Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв
Методом полiморфiзму довжин рестрикцiйних фрагментiв (tRFLP) проведено порiвняльний аналiз комплексу прокарiотних мiкроорганiзмiв пiдзолистих грунтiв при довготривалому вирощуваннi льону-довгунця, з урахуванням iндексу генетичної рiзноманiтностi. Using a method of polymorphism of the lengths of rest...
Gespeichert in:
| Datum: | 2009 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2009
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7756 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв / Н.В. Патыка, Ю.В. Круглов, И.А. Тихонович, В.Ф. Патыка // Доп. НАН України. — 2009. — № 1. — С. 187-192. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-7756 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Патыка, Н.В. Круглов, Ю.В. Тихонович, И.А. Патыка, В.Ф. 2010-04-12T12:06:26Z 2010-04-12T12:06:26Z 2009 Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв / Н.В. Патыка, Ю.В. Круглов, И.А. Тихонович, В.Ф. Патыка // Доп. НАН України. — 2009. — № 1. — С. 187-192. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7756 579.26:631.461 Методом полiморфiзму довжин рестрикцiйних фрагментiв (tRFLP) проведено порiвняльний аналiз комплексу прокарiотних мiкроорганiзмiв пiдзолистих грунтiв при довготривалому вирощуваннi льону-довгунця, з урахуванням iндексу генетичної рiзноманiтностi. Using a method of polymorphism of the lengths of restriction fragments (tRFLP), the comparative analysis of a complex of procaryotic microorganisms of podsolic soils is carried out on the long-term cultivation of flax, taking the index of genetic variety into account. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Екологія Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв The length polymorphism profile of restrictive fragments (tRFLP) of a complex of procaryotic microorganisms in podsolic soils Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв |
| spellingShingle |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв Патыка, Н.В. Круглов, Ю.В. Тихонович, И.А. Патыка, В.Ф. Екологія |
| title_short |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв |
| title_full |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв |
| title_fullStr |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв |
| title_full_unstemmed |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв |
| title_sort |
профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (trflp) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв |
| author |
Патыка, Н.В. Круглов, Ю.В. Тихонович, И.А. Патыка, В.Ф. |
| author_facet |
Патыка, Н.В. Круглов, Ю.В. Тихонович, И.А. Патыка, В.Ф. |
| topic |
Екологія |
| topic_facet |
Екологія |
| publishDate |
2009 |
| language |
Russian |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
The length polymorphism profile of restrictive fragments (tRFLP) of a complex of procaryotic microorganisms in podsolic soils |
| description |
Методом полiморфiзму довжин рестрикцiйних фрагментiв (tRFLP) проведено порiвняльний аналiз комплексу прокарiотних мiкроорганiзмiв пiдзолистих грунтiв при довготривалому вирощуваннi льону-довгунця, з урахуванням iндексу генетичної рiзноманiтностi.
Using a method of polymorphism of the lengths of restriction fragments (tRFLP), the comparative analysis of a complex of procaryotic microorganisms of podsolic soils is carried out on the long-term cultivation of flax, taking the index of genetic variety into account.
