Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2

Чувствительные клетки Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, инфицированные РНК-содержащим фагом MS2, продуцируют фаговые частички и одновременно продолжают делиться, выщепляя чувствительные клетки, способные поддерживать новые циклы инфекции. Размножение фага в чувствительных клетках приводит к появлени...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2008
Main Authors:	Перерва, Т.П., Мирюта, А.Ю., Мирюта, Н.Ю.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Subjects:	Обзорные статьи
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8045
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2 / Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 1. — С. 73-90. — Бібліогр.: 49 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-8045
record_format	dspace
spelling	Перерва, Т.П. Мирюта, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. 2010-04-26T17:16:09Z 2010-04-26T17:16:09Z 2008 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2 / Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 1. — С. 73-90. — Бібліогр.: 49 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8045 577.253.4:561.231 Чувствительные клетки Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, инфицированные РНК-содержащим фагом MS2, продуцируют фаговые частички и одновременно продолжают делиться, выщепляя чувствительные клетки, способные поддерживать новые циклы инфекции. Размножение фага в чувствительных клетках приводит к появлению фагоустойчивых форм в потомстве этих клеток. Показано, что это явление обусловлено не селекцией предсуществующих фагоустойчивых мутантов, а является результатом взаимодействия между фагом и клеткой. В отличие от обычных спонтанных или химически индуцированных мутантов E. coli, MS2-индуцированные фагоустойчивые клетки представлены генетически нестабильными формами. Во время размножения они выщепляют новые MS2-устойчивые формы с более выраженными изменениями в области, кодируемой половым фактором. Клетки двух конечных форм MS2-индуцированных мутантов продуцируют также новый тип фагов, преставленных ДНК-содержащими формами, которые нейтрализуются, однако, анти-MS2 сывороткой. Выщепление этих фагов подтверждает, что генетическая субстанция РНК-содержащего бактериофага способна экспрессироваться как часть ДНК-содержащей структуры. Чутливі клітини Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, інфіковані РНК-вмісним фагом MS2, продукують фагові часточки і одночасно продовжують ділитися, вищеплюючи чутливі клітини, здатні підтримувати нові цикли інфекції. Розмноження фага в чутливих клітинах призводить до появи фагостійких форм в потомстві цих клітин. Показано, що це явище зумовлене не селекцією преіснуючих фагостійких мутантів, а є результатом взаємодії між фагом і клітиною. На відміну від звичайних спонтанних або хімічно індукованих мутантів E. coli, MS2-індуковані фагостійкі клітини представлені генетично нестабільними формами. Під час свого розмноження вони вищеплюють нові MS2-стійкі форми з більш вираженими змінами в області, кодованій статевим фактором. Клітини двох кінцевих форм MS2-індукованих мутантів продукують також новий тип фагів, представлених ДНК-вмісними формами, що нейтралізуються, однак, анти-MS2 сироваткою. Вищеплення цих фагів підтверджує, що генетична субстанція РНК-вмісного бактеріофага здатна експресуватися як частина ДНК-вмісної структури. Sensitive cells of Escherichia coli AB 259 Hfr 3000 infected with RNA-containing phage MS2 produce phage particles and continue to divide showing segregation of sensitive cells maintaining new infection cycles. Phage multiplication in sensitive cells gives rise to phageresistant forms in their progeny. The described phenomenon has been shown to be due not to pre-existing phageresistant cell selection but is a result of interaction of the phage and the cell. In contrast to the usual spontaneous or chemically induced Escherichia coli mutants MS2-induced phage-resistant cells are genetically unstable. During their reproduction they segregate new MS2-resistant types carrying more significant changes in the region coded by the sex factor. Cells belonging to two final MS2-induced mutants also produce a new type of phages; they are DNA-containing forms neutralized, however, by anti-MS2 serum. Production of such phage proves that genetic moiety of RNA-containing phage is able to be expressed as a part of the DNA structure. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Обзорные статьи Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2 Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2
spellingShingle	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2 Перерва, Т.П. Мирюта, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Обзорные статьи
title_short	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2
title_full	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2
title_fullStr	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2
title_full_unstemmed	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2
title_sort	взаимодействие рнк-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: ms2-индуцированные мутанты e. coli и возникновение днк-содержащих производных бактериофага ms2
author	Перерва, Т.П. Мирюта, А.Ю. Мирюта, Н.Ю.
author_facet	Перерва, Т.П. Мирюта, А.Ю. Мирюта, Н.Ю.
topic	Обзорные статьи
topic_facet	Обзорные статьи
publishDate	2008
language	Russian
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
format	Article
description	Чувствительные клетки Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, инфицированные РНК-содержащим фагом MS2, продуцируют фаговые частички и одновременно продолжают делиться, выщепляя чувствительные клетки, способные поддерживать новые циклы инфекции. Размножение фага в чувствительных клетках приводит к появлению фагоустойчивых форм в потомстве этих клеток. Показано, что это явление обусловлено не селекцией предсуществующих фагоустойчивых мутантов, а является результатом взаимодействия между фагом и клеткой. В отличие от обычных спонтанных или химически индуцированных мутантов E. coli, MS2-индуцированные фагоустойчивые клетки представлены генетически нестабильными формами. Во время размножения они выщепляют новые MS2-устойчивые формы с более выраженными изменениями в области, кодируемой половым фактором. Клетки двух конечных форм MS2-индуцированных мутантов продуцируют также новый тип фагов, преставленных ДНК-содержащими формами, которые нейтрализуются, однако, анти-MS2 сывороткой. Выщепление этих фагов подтверждает, что генетическая субстанция РНК-содержащего бактериофага способна экспрессироваться как часть ДНК-содержащей структуры. Чутливі клітини Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, інфіковані РНК-вмісним фагом MS2, продукують фагові часточки і одночасно продовжують ділитися, вищеплюючи чутливі клітини, здатні підтримувати нові цикли інфекції. Розмноження фага в чутливих клітинах призводить до появи фагостійких форм в потомстві цих клітин. Показано, що це явище зумовлене не селекцією преіснуючих фагостійких мутантів, а є результатом взаємодії між фагом і клітиною. На відміну від звичайних спонтанних або хімічно індукованих мутантів E. coli, MS2-індуковані фагостійкі клітини представлені генетично нестабільними формами. Під час свого розмноження вони вищеплюють нові MS2-стійкі форми з більш вираженими змінами в області, кодованій статевим фактором. Клітини двох кінцевих форм MS2-індукованих мутантів продукують також новий тип фагів, представлених ДНК-вмісними формами, що нейтралізуються, однак, анти-MS2 сироваткою. Вищеплення цих фагів підтверджує, що генетична субстанція РНК-вмісного бактеріофага здатна експресуватися як частина ДНК-вмісної структури. Sensitive cells of Escherichia coli AB 259 Hfr 3000 infected with RNA-containing phage MS2 produce phage particles and continue to divide showing segregation of sensitive cells maintaining new infection cycles. Phage multiplication in sensitive cells gives rise to phageresistant forms in their progeny. The described phenomenon has been shown to be due not to pre-existing phageresistant cell selection but is a result of interaction of the phage and the cell. In contrast to the usual spontaneous or chemically induced Escherichia coli mutants MS2-induced phage-resistant cells are genetically unstable. During their reproduction they segregate new MS2-resistant types carrying more significant changes in the region coded by the sex factor. Cells belonging to two final MS2-induced mutants also produce a new type of phages; they are DNA-containing forms neutralized, however, by anti-MS2 serum. Production of such phage proves that genetic moiety of RNA-containing phage is able to be expressed as a part of the DNA structure.
