Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин
Описано простий i швидкий метод видiлення та очищення iнтактних сумарних препаратiв нуклеїнових кислот (НК) з рослин. Метод грунтується на проведеннi одночасного руйнування клiтин, екстракцiї НК та їхнього очищення у присутностi хлороформу та спецiально розробленого гiпертонiчного буфера, який мiсти...
Saved in:
| Date: | 2009 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2009
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7927 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин / О. I. Мартиненко, Т.К. Кириленко, О. Г. Алхiмова // Доп. НАН України. — 2009. — № 2. — С. 179-183. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860060960933281792 |
|---|---|
| author | Мартиненко, О.І. Кириленко, Т.К. Алхімова, О.Г. |
| author_facet | Мартиненко, О.І. Кириленко, Т.К. Алхімова, О.Г. |
| citation_txt | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин / О. I. Мартиненко, Т.К. Кириленко, О. Г. Алхiмова // Доп. НАН України. — 2009. — № 2. — С. 179-183. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| description | Описано простий i швидкий метод видiлення та очищення iнтактних сумарних препаратiв нуклеїнових кислот (НК) з рослин. Метод грунтується на проведеннi одночасного руйнування клiтин, екстракцiї НК та їхнього очищення у присутностi хлороформу та спецiально розробленого гiпертонiчного буфера, який мiстить, крiм стандартних компонентiв, комплекс неiонних ПАР з гiдратованим пероксидом. Отриманi препарати ДНК i РНК характеризуються високим ступенем очищення та придатнiстю до Саузерн- i Нозерн-аналiзу. Запропонований метод забезпечує вихiд НК не менше 70% її кiлькостi, що мiститься у вихiдному матерiалi.
A rapid simple procedure for the isolation of intact total plant nucleic acids is described. The method is based on the simultaneous cell disruption, extraction of nucleic acids, and their purification using chloroform along with a specially developed hypertensive buffer which contained a complex of nonionic SAS with hydrogen peroxide (commercial solution). Isolated total DNA and RNA are intact and of high purity. The plant nucleic acids isolated using our procedure are suitable for the Northern and Southern analysis. The method proposed supplied the nucleic acids yield as much as 70%.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:04:13Z |
| format | Article |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
2 • 2009
БIОХIМIЯ
УДК 577.2.08
© 2009
О. I. Мартиненко, Т. К. Кириленко, О. Г. Алхiмова
Новий експрес-метод видiлення та очищення сумарних
препаратiв ДНК та РНК з рослин
(Представлено членом-кореспондентом НАН України Д. М. Говоруном)
Описано простий i швидкий метод видiлення та очищення iнтактних сумарних препа-
ратiв нуклеїнових кислот (НК) з рослин. Метод грунтується на проведеннi одночасно-
го руйнування клiтин, екстракцiї НК та їхнього очищення у присутностi хлороформу
та спецiально розробленого гiпертонiчного буфера, який мiстить, крiм стандартних
компонентiв, комплекс неiонних ПАР з гiдратованим пероксидом. Отриманi препара-
ти ДНК i РНК характеризуються високим ступенем очищення та придатнiстю до
Саузерн- i Нозерн-аналiзу. Запропонований метод забезпечує вихiд НК не менше 70% її
кiлькостi, що мiститься у вихiдному матерiалi.
Зростання попиту на високоякiснi препарати нуклеїнових кислот (НК) зумовлено, насам-
перед, значним розширенням сфери їхнього застосування в рiзних галузях науки i вироб-
ництва: фундаментальних дослiдженнях (бiологiя, космобiологiя, молекулярна медицина,
фармакологiя), сiльському господарствi (виведення високопродуктивних генетично модифi-
кованих рослин i тварин), новiтнiх напрямках сучасної бiо- та нанотехнологiї (генна iнжене-
рiя, бiосенсори, виробництво напiвпровiдникiв (новi матерiали) та засобiв бiоiнформатики).
Вiдмiтною тенденцiєю сьогодення є розробка пiдходiв до препаративного отримання НК
у промислових масштабах [1].