|
| issn |
1025-6415 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7756 |
| citation_txt |
Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв / Н.В. Патыка, Ю.В. Круглов, И.А. Тихонович, В.Ф. Патыка // Доп. НАН України. — 2009. — № 1. — С. 187-192. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT patykanv profilʹpolimorfizmadlinrestrikcionnyhfragmentovtrflpkompleksaprokariotnyhmikroorganizmovpodzolistyhpočv AT kruglovûv profilʹpolimorfizmadlinrestrikcionnyhfragmentovtrflpkompleksaprokariotnyhmikroorganizmovpodzolistyhpočv AT tihonovičia profilʹpolimorfizmadlinrestrikcionnyhfragmentovtrflpkompleksaprokariotnyhmikroorganizmovpodzolistyhpočv AT patykavf profilʹpolimorfizmadlinrestrikcionnyhfragmentovtrflpkompleksaprokariotnyhmikroorganizmovpodzolistyhpočv AT patykanv thelengthpolymorphismprofileofrestrictivefragmentstrflpofacomplexofprocaryoticmicroorganismsinpodsolicsoils AT kruglovûv thelengthpolymorphismprofileofrestrictivefragmentstrflpofacomplexofprocaryoticmicroorganismsinpodsolicsoils AT tihonovičia thelengthpolymorphismprofileofrestrictivefragmentstrflpofacomplexofprocaryoticmicroorganismsinpodsolicsoils AT patykavf thelengthpolymorphismprofileofrestrictivefragmentstrflpofacomplexofprocaryoticmicroorganismsinpodsolicsoils |
| first_indexed |
2025-11-27T02:10:06Z |
| last_indexed |
2025-11-27T02:10:06Z |
| _version_ |
1850793014665936896 |
| fulltext |
УДК 579.26:631.461
© 2009
Н.В. Патыка, Ю. В. Круглов, И. А. Тихонович, В. Ф. Патыка
Профиль полиморфизма длин рестрикционных
фрагментов (tRFLP) комплекса прокариотных
микроорганизмов подзолистых почв
(Представлено академиком НАН Украины В. С. Подгорским)
Методом полiморфiзму довжин рестрикцiйних фрагментiв (tRFLP) проведено порiв-
няльний аналiз комплексу прокарiотних мiкроорганiзмiв пiдзолистих грунтiв при довго-
тривалому вирощуваннi льону-довгунця, з урахуванням iндексу генетичної рiзноманiт-
ностi.
Известно, что микроорганизмы являются неотъемлемым гомеостатическим составляющим
компонентом почвы, который осуществляет и определяет в ней важнейшие функции транс-
формации веществ и энергии. Микробиоте принадлежит важная роль в функционирова-
нии различных экосистем, но развитию детального изучения микробного биоразнообразия
в окружающей среде препятствовали ограниченные прикладные возможности. Это, в свою
очередь, создавало дополнительные сложности для микробиологов, поскольку при оценке
любым из известных методов большого количества разнообразных организмов и получе-
нии представлений относительно их экологической изменчивости необходимо проанализи-
ровать достаточно большое количество образцов. За прошедшее десятилетие в области био-
логии широкое развитие получили молекулярные методы, позволяющие преодолеть проб-
лемы, возникающие в практике классических микробиологических методов исследований.
Использование молекулярных методов в почвенной микробиологии показало, что во мно-
гих естественных условиях обитания биоразнообразие и сложность микробных сообществ,
так же как и их пространственно-временная разнородность, гораздо более обширны, чем
первоначально ожидалось.
Доминирующая часть микробных сообществ в почве представлена сложным комплексом
различных морфотипов и физиологических групп. Общепринятая почвенная микробиоло-
гия изучает только те немногие микробные сообщества (таксономические группы), которые
культивируются на селективных средах. Для количественной оценки микробиологических
особенностей почв, как правило, используются методы определения микробной биомассы,
количества выделенного углекислого газа, но практика показывает, что эти методы не мо-
гут дать полной информации об основе почв, т. е. структуре микробных сообществ. То же
самое можно сказать в отношении анализа уровня сообществ, при котором используется
метод “стекол обрастания”.
Структура микробных сообществ является неотъемлемой составной частью детальной
характеристики почв, включая определенные процессы и факторы, прямо или косвенно
влияющие на их особенности.
Нам известно не более 10% того, что имеется в мире микроорганизмов. Например, ко-
личественная оценка бактериальных разновидностей в почве показала, что их число насчи-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №1 187
тывает более чем 4000 разновидностей (биовариантов) на 30 г почвы, это свидетельствует
о сложности и важности изучения межбиотических взаимодействий всех компонентов при-
родных сообществ, включая растения, а также применяемые агроприемы [1–3].
Использование молекулярно-генетических методов в микробиологии расширило воз-
можности исследований и привело к формированию нескольких направлений в система-
тике микроорганизмов:
создание филогенетической систематики микроорганизмов;
идентификация штаммов с использованием филогенетической и фенотипической ин-
формации;
выявление микроорганизмов из окружающей среды без их культивирования.
