Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях

Фосфотрицинустойчивые растения двух промышленных яровых сортов рапса (Brassica napus L. var. oleifera DC.) получены путем Agrobacterium tumefaciens – опосредованной трансформации листовых дисков. Векторные конструкции содержали беспромоторную кодирующую последовательность гена фосфинотрицин ацетилтр...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2008
Main Authors:	Сахно, Л.А., Гочева, Е.А., Комарницкий, И.К., Кучук, Н.В.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Subjects:	Оригинальные работы
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8043
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях / Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 1. — С. 21-28. — Бібліогр.: 41 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860075919957295104
author	Сахно, Л.А. Гочева, Е.А. Комарницкий, И.К. Кучук, Н.В.
author_facet	Сахно, Л.А. Гочева, Е.А. Комарницкий, И.К. Кучук, Н.В.
citation_txt	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях / Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 1. — С. 21-28. — Бібліогр.: 41 назв. — рос.
collection	DSpace DC
description	Фосфотрицинустойчивые растения двух промышленных яровых сортов рапса (Brassica napus L. var. oleifera DC.) получены путем Agrobacterium tumefaciens – опосредованной трансформации листовых дисков. Векторные конструкции содержали беспромоторную кодирующую последовательность гена фосфинотрицин ацетилтрансферазы (bar), которая была размещена между двумя инвертированными lox-сайтами (элементы системы Cre/lox рекомбинации фага Р1), и селективный ген неомицинфосфотрансферазу II (nptII). Наличие введенных генов в геноме полученных растений подтверждено с помощью ПЦР. Показано их стабильное и сцепленное наследование в поколениях Т1 и Т2. Рослини двох промислових сортів ріпака (Brassica napus L. var. oleifera DC.), які є стійкими до фосфінотрицину, отримано шляхом Agrobacterium tumefaciens-опосередкованої трансформації листових дисків. Векторні конструкції несли безпромоторну кодуючу послідовність гена фосфінотрицинацетилтрансферази (bar), яка була розташована між двома інвертованими lox сайтами (елементи системи Cre/lox рекомбінації фага Р1), і селективний ген неоміцинфосфотрансферази II (nptII). Наявність в геномі отриманих рослин введених генів підтверджено за допомогою ПЛР. Показано їх стабільне та зчеплене успадкування у поколіннях Т1 і Т2. Phosphinothricin resistant plants of two rapeseed (Brassica napus L. var. oleifera DC.) spring industrial cultivars were obtained by Agrobacterium tumefaciens leaf disk transformation. Vector constructions contained the promoterless coding sequence of phosphinothricin acetyltransferase (bar) gene located between two inverted lox sites (elements of Cre/lox recombination system of P1 phage) and selective neomycinphosphotransferase II gene (nptII). Integration of the alien genes was confirmed by the PCR analyses. Stable and linked inheritance of foreign genes in Т1 and Т2 progeny was shown.
first_indexed	2025-12-07T17:14:01Z
format	Article
fulltext	Фосфинотрицинустойчивые растения двух промыш� ленных яровых сортов рапса (Brassica napus L. var. oleifera DC.) получены путем Agrobacterium tumefaciens� опосредованной трансформации листовых дисков. Век� торные конструкции содержали беспромоторную коди� рующую последовательность гена фосфинотрицинаце� тилтрансферазы (bar), которая была размещена между двумя инвертированными lox�сайтами (элементы сис� темы Cre/lox рекомбинации фага Р1), и селективный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII). Наличие в гено� ме полученных растений введенных генов подтверждено с помощью ПЦР. Показано их стабильное и сцепленное наследование в поколениях Т1 и Т2. Введение. Рапс возделывается более чем в 50 странах мира, основные посевные площади сосредоточены в Китае, Канаде, Индии, Гер� мании, Франции. Мировой сбор семян этой культуры в 2003 г. составил 36146 тыс. тонн (FАО). По количеству производимого раститель� ного масла рапсу принадлежит третье место в мире после сои и хлопчатника [1]. В Украи� не он является второй по значению маслич� ной культурой (вслед за подсолнечником), по� севные площади увеличиваются, начиная с 1997 г., и в 2005 г. составили более 400 тыс. га. Создание новых высокопродуктивных сортов этой культуры не может обойтись без дости� жений в области генетической инженерии. Эксперименты по трансформации рапса в мире проводятся в нескольких направлениях. 