Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші

Сконструйовано комбінаторну бібліотеку кДНК варіабельних генів імуноглобулінів мишей, імунізованих рекомбінантним інтерфероном β1b людини (rhIFN-β1b). Для цього ампліфіковану зі спленоцитів кДНК варіабельних генів важких (VH) і легких (VL) ланцюгів імуноглобулінів об’єднували лінкерною ДНК у складі...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2008
Main Authors:	Павлова, М.В., Гільчук, П.В., Похоленко, Я.О., Ніколаєв, Ю.С., Кордюм, В.А.
Format:	Article
Language:	Ukrainian
Published:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Subjects:	Оригинальные работы
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8078
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші / М.В. Павлова, П.В. Гільчук, Я.О. Похоленко, Ю.С. Ніколаєв, В.А. Кордюм // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 2. — С. 10-15. — Бібліогр.: 12 назв. — укp.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859694805193326592
author	Павлова, М.В. Гільчук, П.В. Похоленко, Я.О. Ніколаєв, Ю.С. Кордюм, В.А.
author_facet	Павлова, М.В. Гільчук, П.В. Похоленко, Я.О. Ніколаєв, Ю.С. Кордюм, В.А.
citation_txt	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші / М.В. Павлова, П.В. Гільчук, Я.О. Похоленко, Ю.С. Ніколаєв, В.А. Кордюм // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 2. — С. 10-15. — Бібліогр.: 12 назв. — укp.
collection	DSpace DC
description	Сконструйовано комбінаторну бібліотеку кДНК варіабельних генів імуноглобулінів мишей, імунізованих рекомбінантним інтерфероном β1b людини (rhIFN-β1b). Для цього ампліфіковану зі спленоцитів кДНК варіабельних генів важких (VH) і легких (VL) ланцюгів імуноглобулінів об’єднували лінкерною ДНК у складі послідовностей одноланцюгових антитіл – ScFv’s (single chain Fv antibodies). Одержаний пул ScFv-ДНК було клоновано у фагмідному векторі і використано для трансформації Escherichia coli. З використанням методу фагового дисплея відібрано бактеріальні клони, які продукують специфічні до rhIFN-β1b ScFv’s. У роботі встановлено такі характеристики створеної бібліотеки, як представленість, функціональний розмір та вихідне різноманіття послідовностей ScFv-ДНК. Продемонстровано високу специфічність взаємодії виділених фаговим дисплеєм ScFv’s з rhIFN-β1b. Была сконструирована комбинаторная библиотека кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мышей, иммунизированных рекомбинантным интерфероном β1b человека (rhIFN-β1b). Для этого амплифицированную из спленоцитов кДНК вариабельных генов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей иммуноглобулинов объединяли линкерной ДНК в составе последовательностей одноцепочечных антител – ScFv’s (single-chain Fv-antibodies). Полученный пул ScFv-ДНК был заклонирован в фагемидный вектор и использован для трансформации клеток Escherichia coli. С использованием метода фагового дисплея отобраны бактериальные клоны, которые продуцируют специфические к rhIFN-β1b одноцепочечные антитела. В работе определены такие характеристики созданной библиотеки, как представленность, функциональный размер, а также исходное разнообразие последовательностей ScFv-ДНК. Продемонстрирована высокая специфичность взаимодействия ScFv, выделенных с помощью фагового дисплея, с rhIFN-β1b. A cDNA combinatorial antibody library of mouse variable immunoglobulin fragments has been constructed from mice immunized with rhIFN-β1b. For this purpose, cDNAS of immunoglobulin variable heavy (VH) and variable light (VL) chains genes amplified from splenocytes were joined with linker DNA to form ScFv’s (single-chain Fv-antibodies). The obtained ScFv-DNA pool was cloned into a phagemid vector and used for Escherichia coli transformation. Using the phage display technique, bacterial clones producing single-chain antibodies specific to rhIFN-β1b were selected. The following characteristics of the combinatorial library were determined in this work: abundance, functional size, and the initial ScFv-DNA diversity in the library constructed. High specificity of interaction between phage displayed ScFv’s and rhIFN-β1b has been demonstrated.
