень формування адсорбційного шару полісахаридів та фо- латів на поверхні наночастинок. Встановлено оптимальну концентрацію реаґентів, умови (час, температура, порядок змішування) для синтезу на- нокомпозитів PtПС–ФК. На основі досліджень гетерокоаґуляції PtПС–ФК з клітинами раку крові та кінетики цитотоксичного ефекту визначено ток- Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології Nanosystems, Nanomaterials, Nanotechnologies 2013, т. 11, № 4, сс. 741–755  2013 ІМФ (Інститут металофізики ім. Г. В. Курдюмова НАН України) Надруковано в Україні. Фотокопіювання дозволено тільки відповідно до ліцензії http://uk.wikipedia.org/wiki/%D0%86%D0%BD%D1%81%D1%82%D0%B8%D1%82%D1%83%D1%82_%D0%B1%D1%96%D0%BE%D0%BA%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D1%97%D0%B4%D0%BD%D0%BE%D1%97_%D1%85%D1%96%D0%BC%D1%96%D1%97_%D1%96%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D1%96_%D0%A4._%D0%94._%D0%9E%D0%B2%D1%87%D0%B0%D1%80%D0%B5%D0%BD%D0%BA%D0%B0_%D0%9D%D0%90%D0%9D_%D0%A3%D0%BA%D1%80%D0%B0%D1%97%D0%BD%D0%B8 https://intranet.nas.gov.ua/aboutNASU/Documents/RUS/303.htm 742 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. сичну дію таких частинок на ракові клітини та її селективність у порів- нянні з впливом на здорові клітини. При досліджені використано методи атомно-силової, електронної й оптичної мікроскопії та ІЧ-спектроскопію. The method for synthesis of targeted platinum nanoparticles (PtPS–F) func- tionalized by folate and modified by polysaccharides is developed, and the effect of these polysaccharides on tumour cells of different carcinogenesis is studied. Optimal conditions for the PtPS–F synthesis are revealed, based on spectral and electrosurface studies of formation of the adsorption layer of polysaccharides and folate on the surface of nanoparticles. The optimum con- centration of reactants and the conditions (time, temperature, sequence of mixing) for the synthesis of the PtPS–F nanocomposites are established. The toxic effect of nanocomposites on the cancer cells and its selectivity in com- parison with healthy cells are determined by means of investigation of heter- ocoagulation and kinetics of cytotoxic effect. The methods of atomic force, electron and optical microscopies as well as IR-spectroscopy are used. Ключевые слова: наночастицы платины, полисахариды, фолаты, клетки рака крови, клетки рака яичника линии А2780, карцинома Эрлиха, гете- рокоагуляция, цитотоксический эффект. (Получено 10 декабря 2013 г.) 1. ВВЕДЕНИЕ В последние 20 лет интенсивно развиваются исследования в области применения наночастиц (НЧ) золота и серебра в биологии и меди- цине, в частности, в области биодетекции [1] и для интенсификации действия физиотерапевтических методов лечения (фотодинамиче- ский, фототермический и радиотерапия [2–7]), а также для направ- ленного транспорта лекарственных препаратов [8, 9]. Такие приме- нения связаны с плазмон-несущими свойствами НЧ золота и сереб- ра (биодетекция) [10] и с их нетоксичностью [8, 11]. В обзоре [12] отмечено, что исследования по применению наноча- стиц платины практически отсутствуют. Этот факт вызывает удив- ление, поскольку в химиотерапии широко применяются комплек- сы ионов платины с различными органическими соединениями, например, цисплатин. Возможно, повышенное побочное токсиче- ское действие таких препаратов вызвало задержку в соответствую- щих исследованиях по применению наноплатины. Однако в моно- графии [13] К. Б. Яцимирский отмечал, что, в отличие от ионных, нейтральная форма платины Pt(0) не является токсичной. Работами последних лет показана возможность применения наноплатины для инактивации раковых клеток. Так, в работе [14] показано, что, благодаря своим каталитическим свойствам, нано- частицы платины проявляют активность подобно митохондриаль- ному коэнзиму никотинамид-аденин-диниклеотиду, который окис- ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 743 ляется в присутствии НЧ платины, что влияет на синтез АТФ и, со- ответственно, на жизнедеятельность клетки. Здесь же показано, что в кислой среде фагосом (где концентрируются попавшие в клет- ку в результате фагоцитоза частицы платины) происходит выделе- ние свободных ионов платины с поверхности таких частиц, и эти ионы также являются цитотоксичными. В работе [15] показано, что под действием таких ионов в клетках глиобластомы U251 и фиб- робластах лёгких человека IMR-90 происходит нарушение деления (пролиферация) и усиление