Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози

Рослинна біомаса має величезний потенціал як сировина для виробництва біопалива, зокрема паливного етанолу. Основними складовими рослинної біомаси є глюкоза та п’ятивуглецевий цукор ксилоза. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae, які використовуються для промислового виробництва етанолу з глюкози та саха...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2008
Hauptverfasser:	Дмитрук, О.В., Дмитрук, К.В., Вороновський, А.Я., Сибірний, А.А.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Schlagworte:	Обзорные статьи
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8088
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози / О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 2. — С. 70-84. — Бібліогр.: 85 назв. — укp.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-8088
record_format	dspace
spelling	Дмитрук, О.В. Дмитрук, К.В. Вороновський, А.Я. Сибірний, А.А. 2010-04-29T11:18:20Z 2010-04-29T11:18:20Z 2008 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози / О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 2. — С. 70-84. — Бібліогр.: 85 назв. — укp. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8088 576.343:582.282.23 Рослинна біомаса має величезний потенціал як сировина для виробництва біопалива, зокрема паливного етанолу. Основними складовими рослинної біомаси є глюкоза та п’ятивуглецевий цукор ксилоза. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae, які використовуються для промислового виробництва етанолу з глюкози та сахарози, не здатні ферментувати ксилозу. Отже, аби забезпечити економічно вигідне перетворення рослинної біомаси до етанолу, потрібно знайти у природі або сконструювати мікроорганізм, здатний до підвищеної ферментації не лише глюкози, а і ксилози. Досягти активної ферментації ксилози можна, забезпечивши ефективність початкових етапів метаболізму цієї пентози, які визначають і ефективність алкогольної ферментації ксилози в цілому [1]. В огляді детально охарактеризовані ферменти, задіяні на початкових етапах метаболізму ксилози у дріжджів (ксилозоредуктаза, ксилітолдегідрогеназа і ксилулокіназа) і бактерій (ксилозоізомераза і ксилулокіназа), та показані шляхи конструювання штамів дріжджів, здатних до ефективного синтезу етанолу із ксилози. Растительная биомасса обладает огромным потенциалом в качестве сырья для производства биотоплива, в частности топливного этанола. Основными составными растительной биомассы являются глюкоза и пятиуглеродный сахар ксилоза. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые используются для промышленного производства этанола из глюкозы, не способны ферментировать ксилозу. Следовательно, для обеспечения экономически выгодного превращения растительной биомассы в этанол необходимо найти в природе или сконструировать микроорганизм, эффективно ферментирующий не только глюкозу, но и ксилозу. Обеспечить эффективную ферментацию ксилозы можно, обеспечив эффективность начальных этапов метаболизма этой пентозы, которые определяют эффективность алкогольной ферментации в целом. В обзоре детально охарактеризированы ферменты, задействованніе на начальных этапах метаболизма ксилозы у дрожжей (ксилозоредуктаза, ксилитолдегидрогеназа и ксилулокиназа) и бактерий (ксилозоизомераза и ксилулокиназа), а также рассмотрены пути конструирования штаммов дрожжей – эффективных продуцентов этанола из ксилозы. Plant biomass possesses a huge potential as a source for biofuel production. The main components of biomass are glucose and five-carbon sugar xylose. The yeast Saccharomyces cerevisiae that is used for industrial ethanol production from glucose is unable to xylose fermentation. Therefore a microorganism capable for efficient fermentation of both glucose and xylose has to be found in nature or constructed for economically feasible biomass conversion to ethanol. The active xylose fermentation could be performed by increasing the efficiency of initial stages of xylose metabolism [1]. In this review the enzymes of initial stages of xylose metabolism in yeasts (xylose reductase, xylitol dehydrogenase, xylulokinase) and bacteria (xylose isomerase and xylulokinase) are characterized. The ways for construction of yeast strains capable of efficient alcoholic xylose fermentation are discussed. uk Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Обзорные статьи Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози
spellingShingle	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози Дмитрук, О.В. Дмитрук, К.В. Вороновський, А.Я. Сибірний, А.А. Обзорные статьи
title_short	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози
title_full	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози
title_fullStr	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози
title_full_unstemmed	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози
title_sort	метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози
author	Дмитрук, О.В. Дмитрук, К.В. Вороновський, А.Я. Сибірний, А.А.