1. Улучшение качества и соотношения жир� ных кислот в масле семян. Получены сорта: а) со значительно уменьшенным количеством глюкозинолатов (до 97 % по сравнению с кон� тролем) [2]; б) накапливающие до 50 % только лауриловой кислоты [3]; в) с повышенным (до 30 %) содержанием стеариловой кислоты [4]. 2. Улучшение кормовых качеств семян. По� лучены растения с увеличенным накоплением в семенах лизина [5]. 3. Улучшение сельскохозяйственных харак� теристик. Получены растения, устойчивые к гербицидам [6], грибковым патогенам [7], ви� русам [8]. 4. Конструирование мужской стерильности и самосовместимости. Получены линии рапса с признаком мужской стерильности [9, 10]. Целью нашей работы было получение рас� тений рапса, устойчивых к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида BASTA), с использованием векторов, содержащих эле� менты системы Cre/lox рекомбинации фага Р1, поскольку было показано, что при размеще� нии lox�сайта в генетических конструкциях в непосредственной близости к правой границе Т�ДНК происходит стабильная экспрессия (c частотой до 80 %) следующего за lox�сайтом беспромоторного гена bar [11]. Материалы и методы. Растительный мате- риал. В качестве исходного материала использо� вали семена ярового рапса (Brassica napus L. var. oleifera DC.) двух промышленных сортов – Калиновский селекции Национального аграр� ного университета, любезно предоставленные ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 21 © Л.А. САХНО, Е.А. ГОЧЕВА, И.К. КОМАРНИЦКИЙ, Н.В. КУЧУК, 2008 Л.А. САХНО, Е.А. ГОЧЕВА, И.К. КОМАРНИЦКИЙ, Н.В. КУЧУК Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины 03143, Киев, ул. Акад. Заболотного, 148 E%mail: iicb@iicb.kiev.ua СТАБИЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕСПРОМОТОРНОГО ГЕНА bar В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЯХ РАПСА УДК 577.21:582.926.2 акад. В.Ф. Пересыпкиным, и ВНИС 100, полу� ченные от д�ра биол. наук Ф.Н. Пария. Agrobacterium tumefaciens-опосредованная трансформация рапса. В экспериментах по трансформации использовали листья 3–4�не� дельных растений, выращенных в асептичес� ких условиях (температура 24 °С, освещен� ность 4000–5000 лк при 16/8 (свет/темнота) фотопериоде). За 3–4 сут до инфицирования экспланты насекали и помещали для инициа� ции каллуса на поверхность агаризованной сре� ды MS [12], дополненной 2 мг/л 2,4�Д, 1 мг/л НУК, 0,1 мг/л БАП и 0,1 мг/л кинетина (среда I, табл. 1). Кроме того, среда I содержала 1 г/л тиосульфата натрия в качестве агента, увели� чивающего восприимчивость растительных тканей к агробактерии и таким образом повы� шающего эффективность трансформации [13]. В подготовленной агробактериальной суспен� зии экспланты нарезали на сегменты размером приблизительно 0,3–0,5 � 0,3–0,5 см и выдер� живали, периодически перемешивая, в течение получаса. Затем, подсушив фильтровальной бумагой, переносили их в те же чашки Петри, где проходило прекультивирование. Сокуль� тивирование продолжалось в течение 2 сут на свету в условиях термальной комнаты [14]. После этого экспланты отмывали от избытка агробактерий жидкой средой II, подсушивали и переносили на агаризованную среду II (табл. 1) с тиосульфатом серебра (5 мг/л) и цефотакси� мом (500 мг/л) для элиминации бактерий и роста каллуса. Через 5–7 сут культивирования в условиях термостата (24 °С) их пассировали на среду того же состава, но с добавлением 5 мг/л фосфинотрицина (РРТ) в качестве се� лективного агента. Формирование каллуса при этом продолжалось на рассеянном свету в течение последующих 7–10 дней. Для регене� рации использовали среду MS с добавлением 2 мг/л БАП, 1 мг/л зеатина, 1 мг/л АБК, 1 мг/л НУК и 1 мг/л ГК (среда III, табл. 1), 250 мг/л цефотаксима и 5 мг/л РРТ. Спустя еще 3 нед сформировавшиеся зеленые побеги пересажи� вали на безгормональную среду MS, дополнен� ную 5 мг/л РРТ, а остальные каллусы пассиро� вали снова на регенерационную среду того же состава. Полученные растения выращива� ли на безгормональной агаризованной среде MS с 10 мг/л РРТ. Формирование корней про� ходило в этих условиях без дополнительной инициации. Плазмиды и бактериальный штамм. Для трансформации использовались плазмиды pICН 3744, pICН 3737, pICН 9414. Векторные конструкции были любезно предоставлены компанией Icon Genetics GmbH (Германия). Кроме селективного гена