Практична необхiднiсть пошуку нових ефективних способiв одержання НК зумовлена
труднощами, що виникають при видiленнi iнтактних препаратiв НК з рiзних бiооб’єктiв,
особливо з рослинного матерiалу. Справа в тому, що клiтини цього типу характеризуються
низьким сумарним вмiстом НК та високою нуклеазною активнiстю, наявнiстю чималої кiль-
костi бiлкiв, вуглеводiв, пiгментiв та iнших клiтинних агентiв, позбавитися вiд яких часто
буває дуже складно [2, 3].
Одним iз критерiїв якостi препаратiв НК є висока полiмернiсть молекул. У процесi
видiлення ступiнь деградацiї цих бiополiмерiв спричинений як дiєю клiтинних нуклеаз,
гiдродинамiчними впливами на цiлiснiсть молекул, так i бiологiчним вiком вихiдного бiома-
терiалу. Вiдомо, що онтогенез будь-якого органiзму супроводжується неминучим процесом
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №2 179
його старiння, внаслiдок чого в клiтинах вiдбувається поступова фрагментацiя ДНК [4, 5].
Це значно знижує вихiд високополiмерної НК i потребує певної стандартизацiї бiооб’єктiв,
якi використовують для отримання НК.
Найважливiшим етапом видiлення НК є їхнє очищення. Нинi широко застосовують ме-
тоди депротеїнiзацiї, якi грунтуються на використаннi фенолу. Проте застосування цього
хiмiчного агента для еукарiотiв у багатьох випадках призводить до втрати певних класiв
нуклеотидних послiдовностей ДНК, а також до значного зниження виходу цих бiополiме-
рiв [6, 7].
На сьогоднi розроблено великий арсенал методiв одержання якiсних препаратiв НК,
проте серед них не iснує жодного, який мiг би претендувати на унiверсальнiсть. Тому ми
ставили собi за мету розробити альтернативнi шляхи отримання та очищення високоякiсної
НК iз “проблемного” рослинного матерiалу.
Матерiали та методи дослiдження. В експериментах використовували листя видiв
рослин маку Papaver (P. nudicaule, P. somniferum) та проросткiв пшеницi Triticum.
Кiлькiсний вмiст одно- та дволанцюгових НК у рослинних тканинах визначали модифi-
кованим методом [8], який грунтується на здатностi одноланцюгових НК повнiстю гiдро-
лiзуватися 0,5 М КОН при 67 ◦С, а дволанцюгових — 0,5 М НСlО4 при 90 ◦С. Вмiст НК
у вiдповiдних фракцiях вимiрювали за допомогою спектрофотометра “Specord M-40” (“Carl
Ziess”, Нiмеччина) стандартним способом.
Лiзис рослинних клiтин, екстракцiю та очищення препаратiв НК проводили спецiально
розробленим нами буфером: 6% сахароза; 25 мМ ЕДТА; 40 мМ трис-НСl, pH 8,0; 0,3 М
натрiю ацетат; 4% Triton X-100; 0,25 — 3% Vanish (комплекс неiонних ПАР з гiдратованим
пероксидом).
Видiлення НК зводилося до таких операцiй.
Зразок рослинної тканини (1 г) ретельно розтирали в рiдкому азотi, швидко переноси-
ли в суспензiю, що мiстила по 5 мл буфера та хлороформу, iнкубували гомогенну сумiш
30 хв при кiмнатнiй або пiдвищенiй температурi з наступним центрифугуванням (10000 g,
15–20 хв) до повного роздiлення фаз. При необхiдностi вiдiбрану водну фазу додатково де-
протеїнiзували рiвним об’ємом хлороформу i повторювали цю процедуру до повного зник-
нення iнтерфази на межi водної фази i хлороформу. НК осаджували 2,5 об’ємами етанолу,
промивали 70% спиртом та зберiгали при −20
◦С. Роздiлення молекул ДНК i РНК здiйс-
нювали у ТЕ-буферi за допомогою LiCl [9] або РНКази i ДНКази вiдповiдно.
Для порiвняння видiляли НК вiдомим способом [10] з використанням буфера STTEN
(6% сахароза; 4% Triton X-100; 40 мM трис-HCl, pH 7,5–8,0; 40 мM EДTA; 0,9 — 1 M NaCl).
Концентрацiю НК та їхнi спектрофотометричнi характеристики визначали за допомо-
гою спектрофотометра “Specord M-40” (“Carl Zeiss”, Нiмеччина) вiдомим методом [11].