author_facet	Дмитрук, О.В. Дмитрук, К.В. Вороновський, А.Я. Сибірний, А.А.
topic	Обзорные статьи
topic_facet	Обзорные статьи
publishDate	2008
language	Ukrainian
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
format	Article
description	Рослинна біомаса має величезний потенціал як сировина для виробництва біопалива, зокрема паливного етанолу. Основними складовими рослинної біомаси є глюкоза та п’ятивуглецевий цукор ксилоза. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae, які використовуються для промислового виробництва етанолу з глюкози та сахарози, не здатні ферментувати ксилозу. Отже, аби забезпечити економічно вигідне перетворення рослинної біомаси до етанолу, потрібно знайти у природі або сконструювати мікроорганізм, здатний до підвищеної ферментації не лише глюкози, а і ксилози. Досягти активної ферментації ксилози можна, забезпечивши ефективність початкових етапів метаболізму цієї пентози, які визначають і ефективність алкогольної ферментації ксилози в цілому [1]. В огляді детально охарактеризовані ферменти, задіяні на початкових етапах метаболізму ксилози у дріжджів (ксилозоредуктаза, ксилітолдегідрогеназа і ксилулокіназа) і бактерій (ксилозоізомераза і ксилулокіназа), та показані шляхи конструювання штамів дріжджів, здатних до ефективного синтезу етанолу із ксилози. Растительная биомасса обладает огромным потенциалом в качестве сырья для производства биотоплива, в частности топливного этанола. Основными составными растительной биомассы являются глюкоза и пятиуглеродный сахар ксилоза. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые используются для промышленного производства этанола из глюкозы, не способны ферментировать ксилозу. Следовательно, для обеспечения экономически выгодного превращения растительной биомассы в этанол необходимо найти в природе или сконструировать микроорганизм, эффективно ферментирующий не только глюкозу, но и ксилозу. Обеспечить эффективную ферментацию ксилозы можно, обеспечив эффективность начальных этапов метаболизма этой пентозы, которые определяют эффективность алкогольной ферментации в целом. В обзоре детально охарактеризированы ферменты, задействованніе на начальных этапах метаболизма ксилозы у дрожжей (ксилозоредуктаза, ксилитолдегидрогеназа и ксилулокиназа) и бактерий (ксилозоизомераза и ксилулокиназа), а также рассмотрены пути конструирования штаммов дрожжей – эффективных продуцентов этанола из ксилозы. Plant biomass possesses a huge potential as a source for biofuel production. The main components of biomass are glucose and five-carbon sugar xylose. The yeast Saccharomyces cerevisiae that is used for industrial ethanol production from glucose is unable to xylose fermentation. Therefore a microorganism capable for efficient fermentation of both glucose and xylose has to be found in nature or constructed for economically feasible biomass conversion to ethanol. The active xylose fermentation could be performed by increasing the efficiency of initial stages of xylose metabolism [1]. In this review the enzymes of initial stages of xylose metabolism in yeasts (xylose reductase, xylitol dehydrogenase, xylulokinase) and bacteria (xylose isomerase and xylulokinase) are characterized. The ways for construction of yeast strains capable of efficient alcoholic xylose fermentation are discussed.
issn	0564-3783
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8088
citation_txt	Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози / О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 2. — С. 70-84. — Бібліогр.: 85 назв. — укp.