На сегодняшний день многие работы базируются на исследованиях нуклеиновых кис-
лот (ДНК и РНК), непосредственно извлеченных из образцов различных почв [3, 4]. При
помощи полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с соответствующими филогенетическими мар-
керами (16S rRNA, 18S rRNA и др.) проводится изучение, определение генов, кодирующих
малую или большую субъединицу рибосомальной РНК (rRNA), что способствует дальней-
шему развитию исследований разнообразных изолятов и некультивируемых видов микроб-
ных сообществ биогеоценозов [5, 6]. Следует отметить, что сравнительный анализ природ-
ных микробных сообществ способствует ускоренному изучению их структурно-функцио-
нальных особенностей, учитывая специфичность уникальных или доминирующих групп
при определенных условиях [7, 8].
Методика. Изучение почвенных микробных сообществ осуществлялось на базе сверх-
длительного (с 1912 г.) стационарного полевого опыта Российского государственного
аграрного университета Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязе-
ва (МСХА). Опытное поле находится в центральной части Русской равнины, на окраине
склона Клинско-Дмитровской гряды. Рельеф близлежащей территории представляет мо-
ренную равнину на водоразделе рек Москва и Яуза и возвышается над уровнем реки Моск-
ва на 60 м. Опытный участок размером 1,53 га с ровной макроповерхностью и небольшим
уклоном (1 град) на северо-запад. Почвообразующие породы представлены четвертичными
отложениями супесчаной и суглинистой бурой морены с прослойками (10–22) юрских глин.
Международное название почвообразующей породы — суглинистая красно-бурая плейсто-
ценовая морена.
Почва дерново-слабоподзолистая, старопахотная кислая и заплывающая (по классифи-
кации ФАО — Podsolluvisol). Согласно данным гранулометрического анализа, в пахотном
(0–20 см) слое почвы содержалось фракций менее 0,01 мм 22,0% [9].
Образцы почв отбирали осенью после сбора урожая льносоломки (Linum usitatissi-
mum L.) из верхнего 15 см пахотного горизонта. Отбор почвенных образцов для микро-
биологического анализа осуществляли из следующих вариантов опыта:
Бессменная культура: 1 — лен (контроль); 2 — лен + NPK; 3 — лен + навоз;
Севооборот: 4 — лен + NPK; 5 — чистый пар.
Экстракцию ДНК почвенных микроорганизмов осуществляли методом, описанным
в [10]. Проводили визуальную детекцию полученных образцов ДНК после электрофорети-
ческого разделения в 1% агарозном геле (рис. 1), после чего полученную почвенную ДНК
очищали от примесей гуминовых кислот как описано в [11].
Выполняли ПЦР флуоресцентно-меченными праймерами (рис. 2) Eu3 [12], затем 1 мкл
полученного продукта ПЦР рестрицировали ферментами НаеIII и MspI (обязательными
и незаменимыми инструментами практически всех этапов этого сложного процесса).
188 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №1
Рис. 1. Электрофореграмма тотальной почвенной ДНК:
1 — маркер молекулярных масс (1500 bp); 2–15 — повторности вариантов отбора
Рис. 2. Электрофореграмма 16S rRNA с флуоресцентно-меченным праймером:
1 — маркер молекулярных масс (1500 bp); 2–13 — повторности вариантов отбора
В автоматическом секвенаторе Beckman CEQ 8000 определяли интенсивность флуорес-
ценции каждого пика, который пропорционален количеству геномного соответствия ДНК
для каждой таксономической единицы в образце. Для классификации биотического со-
общества на примере полученных результатов использовались показатели доминирования
и сходства между двумя пробами [13, 14].
Результаты исследования и их обсуждение. Анализ профилей tRFLP (рис. 3)
показал значительную разницу между ними. Это отображается как в количестве обнару-
женных генотипов, так и в структуре их распределения.
По индексу “видового” богатства прокариот почвы различных вариантов опыта распо-
лагаются в убывающем порядке следующим образом: лен в севообороте в варианте с при-
менением NPK → бессменная культура льна, навоз → бессменный лен → бессменный лен
по фону NPK → чистый пар. Таким образом, видовое богатство прокариот выше в почвах,
куда систематически поступали вещества в виде растительных остатков и органических
удобрений, что согласуется с имеющимися в литературе данными.