Електрофорез сумарних препаратiв НК у 0,8% агарозному гелi i ТВЕ-буферi (pH 8,0)
та гiбридизацiйнi експерименти здiйснювали вiдповiдно до рекомендацiй [12].
Мiчення ДНК (фрагмент гена рибосомної 18S РНК щура) дигоксигенiном-dUTP (DIG),
а також її наступну детекцiю методом хемiлюмiнесценцiї здiйснювали за протоколом “Boeh-
ringer Mannheim” (Нiмеччина).
Результати дослiдження та їхнє обговорення. З метою оцiнки ефективностi за-
пропонованого способу, а також оптимiзацiї умов селекцiї рослин як потенцiйних джерел
широкомасштабного отримання НК ми застосували iнформативний кiлькiсний критерiй,
який вiдображає ступiнь деградацiї молекул ДНК безпосередньо в рослинних тканинах
у процесi онтогенезу [13]. Така процедура дозволила вiдiбрати найпроблемнiший вихiдний
180 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №2
Рис. 1. Ефективнiсть очищення препаратiв НК
P. nudicaule, отриманих вiдомим (1 ) та запропо-
нованим методом при кiмнатнiй (2 ) i пiдвищенiй
до 50 ◦С (3 ) температурi
Рис. 2. Електрофореграма в 0,8% агарозному ге-
лi сумарних препаратiв ДНК i РНК, отрима-
них запропонованим методом з проросткiв пше-
ницi (1 ) та маку (2 ), ДНК фага λ (3 )
рослинний матерiал для опрацювання запропонованого способу видiлення НК. Серед усьо-
го спектра дослiджених рослин (маку та пшеницi) лише листя P. nudicaule з числовим
показником, що становив 3,5–4,7, використовували у подальшiй роботi. Вiдiбранi рослин-
нi тканини P. nudicaule характеризувалися, з одного боку, ще значним вмiстом нативної,
хоча i частково деградованої ДНК, а з iншого — присутнiстю в рослинних екстрактах ве-
ликої кiлькостi клiтинних агентiв, здатних специфiчно модифiкувати молекули НК, значно
ускладнюючи процес їхнього видiлення i очищення.
Пропонованi умови одержання високоочищених препаратiв рослинної ДНК виявилися
значно ефективнiшими за вiдомi методи. Це пов’язано, на нашу думку, з тим, що експе-
риментально винайдений унiкальний склад буфера в комбiнацiї з пiдвищеною температу-
рою розчину дозволяє максимально оптимiзувати процес видiлення та очищення якiсних
препаратiв ДНК (рис. 1). Так, присутнiсть у розробленому нами буферi комплексу де-
тергентiв (Тритон Х-100, неiонних ПАР) забезпечує не тiльки м’який та ефективний лi-
зис клiтин, але разом iз солями (0,3 М натрiю ацетат), хлороформом та антиоксидантом
(гiдратований пероксид) дає можливiсть значно iнтенсифiкувати i прискорити тривалий
процес неруйнiвного очищення молекул вiд бiлкiв, пiгментiв та iнших клiтинних домiшок.
Наявнiсть сахарози дозволяє при лiзисi рослинних протопластiв запобiгти миттєвiй вну-
трiшньоклiтиннiй механiчнiй деградацiї молекул НК i активацiї ендогенних нуклеаз. Для
пригнiчення нуклеазної активностi буфер, крiм названих вище сполук, мiстить також хе-
лати (EДTA).
Порiвняльний аналiз виходу нативних препаратiв ДНК з листя P. nudicaule, iзольо-
ваних за умов двох незалежних способiв — ранiше розробленого нами [10] (контроль) та
запропонованого в цiй роботi, виявив переваги останнього. Згiдно з експериментальними
даними кiлькiсний вихiд ДНК, забезпечений модифiкованим способом, становить 65–70%
вмiсту НК у рослинному матерiалi. До речi, запропонований спосiб, крiм ДНК, гарантує
також i стабiльне отримання великої кiлькостi високополiмерних препаратiв РНК з одного
рослинного зразка.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №2 181
Рис. 3. Дот-гiбридизацiя рекомбiнантної плазмi-
ди pRrB3, яка мiстить фрагмент гена 18S РНК
щура (К), ДНК маку (1 ) та ДНК пшеницi (2 )
з DIG-мiченим фрагментом гена 18S рибосомної
РНК щура
Рис. 4. Блот-гiбридизацiя препаратiв РНК з про-
росткiв маку (1 ) та пшеницi (2 ) з DIG-мiченим
фрагментом гена 18S рибосомної РНК щура
Запропонований спосiб дозволяє отримувати тотальну високополiмерну рослинну НК,
про високий ступiнь чистоти якої свiдчить спектрофотометричний коефiцiєнт A260/A280 =
= 1,85–2,0.