first_indexed	2025-12-01T00:59:24Z
format	Article
fulltext	ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 210 Сконструйовано комбінаторну бібліотеку кДНК ва� ріабельних генів імуноглобулінів мишей, імунізованих ре� комбінантним інтерфероном β1b людини (rhIFN�β1b). Для цього ампліфіковану зі спленоцитів кДНК варіабель� них генів важких (VH) і легких (VL) ланцюгів імуноглобу� лінів об’єднували лінкерною ДНК у складі послідовностей одноланцюгових антитіл – ScFv’s (single�chain Fv�anti� bodies). Одержаний пул ScFv�ДНК було клоновано у фаг� мідному векторі і використано для трансформації Escherichia coli. З використанням методу фагового дисп� лея відібрано бактеріальні клони, які продукують специ� фічні до rhIFN�β1b ScFv’s. У роботі встановлено такі характеристики створеної бібліотеки, як представле� ність, функціональний розмір та вихідне різноманіття послідовностей ScFv�ДНК. Продемонстровано високу специфічність взаємодії виділених фаговим дисплеєм ScFv’s з rhIFN�β1b. Вступ. Новітнім підходом одержання висо� коспецифічних імунологічних реагентів є кон� струювання великих за розміром комбінатор� них бібліотек кДНК варіабельних (V) генів імуноглобулінів. З таких бібліотек у подаль� шому можливий відбір варіантів кДНК, що кодують рекомбінантні антитіла з необхідною специфічністю та афінністю [1–3]. Конструю� вання комбінаторної бібліотеки передбачає селективну ампліфікацію кДНК варіабельних фрагментів важких (VH) та легких (VL) ланцю� гів імуноглобулінів з наступним випадковим їхнім об’єднанням у складі ДНК рекомбінант� них антитіл [4]. Ампліфікацію цільової кДНК проводять з використанням специфічних прай� мерів, які синтезують з урахуванням відмін� ностей первинної структури консервативних ділянок V�генів у різних видів тварин і людини. Для ізолювання послідовностей ДНК ці� льових рекомбінантних антитіл проводять се� лекцію комбінаторної бібліотеки. Найбільш розповсюдженим методом селекції біомоле� кул in vitro є фаговий дисплей [2]. Принципом фагового дисплея є одночасне включення ге� нів певних біолігандів (зокрема, рекомбінант� них антитіл) і продуктів їхньої експресії до складу новоутворених частинок нитчастого бактеріофага у разі розвитку інфікувального процесу в E. coli. Рекомбінантні фаги можуть бути відібрані на іммобілізованих молекулах� мішенях і використані як у наступних циклах селекції, так і для продукування цільових ре� комбінантних антитіл у клітинах прокаріотів [5]. Метод фагового дисплея дозволяє прово� дити цілеспрямований пошук варіантів ДНК, які кодують рекомбінантні антитіла з необхід� ними афінністю та специфічністю [6]. До пе� реваг фагового дисплея можна також віднести можливість одержання рекомбінантних анти� тіл проти антигенів, імунізація якими усклад� нена у низці випадків (аутоантигени, токсини тощо). Найпоширенішим форматом рекомбінант� них антитіл є одноланцюгові антитіла ScFv’s (single�chain Fv�antibodies), які одержують трансляцією об’єднаних в один ген ДНК�по� слідовностей варіабельних доменів важкого (VН) та легкого (VL) ланцюгів імуноглобулінів. Завдяки особливостям структури ScFv’s збері� гають конформацію активного центру вихідно� го антитіла і, відповідно, високу антигензв’язу� вальну активність. ScFv’s є зручним форматом УДК 579.69 : 577.12 М.В. ПАВЛОВА 1, П.В. ГІЛЬЧУК 2, Я.О. ПОХОЛЕНКО 2, Ю.С. НІКОЛАЄВ 1, В.А. КОРДЮМ2 1 Київський національний університет ім. Тараса Шевченка E�mail: mariaka@ukr.net 2 Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ E�mail: gilchuk@ukr.net СТВОРЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ІМУННОЇ КОМБІНАТОРНОЇ БІБЛІОТЕКИ кДНК ВАРІАБЕЛЬНИХ ГЕНІВ ІМУНОГЛОБУЛІНІВ МИШІ © М.В. ПАВЛОВА, П.В. ГІЛЬЧУК, Я.О. ПОХОЛЕНКО, Ю.С. НІКОЛАЄВ, В.