Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации
Кiлькiснi змiни бiлкiв теплового шоку Hsp70 та Hsp90 у реакцiї проросткiв гороху на короткочасну дiю гiпергравiтацiї (3, 7, 10 i 14g) вивчали з використанням Вестерн-блот-аналiзу. Виявлено значнi змiни у рiвнi цих бiлкiв як пiд час дiї гравiтацiйних сил, так i в ходi реадаптацiї. Встановлено пiдвище...
Saved in:
| Date: | 2009 |
|---|---|
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2009
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7747 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации / Л.Е. Козеко // Доп. НАН України. — 2009. — № 1. — С. 140-143. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859594144585875456 |
|---|---|
| author | Козеко, Л.Е. |
| author_facet | Козеко, Л.Е. |
| citation_txt | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации / Л.Е. Козеко // Доп. НАН України. — 2009. — № 1. — С. 140-143. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | Кiлькiснi змiни бiлкiв теплового шоку Hsp70 та Hsp90 у реакцiї проросткiв гороху на короткочасну дiю гiпергравiтацiї (3, 7, 10 i 14g) вивчали з використанням Вестерн-блот-аналiзу. Виявлено значнi змiни у рiвнi цих бiлкiв як пiд час дiї гравiтацiйних сил, так i в ходi реадаптацiї. Встановлено пiдвищений вмiст Hsp70 пiсля 15-хвилинної дiї гiпергравiтацiї i Hsp90 — пiсля 1-годинної. Ступiнь i тривалiсть змiн у кiлькостi цих бiлкiв залежали вiд дози гравiтацiйного впливу.
The expression of heat shock proteins Hsp70 and Hsp90 in pea seedlings under short-term hypergravity (3, 7, 10, and 14g) has been investigated by Western-blot analysis. Significant changes in the Hsp70 and Hsp90 level during both a g-force exposure and readaptation are established. An increase in the Hsp70 amount after the 15-min exposure to hypergravity and in the Hsp90 ones after the 1-h exposure is determined. The intensity and duration of the increase depend on the hypergravity dose.
|
| first_indexed | 2025-11-27T18:11:51Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 575.826:577.218
© 2009
Л.Е. Козеко
Количественные изменения белков теплового шока
Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха
на кратковременное действие гипергравитации
(Представлено членом-корреспондентом НАН Украины Е.Л. Кордюм)
Кiлькiснi змiни бiлкiв теплового шоку Hsp70 та Hsp90 у реакцiї проросткiв гороху
на короткочасну дiю гiпергравiтацiї (3, 7, 10 i 14g) вивчали з використанням Вес-
терн-блот-аналiзу. Виявлено значнi змiни у рiвнi цих бiлкiв як пiд час дiї гравiтацiйних
сил, так i в ходi реадаптацiї. Встановлено пiдвищений вмiст Hsp70 пiсля 15-хвилинної
дiї гiпергравiтацiї i Hsp90 — пiсля 1-годинної. Ступiнь i тривалiсть змiн у кiлькостi
цих бiлкiв залежали вiд дози гравiтацiйного впливу.
Важной составляющей неспецифической стрессовой реакции живых систем на воздействия
внешних факторов является синтез белков теплового шока (heat shock protein, Hsp) [1, 2].
Являясь молекулярными шаперонами, они обеспечивают фолдинг/рефолдинг белков клет-
ки, предотвращение агрегации денатурированных белков, сборку олигомерных комплексов,
транспорт белков через мембраны внутриклеточных компартментов и т. д. Вместе с тем
генная экспрессия различных семейств Hsp характеризуется определенной стресс-специ-
фичностью [2]. Очевидно, это связано с тем, что белки каждого семейства функционируют
согласно собственной стратегии [3, 4].
В настоящей работе Hsp рассматриваются в связи с исследованием механизмов адапта-
ции растения к действию гипергравитации — одного из негативных факторов космического
полета. Известны единичные публикации по генной экспрессии этих белков в организмах,
подвергнутых гравитационным перегрузкам, причем почти все они выполнены на животных
объектах [5, 6]. На растительных объектах проведен анализ генной экспрессии в культуре
клеток Arabidopsis thaliana после 1-часового действия гипергравитации (7g), показавший
резкое возрастание количества транскриптов Hsp90 и Hsp60 [7]. Однако детальные иссле-
дования генной экспрессии Hsp в растениях под влиянием гипергравитации до сих пор не
проводились. В данном сообщении приведены результаты определения количества Hsp70
и Hsp90 в проростках гороха при кратковременном действии гипергравитации в диапазоне
3–14g, а также в процессе реадаптации.