апоптоза 1 . Эффект объясняется повре- ждением ДНК таких клеток в результате выделения активных форм кислорода (Н2О2 и О 2) под влиянием ионов платины. Отме- тим, что наночастицы платины в работе [15] были стабилизированы поливиниловым спиртом. В нашей работе для стабилизации наночастиц платины применя- лись полисахариды микроводоросли Chlorella vulgaris, штамм ЛАРГ-3 (Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск). Этот выбор связан с известными результатами независимых исследований, где были доказаны противораковые свойства самих полисахаридов. Так, в работе [16] показано, что высокомолекулярные ПС хлореллы стимулируют синтез цитокинов и II-6, IL-10, INF-, фактора некро- за раковых клеток TNF- и пролиферацию спленоцитов. В работе [17] показано, что кислый полисахарид ChlonA микроводоросли Chlorella pirenoidosa стимулирует фагоцитарную активность рети- кулоэндотелиальной системы крыс, повышает иммунитет. В работе [18] показано, что высокомолекулярный анионный полисахарид клеточного матрикса гиалуронан ингибирует процессы метастази- рования и понижает мультирезистентность раковых клеток. Отме- тим, что в работе [19], посвящённой разработке метода получения монокристаллов-нанопризм золота, основанного на применении полисахаридов Chlorella vulgaris штамм ЛАРГ-3 как восстановите- ля-стабилизатора, было установлено, что эти ПС имеют средний молекулярный вес 500 кДа и анионную природу. Известно также влияние полисахаридов грибов на активацию иммунной системы организма [20]. Полисахариды гинкго билоба активируют апоптоз и торможение пролиферации клеток рака желудка [21]. Полисахариды и фагоцитоз. Полисахариды усиливают проник- новение наночастиц в клетку на основе известного механизма фаго- цитоза. Так, ещё в 1978 году было показано, что анионные высоко- молекулярные полиэлектролиты лучше, чем катионные и нейтральные полимеры проникают и воздействуют на клетки сар- 1 Апоптоз — программируемая клеточная смерть, регулируемый процесс само- ликвидации на клеточном уровне, в результате которого клетка фрагментирует- ся на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембра- ной. Один из методов терапии рака — активация апоптоза раковых клеток (способных, в отличие от здоровых, делиться практически бесконечно). 744 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. комы-180 [22]. В работе [23] показано, что полианионы вызывают переориентацию фосфолипидов в мембране, что облегчает её де- формацию и стимулирует фагоцитоз наночастиц, покрытых ад- сорбционным слоем таких полианионов. Полисахариды могут раз- лагаться в кислой среде фагосом, что создаёт возможность прямого действия покрытых ими частиц препарата [23]. Интересно отметить, что в последнее время эффективно развива- ется близкое к рассматриваемому нами направление carbohydrate (polysaccharide) targeting [24]. Здесь полисахариды применяются как лиганды для создания сахарид-модифицированных лекар- ственных препаратов. Данное направление связано с особенностями процесса гликолиза при развитии злокачественных образований. Известно [25], что опухолевые клетки утилизируют глюкозу со зна- чительно большей скоростью, даже в анаэробных условиях, чем клетки здоровых тканей — опухоль является своеобразной «ло- вушкой» для глюкозы. В монографии [26] указано, что гликолити- ческий фенотип — это почти универсальный феномен опухолей че- ловека. Поэтому, вполне возможно, что раковые клетки и опухоли агрегируют и усваивают глико-таргетные наноносители по меха- низмам, которые определяют характерный для них повышенный уровень усвоения глюкозы. Функционализация наночастиц фолатами применяется для их селективного связывания с трансформированными клетками. Из- вестно, что более 40% клеток различного онкогенеза и, прежде все- го, интенсивные формы раковых патологий, выделяют на своей по- верхности повышенную концентрацию фолат-рецепторов (белок — гликозилфосфатидинозитол-линкер FR  ). Фолаты — натриевые или кальциевые соли фолиевой кислоты (витамин В9) также способ- ствует транспорту макромолекул внутрь клетки на основе рецеп- тор-модулированного эндоцитоза [27]. Поэтому фолаты являются антиген-биомаркёрами для клеток, имеющих фолат-рецептор FR  . При этом нормальные клетки здоровых тканей таких фолат- рецепторов не имеют, что и позволяет лекарствам с фолатами свя- зываться только с трансформированными клетками опухоли. Фо- латы проникают в цитозоль, но не связываются с лизосомальными компонентами [28]. Функционализацию фолатами применяют для адресной достав- ки лекарственных препаратов (targeting drug delivery) золотых [29, 30] и магнитных [31] частиц. В последнее время появились работы по применению фолатов для функционализации наночастиц пла- тины. В работе [32] представлены результаты синтеза платиновых наночастиц с адсорбционным слоем фолатов (НЧ Pt–ФА) и исследо- вания их действия на раковые и нормальные клетки. По данным электрофореза такие частицы были заряжены отрицательно. Ис- следовалось воздействие Pt–ФА на здоровые клетки МС-3Т3-Е1 и ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 745 клетки костной опухоли ROS 17/2.8. Было показано, что при боль- ших концентрациях НЧ Pt–ФА (130–260 мг/л) имеет место 100% гибель клеток в двух культурах. Напротив, при низких концентра- циях выживало 98,5% нормальных клеток МС-3Т3-Е1 и 32,85% раковых клеток ROS 17/2.8. Избыток раствора фолата в смеси кле- ток с НЧ Pt–ФА нивелировал такую селективность, что связывает- ся с блокировкой фолат-рецепторов раковых клеток ионами фолата из раствора и исключением в дальнейшем возможности их агреги- рования с НЧ Pt–ФА. Аналогичные результаты получены в работе [33], где исследова- но взаимодействие функционализированных фолатами и покрытых анионными и катионными электролитами наночастиц золота с клетками рака груди линии VP 229 и MDA MB 231 (в сравнении с частицами без фолата или клетками с FR  — неактивированными макрофагами). Для нас представляет интерес сделанный на основе спектральных исследований вывод авторов о том, что связь фолатов с анионным полиэлектролитом осуществляется по электростатиче- скому механизму, а не на основе ковалентной связи. При этом в ра- боте отмечено, что в случае ковалентной связи фолатов с адсорбци- онным слоем полимера на поверхности НЧ возможно образование токсических побочных продуктов и снижение уровня селективно- сти по фолат-связи. Судя по известной литературе, на данный момент пока не удалось найти прямых аналогов нашей работы, цель которой — синтез и ис- следование для применения в онкотерапии нанокомпозитов на ос- нове наноплатины, модифицированной полисахаридами микрово- доросли хлорелла и фукционализированной фолатами. Это обстоя- тельство, а также приведённые в обзоре сведения о механизмах ци- тотоксического действия на раковые клетки наноплатины и поли- сахаридов и о стимулирующем действии последних в процессе фа- гоцитоза покрытых ими наночастиц, а также данные о таргетной роли фолатов для повышения селективности агрегации наночастиц с раковыми клетками указывают на обоснованность поставленной в работе цели исследования. 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ Клетки рака крови линии Namalwa и линии Jurkat выращивались на среде RPMI 1640 (SIGMA) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В экспериментах использовалась суспензия та- ких клеток в питательной среде. Клетки линии Namalwa практиче- ски не имеют фолат-рецепторов FR  , а для клеток линии Jurkat ха- рактерно повышенное выделение (overexcretion) таких рецепторов. Поэтому выбор лейкозных клеток указанных линий связан с необ- ходимостью экспериментального подтверждения селективного вза- 746 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. имодействия НЧ Pt–ПС–ФА именно с клетками, выделяющими фолат-рецепторы. Отделение лимфоцитов из венозной крови здорового человека выполнялось по стандартной методике центрифугирования крови в заданном градиенте плотности [34]. Такие клетки обычно рассмат- ривают как здоровый аналог (контроль) раковых клеток крови. Здоровые клетки практически не имеют фолат-рецепторов [35]. По- этому выбор здоровых лимфоцитов, как контроля, связан с необхо- димостью экспериментального подтверждения их пониженной, в сравнении с FR+-клетками Jurkat, агрегации с НЧ Pt–ПС–ФА. Кроме того, сравнение агрегации здоровых лимфоцитов с НЧ PtПС с аналогичным эффектом для раковых клеток и Namalwa и Jurkat позволит установить селективность такой агрегации по отношению к раковым клеткам. Клетки линии Namalwa и Jurkat и здоровые лимфоциты получа- ли на экспериментальной базе Института экспериментальной пато- логии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Укра- ины2. Клетки рака яичника человека линии А2780 выращивались на среде ISCOV (SIGMA-ALDRICH)10% FCS при температуре 37С. Полисахариды (ПС) Chlorella vulgaris ЛАРГ-3 осаждали ацетоном из культуральной среды клеток хлорелла (при соотношении 2:1), предварительно