Видiленi препарати ДНК i РНК пiддавали гель-електрофоретичному аналiзу. Отриманi
електрофореграми демонструють характерну для iнтактних молекул рухомiсть цих бiопо-
лiмерiв у 0,8% агарозному гелi (рис. 2).
Описаний метод дозволяє отримувати сумарнi препарати рослинної НК, придатнi для
гiбридизацiйних експериментiв. Нами визначенi рiвнi дот-гiбридизацiї DIG-мiченої ДНК
(фрагмент гена рибосомної 18S РНК щура) з ДНК маку та пшеницi (рис. 3) та блот-гiбри-
дизацiї цього ДНК-зонда з молекулами РНК проросткiв маку та пшеницi (рис. 4).
Таким чином, запропонований експрес-метод одержання високополiмерних препаратiв
НК має цiлу низку переваг у порiвняннi з вiдомими способами. Вiн простий i ефективний
(вихiд становить не менше 70% кiлькостi, що мiститься у вихiдному матерiалi) та придатний
для видiлення НК з обмежених кiлькостей дослiджуваного матерiалу, що дозволяє вико-
ристовувати його у промислових масштабах. Завдяки мiнiмальнiй кiлькостi манiпуляцiй зi
зразками та iстотнiй економiї часу вiн є рентабельним особливо в умовах експрес-аналiзу
великої кiлькостi дослiджуваних бiологiчних зразкiв. Вiдсутнiсть необхiдностi у дорогих
реактивах i обладнаннi надають методовi загальнодоступностi.
1. Материалы Международной конференции “Биотехнология и бизнес” (Москва, 21–22 апр. 2003 г.). –
Москва: Наука, 2003. – 957 с.
2. Клонирование ДНК. Методы / Под ред. Д. Гловера. – Москва: Мир, 1988. – 538 с.
3. Simkova H., Cihalikova J., Vrana J. et al. Preparation of high molecular weight DNA from plant nuclei
and chromosomes isolated from root tips // Biol. plant. – 2003. – 46, No 3. – P. 369–373.
4. Гринюк I. I., Корнiйчук Г.М., Капралов О.О., Матишевська О.П. Змiни структурного стану хро-
матину в тимоцитах на ранньому етапi апоптозу за iндукцiї пероксидом водню i радiацiєю // Укр.
бiохiм. журн. – 2004. – 76, № 5. – С. 90–95.
182 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2009, №2
5. Топчiй Н.М. Деградацiя ДНК у процесi старiння листкiв цукрового буряка (Beta vulgaris L.) // Там
же. – 2001. – 73, № 3. – С. 116–120.
6. Skinner D.M., Triplett L. L. The selective loss of DNA satellites on deproteinization with phenol // Bi-
ochem. and Biophys. Res. Communs. – 1967. – 28, No 6. – P. 892–897.
7. Черепенко Е.И., Галкин А.П., Лебедев В.Р., Кок И.П. Щадящий метод выделения ДНК из ядер
клеток насекомых // Укр. биохим. журн. – 1982. – 54, № 3. – С. 316–321.
8. Schmidt G., Thannhauser S. I. A method for the determination of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid,
and phosphoproteins in animal tissues // J. Biol. Chem. – 1945. – 161, No 1. – P. 83–89.
9. Verwoerd T. C., Dekker M.M., Hoekema A. A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs //
Nucl. Acids Res. – 1989. – 17, No 6. – P. 2362–2364.
10. Мартыненко Е.И., Кириленко Т.К., Алхимова Е. Г. Метод выделения ДНК из растений // Доп.
НАН України. – 2004. – № 7. – С. 171–175.
11. Henderson J. T., Benight A. S., Hanlon S. A semi-micromethod for the determination of the extinction
coefficients of the duplex and single-stranded DNA // Anal. Biochem. – 1992. – 201, No 1. – P. 17–29.
12. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook C. S. Molecular cloning. A Laboratory Manual. – New York: Cold
Spring Harbor Lab. Press, 1982. – 394 p.
13. Martynenko O. I., Kyrylenko T.K., Gorai A.A., Alkhimova O.G. Quantitative RNA/DNA ratio as cri-
terion for functionalstate of plant genomic DNA // Укр. бiохiм. журн. – 2005. – 77, No 2. – С. 209.
Надiйшло до редакцiї 04.08.2008Iнститут молекулярної бiологiї i генетики
НАН України, Київ
O. I. Martynenko, T. K. Kyrylenko, O.G. Alkhimova
A novel simple rapid method of DNA and RNA isolation from plants
A rapid simple procedure for the isolation of intact total plant nucleic acids is described. The method
is based on the simultaneous cell disruption, extraction of nucleic acids, and their purification
using chloroform along with a specially developed hypertensive buffer which contained a complex
of nonionic SAS with hydrogen peroxide (commercial solution). Isolated total DNA and RNA are
intact and of high purity. The plant nucleic acids isolated using our procedure are suitable for the
Northern and Southern analysis. The method proposed supplied the nucleic acids yield as much
as 70%.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2009, №2 183
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-7927 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:04:13Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Мартиненко, О.І. Кириленко, Т.К. Алхімова, О.Г. 2010-04-22T13:49:53Z 2010-04-22T13:49:53Z 2009 Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин / О. I. Мартиненко, Т.К. Кириленко, О. Г. Алхiмова // Доп. НАН України. — 2009. — № 2. — С. 179-183. — Бібліогр.: 13 назв. — укр. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7927 577.2.08 Описано простий i швидкий метод видiлення та очищення iнтактних сумарних препаратiв нуклеїнових кислот (НК) з рослин. Метод грунтується на проведеннi одночасного руйнування клiтин, екстракцiї НК та їхнього очищення у присутностi хлороформу та спецiально розробленого гiпертонiчного буфера, який мiстить, крiм стандартних компонентiв, комплекс неiонних ПАР з гiдратованим пероксидом. Отриманi препарати ДНК i РНК характеризуються високим ступенем очищення та придатнiстю до Саузерн- i Нозерн-аналiзу. Запропонований метод забезпечує вихiд НК не менше 70% її кiлькостi, що мiститься у вихiдному матерiалi. A rapid simple procedure for the isolation of intact total plant nucleic acids is described. The method is based on the simultaneous cell disruption, extraction of nucleic acids, and their purification using chloroform along with a specially developed hypertensive buffer which contained a complex of nonionic SAS with hydrogen peroxide (commercial solution). Isolated total DNA and RNA are intact and of high purity. The plant nucleic acids isolated using our procedure are suitable for the Northern and Southern analysis. The method proposed supplied the nucleic acids yield as much as 70%. uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Біохімія Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин A novel simple rapid method of DNA and RNA isolation from plants Article published earlier |
| spellingShingle | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин Мартиненко, О.І. Кириленко, Т.К. Алхімова, О.Г. Біохімія |
| title | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин |
| title_alt | A novel simple rapid method of DNA and RNA isolation from plants |
| title_full | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин |
| title_fullStr | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин |
| title_full_unstemmed | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин |
| title_short | Новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів ДНК та РНК з рослин |
| title_sort | новий експрес-метод виділення та очищення сумарних препаратів днк та рнк з рослин |
| topic | Біохімія |
| topic_facet | Біохімія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/7927 |
| work_keys_str_mv | AT martinenkooí noviiekspresmetodvidílennâtaočiŝennâsumarnihpreparatívdnktarnkzroslin AT kirilenkotk noviiekspresmetodvidílennâtaočiŝennâsumarnihpreparatívdnktarnkzroslin AT alhímovaog noviiekspresmetodvidílennâtaočiŝennâsumarnihpreparatívdnktarnkzroslin AT martinenkooí anovelsimplerapidmethodofdnaandrnaisolationfromplants AT kirilenkotk anovelsimplerapidmethodofdnaandrnaisolationfromplants AT alhímovaog anovelsimplerapidmethodofdnaandrnaisolationfromplants |