А. КОРДЮМ, 2008 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 11 Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК для конструювання фагової бібліотеки та по� дальшої роботи з нею [2]. На сьогодні технологія рекомбінантних ан� титіл набула великого практичного значення, оскільки в поєднанні з методами конструюван� ня і селекції комбінаторних бібліотек кДНК in vitro дозволяє одержувати високоспецифічні імунологічні реагенти для діагностичних, лі� кувальних та дослідницьких потреб. Нижча собівартість порівняно із моноклональними антитілами, а також принципово нові можли� вості використання для терапії та діагностики різних захворювань зумовлюють значний прак� тичний інтерес до одержання високоспеци� фічних ScFv’s проти цільових антигенів. Дана робота присвячена створенню та ха� рактеристиці імунної комбінаторної бібліоте� ки V�генів миші з метою подальшого одер� жання панелі ScFv’s проти рекомбінантного інтерферону β1b людини (rhIFN�β1b). Матеріали і методи. Для створення комбіна� торної бібліотеки та фагового дисплея ScFv’s використовували набори реактивів «Mouse Module Recombinant Phage Antibody System», «Expression Module Recombinant Phage Antibody System» («Amersham Biosciences», Швеція). В процедурах молекулярного клонування засто� совували ферменти виробництва «Fermentas» (Литва) та «Sigma» (CША). Для експресії кло� нованих генів використовували фагміду pCANTAB 5E («Amersham Biosciences», Шве� ція). Генно�інженерні маніпуляції з ДНК ви� конували згідно зі стандартними методами та рекомендаціями виробника відповідного набору реактивів [7]. Імунізація мишей. Для імунізації використо� вували самок мишей лінії BALB/c (n = 12) ві� ком 2–2,5 міс. Імунізацію проводили тричі за наступною схемою, вводячи кожного разу по 80 мкг rhIFN�β1b на одну тварину: першу іму� нізацію здійснювали з повним ад’ювантом Фрейнда, другу – з неповним ад’ювантом, а третю – без ад’юванта. По завершенні циклу імунізації у сироватці крові мишей методом ELISA визначали титр антитіл до rhIFN�β1b. Всі маніпуляції з тваринами здійснювали з ви� користанням седативних та анестезуючих пре� паратів згідно з ветеринарним законодавством. Конструювання комбінаторної бібліотеки кДНК V�генів [8]. З використанням методу фе� нольної екстракції із селезінок імунізованих мишей виділяли тотальну РНК [7]. Для одер� жання фракції полі�А(+) РНК використовува� ли набір реактивів «mRNA Purification Kit» («Amersham Biosciences», Швеція). Синтез кДНК здійснювали в реакції зворотної транс� крипції з використанням вироджених гексанук� леотидних праймерів. Варіабельні послідовності важких і легких ланцюгів імуноглобулінів амп� ліфікували у двох окремих реакціях, використо� вуючи видоспецифічні праймери з набору ре� активів «Mouse Module Recombinant Phage Antibody System». Розділені і очищені із 0,8%� ного агарозного гелю фрагменти VH і VL змішу� вали з олігонуклеотидами, що кодують лінкер� ний пептид (Gly4Ser)3, і ампліфікували з праймерами для введення сайтів рестрикції ендонуклеаз SfiI и NotI. Отриманий продукт гідролізували відповідними рестриктазами, лі� гували з вектором pCANTAB 5E та використо� вували для трансформації E. coli штаму TG1. Оцінку представленості бібліотеки прово� дили шляхом підрахунку індивідуальних коло� ній, одержаних після висіву трансформованих клітин на селективне агаризоване середовище 2YT�AG (17 г/л бактотриптону, 10 г/л дріжд� жового екстракту, 5 г/л NaCl, 100 мкг/мл ампі� циліну, 2 % глюкози). Селекція фагової бібліотеки [6]. Для фагово� го дисплея ScFv’s використовували фаг�хелпер М13К07 та штам�реципієнт E. coli TG1 з набо� ру реактивів «Expression Module Recombinant Phage Antibody System». Фагову бібліотеку одержували як описано у протоколах вироб� ника набору реактивів «Expression Module Recombinant Phage Antibody System». Відбір ДНК, що кодує ScFv’s необхідної специфічнос� ті, проводили методом афінної селекції фаго� вої бібліотеки на іммобілізованому rhIFN�β1b. Селекцію здійснювали за наступною схемою: в лунку полістиролового планшета для ELISA («Nunc», Данія) вносили rhIFN�β1b в концен� трації 20 мкг/мл та інкубували 12–14 год при 4 °С. Після завершення сорбції антигена план� шет двічі відмивали фосфатно�сольовим бу� фером (PBS) і блокували місця неспецифічно� го зв’язування буфером PBS, який містив 0,1 % твіну 20 (PBSТ). Для афінної селекції в лунку вносили 1011 рекомбінантних фагів у бу� фері PBSТ та інкубували 2 год при 37 °С. Про� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 212 М.