упаренной при 70С до 10-кратного уменьшения объёма. Полисахариды отделяли центрифугированием, остатки ацетона удаляли выпариванием. Полученный продукт растворяли в дистилляте и диализовали против бидистиллята. Концентрацию полисахаридов определяли фенол-сернокислым методом [36]. Наночастицы платины, стабилизированные адсорбционным слоем полисахаридов (НЧ PtПС) получали восстановлением HPtCl63H2O аскорбиновой кислотой с добавлением после 15–20 мин перемешивания указанной смеси раствора полисахаридов до их конечной концентрации в смеси 30 мг/дм3. Данная концентра- ция ПС установлена на основе комплекса экспериментов, включа- ющего исследования изотермы адсорбции полисахаридов на нано- частицах платины и изменения электрокинетического потенциала частиц в результате такой адсорбции (рис. 1). Здесь пунктиром вы- делен оптимальный интервал концентрации полисахаридов для стабилизации наночастиц платины и получения биоконъюгатов НЧ PtПС — 15–50 мгПС/дм3. Распределение наночастиц платины и биоконъюгатов НЧ PtПС по размерам исследовали методом атомной силовой микроскопии (сканирующий зондовый микроскоп Dimension 3000, Bruker/Veeco) — рис. 2. Из сравнения рисунков 2, а, б видно, что 2 Благодарим за подготовку культур лейкозных и нормальных клеток с.н.с., к.б.н. Е. Д. Шишко (ИЭПОР НАН Украины). ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 747 адсорбция ПС приводит к увеличению среднего размера частиц платины от 18 до 38 нм. Фолат натрия (М495,41) получали растворением 50 г фолиевой кислоты в 1 л 1 М раствора NaOH с последующим диализом (в тем- ноте, с перемешиванием). Фолат кальция (М511,50) — использо- вали готовый препарат фирмы «SIGMA-ALDRICH». Исследования влияния концентрация фолата Са (FCa) или Na (FNa) на электрокинетический потенциал биоконъюгатов НЧ PtПС применили для определения оптимальной концентрации ФА для синтеза НЧ Pt–ПС–ФА. Взаимодействие наночастиц платины с адсорбционным слоем полисахаридов и таких же частиц, функционализированных фола- тами (НЧ Pt–ПС–ФА), с раковыми и нормальными клетками крови изучали на основе комплекса методов, включающего исследования гетерокоагуляции этих наноформ с клетками и цитотоксического эффекта. а б Рис. 2. Распределение частиц НЧ Pt (а) и НЧ PtПС (б) по размерам. Рис. 1. Влияние адсорбции полисахаридов (1) на электрокинетический потенциал (2) наночастиц платины. 748 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. Эффективность гетерокоагуляции оценивали, определяя оста- точную концентрацию по платине неагрегированных с клетками наночастиц в супернатанте после центрифугирования смеси клеток и частиц заданной концентрации, предварительно находящихся в контакте в течение одного часа [37]. Цитотоксический эффект воздействия наночастиц на раковые и нормальные клетки исследовали на основе определения стандарт- ного индекса IC50 — концентрации действующего вещества, при ко- торой за данный промежуток времён погибает 50% клеток задан- ной концентрации [38]. Мёртвые клетки выделяли красителем трипановым синим, их подсчёт выполняли методом оптической микроскопии соответствующего препарата клеток в камере Горяе- ва. Методом ИК-спектроскопии исследовали механизм взаимодей- ствия наночастиц полисахаридов, адсорбированных на поверхно- сти, с фолатами. Методом просвечивающей электронной микроскопии JEM-1230 («JEOL», Япония) выполнено цитоморфологическое исследование ультраструктуры клеток [34]. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Для получения функционализированных фолатами НЧ PtПС необ- ходимо установить оптимальную концентрацию фолата, обеспечи- вающую его максимальную адсорбцию на наночастицах. Было предположено, что изменение поверхностного заряда (электроки- нетического -потенциала) таких частиц в зависимости от концен- трации фолата качественно соответствует изменению адсорбции фолатов на частицах. Результаты измерения зависимости - потенциала наночастиц PtПС и, для сравнения, наночастиц плати- ны от концентрации FNa представлены на рис. 3. Как видно, в ин- тервале концентрации фолата натрия до 20 мг/дм3 происходит за- метное увеличение по модулю -потенциала наночастиц, и с после- дующим ростом концентрации FNa их -потенциал практически не изменяется. Это позволяет допустить, что оптимальная концентра- ция для функционализации НЧ PtПС может быть выбрана в интер- вале 15–30 мг/дм3. Такая низкая концентрация по фолату исклю- чает негативный эффект блокировки FR+-рецепторов раковых