work_keys_str_mv	AT dmitrukov metabolíčnaínženeríâpočatkovihetapívkatabolízmuksiloziudríždžívzmetoûkonstruûvannâefektivnihproducentívetanoluzlígnocelûlozi AT dmitrukkv metabolíčnaínženeríâpočatkovihetapívkatabolízmuksiloziudríždžívzmetoûkonstruûvannâefektivnihproducentívetanoluzlígnocelûlozi AT voronovsʹkiiaâ metabolíčnaínženeríâpočatkovihetapívkatabolízmuksiloziudríždžívzmetoûkonstruûvannâefektivnihproducentívetanoluzlígnocelûlozi AT sibírniiaa metabolíčnaínženeríâpočatkovihetapívkatabolízmuksiloziudríždžívzmetoûkonstruûvannâefektivnihproducentívetanoluzlígnocelûlozi
first_indexed	2025-11-25T23:32:42Z
last_indexed	2025-11-25T23:32:42Z
_version_	1850583115014078464
fulltext	70 Рослинна біомаса має величезний потенціал як сиро� вина для виробництва біопалива, зокрема паливного етанолу. Основними складовими рослинної біомаси є глю� коза та п’ятивуглецевий цукор ксилоза. Дріжджі Sac� charomyces cerevisiae, які використовуються для промис� лового виробництва етанолу з глюкози та сахарози, не здатні ферментувати ксилозу. Отже, аби забезпечити економічно вигідне перетворення рослинної біомаси до етанолу, потрібно знайти у природі або сконструю� вати мікроорганізм, здатний до підвищеної ферментації не лише глюкози, а і ксилози. Досягти активної фермен� тації ксилози можна, забезпечивши ефективність по� чаткових етапів метаболізму цієї пентози, які визнача� ють і ефективність алкогольної ферментації ксилози в цілому [1]. В огляді детально охарактеризовані фер� менти, задіяні на початкових етапах метаболізму кси� лози у дріжджів (ксилозоредуктаза, ксилітолдегідроге� наза і ксилулокіназа) і бактерій (ксилозоізомераза і ксилулокіназа), та показані шляхи конструювання штамів дріжджів, здатних до ефективного синтезу етанолу із ксилози. Вступ На сьогодні понад три чверті виробленого в світі етанолу використовується як додаток до палива в двигунах внутрішнього згоряння і лише 15 % – для приготування спиртних на� поїв. Однак джерелами паливного етанолу служать досить дорогі субстрати – цукор (са� хароза) або крохмаль, що перешкоджає широ� кому розповсюдженню виробництва паливно� го етанолу. Водночас етанол у величезних кількостях можна одержувати з відходів сіль� ського господарства та деревообробної про� мисловості (солома, кукурудзяний качан, луз� га насіння, кора дерев тощо), що дозволило б істотно зменшити забруднення навколишнього середовища такими відходами. Спалювання поновлюваного джерела енергії – рослинної біомаси або продуктів її ферментації, на відмі� ну від спалювання викопного палива, не при� зводить до зростання кількості вуглекислого газу, що надходить до атмосфери, оскільки ці сполуки в будь�якому випадку перетворю� ватимуться до вуглекислоти внаслідок мікроб� ної деградації (процес так званої мінералізації біомаси, який забезпечує кругообіг вуглецю в природі). Безпосереднє спалювання біомаси в двигунах внутрішнього згоряння бензино� вих автомобілів неможливе, однак у випадку перетворення біомаси до етилового спирту за� мість бензину можна використовувати бензи� но�етанольні суміші або чистий етанол. Наяв� ність в бензині кисневмісної сполуки, етанолу, дозволяє досягти практично повного окислен� ня в двигунах чадного газу до вуглекислого, а закису і окису азоту до двоокису азоту, що суттєво зменшує токсичність вихлопних газів. В багатьох країнах світу, зокрема