В. Павлова, П.В. Гільчук, Я.О. Похоленко, Ю.С. Ніколаєв, В.А. Кордюм мивання від неспецифічно зв’язаних фагів здійснювали буферами PBSТ та PBS. Для елю� ції зв’язаних з антигеном рекомбінантних фа� гів використовували буфер 0,1 М гліцин�НСl, 0,5 М NaCl (рН 2,2). Елюат фагів нейтралізува� ли розчином 2 М триса і використовували для ампліфікації в E. coli та наступного циклу афін� ної селекції. Імуноблотинг. Елюйованими з антигена фа� гами інфікували клітини штаму TG1, які висі� вали на агаризоване середовище 2YT�AG. Іму� нохімічне скринування клонів проводили з використанням методу реплік колоній [9]. На поверхню нітроцелюлозної мембрани (Hybo� und�C Extra, «Amersham Biosciences», Швеція) наносили rhIFN�β1b (10 мкг/мл). Місця не� специфічного зв’язування білків блокували буфером PBS, який містив 3 % знежиреного молока (PBSМ). Мембрану послідовно про� мивали буферами PBSТ та PBS. Після підсу� шування мембрани отримували репліки коло� ній, які переносили на агаризоване середо� вище 2YT�А з 1 мМ індуктора експресії ІПТГ, і інкубували 10–12 год при 30 °С. Після завер� шення інкубації мембрану відмивали буфером PBSТ і вносили у буфері PBSМ кон’юговані з пероксидазою хрону моноклональні антитіла проти С�кінцевої мітки ScFv’s – E�tag («Amer� sham Biosciences», Швеція). Утворені імунні комплекси проявляли з використанням хро� могенного субстрату 4�хлоро�1�нафтолу («Sig� ma», США). Рестрикційний аналіз. ScFv�ДНК одержували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів pCANTAB� R1 5'�d [CCATGATTACGCCAAGCTTTGGA� GCC]�3', pCANTAB�R2 5'�d [CGATCTAAA� GTTTTGTCGTCTTTCC]�3' та рекомбінантих фагмід відібраних позитивних клонів як мат� риці. Ампліфікацію проводили за наступних умов: 94 °С – 0,5 хв; 55 °С – 1 хв; 72 °С – 1 хв (30 циклів). Одержані продукти ПЛР (1000 п.н.) гідролізували рестриктазою MvaI і розді� ляли у 7%�ному поліакриламідному гелі. Візу� алізацію ДНК здійснювали розчином бромис� того етидію. Експресія ScFv’s в E. coli. Культуру нарощува� ли при 30 °С в середовищі 2YT�AG до А600 = 0,8, індукування синтезу ScFv’s здійснювали вне� сенням ІПТГ до кінцевої концентрації 1 мМ. Продукування ScFv’s проводили за інтенсивної аерації культури протягом 14 год, по завершен� ню ферментації клітини осаджували центрифу� гуванням і використовували для одержання фракції периплазматичних білків [4]. Ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA). В лунки полістиролового планшету для ELISA («Nunc», Данія) вносили rhIFN�β1b (10 мкг/ мл) та інкубували 1 год при 37 °С. Після бло� кування місць неспецифічного зв’язування білків вносили фракції периплазми, які до� сліджувались, та інкубували 1 год при 37 °С. Лунки промивали буфером PBSТ, утворені імунні комплекси проявляли кон’югованими з пероксидазою хрону анти�E�tag антитілами, як хромогенний субстрат використовували розчин ТМВ («Sigma», США). Після розвитку забарвлення реакцію зупиняли внесенням 1 М сірчаної кислоти і вимірювали величину ад� сорбції А450 на багатоканальному фотометрі Multiscan MCC/340 («Titertek», США). Результати досліджень та їх обговорення. Якість отриманих фаговим дисплеєм ScFv’s визначається такими їх характеристиками, як специфічність взаємодії з антигеном, афін� ність, стабільність при зберіганні, а також ста� більність експресії бактеріальним продуцен� том. Для відбору ScFv’s з перерахованими властивостями ключовим етапом є конструю� вання великої за розміром і різноманіттям комбінаторної бібліотеки. Зважаючи на це, актуальним видається встановлення таких ха� рактеристик комбінаторної бібліотеки, як представленість (кількість одержаних транс� формантів), функціональний розмір (відсоток клонованої кДНК, яка кодує повнорозмірний поліпептидний продукт), та вихідне різнома� ніття ScFv�ДНК. Останній показник визначає можливість відбору з бібліотеки панелі анти� ген�специфічних ScFv’s з різними рівнями афінності та специфічності [10]. В даній роботі для синтезу кДНК V�генів і конструювання комбінаторної бібліотеки вико� ристовували мРНК з селезінок двох