кле- ток при избыточной концентрации свободного фолата в растворе, на что обратили внимание авторы [32]. Как видно из данных, пред- ставленных на рис. 3, -потенциал частиц с фолатом натрия НЧ Pt– ПС–FNa ниже, чем частиц НЧ Pt–FNa. Такое отличие связано с тем, что адсорбция полисахаридов на наночастицах платины в об- ласти концентрации ПС, применяемой для получения НЧ PtПС, уменьшает поверхностный заряд НЧ Pt (см. рис. 1). Во всех случаях ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 749 частицы заряжены отрицательно, их -потенциал 0. Особенности взаимодействия фолата натрия с полисахаридами исследованы методом ИК-спектроскопии на примере функциона- лизированных фолатом натрия наночастиц золота с адсорбционным слоем полисахаридов и представлены на рис. 4. Взаимодействие фолата натрия с НЧ AuПС ведёт к перестройке водородных связей в спектре НЧ Au–ПС–FNa. Как видно из спектра, имеет место усиле- ние интенсивности водородно-связанного NH колебания на 3450 и 3450 см 1, ослабление и низкочастотный сдвиг контура спектра во- дородно-связанного OH колебания; происходит усиление COOH ко- лебаний на 1730 см 1 и деформационных водородных связей OH в области 650–770 см 1. Анализируя полученные данные, можно сде- Рис. 4. ИК-спектры НЧ Au–ПС–FNa (кривая 1) и FNa (кривая 2). Рис. 3. Влияние концентрации фолата натрия на -потенциал наночастиц платины (Pt) и наночастиц платины с адсорбционным слоем полисахари- дов (PtПС) в среде 10 3 М NaCl. 750 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. лать вывод о том, что взаимодействие между НЧ Au–ПС и FNa про- исходит по электростатическому механизму между карбоксильны- ми группами ПС и аминогруппами FNa. Эффективность агрегации наночастиц PtПС и Pt–ПС–FNa с клетками рака крови изучали на основе методов исследования гете- рокоагуляции (коллоидопоглощения) и соответствующей кинетики цитотоксического эффекта. Результаты исследований приведены на рис. 5. Как видно, модификация фолатами наночастиц платины с адсорбционным слоем полисахаридов усиливает их агрегацию с FR  -клетками линии Jurkat (см. рис. 5, а), но не приводит к такому усилению в случае агрегации с клетками линии Namalwa, не име- ющими таких рецепторов (см. рис. 5, б). Представленные на рис. 6 результаты исследования эффективно- а б Рис. 5. Агрегация клеток рака крови линии Jurkat (а) и линии Namalwa (б) с НЧ PtПС и НЧ Pt–ПС–FNa (Скл4,7105 кл/см3, Тконт1 час). Рис. 6. Агрегация клеток рака крови линии Namalwa с НЧ PtПС и НЧ Pt– ПС–FNa и нормальных лимфоцитов с НЧ Pt–ПС–FNa (Скл4,7105 кл/см3, Тконт1 час). ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 751 сти агрегации раковых клеток линии Namalwa и здоровых лимфо- цитов с НЧ PtПС и с НЧ Pt–ПС–FNa показывают, что, во-первых, модифицированные полисахаридами наночастицы платины селек- тивно взаимодействуют с такими клетками — их агрегация с рако- выми клетками намного выше, чем с нормальными и, во-вторых, функционализация наночастиц фолатами усиливает этот эффект — частицы НЧ Pt–ПС–FNa агрегируют со здоровыми лимфоцитами слабее, чем с раковыми. Один из методов исследования токсического действия препарата на клетки основан на определении индекса IC50. Предварительно ис- следовали влияние адсорбции полисахаридов на наночастицах пла- тины на усиление их цитотоксического эффекта — на примере кле- ток рака яичника линии А2780 (рис. 7). Здесь представлена зави- симость доли интактных (живых) клеток А2780 от времени контак- та с наночастицами платины и такими же частицами, но покрыты- ми адсорбционным слоем полисахаридов хлореллы. Как видно, эф- фективность токсического воздействия НЧ PtПС заметно выше, чем НЧ Pt — в первом случае половина клеток погибает при кон- центрации НЧ PtПС 16 мг/дм3, во втором — при концентрации НЧ Pt 60 мг/дм3. Как видно, адсорбционный слой ПС на поверхности НЧ платины уменьшает величину IC50 более чем в три раза. Причи- ны такого эффекта могут быть связаны с отмеченными выше фак- торами токсического действия полисахаридов на раковые клетки и способностью полисахаридов, как анионного полиэлектролита, ин- тенсифицировать фагоцитоз. Аналогично, на основе подсчёта доли живых и мёртвых клеток в зависимости от времени их контакта с наночастицами (кинетика цитотоксического эффекта) исследовали токсическое действие НЧ PtПС и НЧ Pt–ПС–FСа на клетки рака крови. Соответствующие ре- Рис. 7. Зависимость доли живых клеток рака яичника человека А2780 от концентрации наночастиц платины и платины с адсорбционным слом по- лисахаридов (Тконт1 час). 