Материалы и методы исследования. Пятидневные проростки гороха (Pisum sati-
vum L., сорт Интенсивный), выращенные в темноте при (22± 1) ◦С, подвергали центрифу-
гированию с ускорениями 3, 7, 10 и 14g в течение 15 мин и 1 ч, используя центрифугу с ба-
кет-ротором радиусом 0,65 м. Часть проростков была заморожена в жидком азоте сразу же
после центрифугирования, другая часть — после реадаптации в течение 1,5 ч (после 15 мин
центрифугирования), 1,5 ч и 24 ч (после 1 ч центрифугирования). Контролем служили
проростки, растущие стационарно при 1g. Для выделения растворимых белков заморожен-
ный материал гомогенизировали с буфером, содержащим 25 мM трис-HCl, pH 8,0, 1 мM
ЭДTA, 20 мM NaCl, 1 мM ФМСФ. Гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 14000g
(4 ◦C). Концентрацию белка измеряли по [8]. Затем к гомогенату добавляли равное количе-
140 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №1
ство буфера, содержащего 0,125 M трис-HCl, pH 6,8, 4% ДС-Na, 20% глицерин, 5% β-мер-
каптоэтанол. Количество Hsp70 и Hsp90 анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа.
Белки разделяли в 10%-м полиакриламидном геле, содержащем ДС-Na (ПААГ-ДС-Na) [9],
затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану в течение 1 ч при 300 мА. Иммуноде-
текцию белков проводили как описано в [10], используя антитела к Hsp70, Hsp90 и актину,
антимышиные IgG, коньюгированные с биотином, и экстравидин-пероксидазную систему
их визуализации (“Sigma”). Актин использовали в качестве внутреннего контроля загрузки
белка в геле. С помощью денситометрического анализа с использованием компьютерной
программы ImageMasterTM TotalLab, version 2.00 (“Amersham”) было определено количест-
во белка (в усл. ед.), соответствующее каждой зоне на блотах. Эксперименты проводились
в трехкратной повторности.
Результаты исследования и их обсуждение. С помощью Вестерн-блот-анализа
выявлены значительные количественные изменения Hsp70 и Hsp90 в проростках гороха,
подвергнутых действию гипергравитации. Уже после 15 мин центрифугирования количест-
во Hsp70 возрастало, причем процент превышения увеличивался с увеличением ускорения —
от 13% при 3g до почти 100% при 14g по сравнению с контрольными растениями (рис. 1,
А). Через 1,5 ч после окончания 15-минутного центрифугирования количество Hsp70 сни-
жалось в проростках, подвергнутых действию 3 и 7g, однако продолжало возрастать в про-
ростках после действия 10 и 14g, что наглядно видно на гистограммах, изображающих
относительное количество исследуемых белков в процентах от контроля (см. рис. 1, А, б ).
После центрифугирования проростков в течение 1 ч количество Hsp70 превышало таковое
в контроле на 40–85% (рис. 1, Б). В ходе реадаптации уровень Hsp70 оставался высоким
в течение 1,5 ч и снижался через 24 ч, достигая контрольного в проростках, подвергнутых
действию 3 и 7g (см. рис. 1, Б, б ).
Количество Hsp90 после 15-минутного центрифугирования существенно не изменялось,
тогда как после 1-часового — повышалось на 60–80% (см. рис. 1). В ходе реадаптации после
1-часового центрифугирования уровень Hsp90 оставался высоким в течение первых 1,5 ч
и снижался до нормального к 24-му часу (см. рис. 1, Б, б ). Следует отметить, что Hsp90
детектировался в значительном количестве во всех образцах, включая контрольные, что
характерно для белков этого семейства и, как полагают, связано с их участием в основных
метаболических процессах клетки (“housekeeping functions”) [4].