неомицинфосфотранс� феразы II (nptII), они содержали кодирующую последовательность гена устойчивости к фос� финотрицину (гена bar) и независимый 35S промотор, которые были размещены между двумя инвертированными lox�сайтами (рис. 1). Общую схему конструкций можно предста� вить как RB�lox�bar�35S�lox�nptII. Плазмиды pICН 3744 и pICН 9414 содержали дополни� тельный loxА(loxР) сайт, находящийся в пря� мой ориентации по отношению к другому loxА(loxР) сайту. Суспензию Agrobacterium tumefaciens (штамм GV3101) наращивали в 20 мл жидкой среды LB [15], дополненной 50 мг/л карбенициллина и 100 мг/л рифампицина, на качалке (180 об/ мин) в течение 24 ч при 24 °С в темноте. Затем агробактериальную суспензию разбавляли в три раза средой II и инкубировали в тех же условиях в течение 3–4 ч. Полученную суспен� зию использовали для инфицирования. Анализ с помощью полимеразной цепной реак- ции (ПЦР). Интеграцию чужеродных генов в растительный геном определяли с помощью ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 22 Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук Та б л и ц а 1 Состав сред, использованных в экспериментах по трансформации рапса Сахароза Инозитол Гидролизат казеина 2,4�Д НУК Кинетин БАП АБК Зеатин ГК Тиосульфат Na 30 000 300 300 2 1 0,1 0,1 – – – 1000 30 000 300 300 2 1 0,1 0,1 – – – – 10 000 100 – – 1 – 2 1 1 1 – Компоненты, мг/л I II III Среда П р и м е ч а н и е . Основой являлась среда MS. ПЦР. Тотальную ДНК из предположительно трансгенных растений выделяли из листовой ткани согласно методике, предложенной Che� ung et al. [16]. Для реакции использовали 40 нг ДНК растительного образца, по 0,5 мкМ соот� ветствующих праймеров, по 200 мкМ каждого из трифосфатов, 1 ед. Taq ДНК�полимеразы, ПЦР реакционный буфер, который содержал 50 мМ КСl, 10 мМ Tris�HCl (pH 9 при 25 °С), 0,1 % Triton X�100 и 2 мM MgCl2. Общий объем смеси равнялся 20 мкл. Для идентификации гена nptII использовали праймеры 5'�GAGGC TATTCGGCTATGACTG�3' и 5'�CAAGCTCTT CAGCAATATCACG�3', амплифицирующие фрагмент величиной 622 п.н. [17]. Наличие в геноме регенерантов кодирующей последова� тельности гена bar подтверждали, используя праймеры 5'�ATGAGCCCAGAACGACGCCG CC�3' и 5'�CAGATCTCGGTGACGGGCAGG AC�3', дающие фрагмент величиной 551 п.н. Изолированная ДНК из нетрансформирован� ных растений (отрицательный контроль) и 1 нг плазмидного вектора рICН 3744 (поло� жительный контроль) были амплифицирова� ны с теми же праймерами и при тех же усло� виях. Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик ИМ02» (фирма «ДНК�технология», Москва). Использовали следующие профили: для гена nptII – 94 °С – 1 мин, 35 циклов: 94 °С – 1 мин, 60 °С – 1 мин, 72 °С – 45 с, затем 4 мин при 72 °С; для гена bar – 94 °С – 1 мин, 35 цик� лов: 94 °С – 1 мин, 60 °С – 1 мин, 72 °С – 30 с, затем 4 мин при 72 °С. Продукты ПЦР анали� зировали при помощи электрофореза в 1,5 %� ном агарозном геле в трис�ацетатной буфер� ной системе. Статистическая обработка результатов. Частоту трансформации определяли как отно� шение числа полученных растений к общему количеству эксплантов, эффективность транс� формации рассчитывали как отношение числа трансгенных растений к общему количеству растений, полученных при трансформации. Для определения достоверности расщепле� ния в первом поколении трансформантов ис� пользовали стандартный критерий χ2. Результаты исследований и их обсуждение. В результате экспериментов получено 88 неза� висимых, устойчивых к фосфинотрицину ли� ний рапса двух промышленных яровых сортов (табл. 2). В качестве эксплантов мы использовали прекультивированные листовые пластинки растений рапса, выращенных в асептических условиях. Регенерация наблюдалась спустя 4– 5 нед после начала эксперимента (рис. 2) в условиях селективного давления фосфинотри� цина (5 мг/л). Спустя еще 7–14 сут устойчивые побеги формировались полностью (рис. 3). При переносе на безгормональные среды укорене� ние регенерантов происходило без дополнитель� ной индукции в течение последующих 2–3 не� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 23 Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях рапса Рис. 1. Схемы конструкций, использованных в экспе� риментах: LB – левая граница Т�ДНК, RB – правая граница Т�ДНК, bar – кодирующая часть гена фос� финотрицинацетилтрансферазы, nptII – ген неоми� цинфосфотрансферазы II, loxA, loxM, loxP – сайты спе� цифической рекомбинации Та б л и ц а 2 