752 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. зультаты приведены на рис. 8. Данные, представленные на рис. 8, а, показывают, что функционализация фолатом кальция наноча- стиц платины с полисахаридами усиливает их токсическое дей- ствие на FR  раковые клетки Jurkat: 50% клеток погибает за 1 час контакта с НЧ Pt–ПС–FСa, в то время как с клетками линии Namalwa такой же эффект достигается вдвое дольше (рис. 8, б). Как видно из данных, представленных на рис. 8, за время эксперимента все клетки в питательной среде без частиц сохраняли жизнедея- тельность. Результат действия НЧ Pt–ПС–FNa на клетки линии Namalwa иллюстрируют ПЭМ-микрофото3 на рис. 9, б, в. Как видно после 1 часа контакта с НЧ, в раковых клетках происходит нарушение уль- траструктуры, деформация ядра, наружной мембраны, образование фагосом (сравните с исходной структурой клетки Namalwa — рис. 9, а) или же полное фрагментирование на отдельные апоптотиче- ские тельца. Последнее предположение сделано на основе сравне- ния с микрофото сканирующей электронной микроскопии из рабо- ты [39] (рис. 9, г), где зафиксирован апоптоз клетки лейкоцита. 4. ВЫВОДЫ Разработаны методы синтеза модифицированных фолатами натрия и кальция наночастиц платины, покрытых адсорбционным слоем полисахаридов. Показано, что модификация полисахаридами уси- ливает цитотоксическое действие наночастиц платины. 3 Благодарим вед. инженера ИЭПОР НАН Украины Н. А. Трегубову за цито- морфологический анализ. а б Рис. 8. Кинетика цитотоксического эффекта клеток рака крови линии Jurkat (а) и линии Namalwa (б) после контакта с НЧ PtПС и НЧ Pt–ПС– FСa. ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 753 Определены оптимальные концентрации реагентов, условия (время, температура, порядок смешивания) для синтеза НЧ Pt– ПС–ФА. Оптимальные условия синтеза НЧ Pt–ПС–ФА установле- ны на основе электроповерхностных исследований формирования адсорбционного слоя полисахаридов и фолатов на поверхности НЧ. В опытах с клетками рака крови линии Jurkat, имеющих фолат- рецепторы, и линии Namalwa, у которых их нет, экспериментально доказаны факты усиления агрегации и цитотоксического действия функционализированных фолатами натрия и кальция НЧ PtПС на клетки линии Jurkat. Также показано, что цитотоксическое дей- ствие НЧ Pt–ПС–ФА на эти клетки выше в сравнении с действием НЧ PtПС. Показана селективность взаимодействия НЧ Pt–ПС–ФА с раковыми клетками на фоне здоровых лимфоцитов. Полученные результаты могут быть положены в основу разра- ботки новых лекарственных препаратов для терапии рака на основе наночастиц платины, модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатом. Работа выполнена в рамках проекта № 63/Н при финансовой поддержке Целевой комплексной программы фундаментальных исследований НАН Украины «Фундаментальные проблемы нано- структурных систем, наноматериалов, нанотехнологий». ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. L. Dykman and N. Khlebtsov, Chem. Soc. Rev, 41: 2256 (2012). 2. Н. Ф. Гамалея, Г. О. Лесняк, И. В. Прокопенко, Фотобиология и фотомеди- цина, 7, № 1–2: 67 (2007). 3. X. Huang, K. Prashant, I. H. El-Sayed, and M. A. El-Sayed, Nanomedicine, 2, а б в г Рис. 9. ПЭМ-фотографии клетки линии Namalwa (а) и такой же клетки после контакта с НЧ Pt–ПС–FNa (б, в), СЭМ-микрофото апоптоза клетки лейкоцита человека (г) [39]. 754 В. Р. ЭСТРЕЛА-ЛЬОПИС, А. В. ЧЕВЫЧАЛОВА, Е. М. ФЕСЕНКО и др. No. 5: 681 (2007). 4. А. Ю. Крутяков, А. А. Кудринский, А. Ю. Оленин, Г. В. Лисичкин, Успехи химии, 77, № 3: (2008). 5. E. C. Dreaden, A. M. Alkilany, X. Huang, C. J. Murphy, and M. A. El-Sayed, Chem. Soc. Rev, 41: 2740 (2012). 6. P. K. Jain, X. Huang, I. H. El-Sayed, and M. A. El-Sayed, Plasmonics, 2: 107 (2007). 7. B. N. Khlebtsov, V. P. Zharov, A. G. Melnikov, V. V. Tuchin, N. G. Khlebtsov, Nanotechnology, 17, No. 20: 5167 (2006). 8. D. Pissuwan, T. Niidome, and M. B. Cortie, Journal of Controlled Release, 149: 65 (2011). 9. J. Shi, Z. Xiao, N. Kamaly, and O. C. Farokhzad, Acc. Chem. Res., 44, No. 10: 1123 (2011). 10. S. Abalde-Cela, P. Aldeanueva-Potel, C. Mateo-Mateo et al., Journal of Royal Society Interface, 7: 435 (2010). 11. L. Vigderman and E. R. Zubarev, Adv. Drug Deliv. Rev., 65: 663 (2013). 12. R. Bhattacharya and P. Mukherjee, Adv. Drug Deliv. Rev., 60: 1289 (2008). 13. К. Б. Яцимирский, Проблемы бионеорганической химии (Москва: Мир: 1976). 