в Бра� зилії, США, Канаді та країнах Європейського співтовариства, існують національні програми виробництва паливного етанолу з конвенцій� ної сировини (цукор, крохмаль) та національ� ні і міжнародні програми наукових дослід� жень, спрямовані на розробку технологій отримання паливного етанолу з лігноцелюлоз� них відходів сільського господарства та дерево� обробної промисловості. Алкогольна ферментація конвенційної си� ровини – гексоз, їх димерів (сахароза, мальто� за, целобіоза) або полімерів (целюлоза, амілоза, амілопектин) ефективно здійснюється за допо� могою мікроорганізмів. Для цієї процедури традиційно використовують дріжджі Saccharo� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 © О.В. ДМИТРУК, К.В. ДМИТРУК, А.Я. ВОРОНОВСЬКИЙ, А.А. СИБІРНИЙ, 2008 Обзорные статьи УДК 576.343:582.282.23 О.В. ДМИТРУК 1, К.В. ДМИТРУК 1, А.Я. ВОРОНОВСЬКИЙ 1, А.А. СИБІРНИЙ 1, 2 1 Інститут біології клітини НАН України, Львів 79005 2 Жешівський університет, Жешів 35–601, Польща E�mail: sibirny@cellbiol.lviv.ua МЕТАБОЛІЧНА ІНЖЕНЕРІЯ ПОЧАТКОВИХ ЕТАПІВ КАТАБОЛІЗМУ КСИЛОЗИ У ДРІЖДЖІВ З МЕТОЮ КОНСТРУЮВАННЯ ЕФЕКТИВНИХ ПРОДУЦЕНТІВ ЕТАНОЛУ З ЛІГНОЦЕЛЮЛОЗИ 71 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання myces cerevisiae або бактерії Zymomonas mobilis. Однак серед основних цукрів лігноцелюлозних гідролізатів, окрім гексоз, значний відсоток (35–45 %) складають пентози (ксилоза, арабі� ноза), які не ферментують і не метаболізують сахароміцети або Z. mobilis. Слід зазначити, що ферментувати пентози здатна досить обмежена група мікробів, серед яких найбільший інтерес викликають дріжджі Pichia stipitis. Однак хоча рівень алкогольної ферментації ксилози P. stipitis наближається до теоретично можливого максимуму, алко� гольна ферментація гексоз у цього організму значно поступається ефективності даного про� цесу у сахароміцетів. Для максимальної реалі� зації енергетичного потенціалу лігноцелюлози необхідно використовувати штами, здатні до активного спиртового бродіння як гексоз, так і пентоз. Оскільки таких штамів у природі по� ки що не виявлено, проводиться пошук у при� роді мікроорганізмів – ефективних фермента� торів основних цукрів гідролізатів лігноцелю� лози, з одного боку, та конструювання реком� бінантних штамів шляхом введенням генів пентозного метаболізму у геном традиційних ферментуючих організмів (S. cerevisiae, Z. mo� bilis) – з іншого. У даному огляді основну увагу зосереджено на особливостях початкових етапів метаболіз� му ксилози у дріжджів, які є лімітуючими на шляху ефективної алкогольної ферментації лігноцелюлозних гідролізатів. Метаболізм ксилози у дріжджів П’ятивуглецевий цукор ксилоза є одним з основних компонентів лігноцелюлозних гід� ролізатів. Її усереднена кількість досягає 30 % загального вмісту цукрів у гідролізатах. У кси� лозоферментуючих дріжджів на перших ета� пах метаболізму цієї пентози задіяні два фер� менти, що належать до класу оксидоредуктаз: НАДФН�залежна ксилозоредуктаза (КР) (EC 1.1.1.21.) і НАД�залежна ксилітолдегідрогеназа (КДГ) (EC 1.1.1.9.). Початковим етапом мета� болізму є відновлення ксилози до ксиліту за до� помогою ферменту КР з наступним окислен� ням ксиліту до ксилулози за допомогою КДГ. Далі ксилулоза фосфорилюється ксилулокіна� зою (КК) (EC 2.7.1.17) до ксилулозо�5�фосфа� ту, який поступає в пентозофосфатний