Эффективность регенерации и трансформации листовых эксплантов рапса Калиновский ВНИС 100 ВНИС 100 pICH 3744 pICH 3737 pICH 9414 210 640 200 22 70 24 19 51 18 19 50 18 9 8 9 86,3 72,8 75,0 Сорт Вектор Частота трансформации Эффективность трансформации Количество экс� плантов реге� нерантов устойчивых к РРТ трансгенных (ПЦР+) % дель. Наблюдаемые различия в эффективности регенерации и трансформации у использова� ных сортов были незначительными (табл. 2). В экспериментах по трансформации рапса используют различные виды эксплантов. Чаще всего инфицировали гипокотили проростков, поскольку они имеют высокий регенерацион� ный потенциал и их легко получать в доста� точном количестве [18–24]. Высокой эффек� тивности трансформации рапса, используя в качестве эксплантов черешки 4–6�суточных котиледонов, добились Moloney et al. [25], Hong et al. [26], Damgaard et al. [20], Li et al. [27]. Микроспоры как экспланты для транс� формации привлекали возможностью получе� ния гомозиготных трансформантов, у которых можно изучать рецессивные аллели [28–30]. Сoкультивированию с агробактерией подвер� гали междоузлия растений, выращенных в теплице и достигших стадии формирования соцветий [18, 31], а также протопласты, выде� ленные из гипокотилей [32] и мезофилла [33]. Использование нами листовых дисков культи� вируемых in vitro растений позволило полу� чить трансформанты рапса с приемлемой час� тотой (~ 9 %) и эффективностью (~70–85 %) за довольно короткое время (появление пер� вых регенерантов наблюдали спустя 7–8 нед с момента начала экспериментов, на получение основного количества укорененных растений затрачивалось 3–3,5 мес). К преимуществам указанного подхода можно отнести исключе� ние необходимости стерилизации исходного материала перед постановкой каждого опыта и возможность работы с более однородной в генетическом отношении популяцией кле� ток, чем в случае использования гипокотилей проростков. Одним из определяющих моментов в про� ведении экспериментов мы считаем прекуль� тивирование эксплантов на среде для каллусо� образования, что приводит к подготовке рас� тительной ткани к инфицированию и в то же время позволяет ей легче пережить обработку агробактерией. Как показали наши предвари� тельные исследования, использование листо� вых дисков без прекультивирования либо пре� культивирование их в течение 1–2 сут было не� эффективным и приводило к практически полной гибели растительных тканей. Прекуль� тивирование эксплантов давало положительные результаты и в экспериментах Mukhopadhyay et al. [34], Radke et al. [35], Радчук и др.[22]. В некоторых работах авторы указывают на не� целесообразность такого шага, отмечая, что хотя и усиливается образование каллуса на эксп� лантах, но полностью ингибируется морфоге� нез [36]. Возможно, такая ситуация характерна только для определенного вида эксплантов (бы� ли использованы междоузлия 6–8�недельных растений рапса из асептической культуры), ISSN 0564–3783. Цитология и генетика.2008. № 124 Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук Рис. 2. Начало регенерации из листовых дисков рап� са сорта ВНИС 100, инфицированных A. tumefaciens pICH 3737 Рис. 3. Сформированный побег рапса на селективной регенерационной среде (10 мг/л фосфинотрицина) либо на конечный результат повлияло и выра� щивание самих исходных растений на среде, содержащей регуляторы роста. Наличие генов nptII (результаты не предс� тавлены) и bar (рис. 4) в регенерированных ли� ниях подтверждено с помощью ПЦР�анализов. Листовые диски полученных растений тестировали на устойчивость к канамицину (100 мг/л в среде для каллусообразования) (рис. 5). Результаты тестирования коррелиро� вали с результатами ПЦР. Растения�трансформанты легко адаптиро� вались к условиям закрытого грунта. Девять линий растений Т0 сорта Калиновский, полу� ченные в результате экспериментов с вектор� ной конструкцией рICН 3744, были высаже� ны в почву в условиях теплицы. Они имели нормальную морфологию вегетативных и, в по� давляющем большинстве, генеративных орга� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 25 Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях рапса Рис. 4. ПЦР�анализ тотальной ДНК рапса с прайме� рами, комплементарными гену bar (размер фрагмен� та – 551 п.