Более подробный анализ экологических параметров комплекса прокариот (табл. 1) пока-
зал, что генотипическое разнообразие, определяемое по индексу Шеннона, наиболее высо-
кое в почве, где лен выращивали в севообороте (4,01), наименьшее в бессменной культуре
льна (2,37–2,90) и чистом паре (2,66). Промежуточное положение занимает бессменный лен,
выращиваемый по фону систематического применения навоза (3,68).
Индекс доминирования является относительно низким, что говорит о достаточно ста-
бильных гомеостатических системах, сложившихся на протяжении 95 лет. Однако уровень
доминирования в севооборотном варианте и бессменной культуре с навозом был в 2–3 ра-
за ниже, чем в других вариантах опыта, что характеризует более высокую выравненность
численности различных генотипов прокариот в комплексе.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №1 189
Рис. 3. Влияние сверхдлительной (с 1912 г.) культуры Linum usitatissimum L. на генетическое разнообразие
прокариот в подзолистой почве (профиль tRFLP, праймер EU3, на оси абсцисс указан диапазон размера
60–400 пар нуклеотидов, на оси ординат — интенсивность флуоресценции)
Анализируя сходство генотипических структур комплекса прокариот в различных ва-
риантах опыта, следует отметить весьма существенную разницу между ними. В частности,
индекс “видового” сходства прокариот почвы под посевами льна в севообороте и бессмен-
ной культуре является низким и составляет 0,074, а в бессменной культуре с применением
Таблица 1. Экологические параметры прокариотного комплекса подзолистой почвы в сверхдлительном
опыте МСХА
Вариант
Показатель
разнообразия, H доминирования, C сходства∗
Бессменная культура льна
без удобрений 2,37 0,21 0,074
NPK 2,90 0,23 0,059
навоз 3,68 0,12 0,667
Севооборот
чистый пар 2,66 0,217 0,466
лен + NPK 4,01 0,063 1,000
∗Коэффициент попарного сходства рассчитан по формуле [14] и выражен в относительных величинах по
отношению к севообороту.
190 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №1
NPK — всего 0,059, в то время как в бессменной культуре с навозом он возрастает до 0,667
и приближается к севооборотному варианту. Полученные данные указывают на то, что
в условиях различных систем земледелия и агрофитоценозов формируются разные по ге-
нотипической структуре комплексы микроорганизмов. Эти различия возрастают по годам.
В бессменной культуре льна корневые экссудаты, листовой и корневой опад дают не-
значительное поступление органического вещества в почву. Вследствие этого, по-видимому,
снижаются энергетические запасы, происходит истощение легкоподвижного органическо-
го вещества, что ограничивает возможности для развития микроорганизмов. Микрофлора
почвы находится в экстремальных условиях. В еще худших условиях находится почва чи-
стого пара. Здесь фактически исключено поступление в почву органического вещества. По
индексу разнообразия и доминирования эти почвы близки. Однако мы не имеем ни одного
сходного генотипа для этих вариантов опыта. Следовательно, дело не только в дефиците ор-
ганического вещества. По-видимому, лен оказывает специфическое действие на микрофло-
ру, обусловливающее накопление в почве микроорганизмов продуцентов фитотоксических
и антибиотических веществ [14], которые ингибируют рост растений и оказывают селекци-
онное действие на бактерии. Однако этот вопрос требует дополнительного изучения.
Согласно результатам исследования, на формирование структуры микробного комплек-
са почвы под посевами льна-долгунца существенное влияние оказывает история поля (сево-
оборот, бессменная культура). В условиях длительной бессменной культуры льна-долгунца
по сравнению с севооборотом происходит обеднение бактериального комплекса и изменение
его структуры. Наблюдается смена доминирующих форм. Снижается генетическое разно-
образие прокариот. Длительное применение минеральных удобрений в бессменной культуре
оказывает отрицательное действие на генетическое разнообразие микроорганизмов почвы.
Ряд видов выпадает из микробоценоза. Это свидетельствует о том, что монокультура рас-
тения льна способствует обеднею генетических ресурсов микрофлоры почв и коренному
изменению ее качественного состава, что, по-видимому, напрямую связано со снижением
устойчивости растений к природным и антропогенным стрессам.