issn	0564-3783
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8045
citation_txt	Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2 / Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 1. — С. 73-90. — Бібліогр.: 49 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT perervatp vzaimodeistviernksoderžaŝihbakteriofagovskletkoihozâinomms2inducirovannyemutantyecoliivozniknoveniednksoderžaŝihproizvodnyhbakteriofagams2 AT mirûtaaû vzaimodeistviernksoderžaŝihbakteriofagovskletkoihozâinomms2inducirovannyemutantyecoliivozniknoveniednksoderžaŝihproizvodnyhbakteriofagams2 AT mirûtanû vzaimodeistviernksoderžaŝihbakteriofagovskletkoihozâinomms2inducirovannyemutantyecoliivozniknoveniednksoderžaŝihproizvodnyhbakteriofagams2
first_indexed	2025-11-26T18:38:10Z
last_indexed	2025-11-26T18:38:10Z
_version_	1850768629379891200
fulltext	Чувствительные клетки Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, инфицированные РНК�содержащим фагом MS2, продуцируют фаговые частицы и одновременно продол� жают делиться, выщепляя чувствительные клетки, спо� собные поддерживать новые циклы инфекции. Размноже� ние фага в чувствительных клетках приводит к появле� нию фагоустойчивых форм в потомстве этих клеток. Показано, что это явление обусловлено не селекцией предсуществующих фагоустойчивых мутантов, а явля� ется результатом взаимодействия между фагом и клеткой. В отличие от обычных спонтанных или хи� мически индуцированных мутантов E. coli, MS2�индуци� рованные фагоустойчивые клетки представлены гене� тически нестабильными формами. Во время размноже� ния они выщепляют новые MS2�устойчивые формы с бо� лее выраженными изменениями в области, кодируемой половым фактором. Клетки двух конечных форм MS2� индуцированных мутантов продуцируют также новый тип фагов, представленных ДНК�содержащими форма� ми, которые нейтрализуются, однако, анти�MS2 сыво� роткой. Выщепление этих фагов подтверждает, что генетическая субстанция РНК�содержащего бактерио� фага способна экспрессироваться как часть ДНК�содер� жащей структуры. Введение Известно, что популяции РНК�содержащих вирусов представлены не одним типом генома определенной структуры, а представляют собой гетерогенную смесь родственных геномов (ква� зивиды) [1]. Благодаря высокому темпу возник� новения мутаций геномы квазивидовых вирус� ных популяций содержат одну и ту же так на� зываемую консенсусную последовательность, которая определяет их видовую принадлеж� ность, но отличаются друг от друга и от консен� сусной последовательности одной, нескольки� ми или множеством мутаций. Большинство популяций РНК�содержа� щих вирусов (квазивидов) содержат все возмож� ные одиночные и двойные мутации, а также в разных соотношениях тройные, четверные и т.д. мутации. Большой вклад в эти исследова� ния внесло использование фага Qβ как модели РНК�содержащего вируса. В то же время среди всех этих исследований и полученных на их основе результатов почти полностью отсутствуют некоторые направления и явления, изучение которых также могло бы иметь существенное значение. К таким явле� ниям следует отнести образование новых форм в потомстве клеток, перенесших вирусную ин� фекцию, и возникновение новых типов виру� сов за счет их взаимодействия с геномом инфи� цированной клетки. На протяжении многих лет объектом наше� го внимания был РНК�содержащий фаг MS2. В ряде наших работ на его модели изучалась принципиальная способность РНК�содержа� щих вирусов, для которых не установлена ис� тинная лизогения, вступать во взаимодействие с хромосомой клетки�хозяина, что, как выяс� нилось, приводит к возникновению бактери� альных мутантов плейотропного типа и новых типов вируса. Актуальность данного направления исследо� ваний вытекает из постоянной необходимости в создании новых подходов и эксперименталь� ных моделей для изучения процессов, идущих в инфицированной клетке и популяции инфи� цированных клеток. При этом особое значение имеет исследование отдаленных последствий этих процессов, которые не ограничиваются развитием какой�либо из форм инфекции, а выливаются в возникновение новых, как менее, так и более агрессивных форм, имеющих се� лективные преимущества по сравнению с ис� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 73 © Т.П. ПЕРЕРВА, А.Ю. МИРЮТА, Н.Ю. МИРЮТА, 2008 УДК 577.253.4:561.231 Т.П. ПЕРЕРВА, А.Ю. МИРЮТА, Н.Ю. МИРЮТА Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, ул. Акад. Заболотного 150, Киев, 03143, Украина E%mail: kunakh@imbg.org.ua ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РНКJ СОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ С КЛЕТКОЙJХОЗЯИНОМ: MS2JИНДУЦИРОВАННЫЕ МУТАНТЫ E. COLI И ВОЗНИКНОВЕНИЕ ДНКJСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ БАКТЕРИОФАГА MS2 ходными. Последнее обстоятельство приобре� тает особое значение в связи с регистрацией новых, ранее неизвестных инфекционных забо� леваний. В настоящей работе мы приводим краткий обзор данных литературы и собствен� ных исследований, посвященных проблеме вза� имодействия РНК�содержащего бактериофага MS2 с инфицированной им клеткой�хозяином. Особенности РНКJсодержащих бактериофагов как модельной системы [2, 3] С момента своего открытия в 1961 г. [4] РНК� содержащие бактериофаги служили модельны� ми системами для решения различных проблем молекулярной биологии. Будучи источником гомогенной и стабильной мРНК они оказались особенно полезными при изучении регуляции генной экспрессии на уровне трансляции. Концепции полярности и контроля трансля� ции белками�репрессорами были разработаны именно на основании изучения фаговых РНК. Таксономия и классификация. РНК�содержа� щие бактериофаги образуют семейство Levivi� ridae, разбитое на четыре основные группы в соответствии с серологическими и физико� химическими свойствами. Лучше всех охарактеризован в группе I фаг MS2. Его ближайшими родственниками явля� ются R17, f2, M12 и JP501 (> 90 % гомологии), фаг fr отстоит от них несколько дальше. Гено� мы MS2 и fr полностью секвенированы. В группе II полностью секвенированы геномы фагов GA и KU1. Прототипом группы III яв� ляется Qβ, геном которого тоже полностью секвенирован. В группе IV лучше всех охарак� теризован фаг SP. Структура вириона. Каждый вирион содержит одну молекулу положительной цепочки РНК, 180 копий белка оболочки и одну копию белка созревания, или А�белка. Фаги группы III так� же содержат 3–14 копий совместно прочитан� ного (read�through) белка А1 в своем капсиде, что относится и к группе IV, из�за чего обо� лочка этих фагов имеет неизомерную структу� ру. Диаметр частичек РНК�содержащих бакте� риофагов составляет около 26 нм, толщина белковой оболочки – около 2,3 нм. Инфекционный процесс. РНК�содержащие фаги инфицируют клетку путем адсорбции на F�пили и проникновения РНК вдоль них. Эти филаментозные структуры могут иметь разное происхождение и серотипы. Прикрепление фага к белковой поверхности пили происхо� дит с участием белка созревания А. Белок обо� лочки не играет никакой роли в этом процес� се, в то время как двойной комплекс А�белка с одной копией РНК группы I может инфици� ровать клетку. У фагов группы III минималь� ный инфицирующий набор требует дополни� тельного присутствия совместно прочитанного белка А1. Вряд ли А�белок играет какую�либо другую роль, кроме обеспечения проникнове� ния фаговой РНК в клетку, поскольку полнос� тью очищенная от белка фаговая РНК способ� на генерировать инфекционное потомство в сферопластах. Генетическая структура. Геном РНК�содер� жащих бактериофагов состоит из четырех ге� нов, кодирующих белки созревания, оболочки, лизиса и репликазы. Все гены разделены меж� генными участками за исключением гена бел� ка лизиса, который в группе I (MS2) частично перекрывает гены белка оболочки и реплика� зы. В группе II ген белка лизиса перекрывает территорию между генами белка оболочки и репликазы, в то время как в группах III и IV он полностью включает ген белка оболочки и часть межгенной последовательности, не до� ходя до гена репликазы. Белок лизиса не входит в состав вириона и во время фагового синтеза включается в цитоплазматическую мембрану, вызывая ее дезорганизацию. Экспрессия генов. Появление фаговых бел� ков четко контролируется геномом как с точ� ки зрения их количества, так и с точки зрения момента их появления. Контроль осуществля� ется за счет вторичной структуры РНК, огра� ничивающей связывание рибосом в областях инициации трансляции. Белок созревания ну� жен в небольшом количестве – одна копия на вирион, в связи с чем его трансляция поддер� живается на низком уровне. Белок репликазы, необходимый в небольших количествах, синте� зируется в течение первых 20 мин инфекции, после чего его синтез ингибируется белком оболочки, который присоединяется к сайту в стартовой области репликазного гена. Белок оболочки синтезируется на протяжении всего инфекционного цикла без какого�либо нега� тивного контроля. Ген белка лизиса, так же как ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 174 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта и репликазы, находится под трансляционным контролем гена белка оболочки. Репликация. Большинство данных относи� тельно репликации были получены в системе фага Qβ, но при этом имеется в виду, что прин� цип репликации идентичен для всех групп фа� гов. Попав в клетку, фаговая РНК выступает сначала в роли мессенджера (мРНК), посколь� ку размножение нуждается в продукте гена реп� ликазы. После его появления фаговая субъеди� ница соединяется с факторами клетки�хозяина, что делает возможной репликацию фаговой РНК. Ферментный комплекс, осуществляющий репликацию фаговой РНК, содержит одну субъединицу, кодируемую фагом, и три субъеди� ницы, кодируемые клеткой�хозяином. Репли� кация происходит путем синтеза свободной минус�цепочки с последующим синтезом на ней плюс�цепочек. Неразделенные положи� тельные и отрицательные цепочки не могут слу� жить субстратом для репликазного комплекса, откуда вытекает, что последний должен разли� чать сайты инициации на исходных и дочерних цепочках. Филогения РНК!