н.): 1 – маркер; 2–3 – линии 2 и 15, транс� формированные вектором рІСН 3744; 4 – линия 22, трансформированная конструкцией рІСН 9414; 5, 6 – линии 57 и 66, трансформированные вектором рІСН 3737; 7 – положительный контроль, ДНК плазмиды рІСН 3744; 8 – отрицательный контроль, ДНК исход� ного растения Рис. 5. Тест на устойчивость к канамицину листовых дисков рапса сорта Калиновский (три недели после начала тестирования): а – контроль, б – линия 3744/2 Bn5/44/1, Т1 Bn5/44/2, Т1 Bn5/44/5, Т1 Bn5/44/11, Т1 Bn5/44/15, Т1 Bn5/44/17, Т1 Bn5/44/19, Т1 Bn5/44/1, Т2 Bn5/44/2, Т2 Калиновский (контроль) 278 284 280 278 281 276 280 279 284 310 94 88 84 100 98 81 90 90 86 90 72 69 66 78 72 62 68 90 86 – 22 19 18 22 26 19 22 – – 90 3 : 1 3 : 1 3 : 1 3 : 1 3 : 1 3 : 1 3 : 1 – – – 0,13 0,55 0,57 0,48 0,12 0,15 0,01 – – – Линия Масса 100 семян, мг Всхожесть in vitro, % устойчивых к РРТ не устойчивых к РРТ Расщепление χ2 Количество растений Та б л и ц а 3 Характеристика Т1 и Т2 поколений трансформированных линий рапса (сорт Калиновский, вектор pICH 3744) П р и м е ч а н и е . Проращивали по 100 семян каждой линии. нов. Цветки семи из девяти трансформирован� ных линий рапса не отличались от контроль� ных, у двух линий было отмечено явление гете� ростилии – удлиненный пестик и укороченные тычинки. При самоопылении у линий Bn/44/1, Bn/44/2, Bn/44/5, Bn/44/11, Bn/44/15, Bn/44/ 17 и Bn/44/19 завязались жизнеспособные се� мена (табл. 3). Подобные результаты были по� лучены в работах Радчука и др. [22], Cardoza et al. [37], Wang et al. [38, 39]. Следует также отме� тить, что результаты наших исследований в некоторой степени отличаются от полученных в экспериментах Ралдугиной и др. [36], где все растения Т0 имели аномалии в строении цвет� ков, и только для одного из семи клонов уда� лось получить четыре нормальных семени при принудительном самоопылении. Авторы пред� полагали, что наблюдаемая ими комплексная стерильность трансформантов вызвана наруше� нием гормонального баланса полученных рас� тений. Возможно, в наших опытах условия проведения трансформации не оказали такого мощного дезорганизующего воздействия на растительную систему, либо проявились сор� товые особенности генотипов, вовлеченных в эксперименты. Семена, полученные при самоопылении первичных трансформантов, проращивали в асептических условиях и тестировали на устойчивость к фосфинотрицину. Наблюдае� мое расщепление по экспрессии введенного гена bar в условиях in vitro составило прибли� зительно 3 : 1 (табл. 3). Это свидетельствует о том, что в указанных растениях находится од� на копия перенесенного гена bar. Семена трансформантов отличались всхо� жестью в условиях in vitro, сравнимой с семе� нами контрольных растений (табл. 3). В поколении Т2 все потомки сохраняли устойчивость к РРТ. Результаты тестирования на устойчивость к РРТ у проростков Т1 и Т2 коррелировали с результатами ПЦР�анализов. У этих растений сохранялась способность рас� ти на средах с канамицином. Таким образом, введенные гены (nptII и bar) наследовались стабильно и сцепленно. В ходе работы были отобраны устойчивые к фосфинотрицину линии рапса, которые харак� теризовались наличием в своем геноме кодиру� ющей последовательности гена bar. Подобные результаты при трансформации табака [40] и са� харной свеклы [41] были получены ранее. Кро� ме того, было показано, что беспромоторный ген bar экспрессируется благодаря оригиналь� ному расположению в конструкции, а именно между двумя инвертированными lox�сайтами в непосредственной близости к правой границе Т�ДНК [11]. Введенные в геном рапса гены nptII и bar сохраняют свою активность в после� дующих поколениях (Т1, Т2). Полученные рас� тения могут быть вовлечены в селекционные программы, а предложенную методику транс� формации можно использовать в последующих экспериментах. При замене в конструкции ко� дирующей последовательности гена bar на со� ответствующую последовательность другого не� обходимого гена можно ожидать экспрессии последнего с достаточно высокой частотой. SUMMARY. Phosphinothricin resistant plants of two rapeseed (Brassica napus L. var. oleifera DC.) spring indus� trial cultivars were obtained by Agrobacterium tumefaciens leaf disk transformation. Vector constructions contained the promoterless coding sequence of phosphinothricin acetyltransferase (bar) gene located between two inverted lox�sites (elements of Cre/lox recombination system of P1 phage) and selective neomycinphosphotransferase II gene (nptII). Integration of the alien genes was confirmed by the PCR analyses. Stable and linked inheritance of