Таким образом, использование метода полиморфизма длин рестрикционных фрагмен-
тов (tRFLP) позволяет сравнить структуру микробных сообществ, а также продемонстри-
ровать и оценить бактериальное разнообразие в почвах, увидеть новые генотипы почвенной
микробиоты, не культивируемые или слабокультивируемые на селективных средах обще-
принятыми микробиологическими методами, что открывает широкие перспективы приме-
нения его для изучения экологии микробных сообществ и микробиологического монито-
ринга почв.
Авторы выражают благодарность сотрудникам ГНУ ВНИИСХМ Е.Е. Андронову, А. Г. Пи-
наеву, сотрудникам кафедры земледелия РГАУ МСХА за содействие в проведении научно-иссле-
довательских работ.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 07–04–13 527 офи-ц.
1. Buckley D.H., Schmidt T.M. The structure of microbial communities in soil and the lasting impact of
cultivation // Microbial Ecol. – 2001. – 42. – P. 11–21.
2. Torsvik V., Goksoyr J., Daae F. L. High diversity in DNA of soil bacteria // Appl. and Environ. Microbiol. –
1990. – 56. – P. 782–787.
3. Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology / Ed. D.R. Boone, R.W. Castenholz. – 2nd. ed. – New York;
Berlin; Heidelberg: Springer, 2001. – Vol. 1. – 721 p.
4. Felske A., Wolterink A., Van Lis R. et al. Response of a soil bacterial community to grassland succession
as monitored by 16S rRNA levels of the predominant ribotypes // Appl. and Environ. Microbiol. – 2000. –
66. – P. 3998–4003.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №1 191
5. Hugenholtz P., Goebel B.M., Pace N.R. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic
view of bacterial diversity // Ibid. – 1998. – No 1. – P. 173–198.
6. Marsh T. L. Terminal restriction fragment length polymorphism (TRFLP): an emerging method for cha-
racterizing diversity among homologous populations of amplicons // Curr. Opin. Microbiol. – 1999. – 2. –
P. 323–327.
7. Widmer F., Fliessbach A., Laczko E. et al. Assessing soil biological characteristics: a comparison of bulk soil
community DNA-, PLFA-, and BiologTM-analyses // Soil Biol. and Biochem. – 2001. – 33. – P. 1029–1036.
8. Длительному полевому опыту ТСХА 90 лет: итоги научных исследований / Под ред. А.Ф. Сафоно-
ва. – Москва: Изд-во МСХА, 2002. – 246 с.
9. Pace N.R., Stahl D.A., Lane D. J., Olsen G. J. The analysis of natural microbial populations by ribosomal
RNA sequences // Adv. Microbial. Ecol. – 1986. – 9. – P. 1–55.
10. Duarte G. F., Rosado A. S., Seldin L. et al. Extraction of ribosomal RNA and genomic DNA from soil for
studying the diversity of the indigenous bacterial community // J. Microbiol. Methods. – 1998. – 32. –
P. 21–29.
11. Doyle J. J., Doyle J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. – 1987. – 12. – P. 13–15,.
12. Moreira D. Efficient removal of PCR inhibitors using agarose-embedded DNA preparations // Nucl. Acids
Res. – 1998. – 26, No 13. – P. 3309–3310.
13. Brajesh K. S., Nazaries L., Munro S. et al. Use of Multiplex Terminal Restriction Fragment Length
Polymorphism for Rapid and Simultaneous Analysis of Different Components of the Soil Microbial Com-
munity // Аpp. and Environ. Microbiol. – 2006. – 72, No 11. – P. 7278–7285.
14. Одум Ю. Основы экологии / Под ред. Н.П. Наумова. – Москва: Мир, 1975. – 733 с.
Поступило в редакцию 16.04.2008Государственное научное учреждение
Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии, Санкт-Петербург, Пушкин
Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
N.V. Patyka, Y.V. Kruglov, I. А. Tihonovich, V. F. Patyka
The length polymorphism profile of restrictive fragments (tRFLP) of
a complex of procaryotic microorganisms in podsolic soils
Using a method of polymorphism of the lengths of restriction fragments (tRFLP), the comparative
analysis of a complex of procaryotic microorganisms of podsolic soils is carried out on the long-term
cultivation of flax, taking the index of genetic variety into account.
192 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №1
|