імунних мишей з найвищим титром специфічних анти� тіл у сироватці крові (1 : 500 000). Оскільки імун� на бібліотека є збагаченим джерелом послідов� ностей цільових V�генів, імовірність виділення панелі високоафінних ScFv’s проти rhIFN�β1b є достатньо високою. Перевагою зазначеного під� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 13 Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК ходу також є те, що при роботі з імунізованими тваринами відсутня необхідність генерування великої за розміром комбінаторної бібліотеки. Представленість отриманої нами бібліотеки склала ~5 · 105 незалежних клонів. Наступним етапом було визначення функ� ціонального розміру бібліотеки. Фагмідну ДНК випадково відібраних клонів використовували як матрицю для ампліфікації ScFv�ДНК. Було показано, що 30 % серед проаналізованих ре� комбінантних фагмід (n = 15) містять повно� розмірні варіанти ScFv�ДНК, у той час як інші клоновані фрагменти мали меншу молекулярну масу (рис. 1). Конструкція фагміди pCANTAB 5E передбачає введення послідовностей ДНК лідерного пептиду і С�кінцевого фрагменту E�tag, які фланкують кодуючу частину гена ScFv’s по сайтах рестрикції SfiI і NotI. Оскіль� ки при індукуванні промотору lac фагміди ScFv’s секретуються у периплазму E. coli, за допомогою моноклональних анти�E�tag анти� тіл можливо визначати їхню експресію. За ре� зультатами імуноблотингу було встановлено, що ~40 % серед проаналізованих клонів біб� ліотеки (n = 362) продукують ScFv’s з послі� довністю E�tag (результати не представлено). Враховуючи наведені результати можна зро� бити висновок, що сконструйовано імунну комбінаторну бібліотеку кДНК V�генів миші з використанням достатньо ефективної схеми клонування. Різноманітність V�генів, представлених у бібліотеці, оцінювали гідролізом повнороз� мірних ампліконів ScFv’s (n = 5) рестриктазою MvaI. Зазначений метод досить часто викорис� товується для виявлення відмінностей у пер� винній структурі індивідуальних генів ScFv’s [11]. Важливо зазначити, що для кожної з про� аналізованих нами послідовностей спостеріга� лися унікальні набори фрагментів рестрикції (рис. 2), що свідчить про високу різноманіт� ність вихідної бібліотеки. Високий титр специфічних антитіл у сиро� ватці крові імунізованих тварин, високі показ� ники представленості, функціонального розміру та вихідного різноманіття ScFv�ДНК комбіна� торної бібліотеки дозволяють сподіватись на одержання панелі ScFv’s проти rhIFN�β1b. Для селекції комбінаторної бібліотеки на� ми було використано метод фагового дисплея. Основною перевагою фагового дисплея є мож� ливість спрямованої селекції кДНК, що кодує специфічні до цільового антигена ScFv’s. Це досягається шляхом афінного зв’язування екс� понованих на поверхні фага ScFv’s з іммобілі� зованим антигеном і наступної ампліфікації цих фагів в E. coli. Важливим етапом при про� веденні афінного збагачення бібліотеки є роз� робка правильної стратегії селекції, оскільки вибіркова ампліфікація певних фагів може привести до втрати вихідного різноманіття ці� льових послідовностей і/або виділення ScFv’s з низькими константами афінності. У даній Рис. 1. Електрофореграма розділення в 0,8%�ному агарозному гелі фрагментів ScFv�ДНК, одержаних ампліфікацією з випадково відібраних клонів (n = 15) вихідної бібліотеки (доріжки 1–15); М – маркер мо� лекулярної маси ДНК (GeneRuler 1 kb DNA Ladder, «Fermentas») Рис. 2. Електрофореграма розділення в 7%�ному по� ліакриламідному гелі фрагментів рестрикції, одержаних гідролізом рестриктазою MvaI повнорозмірної ScFv� ДНК (n = 5) із вихідної бібліотеки (доріжки 1–5); М – маркер молекулярної маси ДНК (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, «Fermentas») ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 214 М.В. Павлова, П.В. Гільчук, Я.О. Похоленко, Ю.С. Ніколаєв, В.