for� eign genes in Т1 and Т2 progeny was shown. РЕЗЮМЕ. Рослини двох промислових сортів ріпа� ка (Brassica napus L. var. oleifera DC.), які є стійкими до фосфінотрицину, отримано шляхом Agrobacterium tumefaciens�опосередкованої трансформації листових дисків. Векторні конструкції несли безпромоторну кодуючу послідовність гена фосфінотрицинацетил� трансферази (bar), яка була розташована між двома інвертованими lox�сайтами (елементи системи Cre/lox рекомбінації фага Р1), і селективний ген неоміцин� фосфотрансферази II (nptII). Наявність в геномі отри� маних рослин введених генів підтверджено за допомо� гою ПЛР. Показано їх стабільне та зчеплене успадку� вання у поколіннях Т1 і Т2. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Production of selected agricultural commodities, Group II (2003) – http:/faostat.fao.org/faostat 2. Chavadej S., Brisson N., McNeil J.N., Luca V. Redirec� tion of tryptophan leads to production of low indole glucosinolate canola // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1994. – 91. – P. 2166–2170. 3. Voeker T.A., Worrel A.C., Anderson L., Bleibaum J., Fan C., ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 126 Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук Hawkins D.J., Radke S.E., Davies H.M. Fatty acid biosynthesis redicted to medium chains in transgenic oilseed plants // Science. – 1992. – 257. – P. 72–74. 4. Knutzon D.S., Thompson G.A., Radke S.E., Johnson W.B., Knauf V.C., Kridl J.C. Modification of Brassica seed oil by antisense expression of a stearoyl�acyl carrier pro� tein desaturase gene // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1992. – 89. – P. 2624–2628. 5. Falco S.C., Guida T., Locke M., Mauvais T., Sanders C., Ward R.T., Webber P. Trangenic canola and soybean seeds with increased lysine // Biotechnol. – 1995. – 13. – P. 577–582. 6. Carpenter J., Gianessi L. Herbicide use on roundup ready crops [Letter] // Science. – 2000. – 287, № 5454. – P. 803. 7. Grison R., Grezes�Besset B., Schneider M., Lucante N., Olsen L., Leguay J.J., Toppan A. Field tolerance to fun� gal pathogenes of Brassica napus constitutively express� ing a chimeric chitinase gene // Nature Biotechnol. – 1996. – 14. – P. 643–646. 8. Herve C., Rouan D., Guerche P., Montane M.H. Molecular analysis of transgenic rapeseed plants obtained by direct gene transfer of two separate plas� mids containing, respectively, the cauliflower mosaic virus coat protein gene and a selectable marker gene // Plant Sci. – 1993. – 91. – P. 181–193. 9. Denis M., Delourme R., Gourret J.P., Mariani C., Renard M. Expression of engoneering nuclear male sterility in Bras� sica napus // Plant Physiol. – 1993. – 101. – P. 1295–1304. 10. De Block M., Debrouwer D. Engineered fertility control in transgenic Brassica napus L. – histochemical analy� sis of anther development // Planta. – 1993. – 189. – P. 218–225. 11. Щербак Н.Л., Белокурова В.Б., Гецко И.О., Комарниц� кий И.К, Кучук Н.В. Изучение влияния lox�сайтов Cre�lox системы рекомбинации на экспрессию бес� промоторного bar гена в трансгенных растениях // Цитология и генетика. – 2006. – 40, № 1. – С. 3–9. 12. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. – 1962. – 15. – P. 473–497. 13. Olhoft P.M., Lin K., Galbraith J., Neilsen N.C., Somers D.A. The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium�mediated transformation of soybean cotyledonary�node cells // Plant Cell Rep. – 2001. – 20. – P. 731–737. 14. Zambre M., Terryn N., De Clercq J., De Buck S., Dillen W., van Montagu M., Van Der Straeten D., Angenon G. Ligth strongly promotes gene transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells // Planta. – 2003 – 216. – P. 580–586. 15. Маниатис Т., Фрич Е.Ф., Сэмбрук Дж. Методы ге� нетической инженерии. Молекулярное клониро� вание. – М.: Мир, 1984. – 521 с. 16. Cheung W.Y., Hubert N., Landry B.S. A simple and rapid DNA microextraction method for plant, animal and insect suitable for RAPD and other PCR analyses // PCR Meth. Appl. – 1993. –3. – P. 69–70. 17. Demeke T., Huel P., Baga M., Caswell K., Leung N., Chibbar R.N. Transgene inheritance and silencing in hexaploid spring wheat // Theor. Appl. Genet. – 1999. – 99, № 9. – P. 947–953. 18. Fry J., Barnason A., Horsch K.B. Transformation of Bras� sica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors // Plant Cell Rep. – 1987. – 6, № 5. – P. 321–326. 19. Гирич А.М., Череп Н.