14. K. Hikosaka et al. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 66: 195 (2008). 15. P. V. Asharani, Xinyi Ng, M. Р. Hande, and S. Valiyaveettil, Nanomedicine, 5, No. 1: 51 (2010). 16. J. A. Kralovec, Chlorella Composition Having High Molecular Weight Polysac- charides and Polysaccharide Complexes (Patent US №6974576) (13.12.2005). 17. А. Komiyama and I. Umezawa, Acidic Polysaccharide CH-1 Isolated from Chlo- rella Pyrenoidosa and the Use Thereof (Patent US №4533548) (06.08.1985). 18. S. Misra, B. P. Toole, and S. Ghatak, J. Bio. Chem., 281, No. 46: 34936 (2006). 19. В. Р. Эстрела-Льопис, Т. И. Бородинова, И. Н. Юркова, Коллоидно- химические основы нанонауки (Киев: Академпериодика: 2005), т. 8, с. 238. 20. A. S. Daba and O. U. Ezeronye, African Journal of Biotechnology, 2, No. 12: 672 (2003). 21. A. H. Xu, H. S. Chen, B. C. Sun, X. R. Xiang, Y. F. Chu, F. Zhai, and L. C. Jia, World J. Gastroenterology, 9, No. 11: 2424 (2003). 22. E. M. Hodnett, J. Amirmoazzami, and J. Tai, Journal of Medicinal Chemistry, 21, No. 7: 652 (1978). 23. M. A. Yessine and J. C. Leroux, Adv. Drug Deliv. Rev., 56: 999 (2004). 24. W. Yu, N. Zhang, and C. Li, Cure Pharm. Des., 15, No. 32: 3826 (2009). 25. В. Ц. Шапот, Биохимические аспекты опухолевого роста (Москва: Меди- цина: 1975), с. 304. 26. С. Осинский, П. Ваупель, Микрофизиология опухолей (Киев: Наукова дум- ка: 2009), с. 108. 27. B. A. Kamen and A. Capdevila, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5983 (1986). 28. J. Sudimack and R. J. Lee, Adv. Drug Deliv. Rev., 41: 147 (2000). 29. Z. Zhang, J. Jia, Y. Lai, Y. Ma, J. Weng, and L. Sun, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18: 5528 (2010). 30. V. Dixit, J. Bossche, D. M. Sherman, D. H. Thompson, and R. P. Andres, Bio- conjugate Chem., 17, No. 3: 603 (2006). 31. C. J. Xiong, X. H. Yuan, J. D. Zhou, Y. Chen, F. H. Chen, and L. X. Xu, African J. Pharm. Pharmacol., 7, No. 12: 666 (2013). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21692448 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yu%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19925431 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zhang%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19925431 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19925431 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19925431 ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ НАНОЧАСТИЦ Pt С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ 755 32. E. Schneider, M. Chavali et al., Cancer Research, 72, No. 8, Suppl. 1 (2012); doi: 10.1158/1538-7445.AM2012-1956. 33. S. Mandal, A. Bonifacio et al., Colloid Polym. Sci., 289, No. 3: 269 (2001). 34. А. А. Миронов, Методы электронной микроскопии в биологии и медицине (Санкт-Петербург: Наука: 1994). 35. P. S. Low and S. A. Kularatne, Curr. Opin. Chem. Biol., 13, No. 3: 256 (2009). 36. И. Я. Захарова, Л. В. Косенко, Методы исследования полисахаридов мик- роорганизмов (Киев: Наукова думка: 1982), с. 36. 37. В. Р. Естрела-Льопис и др., Дослідження коагуляції у плазмі крові наноча- стинок та нанокристалів золота і платини та їх взаємодії з трансфор- мованими клітинами певного онкогенезу з метою використання в онкоте- рапії (звіт про науково-дослідну роботу № 0107U007693) (2009). 38. Y. Cheng and W. H. Prusoff, Biochem. Pharmacol., 22, No. 23: 3099 (1973). 39. Apoptosis in Carcinogenesis and Chemotherapy. Apoptosis in Cancer (Eds. G. G. Chen and P. B. S. Lai) (Dordrecht, The Netherlands: Springer Science+Business Media BV: 2009). http://academic.research.microsoft.com/Author/55470978/subhra-mandal http://academic.research.microsoft.com/Author/50278272/alois-bonifacio
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-75933
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	1816-5230
language	Russian
last_indexed	2025-12-07T19:04:24Z
publishDate	2013
publisher	Інститут металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України
record_format	dspace