шлях (ПФШ) з наступним перетворенням у гліколі� тичному шляху до пірувату. На завершальному етапі піруват перетворюється в ацетальдегід, який відновлюється до етанолу (рис. 1). Транспорт ксилози Першим етапом метаболізму ксилози у дріжджів є її транспорт в клітину. Відомо, що у ксилозозасвоюючих дріжджів P. stipitis, Pichia heedii i Candida shehatae ксилоза потрапляє в клітину за допомогою двох транспортних сис� тем в залежності від концентрації цукру в се� редовищі. При високій концентрації ксилози спрацьовує низькоспоріднена транспортна система або так звана система полегшеної дифу� зії за градієнтом концентрації цукру. При низь� кій концентрації ксилози в середовищі клітина використовує високоспоріднену транспортну систему з використанням АТФ (ксилозо�про� тонна симпортна система) [2, 3]. Встановлено, що гени SUT1 P. stipitis (цукровий транспортер 1) і GXF1 Candida intermedia (глюкозо�ксилозний фасилітатор 1) кодують глюкозо�ксилозні транспортери, які експресуються конститу� тивно та забезпечують низькоспоріднений транспорт ксилози у клітину [4, 5]. Високоспо� ріднена симпортна система поки що ідентифі� кована лише в C. intermedia. Ген GXS1 (глюкозо� ксилозний симпортер 1) кодує транспортер, що належить до родини моносахарид�протон� них симпортерів, які присутні у деяких дріжд� жів і грибів, проте не виявлені у S. cerevisiae [4]. Гомологи генів GXF1 та GXS1 C. intermedia були ідентифіковані в геномі термотолерант� них ксилозозасвоюючих дріжджів Hansenula polymorpha. Однак посилення експресії потен� ційних транспортерів ксилози не призводили до покращання ефективності алкогольної фер� ментації ксилози. У S. cerevisiae ксилоза потрапляє в клітину через гексозні транспортери, які мають в де� кілька разів нижчу спорідненість до ксилози порівняно з глюкозою [6, 7]. Гексозні транс� портери належать до родини генів HXT [8]. У S. cerevisiae виявлено високоспоріднені (HXT2, HXT6 і HXT7) і низькоспоріднені (HXT1, HXT3 і HXT4) транспортери гексоз [9]. Висо� коспоріднена система (Км глюкоза= 1,5 мМ) ре� пресується глюкозою, а низькоспоріднена система (Км глюкоза =20–35 мМ) є конститутив� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 72 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний ною [10, 11]. Км ксилози для високоспорідне� них Hxt�транспортерів становить приблизно 137–190 мМ, а низькоспоріднених приблизно 1,5 М. Це призводить до того, що в глюкозо� ксилозних сумішах спочатку утилізується глю� коза, а потім ксилоза [7, 12]. Для дослідження ролі гексозних транспорте� рів у транспорті ксилози було сконструйовано рекомбінантний штам S. cerevisiae ТМВ3201 з делеціями 18 генів НХТ. Створений штам втра� чав здатність рости на середовищі з ксилозою [13, 14]. Шляхом експресії кожного з генів НХТ в делеційному штамі було встановлено, що глюкозні транспортери Hxt7, Gal2, Hxt4 та Hxt5 є необхідними для транспорту ксилози [13]. Також було показано, що при рості на се� редовищі з ксилозою як єдиним джерелом вуг� лецю у S. cerevisiae експресуються лише Hxt5 і Hxt7. Результати обох експериментів чітко корелюють та вказують на те, що саме ці два Hxt�білки є необхідними для транспорту кси� лози [15, 13]. При коферментації ксилози і глю� кози спостерігалось також підвищення рівня експресії гена AGT1. Ген AGT1, що кодує висо� коспоріднений сахарозо�протонний