Н., Скаржинская М.В., Голов� ко А.Э., Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация рапса Brassica napus L. с помощью Agrobacterium tumefaciens // Цитология и генетика. – 1995. – 29, № 2. – P. 20–25. 20. Damgaard O., Jensen L.H., Rasmussen O.S. Agrobac� terium tumefaciens�mediated transformation of Brassica napus winter cultivars // Transgen. Res. – 1997. – 6, № 4. – P. 279–288. 21. Daley M., Knauf V.C., Summerfelt K.R., Turner J.C. Co� transformation with one Agrobacterim tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker–free transgenic plants // Plant Cell Rep. – 1998. – 17. – P. 489–496. 22. Радчук В.В., Клоке Э., Радчук Р.И., Нойманн М., Блюм Я.Б. Получение трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) с помощью Agrobacterium tume� faсiens // Генетика. – 2000. – 36, № 7. – С. 932–941. 23. Babwah A.V., Wandell C.S. Cytosine deaminase as a substrate�dependent negative selectable marker in Brassica napus // Theor. Appl. Genet. – 2000. – 100, № 5. – P. 802–809. 24. Phogat S.K., Burma P.K., Pental D. High frequency regeneration of Brassica napus varieties and genetic transformation of stocks containing fertility restorer genes for two cytoplasmic male sterility systems // J. Plant Biochem. and Biothecnol. – 2000. – 9, № 2. – P. 73–79. 25. Moloney M.M., Walker J.M., Sharma K.K. High effi� ciency transformation of Brassica napus with Agrobacterium vectors // Plant Cell Rep. – 1989. – 8. – P. 238–242. 26. Hong H.P., Gerster L.J., Datla R. S. S., Albani D., Scoles G., Keller W., Robert L. S. The promoter of a Brassica napus polygalacturonase gene directs pollen expression of β�glucuronidase in transgenic Brassica plants // Plant Cell Rep. – 1997. – 16, № 6. – P. 373–378. 27. Li X., Qin M., Zhen S., Dong W., Bai R. Transgenic plants of Brassica napus and Brassica juncea tolerant to pest insects and analysis of the progeny // Abstracts of 5th International Congress of Plant Molecular Biology. – Singapore, 1997. – P. 1421. 28. Pechan P.M. Succesful cocultivation of Brassica napus microspores and proembryos with Agrobacterium // Plant Cell Rep. – 1989. – 8. – P. 387–390. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 27 Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях рапса 29. Swanson E.B., Eriksson L.R. Haploid transformation in Brassica napus using an octopine�producing strain of Agrobacterium tumefaciens // Theor. Appl. Genet. – 1989. – 78. – P. 831–835. 30. Huang B. Genetic manipulation of microspores and microspore�derived embryos // In Vitro Cell Dev. Biol. – 1992. – 28. – P. 53–58. 31. Pua E.C., Mehra�Palta A., Nagy F., Chua N.�H. Transgenic plants of Brassica napus L. // Biotechnolo� gy. – 1987. – 5, № 8. – P. 815–817. 32. Thomzik J.E., Hain R. Transgenic Brassica napus plants obtained by cocultivation of protoplasts with Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Rep. – 1990. – 9, № 5. – P. 233–236. 33. Sacristan M.D., Gerdemann�Knorck M., Schieder O. Incorporation of hygromycin resistance in Brassica nigra and its transfer to Brassica napus through asym� metric protoplast fusion // Theor. Appl. Genet. – 1989. – 78, № 2. – P. 194–200. 34. Mukhopadhyay N., Arumugam N., Nandakumar P.B.A., Pradhan A.K., Gupta V., Pental D. Agrobacterium medi� ated genetic transformation of oilseed Brassica campestris: transformation frequency is strongly influ� enced by the mode of shoot regeneration // Plant Cell Rep. – 1991. – 11. – P. 506–513. 35. Radke S.E., Andrews B.M., Moloney M.M., Croch M.L., Kridl J.C., Knauf V.C. Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens: developmentally regulated expression of reintroduced napin gene // Theor. Appl. Genet. – 1988. – 75, № 5. – P. 685–694. 36. Ралдугина Г.Н., Горелова С.В., Кожемякин А.В.Ста� бильность и наследование трансгенов в растениях рапса // Физиология растений. – 2000. – 47, № 3. – С. 437–445. 37. Cardoza V., Stewart C.N. Increased Agrobacterium� mediated transformation and rooting efficiencies in canola (Brassica napus L.) from hypocotyl segment explants // Plant Cell Rep. – 2003. – 21. – P. 599– 604. 38. Wang Y., Nowak G., Culley D., Hadwiger L.A., Fristensky B. Constitutive expression of pea defence gene DRR206 confers resistence to blackleg (Lepto� shearia maculans) disease in transgenic canola (Bras� sica napus) // Mol. Plant Microbe Int. – 1999. – 12. – P. 410–418. 