spelling	Эстрела-Льопис, В.Р. Чевычалова, А.В. Фесенко, Е.М. Довбешко, Г.И. Литвин, П.М. 2015-02-06T12:34:52Z 2015-02-06T12:34:52Z 2013 Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками / В.Р. Эстрела-Льопис, А.В. Чевычалова, Е.М. Фесенко, Г.И. Довбешко, П.М. Литвин // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології: Зб. наук. пр. — К.: РВВ ІМФ, 2013. — Т. 11, № 4. — С. 741-755. — Бібліогр.: 39 назв. — рос. 1816-5230 PACSnumbers:81.07.Pr,82.45.Tv,83.80.Lz,87.15.-v,87.19.xj,87.64.-t,87.85.Rs https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/75933 Разработан метод синтеза таргетных, функционализированных фолатами и модифицированных полисахаридами наночастиц платины PtПС–ФК и исследовано их влияние на опухолевые клетки различного онкогенеза. Оптимальные условия синтеза PtПС–ФК установлены на основе электроповерхностных и спектральных исследований формирования адсорбционного слоя полисахаридов и фолатов на поверхности наночастиц. Установлена оптимальная концентрация реагентов, условия (время, температура, порядок смешивания) для синтеза нанокомпозитов PtПС–ФК. На основе исследований гетерокоагуляции PtПС–ФК с раковыми клетками и кинетики цитотоксического эффекта определено токсическое действие таких частиц на раковые клетки и селективность в сравнении со здоровыми клетками. При исследовании использованы методы атомносиловой, электронной и оптической микроскопии и ИК-спектроскопия. Розроблено метод синтезу тарґетних, функціоналізованих фолатами та модифікованих полісахаридами наночастинок платини PtПС–ФК, досліджено їх вплив на пухлинні клітини різного онкогенезу. Оптимальні умови синтезу PtПС–ФК встановлено на основі електроповерхневих і спектральних досліджень формування адсорбційного шару полісахаридів та фолатів на поверхні наночастинок. Встановлено оптимальну концентрацію реаґентів, умови (час, температура, порядок змішування) для синтезу нанокомпозитів PtПС–ФК. На основі досліджень гетерокоаґуляції PtПС–ФК з клітинами раку крові та кінетики цитотоксичного ефекту визначено токсичну дію таких частинок на ракові клітини та її селективність у порівнянні з впливом на здорові клітини. При досліджені використано методи атомно-силової, електронної й оптичної мікроскопії та ІЧ-спектроскопію. The method for synthesis of targeted platinum nanoparticles (PtPS–F) functionalized by folate and modified by polysaccharides is developed, and the effect of these polysaccharides on tumour cells of different carcinogenesis is studied. Optimal conditions for the PtPS–F synthesis are revealed, based on spectral and electrosurface studies of formation of the adsorption layer of polysaccharides and folate on the surface of nanoparticles. The optimum concentration of reactants and the conditions (time, temperature, sequence of mixing) for the synthesis of the PtPS–F nanocomposites are established. The toxic effect of nanocomposites on the cancer cells and its selectivity in comparison with healthy cells are determined by means of investigation of heterocoagulation and kinetics of cytotoxic effect. The methods of atomic force, electron and optical microscopies as well as IR-spectroscopy are used. Работа выполнена в рамках проекта № 63/Н при финансовой поддержке Целевой комплексной программы фундаментальных исследований НАН Украины «Фундаментальные проблемы наноструктурных систем, наноматериалов, нанотехнологий». ru Інститут металофізики ім. Г.В. Курдюмова НАН України Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками Article published earlier
spellingShingle	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками Эстрела-Льопис, В.Р. Чевычалова, А.В. Фесенко, Е.М. Довбешко, Г.И. Литвин, П.М.
title	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками
title_full	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками
title_fullStr	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками
title_full_unstemmed	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками
title_short	Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками
title_sort	гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/75933
work_keys_str_mv	AT éstrelalʹopisvr geterokoagulâciâmodificirovannyhpolisaharidamiifunkcionalizirovannyhfolataminanočasticplatinysrakovymikletkami AT čevyčalovaav geterokoagulâciâmodificirovannyhpolisaharidamiifunkcionalizirovannyhfolataminanočasticplatinysrakovymikletkami AT fesenkoem geterokoagulâciâmodificirovannyhpolisaharidamiifunkcionalizirovannyhfolataminanočasticplatinysrakovymikletkami AT dovbeškogi geterokoagulâciâmodificirovannyhpolisaharidamiifunkcionalizirovannyhfolataminanočasticplatinysrakovymikletkami AT litvinpm geterokoagulâciâmodificirovannyhpolisaharidamiifunkcionalizirovannyhfolataminanočasticplatinysrakovymikletkami

Гетерокоагуляция модифицированных полисахаридами и функционализированных фолатами наночастиц платины с раковыми клетками

Institution

Similar Items