А. Кордюм роботі застосовували елюцію зв’язаних фагів з поверхні іммобілізованого rhIFN�β1b за кис� лих умов (рН 2,2), яку проводили у кожному із двох послідовних циклів афінного збагачен� ня бібліотеки. Метою використання наведе� них умов селекції бібліотеки було одержання ScFv’s з високими показниками специфічнос� ті і стабільності, а також відсутністю негатив� ного впливу на продуцент при експресії. Ефективність збагачення бібліотеки визна� чали за відсотком бактеріальних клонів, які продукують специфічні до rhIFN�β1b ScFv’s. Для цього за допомогою методу імуноблотин� гу аналізували репліки колоній вихідної та збагаченої бібліотеки (рис. 3). Серед 104 про� аналізованих клонів вихідної бібліотеки не ви� явлено продуцентів ScFv’s, специфічних до rhIFN�β1b (рис. 3, а), що, з урахуванням пред� ставленості бібліотеки і можливості елімінації деяких послідовностей, дозволяє очікувати на невисоку різноманітність панелі цільових ScFv’s. Після проведення двох послідовних циклів селекції показано, що понад 95 % про� аналізованих клонів (n = 700) продукують ScFv’s проти rhIFN�β1b (рис. 3, б). За результатами імуноблотингу із збагаче� ної бібліотеки випадковим чином було віді� брано 30 позитивних клонів для подальшого аналізу. Методом ELISA підтверджено проду� кування специфічних до rhIFN�β1b ScFv’s у периплазму та культуральне середовище всіма одержаними клонами. Високу специфічність зв’язування всіх виділених ScFv’s з rhIFN�β1b було продемонстровано в ELISA з викори� станням як антигенів rhIFN�β1b та rhIFN�β2b (результати не представлено), ступінь гомоло� гії амінокислотних послідовностей яких ста� новить ~40 % [12]. Різноманітність ScFv�ДНК одержаних про� дуцентів оцінювали рестрикцією MvaI за схе� мою, яка описана вище. Електрофоретичний аналіз фрагментів рестрикції показав відсут� ність гетерогенності серед проаналізованих варіантів ScFv’s (n = 7) (рис. 4), однак встанов� лення відмінностей первинної структури варі� абельних доменів можливе лише у разі повно� го сіквенування їхньої ДНК. Висновки. Сконструйовано імунну комбіна� торну бібліотеку кДНК V�генів миші з характе� ристиками, які дозволяють сподіватись на от� римання панелі високоафінних ScFv’s проти rhIFN�β1b. З використанням двох циклів афінної селекції фагової бібліотеки ізольовано бактеріальні продуценти цільових ScFv’s, які планується використовувати у подальших ро� ботах. Для виділених ScFv’s показано високу специфічність взаємодії з rhIFN�β1b. SUMMARY. A cDNA combinatorial antibody library of mouse variable immunoglobulin fragments has been con� structed from mice immunized with rhIFN�β1b. For this purpose, cDNAS of immunoglobulin variable heavy (VH) and variable light (VL) chains genes amplified from spleno� cytes were joined with linker DNA to form ScFv’s (single� chain Fv�antibodies). The obtained ScFv�DNA pool was cloned into a phagemid vector and used for Escherichia coli Рис. 3. Імуноблоти реплік бактеріальних колоній, одер� жані в результаті скринування трансформантів вихідної бібліотеки (а) і клонів, отриманих після двох циклів афінної селекції фагової бібліотеки на іммобілізовано� му rhIFN�β1b (б). Кількість колоній на кожній із реплік становить відповідно ~10 000 та 700 Рис. 4. Електрофореграма розділення в 7%�ному полі� акриламідному гелі фрагментів рестрикції, одержаних гідролізом ДНК специфічних до rhIFN�β1b ScFv’s (n = = 7) рестриктазою MvaI (доріжки 1–7); М – маркер мо� лекулярної маси ДНК (GeneRuler100 bp DNA Ladder, «Fermentas») ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 15 Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК transformation. Using the phage display technique, bacte� rial clones producing single�chain antibodies specific to rhIFN�β1b were selected. The following characteristics of the combinatorial library were determined in this work: abundance, functional size, and the initial ScFv�DNA diversity in the library constructed. High specificity of interaction between phage displayed ScFv’s and rhIFN� β1b has been demonstrated. РЕЗЮМЕ. Была сконструирована комбинаторная библиотека кДНК вариабельных генов иммуноглобу� линов мышей, иммунизированных рекомбинантным интерфероном β1b человека (rhIFN�β1b). Для этого амплифицированную из спленоцитов кДНК вариа� бельных генов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей имму� ноглобулинов объединяли линкерной ДНК в составе последовательностей одноцепочечных антител – ScFv’s (single�chain Fv�antibodies). Полученный пул ScFv� ДНК был заклонирован в фагмидный вектор и ис� пользован для трансформации клеток Escherichia coli. С использованием метода фагового дисплея отобраны бактериальные клоны, которые продуцируют специ� фические к rhIFN�β1b одноцепочечные антитела. В работе определены такие характеристики созданной библиотеки, как представленность, функциональный размер, а также исходное разнообразие последователь� ностей ScFv�ДНК. Продемонстрирована высокая специфичность взаимодействия ScFv, выделенных с помощью фагового дисплея, с rhIFN�β1b. СПИСОК ЛІТЕРЕТУРИ 1. Moroney S., Pluckhun A. Modern antibody technology : The impact on drug development // Modern Biopharma ceuticals / Eds J. Knablein. – Weinheim : Wiley�VCH Verlag GmbH and Co. KgaA, 2005. – 4. – P. 1147–1186. 2. Bradbury A., Marks J.D. Antibodies from Phage antibody libraries // J. Immun. Meth. – 2004. – 290. – P. 29–49. 3. Sblattero D., Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries // Nat. Biotechnol. – 2000. – 18, № 1. – P. 75–80. 4. Pope A.R., Embleton M.J., Mernaugh R. Construction and use of antibody gene repertoires // Antibody Engineering / Eds J. McCafferty, H.R. Hoogenboom, D.J. Criswell. – Oxford : IRL Press at Oxford University Press, 1996. – 10. – P. 1–40. 5. Pluckthun A., Krebber A., Krebber C., Horn U., Knupfer U., Wenderoth R., Nieba L., Proba K., Riesenberg D. Producing antibodies in Escherichia coli : from PCR to fermentation // Antibody Engineering / Eds J. McCafferty, H.R. Hoogenboom, D.J. Criswell. – Oxford : IRL Press at Oxford University Press, 1996. – 10. – P. 203–252. 6. Coomber D.W.J. Panning of antibody phage�display libraries : Standard protocols // Methods in Molecular Biology. Antibody Phage display : Methods and Protocols / Eds P.M. O’Brien, R. Aitken – Totowa : Humana Press Inc., 2002. – 178. – P. 133–145. 7. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning : A laboratory manual. – Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 8. Lennard S. Standard protocols for the construction of ScFv libraries // Methods in Molecular Biology. Antibody Phage display : Methods and Protocols / Eds P.M. O’Brien, R. Aitken – Totowa : Humana Press Inc., 2002. – 178. – P. 59–71. 9. Skerra A., Dreher M.L., Winter G. Filter screening of antibody Fab fragments secreted from individual bacte� rial colonies : specific detection of antigen binding with a two�membrane system // Anal. Biochem. – 1991. – 196, № 1. – P. 151–155. 10. De Haard H.J., Neer N., Reurs A., Hufton S.E., Roo� vers R.C., Henderikx P., de Bruine A.P., Arends J.W., Hoogenboom H.R. A large non�immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies // J. Biol. Chem. – 1999. – 274, № 26. – P. 18218–18230. 11. Окунев О.В., Гильчук П.В., Иродов Д.М., Деряби� на Е.Г. Получение и характеристика одноцепочеч� ных антител к интерферону а2b человека // Укр. біохім. журн. – 2005. – 77, № 5. – С. 106–115. 12. Karpusas M., Whitty A., Runkel L., Hochman P. The structure of human interferon�beta: implications for activity // Cell Mol. Life Sci. – 1998. – 54, № 11. – Р. 1203–1216. Надійшла 03.05.07
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-8078
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0564-3783
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-01T00:59:24Z
publishDate	2008
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
record_format	dspace