Полученные данные свидетельствуют об усилении генной экспрессии Hsp70 и Hsp90
в ответ на действие гипергравитации, при этом степень изменений коррелирует с величиной
ускорения и длительностью воздействия. Отметим, что наиболее значительное и продол-
жительное повышение содержания этих стрессовых белков выявлялось после действия 10
и 14g, что превосходит перегрузки во время взлета и посадки космического аппарата (3,5–
8g). Повышение количества Hsp70 и Hsp90, в свою очередь, указывает на возникнове-
ние в клетке потребности в интенсификации функционирования молекулярных шаперонов.
Можно предположить, что активизация окислительных процессов в клетке, выявленная
в реакции растения на гравитационное воздействие [11], приводит к нарушению белковых
конформаций и к возникновению опасности накопления частично денатурированных бел-
ков и их агрегации. Появление в клетке белков в ненативных конформациях в количестве,
превышающем определенный уровень, по одной из существующих моделей транскрипцион-
ной регуляции генов Hsp, может активировать их экспрессию [12]. Согласно другой моде-
ли, основанной на роли цитоплазматической мембраны как первичного сайта восприятия
внешних сигналов, изменения в состоянии мембраны передаются в ядро через каскад хи-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №1 141
Рис. 1. Результаты Вестерн-блот-анализа Hsp90 и Hsp70 в проростках гороха, подвергнутых действию ги-
пергравитации в течение 15 мин (А) и 1 ч (Б): а — иммуноблоты Hsp90, Hsp70 и актина после электрофоре-
тического разделения в ПААГ-ДС-Na суммарных растворимых белков проростков после гравитационного
воздействия; б — гистограммы относительного содержания Hsp90 и Hsp70 в контрольных проростках (1 ),
проростках после гравитационного воздействия (2 ), 1,5- и 24-часовой реадаптации (3, 4 соответственно).
На гистограммах дается ср. значение± ср. ошибка по трем независимым экспериментам
мических и физических факторов, вызывая индукцию генов Hsp [13]. Изменение формы
клетки под действием гипергравитации показано на примере животной клетки, внешним
слоем которой является цитоплазматическая мембрана [14].
По результатам данной работы зависимость изменений уровня Hsp70 от дозы воздейст-
вия была более четкой, изменения инициировались раньше и сохранялись в течение более
длительного периода времени, чем это было определено для Hsp90. Эти различия могут
быть связаны с особенностями шаперонных функций этих белков. Согласно современным
представлениям Hsp70 связывает большинство белков с нарушенной конформацией, тогда
как функции Hsp90 выходят за рамки основных функций молекулярных шаперонов: при
нормальных условиях Hsp90 специфически вовлечен в фолдинг и конформационную регу-
ляцию белков, участвующих в передаче клеточных сигналов [3, 4], в условиях же клеточно-
142 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №1
го стресса он может участвовать в ренатурации белков с нарушенной конформацией [15].
Можно предположить, что Hsp70 первым принимает вызов опасности накопления белков
с ненативной конформацией, в то время как Hsp90 выполняет свои специфические функции,
а активация синтеза Hsp90 происходит при более длительном гравитационном воздействии.
В целом, выявленные изменения в уровне Hsp70 и Hsp90 в проростках гороха под действием
гипергравитации должны играть важную роль в контроле качества клеточных белков во
время и после действия гравитационных перегрузок.
1. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке // Цитология. – 2000. – 42,
№ 4. – С. 323–342.
2. Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. –
1991. – 42. – P. 579–620.
3. Young J. C., Moarefi I., Hartl F. U. Hsp90: a specialized but essential protein folding tool // J. Cell Biol. –
2001. – 154, No 2. – P. 267–273.
4. Picard D. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation // Cell. Mol. Life Sci. – 2002. –
59. – P. 1640–1648.
5. Sun X.Q., Li J. S., Wu X.Y. The expression of heat shock protein 70 in rat brain after +Gz exposure //
J. Gravit. Physiol. – 2002. – 9, No 1. – P. 23–24.
6. Sun X.Q., Cao X. S., Li J. S. Effects of +Gz on memory and brain heat shock protein 70 expression in
rats // Ibid. – 2003. – 10, No 1. – P. 39–40.
7. Martzivanou M., Hampp R. Hyper-gravity effects on the Arabidopsis transcriptome // Physiologia Plan-
tarum. – 2002. – 118. – P. 221–231.
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – 72. – P. 248–254.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //
Nature. – 1970. – 227, No 5259. – P. 680.