фагов. Согласно общему мнению все четыре группы фагов происходят из одного источника. Основанием этому мне� нию служат практически идентичная генети� ческая организация, сильное подобие реплика� тивных комплексов, использование одних и тех же белков хозяина при репликации РНК и сходство механизмов контроля белкового син� теза. Эти свойства легче объясняются дивер� гентной, чем конвергентной эволюцией. Экология. Географическое распределение РНК�фагов имеет достаточно строгий харак� тер. В северной Японии группа II преобладает над группой III (6 : 1), но чем дальше на юг, тем соотношение это уменьшается, и уже в Юго�Восточной Азии группа II встречается редко. Это может быть связано с климатом, поскольку группа III хорошо размножается при 40 °С, а группа II – при 20 °С. Группы I и IV ближе в этом отношении к группе III. В ес� тественных условиях жизненный цикл РНК� фагов поддерживает E. coli, хотя это могут де� лать и другие виды бактерий. В связи с тем, что РНК�колифаги и энтеровирусы занимают одни и те же зоны обитания и имеют сходную структурную организацию, а также сходную чувствительность к факторам окружающей сре� ды, РНК�фаги могут быть использованы как индекс�организмы для отслеживания появле� ния патогенных энтеровирусов. Устойчивость к бактериофагу MS2, индуцированная у E. coli, которая инфицирована этим фагом [5, 6] Отправной точкой экспериментов по иссле� дованию взаимодействия РНК�содержащих бактериофагов с клеткой�хозяином было изу� чение природы возникновения устойчивости к этим фагам в процессе их инфекционного цик� ла, особенно в условиях, не способствующих быстрому клеточному делению [7]. В ранних работах, посвященных биологии РНК�содер� жащих бактериофагов, такое явление даже дискутировалось с точки зрения возможности лизогении у этих фагов [8]. Однако в данном случае на этот вопрос тяжело было ответить при помощи классических тестов из�за спо� собности донор�специфических фагов уста� навливать персистентную инфекцию и секре� тировать зрелое потомство через клеточную стенку [9, 10]. После публикации работы Згаги [11] проблема лизогении у РНК�содержащих фагов была закрыта окончательно, а появление фагоустойчивых форм традиционно расцени� валось как результат селекции предсуществу� ющих бактериальных мутантов [12, 13]. Вмес� те с тем такая трактовка не выглядит доста� точно убедительной, если принять к сведению масштабы наблюдаемой фагоустойчивости. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разрабо� тали собственный метод исследования потом� ства явно чувствительной клетки, перенесшей инфекцию фагом MS2. В отличие от неинфи� цированных или спонтанных фагорезистент� ных мутантов MS2�инфицированные клетки образуют на твердой питательной среде коло� нии характерной формы с плотным центром и прозрачными волнистыми краями, четко отли� чающиеся от обычных для этого штамма коло� ний гладкого типа (рис. 1). Титрование компо� нентов таких колоний показало, что они со� держат в среднем (1–2)·109 бляшкообразующих единиц и 1·108 бактерий. Образование инфек� ционных центров при высеве материала из волнистой колонии может идти как за счет сво� бодного фага, так и за счет клеток, несущих в ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 75 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты себе инфекционное потомство, но не успевших лизироваться в составе волнистой колонии и реализовавших эту возможность при повторном рассеве на твердую среду. По аналогии с други� ми системами, факт одновременного размно� жения фага MS2 и инфицированной им клет� ки может быть определен как состояние носи� тельства 1�го типа, для которого характерно выщепление клеткой чувствительного потом� ства, поддерживающего последующие циклы инфекции [14]. Несложные расчеты с учетом частоты спонтанных мутаций от F+ к F– фено� типу и количества погибших клеток в составе «волнистой» колонии показали, что 98,67 % потомков инфицированной клетки остаются фагочувствительными, а остальные (1,33 %) приобретают фагоустойчивость. Индуцированные фагом MS2 устойчивые штаммы E. coli стабильно сохраняют приобре� тенный признак в процессе пересевов. Возник� новение устойчивости не сопровождается по� явлением внутриклеточной формы иммуннос� ти, поскольку в наших опытах сферопласты, полученные из устойчивых культур, оказались в той же мере компетентными по отношению к фаговой РНК, что и сферопласты из исходной чувствительной культуры. Устойчивость мутан� тных культур обусловлена практически полной потерей ими адсорбирующей активности. По аналогии с данными Видмера и Лебека [15, 16], изучавшими индуцированную MS2 фагоустойчивость в fi+R�культурах E. coli, мы предполагали, что у полученных нами устойчи� вых штаммов также отсутствуют F�пили. Одна� ко это предположение не подтвердилось элек� тронно�микроскопическими исследованиями. На снимках устойчивых клеток четко видны половые пили с адсорбированными на них фа� говыми частичками. Возможно, что адсорбция, наблюдаемая электронно�микроскопически, имеет обратимый характер, и блок инфициро� вания обусловлен отсутствием проникновения фаговой РНК в клетку. В отличие от Видмера и Лебека [15, 16] мы не наблюдали выщепления фага проверенны� ми устойчивыми культурами, которые дальше будем называть первичноустойчивыми, но дальнейшее изучение их показало, что они яв� ляются наиболее адекватным материалом для поиска истинных или дефектных MS2�лизоге� нов как клеток, хромосома которых содержит фаговый геном или его часть. Генетическая нестабильность MS2Jиндуцированных мутантов E. coli. Производные варианты [17, 18] Описанная в предыдущем разделе индукция фагом MS2 фагорезистентных мутантов E. coli логично согласуется с их свойствами, основным из которых следует считать генетическую не� стабильность. В отличие от привычных спон� танных или химически индуцированных эти мутанты не являются конечной формой мутант� ного изменения. В ходе размножения они че� рез ряд промежуточных мутантных форм вы� щепляют новые типы мутантов, у которых усугубление первичной мутации в области по� лового фактора и сохранение фагоустойчи� вости сопровождается стойко наследуемыми изменениями свойств мембран и оболочки, а также нарушением процессов роста и деления. В общем, система MS2�индуцированных му� тантов включает в себя как первичную фаго� устойчивую культуру, так и производные ва� рианты, свойства которых, а также законо� мерность и частота выщепления описаны в настоящем разделе. Первичноустойчивая культура. Колонии кле� ток первичноустойчивого мутанта идентичны колониям дикого типа. Биохимически культу� ра также полностью соответствует исходному типу: сбраживает до кислоты и газа глюкозу, ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 176 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта Рис. 1. Колонии E. coli, образованные MS2�инфици� рованными клетками лактозу, маннит, мальтозу, ксилозу, дульцит, рамнозу, сорбит, арабинозу, выделяет индол и не образует сероводород. Признак MS2�устой� чивости прочно сохраняется культурой в про� цессе пересевов. Свободного фага культура не выделяет. Производные варианты выщеплялись из ко� лоний первичноустойчивой культуры, были отобраны сначала по морфологии колоний на твердой среде и разбиты на три основных типа. Зернистый тип (названный E. coli 23!2). Ко� лонии часто имеют уплотненный центр и про� зрачные неправильные края (рис. 2, а). При длительном хранении посевов на чашках ко� лонии сильно разрастаются, края их приобре� тают совершенно неправильную ветвистую форму, часть клеток врастает в агар. Структура колоний зернистая за счет гибели части мате� риала. Электронно�микроскопически (рис. 2, б) колонии состоят из смеси живых и погиб� ших клеток, наполненных бесформенным, не� структурированным материалом. При этом часть мертвых клеток представлена неразде� ленными филаментозными формами, а часть – более короткими, чем у дикого типа, что сви� детельствует о нарушении процессов роста и деления. От исходной культура биохимически отличается утратой способности сбраживать углеводы, кроме глюкозы до кислоты, и начи� нает слабо ферментировать сахарозу тоже до кислоты. Поскольку потеря признака каса� ется лактозы, маннита, мальтозы, ксилозы, дульцита, рамнозы, сорбита, арабинозы, то, очевидно, ее можно объяснить не мутациями в соответствующих оперонах, а нарушением транспорта углеводов в клетку на уровне мем� бран. Это отклонение от нормы не сопровож� дается появлением ни ауксотрофности, ни термочувствительности. Об изменении свойств мембран и оболочки мутанта свидетельствует также склонность его колоний к «ползучему» росту, проницаемость для белка лизиса, выделяемого лизирующим мутантом (см. ниже), а также повышенная чувствительность к хлороформу и лизоциму. В отличие от первичноустойчивых клетки этого типа уже не имеют F�пили, т.