spelling	Павлова, М.В. Гільчук, П.В. Похоленко, Я.О. Ніколаєв, Ю.С. Кордюм, В.А. 2010-04-29T11:06:26Z 2010-04-29T11:06:26Z 2008 Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші / М.В. Павлова, П.В. Гільчук, Я.О. Похоленко, Ю.С. Ніколаєв, В.А. Кордюм // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 2. — С. 10-15. — Бібліогр.: 12 назв. — укp. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8078 579.69 : 577.12 Сконструйовано комбінаторну бібліотеку кДНК варіабельних генів імуноглобулінів мишей, імунізованих рекомбінантним інтерфероном β1b людини (rhIFN-β1b). Для цього ампліфіковану зі спленоцитів кДНК варіабельних генів важких (VH) і легких (VL) ланцюгів імуноглобулінів об’єднували лінкерною ДНК у складі послідовностей одноланцюгових антитіл – ScFv’s (single chain Fv antibodies). Одержаний пул ScFv-ДНК було клоновано у фагмідному векторі і використано для трансформації Escherichia coli. З використанням методу фагового дисплея відібрано бактеріальні клони, які продукують специфічні до rhIFN-β1b ScFv’s. У роботі встановлено такі характеристики створеної бібліотеки, як представленість, функціональний розмір та вихідне різноманіття послідовностей ScFv-ДНК. Продемонстровано високу специфічність взаємодії виділених фаговим дисплеєм ScFv’s з rhIFN-β1b. Была сконструирована комбинаторная библиотека кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мышей, иммунизированных рекомбинантным интерфероном β1b человека (rhIFN-β1b). Для этого амплифицированную из спленоцитов кДНК вариабельных генов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей иммуноглобулинов объединяли линкерной ДНК в составе последовательностей одноцепочечных антител – ScFv’s (single-chain Fv-antibodies). Полученный пул ScFv-ДНК был заклонирован в фагемидный вектор и использован для трансформации клеток Escherichia coli. С использованием метода фагового дисплея отобраны бактериальные клоны, которые продуцируют специфические к rhIFN-β1b одноцепочечные антитела. В работе определены такие характеристики созданной библиотеки, как представленность, функциональный размер, а также исходное разнообразие последовательностей ScFv-ДНК. Продемонстрирована высокая специфичность взаимодействия ScFv, выделенных с помощью фагового дисплея, с rhIFN-β1b. A cDNA combinatorial antibody library of mouse variable immunoglobulin fragments has been constructed from mice immunized with rhIFN-β1b. For this purpose, cDNAS of immunoglobulin variable heavy (VH) and variable light (VL) chains genes amplified from splenocytes were joined with linker DNA to form ScFv’s (single-chain Fv-antibodies). The obtained ScFv-DNA pool was cloned into a phagemid vector and used for Escherichia coli transformation. Using the phage display technique, bacterial clones producing single-chain antibodies specific to rhIFN-β1b were selected. The following characteristics of the combinatorial library were determined in this work: abundance, functional size, and the initial ScFv-DNA diversity in the library constructed. High specificity of interaction between phage displayed ScFv’s and rhIFN-β1b has been demonstrated. uk Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Оригинальные работы Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші Article published earlier
spellingShingle	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші Павлова, М.В. Гільчук, П.В. Похоленко, Я.О. Ніколаєв, Ю.С. Кордюм, В.А. Оригинальные работы
title	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші
title_full	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші
title_fullStr	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші
title_full_unstemmed	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші
title_short	Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші
title_sort	створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кднк варіабельних генів імуноглобулінів миші
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8078
work_keys_str_mv	AT pavlovamv stvorennâtaharakteristikaímunnoíkombínatornoíbíblíotekikdnkvaríabelʹnihgenívímunoglobulínívmiší AT gílʹčukpv stvorennâtaharakteristikaímunnoíkombínatornoíbíblíotekikdnkvaríabelʹnihgenívímunoglobulínívmiší AT poholenkoâo stvorennâtaharakteristikaímunnoíkombínatornoíbíblíotekikdnkvaríabelʹnihgenívímunoglobulínívmiší AT níkolaêvûs stvorennâtaharakteristikaímunnoíkombínatornoíbíblíotekikdnkvaríabelʹnihgenívímunoglobulínívmiší AT kordûmva stvorennâtaharakteristikaímunnoíkombínatornoíbíblíotekikdnkvaríabelʹnihgenívímunoglobulínívmiší

Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші

Institution

Similar Items