симпор� тер, є необхідним для транспорту сахарози у клітину S. cerevisiae, проте раніше ніколи не асоціювався з транспортом ксилози [16]. За умов надекспресії ключових ксилозних транс� портерів HXT7 і GAL2 покращання утилізації ксилози у промислового ферментатора ксило� зи штама ТМВ3001 не спостерігалось [13]. Очевидно, забезпечення ефективного транс� порту ксилози в клітину є комплексною проб� лемою, що вимагає подальших досліджень не лише рівня експресії тих чи інших транспор� терів, але й їх регуляції. Дисбаланс кофакторів при алкогольній ферментації ксилози у дріжджів та шляхи його подолання Існує фундаментальне розмежування між системами НАДФ/НАДФН і НАД/НАДН у більшості біохімічних шляхів. Катаболічні реак� ції переважно пов’язані з системою НАД/ НАДН, а анаболічні – з системою НАДФ/ НАДФН. Однак в метаболізмі ксилози у дріж� джів обидві кофакторні пари є необхідними для катаболічних реакцій. Оскільки КР і КДГ мають різну кофакторну специфічність, КР використовує переважно НАДФН, а КДГ – НАД, то це призводить до накопичення НАДФ ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 Рис. 1. Шлях метаболізму ксилози у дріжджів та бактерій: КР – ксилозоредуктаза, КДГ – ксилітолдегідрогеназа, КІ – ксилозоізомераза, КК – ксилулокіназа, АрДГ – арабінітолдегідрогеназа, РР – рибулозоредуктаза, РК – рибу� локіназа, Г3ФДГ – гліцеральдегід�3�фосфатдегідрогеназа 73 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання та НАДН і, як результат, до створення дисба� лансу кофакторів у клітині. Для відновлення балансу кофактори повинні бути регенеровані. НАДФН у більшості регенерується в окислю� вальній частині пентозофосфатного шляху. При цьому 1 М глюкозо�6�фосфата, який по� ходить від фруктозо�6�фосфата, окислюється за допомогою глюкозо�6�фосфатдегідрогенази і 6�фосфоглюконатдегідрогенази з утворенням 2 М НАДФН і 1 М СО2 (рис. 1). Активності цих ферментів окислювальної частини пентозофос� фатного шляху підвищуються під час росту дріжджів на середовищі з пентозами, які є дже� релом вуглецю [17]. Для покращання виходу етанолу важливо регенерувати НАДФН шля� хом, який не пов’язаний з продукцією СО2 і то� му не призводить до небажаного відтоку вугле� цю. У рекомбінантних штамів S. cerevisiae, які містили гени перших етапів метаболізму ксило� зи, було експресовано ген GDP1, що кодує НАДФ�залежну гліцеральдегід�3�фосфатдегід� рогеназу із Kluyveromyces lactis, яка здійснює ре� генерацію НАДФН, не пов’язану з продукцією СО2, на відміну від НАДФ�залежної декарбок� силюючої 6�фосфоглюконатдегідрогенази (рис. 1). Рівень ферментації ксилози до етанолу от� риманими рекомбінантними штамами був під� вищеним порівняно із вихідним штамом, при цьому рівень формування СО2 був пониженим. Додаткова делеція гена ZWF1, що кодує глюкозо� 6�фосфатдегідрогеназу, в поєднанні з надекспре� сією гена GDP1 істотно стимулювала фермента� цію ксилози до етанолу [18]. В аеробних умовах НАДН окислюється у дихальному ланцюгу, а акцептором електронів служить молекуляр� ний кисень. Проте за анаеробних умов необхід� на наявність інших акцепторів, якими можуть бути ацетон [19], фурфурол [20] та інші сполу� ки. Якщо ж такі акцептори відсутні, клітини не спроможні відновити кофакторний баланс і таким чином не здатні ферментувати ксилозу до етанолу за анаеробних умов. Як було зазна� чено вище, за умов анаеробного