е. наруше� ние роста и деления, а также свойства мемб� ран и оболочки связаны у этого мутанта с со� бытиями в половом факторе. Лизирующий тип (названный E. coli Lys!23). На сплошном газоне зернистого типа лизиру� ющие клетки образуют колонии, окруженные зоной лизиса (рис. 2, в). На газоне клеток ди� кого типа, при совместном с ним высеве, они растут как отдельные колонии, но без зоны лизиса. На стадии логарифмического роста в жидкой среде оптическая плотность мутант� ной культуры увеличивается быстрее по срав� нению с исходным штаммом. Переход в ста� дию стационарного роста у этого мутанта про� исходит при более высокой плотности культу� ры, чем у дикого типа. При электронно�микроскопическом иссле� довании (рис. 2, г) у лизирующего мутанта на� блюдается отсутствие F�пили и, как правило, жгутиков, а также наличие характерных обра� зований, по количеству соответствующих чис� лу нуклеоидов в активно делящейся клетке E. coli. Характерно также увеличение размеров мутантных клеток по сравнению с диким ти� пом и усиление тенденции к образованию це� почек и конгломератов, что объясняет быстрое оседание клеток на дно в жидких культурах. Биохимически культура активна по отно� шению к глюкозе (кислота через 1 сут), маль� тозе и арабинозе (кислота на 4�е сутки). Куль� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 77 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты Рис. 2. Колонии и клетки MS2�индуцированных мутан� тов: а – колонии мутанта зернистого типа; б – клетки мутанта зернистого типа, �10000; в – колонии мутанта лизирующего типа на газоне клеток мутанта зернистого типа; г – клетки мутанта лизирующего типа, �4000 тура агглютинируется антисывороткой к про� гретым клеткам дикого типа в разведении 1 : 50 – 1 : 100 в отличие от клеток мутанта зер� нистого типа, который вообще не агглютини� руется антисывороткой. Исходная культура агглютинируется этой же сывороткой в разве� дении 1 : 800 – 1 : 1600. По Грамму клетки окрашиваются мозаично. Подобно мутантам зернистого типа, лизиру� ющие мутанты не проявляют признаков ни ауксотрофности, ни термочувствительности. Зоны лизиса вокруг колоний не связаны с индукцией фага, поскольку многократные по� пытки выделить его из этих зон не имели успе� ха. Оказалось, что появление этой зоны обуслов� лено синтезом вещества белковой природы – зона исчезает при обработке посевов проназой, но не ДНКазой или РНКазой. Учитывая про� исхождение MS2�индуцированных мутантов, можно предположить, что литическая актив� ность представлена MS2�кодированным бел� ком лизиса. Действительно, зоны лизиса не формировались при обработке посева антисы� вороткой кролика, полученной к сонифици� рованным рMS27�содержащим клеткам, кото� рые накопили MS2�специфические продукты на протяжении 2–3�недельного культивирова� ния их в жидкой среде при 20–22 °С. Обработ� ка посевов сывороткой неиммунизированного кролика, MS2�антисывороткой, антисыворот� ками к MS2�неинфицированным и рMS27� бесплазмидным сонифицированным клеткам E. coli 3000 такого эффекта не давала. Таким образом, описанный тест позволяет предполо� жить MS2�специфическое происхождение ли� тической активности у мутантов лизирующего типа, т.е. синтез ими фагового белка лизиса. Вместе с тем этот признак (зона лизиса) ока� зался приемлемым при клонировании мутант� ной области MS2�индуцированного мутанта лизирующего типа (см. ниже). Мукоидный тип. Клетки образуют колонии – крупные, мукоидные, выпуклые (рис. 3, г), ко� торые через несколько дней хранения при комнатной температуре становятся плоскими, приобретают перламутровый блеск и иногда лизируют. В биохимическом отношении клет� ки соответствуют дикому типу. Ревертабельность. Ни одна из мутантных форм не ревертирует к исходному морфологи� ческому типу гладких колоний. К исходному типу не ревертируют также промежуточные мутантные типы, утилизирующие сахара и об� разующие зернистые колонии (см. ниже). Закономерности выщепления производных вариантов Выщепление зернистого типа. Колонии зер� нистого типа были обнаружены случайно сре� ди гладких устойчивых колоний; появление их в посевах имело случайный и нерегуляр� ный характер. В дальнейшем наше внимание привлекли некоторые гладкие устойчивые ко� лонии, имеющие выступающие участки более слабого роста, зернистые при изучении их че� рез лупу (рис. 3, а). При рассеве этих зернистых выпячиваний на агаре образуются полупрозрачные зернис� тые колонии (рис. 3, б), клетки которых в био� химическом отношении или полностью отвеча� ют дикому типу, или ферментируют все углево� ды, в том числе и сахарозу, только до кислоты. Мутантные формы зернистого типа, ферменти� рующие углеводы, появляются уже в первич� ных рассевах или в последующих рассевах про� межуточных форм с неравномерной частотой – от 2–3 до нескольких сотых процента. Выщепление мутантов лизирующего типа. Выщепление происходит из клеток зернистого типа с частотой точковых мутаций и может быть отслежено при высеве большого количес� тва клеток на чашку двухслойным методом. Выщепление мутантов мукоидного типа. Клет� ки, образующие мукоидные колонии, выщеп� ляются при формировании колоний первично� устойчивого типа, образуя на этих колониях или слегка выпуклые блестящие сектора, или петлеподобные структуры (рис. 3, в). При рас� севе на чашки материала, отколотого из этих структур, мукоидные колонии (рис. 3, г) фор� мируются без каких�либо переходных типов. Чувствительность мутантов зернистого и ли! зирующего типов к некоторым колифагам. Обед� нение антигенного состава, нарушение транс� порта сахаров, мозаичное окрашивание по Грамму свидетельствуют о значительных нару� шениях свойств клеточной стенки мутантных клеток. В связи с этим интересно было прове� рить чувствительность мутантов к колифагам, рецепторная специфичность которых хорошо ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 178 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта изучена. С этой целью был использован Ох2 фаг, специфический для белка ОmpA, мутанты Ox2h10 и Ox2h12, специфические для белков OmpA и OmpC, и фаг Tulb, специфический для белка OmpC наружной мембраны E. coli [19]. Кроме того, был использован LamB�специфи� ческий фаг λ [20] и LPS�специфические фаги P1 и T7 [21]. Чувствительность к фагам опре� деляли спот�тестами с использованием препа� ратов с титром 109–1010 частичек в 1 мл. В ре� зультате оказалось, что оба мутанта – зернис� тый и лизирующий – чувствительны к фагам Ox2, Ox2h10, Ox2h12, Tulb и P1, но не чувстви� тельны к фагам λ и Т7. К h� и hh�мутантам фа� га λ оба MS2�индуцированных мутанта E. coli оказались чувствительными. Из этих данных следует, что основная часть белков наружной мембраны мутантов зернистого и лизирующе� го типов сохраняют свои свойства, в то время как системы, связанные с формированием у них LPS и LamB белка, вероятно, поврежде� ны. Что касается чувствительности зернистого и лизирующего мутантов к фагу Р1, то послед� ний имеет широкий круг хозяев и, очевидно, менее чувствителен к конформации LPS, ко� торая может изменяться за счет потери одного или нескольких сахаров. Клонирование мутантной области MS2Jиндуцированного мутанта E. сoli и синтез фагоспецифической РНК на клеточной ДНК [22] Имея в своем распоряжении MS2�индуци� рованные мутанты, мы попробовали выяснить, не обусловлены ли их свойства структурной связью фагового генома с клеточной хромосо� мой. Выявление такой связи могло бы пролить свет на сложные для понимания особенности взаимодействия РНК�содержащих бактерио� фагов с клеткой�хозяином и стать доказатель� ством способности фага MS2 если не устанав� ливать истинную лизогению, то индуцировать состояние, основанное на физическом объеди� нении фагового генома с клеточной ДНК. В настоящем разделе описано клонирова� ние EcoR1 фрагментов ДНК хромосомы MS2� индуцированного лизирующего мутанта ки� шечной палочки и показан синтез MS2�спе� цифической РНК в клетках, трансформиро� ванных рекомбинантными плазмидами. На данном этапе был использован мутант лизирующего типа как наиболее перспектив� ный для получения ответов на поставленные вопросы. Получение рекомбинантных плазмид с лити! ческими свойствами мутанта лизирующего типа. Поскольку мутации, определяющие биологи� ческие свойства мутанта лизирующего типа, связаны с особенностями роста и деления, т.е. с областью инициации репликации, клониро� вание интересующей нас области клеточной ДНК проводили с использованием не способ� ного к репликации Ар�фрагмента плазмиды pCV16, несущего ген устойчивости к ампи� циллину [23]. ДНК хромосомы мутанта, обра� ботанную рестриктазой EcoR1, лигировали с изолированным Ар�фрагментом, вырезанным из плазмиды с использованием этого же фер� мента, и лигированной смесью трансформи� ровали реципиентные клетки E. coli HB101. Сначала клоны отбирали по устойчивости к ампициллину. Теоретически полученная та� ким методом клонотека содержала плазмиды, включающие в себя области инициации реп� ликации клеточной хромосомы или интегри� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 79 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты Рис. 3. Выщепление производных вариантов из коло� ний MS2�индуцированного первичноустойчивого му� танта E. coli: а – зернистые выпячивания на колониях первичноустойчивого мутанта; б – колонии, образован� ные клетками, высеянными из зернистых выпячива� ний; в – мукоид�образующие структуры (петли) на ко� лониях первичноустойчивого мутанта; г – колонии мутанта мукоидного типа рованного с ней F�фактора. Следующая зада� ча состояла в отборе клонов, способных про� дуцировать литическую активность того же типа, что и исходный лизирующий мутант. С этой целью мы использовали клетки мутанта зернистого типа E. coli 23�2, при высеве на ко� торый лизирующий мутант образует колонии, окруженные зоной лизиса. Отобранные по устойчивости к ампицил� лину клоны отсевали в отдельные пробирки в жидкую среду и выращивали первые сутки при 37 °С, а затем на протяжении нескольких суток при комнатной температуре. Для провер� ки литических свойств отобранных культур материал из каждой пробирки наносили петлей на свежевысеянный газон клеток E. coli 23�2. Оказалось, что значительная часть Ар�устой� чивых клонов (около одной трети) способна на протяжении нескольких суток накапливать литическую активность и при нанесении на тест�газон образовывать или прозрачное пятно, или зону лизиса вокруг зоны клеточного роста. Способность к накоплению литической актив� ности у разных клонов была неодинаковой – у одних это происходило быстро и сопровож� далось быстрым ростом клеток и быстрым их отмиранием, у других накопление литическо� го вещества происходило более плавно, бакте� риальная суспензия мутнела с обычной для кишечной палочки скоростью, и отмирание клеток не отличалось интенсивностью. При работе с плазмидами первого типа наблюда� лись определенные трудности – низкий выход при выделении и слабоэффективная транс� формация. Плазмиды второго типа легко вы� делялись стандартными методами, эффективно трансформировали E. coli HB101 и при каж� дой повторной трансформации позволяли по� лучать бактериальные культуры со свойствами первичного трансформированного клона. В связи с этим мы пользовались плазмидой pL34, принадлежащей ко второму типу. Лити� ческие свойства описываемой нами экспери� ментальной системы наследуются стабильно и выглядят очень четкими (рис. 4). Судя по данным рис. 4, литические свойст� ва, а именно специфичность к определенному хозяину клона, содержащего плазмиду, совпа� дают с аналогичными показателями у исход� ного лизирующего мутанта и отличаются от подобных свойств фага MS2. Неспособность фага MS2 лизировать зернистый мутант объяс� няется отсутствием у мутантных клеток F�пи� лей. Таким образом, биологические характе� ристики рекомбинантных плазмид позволяют считать, что нам удалось проклонировать учас� ток хромосомы, определяющий фенотип лизи� рующего мутанта E. coli Lys23. Определение наличия MS2Jспецифической РНК в pL34Jтрансформированных клетках E. coli Наличие MS2�специфической РНК в pL34 трансформантах определяли методом блот� гибридизации, которую осуществляли сначала с использованием двух зондов, а именно ДНК плазмид pL34 и pCV16. Прежде всего нас ин� тересовала pL34 как рекомбинантная плазми� да, литические свойства которой соответство� вали литическим свойствам мутанта E. coli ли� тического типа. В связи с этим было важно выяснить, содержит ли pL34 последователь� ность, комплементарную РНК MS2. Плазми� ду pCV16 использовали как контроль. Резуль� таты гибридизации препаратов РНК с 32Р� ДНК плазмиды pL34 приведены на рис. 5, а. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 180 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта Рис. 4. Литические свойства pL34�трансформирован� ной культуры, мутанта лизирующего типа и фага MS2 на стандартном для РНК�содержащего бактерио� фага хозяине E. coli 3000 и его мутанте зернистого типа: а – газон клеток E. coli 3000; б – газон клеток мутанта зернистого типа; 1 – капля бульонной культуры с плаз� мидой pL34; 2 – капля бульонной культуры мутанта ли� зирующего типа; 3 – капля суспензии фага MS2 Как можно видеть, ДНК плазмиды pL34 гибридизуется с РНК pL34�трансформирован� ной культуры, а также с РНК контрольного штамма E. сoli 3000. С РНК фага MS2 гибри� дизация отсутствует, также она отсутствует со всеми образцами РНК при использовании в качестве зонда ДНК плазмиды pCV16 (не пока� зано). Гибридизацию ДНК pL34 с РНК конт� рольной культуры можно, очевидно, объяснить тем, что pL34 включила участок хромосомы мутанта E. сoli 3000, и гибридизация происхо� дит с РНК, гомологичной клеточному фраг� менту плазмидной ДНК. Отсутствие гибриди� зации pL34 с РНК фага MS2 побудило нас к использованию в качестве зонда плазмиды рMS27 [24, 25], содержащей ДНК�копию РНК MS2, и фрагмента этой копии, содержащего только MS2�специфическую последователь� ность, свободную от векторного участка. Ре� зультаты гибридизации представлены на рис. 5, б, в. Полученные данные демонстрируют наличие гибридизации РНК MS2 и суммарной РНК pL34�трансформантов как с зондовой плазмидой рMS27, так и с отдельным фраг� ментом, содержащим часть ДНК�копии РНК фага MS2, свободную от векторной последо� вательности. Расположение сигналов совпада� ет, и отличаются они лишь интенсивностью. Гибридизация с РНК контрольного штамма E. coli 3000 отсутствует, что свидетельствует о специфичности связывания ДНК обоих зон� дов с РНК фага MS2 и РНК pL34�трансфор� мированных клеток. Приведенные в настоящем разделе ре� зультаты исследований позволяют сделать два основных вывода: 1) в клетках, транс� формированных плазмидой pL34, которая включила часть хромосомы MS2�индуциро� ванного лизирующего мутанта E. coli AB259 Hfr 3000, накапливается MS2�специфичес� кая РНК; 2) ДНК плазмиды pL34 с РНК фага MS2 не гибридизуется. Из этого следует, что генетический матери� ал РНК�содержащего фага MS2 может всту� пать в прочное структурное взаимодействие с хромосомной ДНК Hfr�штамма E. coli. В то же время отсутствие гибридизации плазмидной ДНК с РНК MS2 позволяет допустить, что плазмида содержит плюс�цепочку фаговой РНК. Возможно, что размер фагоспецифичес� кого генетического материала, входящего в состав клеточной и, соответственно, плазмид� ной ДНК, меньше размера нативной РНК, о чем можно судить по расположению положи� тельных сигналов (рис. 5, б, в), а также по от� сутствию жизнеспособного фага как в клетках лизирующего мутанта, так и в клетках плазми� досодержащих культур. Определение размера фрагмента ДНК рекомбинантной плазмиды, содержащей MS2Jспецифическую последовательность, и его расположения в рекомбинантной плазмиде [26] В предыдущем разделе был показан синтез фагоспецифической РНК на фрагменте хро� мосомы MS2�индуцированного мутанта E.coli, клонированного в составе рекомбинантной плазмиды. В настоящем разделе представлены результаты изучения клонированного фраг� мента ДНК мутантной клетки с целью опреде� ления размеров MS2�специфической области, ее расположения в рекомбинантной плазмиде и наличия сайтов для некоторых широко ис� пользуемых рестриктаз. Для определения размеров фрагмента ДНК рекомбинантной плазмиды, несущей MS2� специфическую последовательность, и его ло� кализации в рекомбинантной плазмиде ис� пользовали метод блот�гибридизации. В ка� честве зонда служил фрагмент ДНК�копии РНК MS2, свободный от векторной последо� вательности. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 81 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты Рис. 5. Определение наличия MS2�специфической РНК в pL34�трансформантах методом блот�гибриди� зации: а – радиоавтограф блот�гибридизации 32Р� ДНК pL34 с суммарными РНК; б – радиоавтограф блот�гибридизации 32Р�ДНК pMS27 с суммарными РНК; в – радиоавтограф блот�гибридизации 32Р�ДНК фрагмента pMS27 с суммарными РНК; 1 – РНК MS2; 2 – РНК pL34�трансформированной культуры; 3, 4 – РНК E. coli 3000 Электрофореграмма рекомбинантной плаз� миды, рестрицированной эндонуклеазами Pst1, BamH1, HindIII и EcoR1, а также блот�гибри� дизация полученных фрагментов с фрагмен� том рMS27 представлены на рис. 6, а, б. Полученные результаты позволяют считать, что MS2�специфическая последовательность расположена, наиболее вероятно, в составе фрагмента размером 3,9 тыс. п.н., ограниченно� го сайтами Pst1 и BamH1. Расположение этого фрагмента показано на карте рекомбинантной плазмиды, приведенной на рис. 6, в. Четкая гибридизация этого фрагмента с фрагментом ДНК�копии РНК MS2 и практи� чески полное соответствие его размера (3,9 тыс. п.н.) длине РНК MS2 (3569 п.н.) [27] позволяют считать, что MS2�подобная последователь� ность, встроенная в рекомбинантную плазмиду pL34, находится в пределах этого фрагмента. Однако обращает на себя внимание то, что эта область не содержит сайтов EcoR1 и Sal1, обна� руженных в составе ДНК�копии РНК MS2 [28]. Поэтому участок рекомбинантной плазмиды, который по данным гибридизации соответст� вует MS2�последовательности, имеет, очевид� но, строение более сложное, чем двухцепочеч� ная структура. Такой вывод согласуется с по� лученными нами ранее данными, согласно ко� торым меченая ДНК рекомбинантной плаз� миды не гибридизуется с РНК MS2. Отсутст� вие гибридизации плазмидной ДНК с РНК MS2 на фоне синтеза плазмидосодержащими клетками MS2�специфической РНК и отсут� ствием сайтов EcoR1 и Sal1 в пределах фраг� мента 3,9 тыс. п.н. проще всего объяснить не� стандартностью клонированного фрагмента, который может содержать трехцепочечную структуру, одна из цепочек которой представ� лена фаговой РНК. Следует также отметить, что мы не наблю� дали гибридизации при использовании в ка� честве зонда фрагмента рMS27, соответствую� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 182 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта Рис. 6. Электрофореграмма ДНК плазмиды pL34 (a) и радиоавтограф, полученный в результате гибридиза� ции соответствующего фильтра с 32Р�меченой ДНК фрагмента pMS27 (б): 1 – ДНК pMS27 + EcoR1; 2 – ДНК pL34 + Pst1; 3 – ДНК pL34 + Pst1 + BamH1; 4 – ДНК pL34 + BamH1; 5 – ДНК pL34 + BamH1 + HindIII; 6 – ДНК pL34 + HindIII; 7 – ДНК pL34 + HindIII + Pst1; 8 – ДНК pL34 + Pst1 + EcoR1; 9 – ДНК pL34 + EcoR1; 10 – ДНК pL34 + EcoR1 + BamH1; 11 – ДНК pL34 + EcoR1 + HindIII; 12 – ДНК фага λ + EcoR1 + HindIII (маркер); в – физическая карта плаз� мид pCV16 и pL34. Заштрихованная часть соответству� ет фрагменту, содержащему ген устойчивости к ампи� циллину; незаштрихованная и более широкая часть соответствует фрагменту, содержащему MS2�подобную последовательность щего гену белка созревания А. Это обстоятель� ство наводит на мысль, что наша плазмида не содержит соответствующей MS2�специфи� ческой области, что в свою очередь согласует� ся с меньшим размером MS2�специфической РНК, синтезируемой в плазмидосодержащих клетках и отсутствием в них зрелых частичек фага MS2. ДНКJсодержащие производные бактериофага MS2: биологические свойства и структура генома [29, 30] Как было показано выше, мутантные клетки лизирующего типа, высеянные на газон клеток мутанта зернистого типа, образуют колонии, окруженные зоной лизиса. Эти зоны не содер� жат инфекционного фага, поскольку все попыт� ки выделить его с использованием как F+, так и F– штаммов оказались неудачными. Однако более продолжительные наблюдения за сов� местными посевами клеток дикого и мутант� ного типов позволили обнаружить присутст� вие фагов, способных инфицировать только F+, но не F– штаммы E. coli. Появление этих фагов происходит с низкой частотой, и обна� ружение их значительно упрощается, если му� тантную культуру использовать в качестве га� зона, а сверху нанести каплю 24�часовой куль� туры E. coli 3000 или других образующих F�пи� ли клеток. Использование такого приема позво� ляет увидеть, что область роста культуры ди� кого типа в зоне нанесения капли через не� сколько дней становится заметно прозрачнее. После нескольких пассажей на чувствительной культуре материала, взятого из области такого прозрачного пятна, оказывается, что в нем на� капливается инфекционный фаг, идентичный фагу MS2 по отношению к кругу хозяев и ней� трализации MS2�антисывороткой. Такие ин� фекционные фаги были обнаружены при ис� пользовании в качестве газона клеток мутан� тов лизирующего и зернистого