39. Wang W.C., Menon G., Hansen G. Development of a novel Agrobacterium�mediated transformation method to recover transgenic Brassica napus plants // Plant Cell Rep. – 2003. – 22. – P. 274–281. 40. Щербак Н.Л., Белокурова В.Б., Комарницкий И.К., Кучук Н.В. Генетическая трансформация растений Nicotiana africana Merxm. плазмидами, содержащи� ми сайты рекомбинации lox // Цитология и гене� тика. – 2004. – 38, № 4. – С. 3–8. 41. Кіщенко О.М., Комарницький І.К., Кучук М.В. Гене� тично�модифіковані цукрові буряки // Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобіліза� ція, інвентаризація, збереження, використання�: Тези доп. Міжнарод. наук.�практ. конф. – Обро� шино, 2005. – С. 214. Поступила 30.01.07 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика.2008. № 128 Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-8043
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0564-3783
language	Russian
last_indexed	2025-12-07T17:14:01Z
publishDate	2008
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
record_format	dspace
spelling	Сахно, Л.А. Гочева, Е.А. Комарницкий, И.К. Кучук, Н.В. 2010-04-26T17:13:27Z 2010-04-26T17:13:27Z 2008 Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях / Л.А. Сахно, Е.А. Гочева, И.К. Комарницкий, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 1. — С. 21-28. — Бібліогр.: 41 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8043 577.21:582.926.2 Фосфотрицинустойчивые растения двух промышленных яровых сортов рапса (Brassica napus L. var. oleifera DC.) получены путем Agrobacterium tumefaciens – опосредованной трансформации листовых дисков. Векторные конструкции содержали беспромоторную кодирующую последовательность гена фосфинотрицин ацетилтрансферазы (bar), которая была размещена между двумя инвертированными lox-сайтами (элементы системы Cre/lox рекомбинации фага Р1), и селективный ген неомицинфосфотрансферазу II (nptII). Наличие введенных генов в геноме полученных растений подтверждено с помощью ПЦР. Показано их стабильное и сцепленное наследование в поколениях Т1 и Т2. Рослини двох промислових сортів ріпака (Brassica napus L. var. oleifera DC.), які є стійкими до фосфінотрицину, отримано шляхом Agrobacterium tumefaciens-опосередкованої трансформації листових дисків. Векторні конструкції несли безпромоторну кодуючу послідовність гена фосфінотрицинацетилтрансферази (bar), яка була розташована між двома інвертованими lox сайтами (елементи системи Cre/lox рекомбінації фага Р1), і селективний ген неоміцинфосфотрансферази II (nptII). Наявність в геномі отриманих рослин введених генів підтверджено за допомогою ПЛР. Показано їх стабільне та зчеплене успадкування у поколіннях Т1 і Т2. Phosphinothricin resistant plants of two rapeseed (Brassica napus L. var. oleifera DC.) spring industrial cultivars were obtained by Agrobacterium tumefaciens leaf disk transformation. Vector constructions contained the promoterless coding sequence of phosphinothricin acetyltransferase (bar) gene located between two inverted lox sites (elements of Cre/lox recombination system of P1 phage) and selective neomycinphosphotransferase II gene (nptII). Integration of the alien genes was confirmed by the PCR analyses. Stable and linked inheritance of foreign genes in Т1 and Т2 progeny was shown. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Оригинальные работы Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях Article published earlier
spellingShingle	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях Сахно, Л.А. Гочева, Е.А. Комарницкий, И.К. Кучук, Н.В. Оригинальные работы
title	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях
title_full	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях
title_fullStr	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях
title_full_unstemmed	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях
title_short	Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях
title_sort	стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8043
work_keys_str_mv	AT sahnola stabilʹnaâékspressiâbespromotornogogenabarvtransformirovannyhrasteniâh AT gočevaea stabilʹnaâékspressiâbespromotornogogenabarvtransformirovannyhrasteniâh AT komarnickiiik stabilʹnaâékspressiâbespromotornogogenabarvtransformirovannyhrasteniâh AT kučuknv stabilʹnaâékspressiâbespromotornogogenabarvtransformirovannyhrasteniâh

Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях

Institution

Similar Items