росту в середо� вищі з ксилозою за участю НАД�залежної КДГ відбувається формування значної кількості НАДН. Один з шляхів відновлення балансу ко� факторів полягає в окисленні надлишкового НАДН до НАД за участю гліцерол�фосфатде� гідрогенази з утворенням побічного продукту – гліцерину [21] (рис. 1). Іншим шляхом усунення дисбалансу кофак� торів є перенесення водню між двома нуклео� тидними системами НАДН/НАД та НАДФН/ НАДФ за допомогою ферменту трансгідроге� нази: НАДН + НАДФ � НАД + НАДФН. Цей фермент зустрічається у багатьох організмів, проте у дріжджів його не виявлено [22, 23]. Показано, що експресія гетерологічної прока� ріотної трансгідрогенази у S. cerevisiae призво� дить до зменшення утворення НАДФН, однак при цьому значно підвищується кількість глі� церину і 2�оксоглутарату, а вихід біомаси і ета� нолу істотно знижується. Оскільки НАДФН використовується для перетворення 2�оксоглу� тарату в глутамат, а кількість гліцерину підви� щується при надлишку НАДН, це свідчить про недостатню трансгідрогеназну активність та неефективне перетворення НАДН і НАДФ в НАД і НАДФН [24]. Анаеробна алкогольна ферментація ксило� зи без нагромадження побічних продуктів стає можливою лише за умов однакової кофактор� ної специфічності КР і КДГ або наявності ін� шого ферменту, що здатний безпосередньо пе� ретворювати ксилозу в ксилулозу, оминаючи етап формування ксиліту. Таким ферментом є ксилозоізомераза (КІ) (ЕС 5.3.1.5), що зустрі� чається у бактерій та грибів [21]. Її особливос� ті та застосування будуть описані нижче. Ксилозоредуктаза КР каталізує НАДФН�залежне відновлення ксилози до ксиліту. Активність КР є необхід� ною для росту дріжджів на ксилозі. Дріжджові КР належать до ферментної родини альдо�ке� торедуктаз, яка широко представлена серед багатьох організмів, включаючи ссавців, риб, комах, амфібій і рептилій [25]. Перша дріжд� жова КР була клонована у P. stipitis в 1991 р. [26, 27], згодом були клоновані КР Candida tropicalis [28], K. lactis [29], Pachysolen tannophilus [30], Candida tenuis [31], Candida parapsilopsis [32]. Делеція гена XYL1, що кодує КР, у дріжд� жів призводить до втрати здатності рости на середовищі з ксилозою [33]. Хоча більшість відомих альдо�кеторедуктаз є мономерами, КР дріжджів – це димери з молекулярною ма� сою субодиниць від 33 до 40 кДа. Для функціонування даного ферменту не� обхідна наявність кофакторів. Наприклад, не� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 74 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний специфічна альдозоредуктаза S. cerevisiae, яка виявляє активність КР [34], як і КР із С. utilis [23], використовує як кофактор лише НАДФН, натомість КР P. stipitis [35] і C. tenuis [31], крім НАДФН, також здатні використовувати НАДН. КР C. parapsilosis має значно вищу спорідне� ність до НАДН порівняно з НАДФН [32]. P. tannophilus синтезує два ізоферменти КР, один з яких може використовувати як НАДН, так і НАДФН, а другий лише НАДФН [35] (табли� ця). При зниженій аерації фермент переважно використовує обидва кофактори [36]. Більше 200 видів дріжджів здатні рости на ксилозі і лише деякі здатні ферментувати її до етанолу. Існує чітка кореляція між здатністю КР вико� ристовувати обидва кофактори (НАДН і НАДФН) і здатністю дріжджів до алкогольної ферментації ксилози. КР S. cerevisiae була охарактеризована Kuhn