типов, а также клеток, несущих рекомбинантные плазмиды с клонированной в них мутантной областью MS2�индуцированного мутанта E. coli 3000 ли� зирующего типа. Следует также отметить, что фаги нового типа, которые мы дальше будем называть MS2�производными, могут быть об� наружены и в препаратах MS2 исходного ти� па, где они появляются с частотой 10–9–10–10. Обнаружение этих фагов в препаратах MS2 стало возможным только после изучения их фенотипических признаков, в том числе отно� шения к понижению температуры выращива� ния (15–20 °С), при которых они способны об� разовывать негативные колонии в отличие от стандартного фага MS2. Последнее свойство и было выбрано нами в качестве селективного признака для поиска новых MS2�производных фаговых форм в препаратах исходного MS2. Константы нейтрализации для фага MS2, фа� гов, выщепившихся в совместных посевах F+ штаммов E. coli дикого типа с клетками мутан� тов лизирующего и зернистого типов, клетка� ми�носителями pL34 плазмиды, а также фагов, обнаруженных в посевах исходного MS2, сос� тавили 285, 267, 230, 293 и 268 соответственно. В отличие от РНК�содержащих фагов ново� го типа, обнаруженных в свое время в Швей� царии в Qβ и MS2�устойчивых fi+R�культурах E. coli [15, 16], морфология обнаруженных на� ми MS2�производных фагов полностью отли� чается от морфологии фага MS2 как по струк� туре, так и по размеру. Во�первых, MS2�про� изводные фаги содержат ДНК, а не РНК, а во вторых, они имеют морфологию, типичную для ДНК�содержащих бактериофагов, т.е. состоят из головки и хвостового отростка (рис. 7, а, б). Головка MS2�производных фагов имеет ико� саэдрическую форму с диаметром около 50 нм, а длина достаточно гибкого хвостового отрост� ка составляет около 150–160 нм. Несмотря на четкую специфичность адсорб� ции MS2�производных фагов, активных толь� ко в отношении F+�штаммов, электронно�мик� роскопические исследования не выявили их адсорбции на F�пилях, т.е. у данных фагов этот процесс имеет, очевидно, свои нестан� дартные особенности. MS2�производные фа� ги образуют большие негативные колонии с прозрачными центрами, окруженными широ� кими зонами полулизиса, что отличает их от негативных колоний фага MS2 (рис. 7, в). При этом негативные колонии, образованные MS2� производными фагами, невзирая на старение бактериального газона, значительно увеличи� вают свои размеры в течение нескольких су� ток за счет расширения зон полулизиса; 2–3 не� гативные колонии способны занять площадь всей чашки Петри. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 83 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты Следует отметить сильное подобие, а воз� можно, даже идентичность всех ДНК�содер� жащих MS2�производных фагов, независимо от того, выщепились ли они из MS2�индуци� рованных мутантов E. coli, клеток�носителей рекомбинантных плазмид, или были просто выявлены в посевах MS2 исходного типа. Это подобие относится не только к таким парамет� рам, как тип нуклеиновой кислоты, морфоло� гия негативных колоний, морфология фаговой частицы и ее нейтрализация MS2�антисыворот� кой, но и подтверждается также данными ре� стрикционного анализа (рис. 8). Физическое картирование и определение MS2Jспецифической области в ДНК генома MS2Jпроизводного фага [31] В настоящем разделе описано физическое картирование фага Р23�2 – одного из предста� вителей группы MS2�производных фагов, выде� ленного из совместного посева E. coli 3000 и клеток MS2�индуцированного мутанта зернис� того типа E. coli 23�2, а также поиск MS2�спе� цифических последовательностей в геноме этого фага с помощью метода гибридизации. Физическое картирование проводили на основе измерения размеров фрагментов ре� стрикции при простых и комбинированных обработках рестриктазами фаговой ДНК [32]. Размеры фрагментов определяли в тысячах пар нуклеотидов (п.н.). Эти же данные были ис� пользованы для определения общего размера фагового генома. Размеры всех фрагментов рестрикции, со� вокупность которых позволила определить об� щий размер генома фага Р23�2 как общую мо� лекулярную массу этих фрагментов, приведены в табл. 1, а физическая карта фагового генома, построенная на основании измерений фраг� ментов рестрицированной ДНК – на рис. 9, б. Анализ присутствия MS2�специфических последовательностей в геноме фага Р23�2 про� водили с использованием 32Р�меченого Sma1� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 184 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта Рис. 7. Морфология частичек и негативных колоний ДНК�содержащего MS2�произ� водного фага: электронная микроскопия частичек ДНК�содержащего MS2�производ� ного фага (1), смешанного с фагом Т4 (2, рис. а) и фагом MS2 (3, рис. б); увеличение �100000; в – негативные колонии MS2�производных ДНК�содержащих бактериофагов Рис. 8. Электрофореграмма ДНК, выделенных из трех MS2�производных фагов и обработанных тремя ре� стриктазами HaeIII (1–3). Pst1 (4–6) и BamH1 (7–9): 1, 4, 7 – ДНК фага, выщепившегося из мутанта E. coli лизирующего типа; 2, 5, 8 – ДНК фага, выщепившего� ся из мутанта E. coli зернистого типа; 3, 6, 9 – ДНК фага, выщепившегося из клеток, содержащих pL34; 10 – ДНК фага λ + EcoR1 + HindIII (маркер) EcoR1 фрагмента кДНК MS2 размером 1,8 тыс. п.н., выделенного из ДНК плазмиды рMS27. Блот�гибридизация этого зонда с ДНК фага λ, Р23�2 и плазмидой рMS27 показала отсутствие гибридизации с фагом λ (отрицательный конт� роль, маркер), наличие гибридизации практи� чески со всеми фрагментами рMS27 + Sma1+ EcoR1 (положительный контроль, маркер) и наличие гибридизации с частью фрагментов P23�2+Sma1+EcoR1. Размеры фрагментов Р23�2, способных гиб� ридизоваться с зондом, вычисляли по данным денситограммы и сравнивали с данными, по� лученными на основании электрофореграмм рестрицированных фрагментов (табл. 2). Измерение площадей под пиками денсито� граммы показало, что в положительном конт� роле (фрагмент 1,8 тыс. п.н. в ДНК рMS27) и опытном варианте (ДНК фага Р23�2 размером 40 тыс. п.н.) они составляют 3,78 и 0,52 соответ� ственно. Количество копий зондового фраг� мента кДНК MS2, присутствующих в ДНК фа� га Р23�2, вычисляли по формуле N = Mфага·Sфага/Мфр·Sфр [33]. Подставив соответствующие значения, име� ем N = 40 · 0,52/1,8 · 3,78 � 3,3. Таким образом, фаг может содержать около 3–4 копий гомологичных зонду последователь� ностей (учитывая, что в лунку вносили одина� ковое количество препарата – по 1 мкг). Сравнивая данные, приведенные в табл. 2, и расчеты, в соответствии с которыми геном исследуемого фага Р23�2 содержит 3–4 копии фрагмента, гибридизующегося с участком пос� ледовательности кДНК MS2, с расположением соответствующих фрагментов на физической карте, можно сказать, что последовательности, гомологичные MS2�специфическим последо� вательностям, расположены в EcoR1�фраг� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 85 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты Рис. 9. Физическая карта генома MS2�производного фага Р23�2 с двумя вариантами веро� ятного расположения MS2�специфических последовательностей: а – тандемное; б – чередо� вание с MS2�неспецифическими фаговыми последовательностями HindIII Pst1 PvuII EcoR1 Sma1 BamH1 30,6* 28,2* 27,2* 39,6* 15,3 Сайт отсут� ствует 8,5 10,6 10,6 1,0 12,3 1,0 1,5 2,4 12,3 40,1 40,3 40,2 40,6 39,9 Рестриктаза А В С Фрагмент Суммарная молекулярная масса фрагментов (размер генома) Та б л и ц а 1 Размеры рестрицированных фрагментов генома фага Р23!2, тыс. п.н. * Фрагменты, размер которых был определен как сум� ма более мелких фрагментов, полученных после пере� варивания другими рестриктазами. менте и вокруг него и представляют собой или тандем из 3–4 копий (рис. 9, а), или чередова� ние MS2�специфических с MS2�неспецифи� ческими последовательностями (рис. 9, б). Второй вариант представляется более вероят� ным, так как структура фага в этой области не регулярна по отношению к сайтам ре� стрикции, на что можно было бы рассчиты� вать в случае тандема. Сравнение количества и размеров рестрик� ционных фрагментов ДНК Р23�2 (табл. 1) и фага λ [34] показывает, что электрофоретичес� кие профили рестрицированных ДНК этих объектов не совпадают ни по одной рестрик� тазе. Это дает основание думать, что часть ге� нома фага Р23�2, которая не гибридизуется с ДНК MS2, не имеет в основе своего проис� хождения ДНК профага λ. Вместе с тем нами были получены предварительные данные, со� гласно которым наблюдается гибридизация 32Р�меченой ДНК одного из MS2�производ� ных бактериофагов с ДНК хромосомы E. coli, т.е. последняя может быть причастна к проис� хождению этих фагов. Обсуждение Описанные в работе MS2�устойчивые му� танты E. coli AB 259 Hfr 3000 в целом образуют систему мутантов, выщепившихся из первич� ного мутантного штамма через ряд промежу� точных форм. Этот факт свидетельствует о на� личии нестабильности в первичном мутант� ном локусе, что отличает упомянутую группу мутантов от обычных спонтанных или хими� чески индуцированных мутантов. Изменение состояния F�пилей от потери функции у пер� вичноустойчивого мутанта до их физического исчезновения у мутантов зернистого и лизиру� ющего типов, а также отсутствие у сегрегантов реверсий к дикому типу позволяет предполо� жить, что выщепление всех производных форм происходит за счет возникновения деле� ций в мутантной области, локализованной на F�плазмиде. Расширение первичной мутации в области F�фактора сопровождается у сегре� гантов повреждением функции роста – в сто� рону ослабления у мутантов зернистого типа и в сторону усиления у мутантов лизирующего типа. У обоих типов нарушено деление, однако если культура мутантов зернистого типа содер� жит много погибших филаментозных форм, то культура клеток лизирующего типа представ� лена однородными живыми многоядерными клетками, которые часто образуют цепочки и конгломераты. Известно, что клеточное деление F+�бакте� рий сцеплено с репликацией F�плазмиды и что за это сцепление отвечают гены, находя� щиеся рядом с областью инициации реплика� ции F�фактора [35, 36]. Мутации в этих генах приводят к угнетению деления клетки�хозяина и образованию филаментозных форм, что со� ответствует некоторым фенотипическим при� знакам описанных нами мутантов. Следует помнить, однако, что в нашей эксперимен� тальной системе мы имеем дело не с автоном� ной, а с интегрированной в хромосому F� плазмидой. В этом случае репликация всей хромосомы может инициироваться не с хро� мосомного oriC, а с oriF�плазмиды [37], и структурные изменения этой области также могут проявиться как повреждение реплика� ции ДНК, а также роста и деления мутантных клеток. Исходя из степени нарушения роста и деления у мутанта зернистого типа, а также из количества и размера нуклеоидов у мутанта лизирующего типа, где репликация ДНК но� сит очень интенсивный характер и явно опе� режает деление клетки, структурно�функцио� нальные отклонения мутантного oriF весьма значительны. В последнее время накоплено много дан� ных относительно роли клеточной стенки в репликации ДНК и связи репликона со спе� цифическими мембранными белками [38–42]. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 186 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта Та б л и ц а 2 Результаты блот!гибридизации ДНК фага Р23!2 с Smal!EcoRl фрагментом кДНК MS2 по данным электро� фореграммы по данным денситограммы радиоавтографа Долевое содержание зондовой последовательности в фрагментах рестрик� ции ДНК фага Р23�2 Размеры фрагментов рестрикции Р23�2+Smal+EcoR1, тыс. п.н. 15,3 12,3 6,6 4,8 1,0 – 12,8 6,0–9,5 3,4–6,0 1,0 – 0,34 0,41 – 0,25 Молекулярная масса этих белков составляет по разным данным [43, 44] от 55 до 80 тыс. п.н., а основная функция заключается в обра� зовании «мостика» между ДНК и внешней мембраной через пептидо�гликановый слой. При этом образуется специфическая структура, объединяющая наружную мембрану, муреин и ориджин репликации и регулирующая репли� кацию ДНК и ее связь с клеточным делением. На модели oriC E. coli показано, что для связи с мембранным белком область инициации должна иметь специфический участок длиной 463 п.н. [42]. Таким образом, структура орид� жина репликации очень важна для формиро� вания комплекса мембрана–ДНК. В связи с этим мутации и структурные изменения в области oriF MS2�индуцированных мутан� тов E. coli должны усложнить присоединение мембраны к области инициации ДНК. В свою очередь процесс приспособления клеток к этим усложнениям может сопровождаться из� менениями в размещении компонентов клеточ� ных мембран из�за неправильного расположе� ния большой белковой молекулы, пронизыва� ющей все слои клеточной оболочки. Системы, обеспечивающие перемещения разнонаправ� ленных потоков субстратов и продуктов кле� точного метаболизма, очень зависят от струк� турно�функционального состояния клеточной стенки. Ее дефекты способны дать толчок для возникновения целого комплекса отклонений от нормы, подобных тем, которые мы наблю� дали в системе MS2�индуцированных мутан� тов E. coli, в том числе специфики роста и де� ления клеток, образования ими колоний, чув� ствительности клеточной стенки к разным агентам, сбоев в метаболизме углеводов и др. В связи с этим описанные в настоящей работе мутанты представляют собой прекрасную мо� дель для изучения влияния структуры области инициации репликации на клеточную стенку, рост и деление клетки и общий клеточный ме� таболизм. Это направление могло бы также лечь в основу нового подхода к пониманию процессов опухолевой трансформации у выс� ших и расширить моделирование этих процес� сов от низших эукариотов [45] до прокариотов. Процесс делетирования, очевидно, имею� щий место в области мутантного F�фактора, который интегрирован в хромосому MS2�ин� дуцированных мутантов E. coli, проявляется не только в появлении клеточных мутантов, но и в выщеплении фагов нового типа, которые со� держат ДНК, но нейтрализуются MS2�анти� сывороткой. Этот факт можно расценивать как доказательство того, что ДНК новообразован� ных фагов одета в белок оболочки MS2, а это крайне существенно для понимания механиз� ма взаимодействия фаговых РНК с клеточной ДНК. Как показали Пикет и Пибоди [46], бе� лок оболочки РНК�содержащих бактериофа� гов может упаковать любую структуру, но при одном условии – последняя должна содержать хотя бы участок фаговой РНК, к которому должен прикрепиться фаговый белок оболоч� ки. Это обстоятельство дает основание пред� положить наличие цепочки РНК в мутантной области, что согласуется с данными гибриди� зации РНК MS2 и клеточной РНК плазмидо� содержащих клеток, описанных выше. Невзи� рая на отсутствие у нас прямых доказательств в пользу этого предположения, такая гипотеза объясняет исчезновение F�пилей у описанных нами производных MS2�индуцированных му� тантов E. coli механизмами, обусловливающи� ми возникновение делеций в областях ДНК с нестандартной структурой. Наличие MS2�специфических участков у ДНК�содержащих MS2�производных бакте� риофагов было подтверждено в нашей работе методом гибридизации ДНК этих фагов с кДНК плазмиды рMS27. Вместе с тем проис� хождение MS2�неспецифической ДНК этих фагов остается невыясненным. Наиболее ве� роятным может быть предположение, что она представлена прилегающим к мутантному ло� кусу участком хромосомы E. coli, в пользу че� го свидетельствуют полученные нами предва� рительные положительные результаты гибри� дизации 32Р�меченой ДНК одного из MS2� производных бактериофагов с хромосомной ДНК E. coli. В общем образование ДНК�содержащих бактериофагов, нейтрализующихся MS2�анти� сывороткой, еще раз свидетельствует о том, что на фоне хорошо известных и детально изучен� ных процессов могут с низкой частотой про� исходить события, ведущие к образованию но� вых биологических, в данном случае вирусных форм. В отличие от ретровирусов для РНК�со� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 87 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты держащих бактериофагов не описаны проме� жуточные ДНК�содержащие структуры, свя� занные с репродукцией вирусной РНК. Более того, создание кДНК MS2 in vitro сопровожда� лось искусственным присоединением poly (dA) poly (dT) линкера к РНК MS2 [24, 25], отсутст� вие которого делает ее непригодной для работы обратной транскриптазы. Поэтому не исклю� чено, что в основании образования ДНК�со� держащих производных фага MS2 лежат другие механизмы взаимодействия РНК с ДНК, более близкие к механизмам, описанным для прока� риотов [47] или для неретровирусных РНК�со� держащих вирусов высших [48, 49]. В любом случае приведенные нами данные свидетельствуют о том, что такие общебиоло� гические проблемы, как механизмы взаимо� действия РНК� и ДНК�геномов (в том числе на структурном уровне), гетерогенность ви� русных популяций, образование новых форм вирусов и клеток, могут быть успешно отсле� жены в системе MS2�индуцированных кле� точных и фаговых мутантов. Выводы РНК�содержащий бактериофаг MS2 спосо� бен не только селектировать предсуществую� щие фагоустойчивые мутанты, но и индуци� рует устойчивость к самому себе в потомстве инфицированной им клетки E. coli. Мутации к фагоустойчивости возникают в области F� фактора, встроенного в штамме E. coli 3000 в хромосому бактерии. Сохраняя MS2�устойчи� вость, MS2�индуцированные мутанты прояв� ляют генетическую нестабильность и выщеп� ляют новые формы с новыми признаками. Выщепление новых типов бактериальных му� тантов из первичноустойчивого мутанта свя� зано с возникновением делеций в области F� фактора. Конечные сегреганты отличаются от дикого типа особенностями роста и деления, а также свойствами мембран и оболочки кле� ток, что может иметь отношение к функции инициации репликации интегрированного в хромосому F�фактора. Мутантная область MS2�индуцированного бактериального мутанта была проклонирова� на в составе рекомбинантной плазмиды. Ме� тодами гибридизации с рMS27�плазмидой, несущей в своем составе кДНК MS2, и с фраг� ментом этой кДНК показано присутствие MS2�специфической последовательности в ДНК хромосомы клеточного мутанта, а также синтез MS2�специфической РНК в клетках – носителях рекомбинантной плазмиды. MS2�индуцированные мутанты E. coli 3000 секретируют ДНК�содержащие бактериофаги, которые нейтрализуются MS2�антисыворот� кой с той же эффективностью, что и фаг MS2. Методами рестрикции и гибридизации с 32Р� меченым фрагментом кДНК MS2 построена физическая карта одного из MS2�производных фагов и показано наличие 3–4 копий MS2�спе� цифической последовательности в геноме этого фага. Присутствие MS2�специфической информа� ции в составе клонированного фрагмента ДНК MS2�индуцированных мутантов E. coli и в гено� ме ДНК�содержащих MS2�производных фагов, которые нейтрализуются MS2�антисывороткой, подтверждает возможность взаимодействия фа� говой РНК с клеточной ДНК, выливающегося в образование новых клеточных и вирусных форм с абсолютно новыми свойствами. SUMMARY. Sensitive cells of Escherichia coli AB 259 Hfr 3000 infected with RNA�containing phage MS2 pro� duce phage particles and continue to divide showing segre� gation of sensitive cells maintaining new infection cycles. Phage multiplication in sensitive cells gives rise to phage resistant forms in their progeny. The described phenome� non has been shown to be due not to pre�existing phage� resistant cell selection but is a result of interaction of the phage and the cell. In contrast to the usual spontaneous or chemically induced Escherichia coli mutants MS2�induced phage�resistant cells are genetically unstable. During their reproduction they segregate new MS2�resistant types car� rying more significant changes in the region coded by the sex factor. Cells belonging to two final MS2�induced mutants also produce a new type of phages; they are DNA� containing forms neutralized, however, by anti�MS2 serum. Production of such phage proves that genetic moie� ty of RNA�containing phage is able to be expressed as a part of the DNA structure. РЕЗЮМЕ. Чутливі клітини Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, інфіковані РНК�вмісним фагом MS2, проду� кують фагові часточки і одночасно продовжують діли� тися, вищеплюючи чутливі клітини, здатні підтриму� вати нові цикли інфекції. Розмноження фага в чутли� вих клітинах призводить до появи фагостійких форм в потомстві цих клітин. Показано, що це явище зумов� лене не селекцією преіснуючих фагостійких мутантів, ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 188 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта а є результатом взаємодії між фагом і клітиною. На відміну від звичайних спонтанних або хімічно індуко� ваних мутантів E. coli, MS2�індуковані фагостійкі клі� тини представлені генетично нестабільними формами. Під час свого розмноження вони вищеплюють нові MS2�стійкі форми з більш вираженими змінами в об� ласті, кодованій статевим фактором. Клітини двох кінцевих форм MS2�індукованих мутантів продукують також новий тип фагів, представлених ДНК�вмісними формами, що нейтралізуються, однак, анти�MS2 си� роваткою. Вищеплення цих фагів підтверджує, що ге� нетична субстанція РНК�вмісного бактеріофага здатна експресуватися як частина ДНК�вмісної структури. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Domingo Е., Martines�Salas Е., Sobrino F., Carlos J., Portela A., Ortin J., Galindes L., Peres�Brena P., Villanueva N., Najera R., VandePol S., Steinhauer D., DePolo N., Holland J. The quasispecies (extremely heterogeneous) nature of viral RNA genome populations: biological rele� vance – a review // Gene. – 1985. – 40. – P. 1–8. 2. Van Duin J. Single�stranded RNA bacteriophages // The Bacteriophages. Series The Viruses. – New York : Plenum рress, 1988. – P. 117–167. 3. Van Duin J. Single�stranded RNA bacteriophages // Encyclopedia of virology. – London : Acad. press, 1994. – P. 1334–1339. 4. Loeb Т., Linder N.D. A bacteriophage containing RNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1961. – 47, № 3. – P. 232–239. 5. Перерва Т.П. Устойчивость к фагу MS2, индуциро� ванная у E. coli при заражении этим фагом // Ци� тология и генетика. – 1977. – 11, № 1. – C. 3–9. 6. Pererva T.P. Induction of the phage resistance in the progeny of an bcterial cell // Биополимеры и клетка. – 1999. – 15, № 1. – C. 63–66. 7. Dettori R., Macсacaro G.A., Turri M. Sex�specific bac� teriophages E. coli K12. 4. Host�specifity pattern of lysis and lethality of phage µ2 // J. Microbiol. – 1963. – 11, № 1. – P. 15–43. 8. Спигелман С. Внеклеточная стратегия реплициру� ющегося РНК�генома. Стратегия вирусного гено� ма. – M.: Медицина, 1975. – C. 45–67. 9. Hoffmann�Berling H., Maze R. Release of male�specif� ic bacteriophages from surviving host bacteria // Virology. – 1964. – 22, № 3. – P. 305–313. 10. Rappaport I. Some studies of the infectious process with MS2 bacteriophage // Bioсhim. biophys. acta. – 1965. – 103, № 3. – P. 486–499. 11. Zgaga V. Lysogeny by F2 phage? // Nature. – 1977. – 267, № 5614. – P. 860–862. 12. Luria S.E., Delbruck M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistence // Genetics. – 1943. – 28, № 3. – P. 491–511. 13. Lederberg J., Lederberg E.M. Replica plating and indi� rect selection of bacterial mutants // J. Bacteriol. – 1952. – 36, № 3. – P. 399–406. 14. Yu�Chin Hsu. Propagation of elimination of viral infec� tion of carrier cells // Bact. Rev. – 1968. – 32, Pt. l. – P. 387–399. 15. Widmer H.R., Lebec G. Der Einfluss von RNS�Phagen auf Konjugations faktoren // Pathol. Microbiol. – 1974. – 40, № 3/4. – P. 153–154. 16. Widmer H.R., Lebec G. Weitere Ergebnisse zur Wechselwirkung zwichen RNS�Phagen and R� Faktoren // Pathol. Microbiol. – 1974. – 41, № 3/4. – P. 194–195. 17. Перерва Т.П., Малюта С.С. Система MS2�индуци� рованных мутантов E. coli по F�фактору // Моле� куляр. биология. – 1984. – Вып. 38. – C. 81–90. 18. Pererva T.P. Some properties of MS2�induced bacteri� al mutants // Биополимеры и клетка. – 1998. – 14, № 3. – C. 231–237. 19. Моrоnа R., Tomassen J., Henning U. Demonstration of bacteriophage receptor site on the Escherichia coli K12 outer membrane protein OmpC by use of protease // Eur. J. Biochem. – 1985. – 150. – P. 161–169. 20. Randall�Hazelbauer L., Schwartz M. Isolation of bacte� riophage lambda receptor from Escheriсhia сoli // J. Bacteriol. – 1973. – 116. – P. 1436–1446. 21. Lindberg A.A. Bacteriophage receptors // Ann. Rev. Microbiol. – 1973. – 27. – P. 207–241. 22. Перерва Т.П., Мирюта Н.Ю., Мирюта А.Ю. Лизо� гения у фага MS2. Синтез фагоспецифической РНК на клеточной ДНК // Биополимеры и клет� ка. – 1993. – 9, № 1. – C. 45–50. 23. Копылова�Свиридова Т.Н., Фодор И., Баев А.А. Но� вые векторные плазмиды для селекции рекомби� нантных клонов E. coli // Докл. АН СССР.– 1979. – 245, № 5. – C. 1250–1253. 24. Devos R., Van Emmelo J., Contreras R., Fiers W. Constru� ction and characterization of a plasmid containing a nearly full�size DMA copy of bacteriophage MS2 RNA // J. Mol. Biol. – 1979. – 128, № 4. – P. 595–619. 25. Devos R., Contreras R., Van Emmelo J.T., Fiers W. Identification of the translocable element IS1 in a molecular chimera constructed with plasmid pBR322 DNA into which a bacteriophage MS2 copy was insert� ed by the poly (dA) poly (dT) linker method // J. Mol. Biol. – 1979. – 128, № 4. – P. 621–632. 26. Pererva T.P., Miriuta N.Yu., Miriuta A.Yu. et al. Lysogeny by MS2 phage. Analysis of a recombinant plasmid containing MS2 RNA�like sequence // Био� полимеры и клетка. – 1995. – 11, № 1. – C. 61–65. 27. Fiers W., Contreras R., Duerinck F., Haegeman G., Iserentant D., Merreguert J., Min Jou W., Molemans F., Raeymaekers A., Van den Berghe A., Volckaert G., Isehaert M. Complete nucleotide sequence of bacteriophage MS2 RNA // Nature. – 1976. – 260. – P. 500–507. 28. Berkhout В., Van Duin J. Mechanism of translational ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 1 89 Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: МS2-индуцированные мутанты and coupling between coat protein and replicase gene of RNA bacteriophage MS2 // Nucl. Acids Res. – 1985. – 13, № 19. – P. 6955–6967. 29. Перерва Т.П., Мирюта А.Ю., Вудмаска М.И., Алексе� енко И.П. Лизогения у фага MS2. Экспрессия MS2� специфической информации сегрегантами неста� бильных трансдуцирующих фагов Р1 и λ // Биопо� лимеры и клетка. – 1996. – 12, № 4. – C. 73–82. 30. Pererva T.P. DNA�containing phages neutralizing with anti�MS2 serum // Биополимеры и клетка. – 1998. – 14, № 6. – C. 549–552. 31. Мірюта Н.Ю., Мірюта Г.Ю., Перерва Т.П. Фізичне картування геному MS2�похідного ДНК�вмісного фага Р23�2 та виявлення в ньому MS2�специфіч� них послідовностей // Біополімери і клітина. – 2001. – 17, № 3. – С. 225–229. 32. Fitch W.M., Smith T.F., Ralph W.W. Mapping the order of DNA restriction fragments // Gene. – 1983. – 22, № 1. – P. 19–29. 33. Burrington M.G., Seehater J., Downer D.N., Colter J.S. Rescue of BKV�transformed hamster, rat and mouse cells: correlation with levels of nonintegrated viral DNA // Virology. – 1984. – 138, № 1. – P. 168–173. 34. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бакте� рий. – М.: Мир, 1984. – 176 с. 35. Miki Т., Yoshioka К., Horiuchi Т. Control of cell divi� sion by sex factor in Escherichia сoli. 1. The 42,84–43,6 F segment couples cell division of the host bacteria with replication of plasmid DNA // J. Mol. Biol. – 1984. – 174. – P. 606–625. 36. Miki Т., Chang Z�T., Horiuchi Т. Control of cell division by sex factor in Escherichia сoli. 11. Identification of genes for inhibitor protein and trigger protein on the 42,84–43,6 F segment // J. Mol. Biol. – 1984. – 174. – P. 627–646. 37. Chandler М., Silver L., Koth G., Caro L. Chromosomal replication in an Hfr strain of Escherichia coli // J. Mol. Biol. – 1976. – 104. – P. 517–523. 38. Sparks R.B., Helinski D.R. Association of cellular membrane of E.coli minicells and the origins/terminus region of replication of piasmid ColEl DNA // Nature. – 1979. – 277, № 5697. – P. 572–575. 39. Nicoiaidis A.A., Holland I.B. Evidence for the specific association of the chromosomal origin with outer membrane fractions isolated from Escherichia coli // J. Bacteriol. – 1978. – 135, № 1. – P. 178–189. 40. Ogden G.B., Pratt M.J., Schaeohter М. The replicative origin of the E. coli chromosome binds to cell mem� branes only when semimethylated // Cell. – 1988. – 54. – P. 127–135. 41. Nanninga N. Cytokinesis in prokariotes and eukariotes: common principles and different solutions // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2001. – 65, № 2. – Р. 319–333. 42. Bartosik A.A., Jagura�Burdry G. Bacterial chromosome segregation // Acta biochim. pol. – 2005. – 52, № 1. – Р. 1–34. 43. Gudas L.J., James R., Pardeo A.R. Evidence for the involvement of an outer membrane protein in DNA initiation // J. Biol. Chem. – 1976. – 251, № 11. – P. 3470–3479. 44. Kusano Т., Steinmetz D., Hendrickson С., Murchie J., King М., Benson A., Shaechter М. Direct evidence for specific binding of the replicative origin of the Escherichia coli chromosome to the membrane // J. Bacteriol. – 1984. – 158, № 1. – P. 313–316. 45. Zhu J., Brun C., Kurooka H., Ganagida M., Huberman J.A. Identification and characterization of a complex chro� mosomal replication origin in Schizosaccharomyces pombe // Chromosoma. – 1992. – 102. – P. 7–16. 46. Picket J.J., Pibody D.S. Encapsidation of heterologous RNAs by bacteriophage MS2 coat protein // Nucl. Acids Res. – 1993. – 21. – P. 4621–4626. 47. 1nouye S., Inouye M. Bacterial reverse transcriptase // Reverse transcriptase / Eds A.M. Skalka and S.P. Goff. – Cold Spring Harbour Lab. Press, 1993. – 492 p. 48. Weiss R.A., Kellam P. Illicit viral DNA // Nature. – 1997. – 390, № 6657. – Р. 235–236. 49. Klenerman P., Hengartner H., Zinkernagel R.M. A non� retroviral RNA virus persists in DNA form // Nature. – 1997. – 390, № 6657. – Р. 298–301. Поступила 4.07.06 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 190 Т.П. Перерва, А.Ю. Мирюта, Н.Ю. Мирюта

Взаимодействие РНК-содержащих бактериофагов с клеткой-хозяином: MS2-индуцированные мутанты E. coli и возникновение ДНК-содержащих производных бактериофага MS2

Institution

Similar Items