10. Kozeko L., Kordyum E. The stress protein level under clinorotation in context of the seedling developmental
program and the stress response // Microgravity Sci. Technol. – 2006. – 18, No 3/4. – P. 254–256.
11. Барабой В.А., Жадько С.И. Ранние изменения интенсивности спонтанной хемилюминесценции кор-
ней проростков гороха при гипергравитации // Докл. АН Украины. – 1992. – № 7. – С. 156–158.
12. Ananthan J., Goldberg A. L., Voellmy R. Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger
the activation of heat shock genes // Science. – 1986. – 232. – P. 522–524.
13. Leone A., Perrotta C., Maresca B. Plant tolerance to heat stress: current strategies and new emergent
insights // Abiotic stresses in plants / Ed. L. Sanita di Toppi, B. Pawlik-Skowronska. – London: Kluwer,
2003. – P. 1–22.
14. van Loon J. J.W.A., van Laar M.C., Korterik J. P. et al. Gravity Changes Cell Shape // ELGRA News. –
2005. – 24. – P. 85.
15. Nathan D.F., Vos M.H., Lindquist S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1997. – 94. – P. 12949–12956.
Поступило в редакцию 07.05.2008Институт ботаники им. Н. Г. Холодного
НАН Украины, Киев
L.Ye. Kozeko
Quantitative changes of heat shock proteins Hsp70 и Hsp90
in the response of pea seedlings to short-term hypergravity
The expression of heat shock proteins Hsp70 and Hsp90 in pea seedlings under short-term hypergra-
vity (3, 7, 10, and 14g) has been investigated by Western-blot analysis. Significant changes in the
Hsp70 and Hsp90 level during both a g-force exposure and readaptation are established. An increase
in the Hsp70 amount after the 15-min exposure to hypergravity and in the Hsp90 ones after the 1-h
exposure is determined. The intensity and duration of the increase depend on the hypergravity dose.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №1 143
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-7747 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-27T18:11:51Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Козеко, Л.Е. 2010-04-12T11:51:08Z 2010-04-12T11:51:08Z 2009 Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации / Л.Е. Козеко // Доп. НАН України. — 2009. — № 1. — С. 140-143. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7747 575.826:577.218 Кiлькiснi змiни бiлкiв теплового шоку Hsp70 та Hsp90 у реакцiї проросткiв гороху на короткочасну дiю гiпергравiтацiї (3, 7, 10 i 14g) вивчали з використанням Вестерн-блот-аналiзу. Виявлено значнi змiни у рiвнi цих бiлкiв як пiд час дiї гравiтацiйних сил, так i в ходi реадаптацiї. Встановлено пiдвищений вмiст Hsp70 пiсля 15-хвилинної дiї гiпергравiтацiї i Hsp90 — пiсля 1-годинної. Ступiнь i тривалiсть змiн у кiлькостi цих бiлкiв залежали вiд дози гравiтацiйного впливу. The expression of heat shock proteins Hsp70 and Hsp90 in pea seedlings under short-term hypergravity (3, 7, 10, and 14g) has been investigated by Western-blot analysis. Significant changes in the Hsp70 and Hsp90 level during both a g-force exposure and readaptation are established. An increase in the Hsp70 amount after the 15-min exposure to hypergravity and in the Hsp90 ones after the 1-h exposure is determined. The intensity and duration of the increase depend on the hypergravity dose. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Біологія Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации Quantitative changes of heat shock proteins Hsp70 и Hsp90 in the response of pea seedlings to short-term hypergravity Article published earlier |
| spellingShingle | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации Козеко, Л.Е. Біологія |
| title | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации |
| title_alt | Quantitative changes of heat shock proteins Hsp70 и Hsp90 in the response of pea seedlings to short-term hypergravity |
| title_full | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации |
| title_fullStr | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации |
| title_full_unstemmed | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации |
| title_short | Количественные изменения белков теплового шока Hsp70 и Hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации |
| title_sort | количественные изменения белков теплового шока hsp70 и hsp90 в реакции проростков гороха на кратковременное действие гипергравитации |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7747 |
| work_keys_str_mv | AT kozekole količestvennyeizmeneniâbelkovteplovogošokahsp70ihsp90vreakciiprorostkovgorohanakratkovremennoedeistviegipergravitacii AT kozekole quantitativechangesofheatshockproteinshsp70ihsp90intheresponseofpeaseedlingstoshorttermhypergravity |