et al. [34] в 1995 р. Очищений мономерний фермент з молекулярною масою 37 кДа вияв� ляв залежність від НАДФН. КР мала значно вищу спорідненість до ароматичних або алі� фатичних альдегідів, ніж до альдозо�цукрів, найкращим субстратом для КР був нітробенз� альдегід (Км = 46 мкМ), афінність ферменту до ксилози становить 14,8–27,9 мМ [37]. Послі� довність гена GRE3 S. cerevisiae, що кодує КР, виявляє високу ступінь гомології (72 %) до ге� на XYL1 P. stipitis [34]. Відомо, що ген GRE3 ін� дукується в стресових умовах, таких як осмо� тичний та оксидативний стрес, підвищення температури культивування і нестача вугле� цю [38]. За деяких умов делеція гена GRE3 призводить до зменшення нагромад� ження ксиліту [39]. Два інших гомологи НАДФН�залежної альдозоредуктази у S. cere� visiae, YPR1 і YJR096w, також здатні викорис� товувати ксилозу як субстрат, проте ці фер� менти мають набагато вищу Км для ксилози порівняно з Gre3p [40]. Ксилітолдегідрогеназа КДГ кодується геном XYL2 та каталізує пе� ретворення ксиліту в ксилулозу із використан� ням НАД як кофактора. Гени XYL2 було клоно� вано у деяких видів дріжджів і грибів, серед яких P. stipitis, S. cerevisiae, Hypocrea jecorina, Aspergillus oryzae, Arxular adeninivorans, Galacto� candida mastodermitis і C. tropicalis [41–46]. В геномі S. cerevisiae є три гени з високою гомологією до гена XYL2 P. stipitis. Відкрита рамка зчитування YLR070c (ScXYL2) кодує фермент КДГ [41]. Показано, що для цього ферменту Км ксиліт = 25 мМ, Км НАД = 240 мкМ, Км ксилулоза= 1,1 мМ, Км НАДН = 55 мкМ [41]. Ці кінетичні параметри вказують на те, що фермент надає перевагу зворотній реакції пе� ретворення ксилулози у ксиліт і, швидше всього, не здатен забезпечувати потрібний ви� сокий рівень перетворення ксилози до етано� лу по метаболічному шляху. Цікавим є те, що в адаптованого до алкогольної ферментації кси� лози штама S. cerevisiae MBG�2303 активність КДГ є підвищеною у 80 разів порівняно з ви� хідним штамом [47]. Двома іншими паралогами КДГ є SOR1, що кодує сорбітолдегідрогеназу, яка здатна вико� ристовувати ксиліт як субстрат, та ген YDL246c, що виявляє високий ступінь гомології до SOR1 [48]. НАД�залежна КДГ P. stipitis має подібні кі� нетичні константи (Км ксиліт= 26 мМ, Км НАД = = 160 мкМ) до КДГ S. cerevisiae. Вважають, що КДГ P. stipitis регулюється співвідношенням НАДН/(НАДН+НАД) у клітині [49]. Таким чином, при сповільненій аерації внутрішньо� клітинна концентрація НАДН збільшується, що призводить до зниження активності КДГ та формування більшої кількості ксиліту. Делеція гена XYL2 у ксилозозасвоюючих дріжджів призводить до втрати здатності вико� ристовувати ксиліт як джерело вуглецю [33, 50]. Разом з тим деякі види дріжджів з делецією гена XYL2 використовуються для продукції ксиліту, адже цей поліалкоголь далі не метаболізується та викидається клітиною у середовище [51]. Специфічність кофакторів КР різних видів дріжджів Мікроорганізм Кофактор для КР S. cerevisiae (альдозоредуктаза) C. utilis P. stipitis C. tenius C. parapsilosis P. tannophilus 1�й ізозим 2�й ізозим НАДФH НАДФH НАДФH/НАДН НАДФH/НАДН НАДН НАДФH/НАДН НАДФH ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 75 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання Білкова інженерія ксилозоредуктази і ксилітолдегідрогенази Дріжджі S. сerevisiae є найкращими фер� ментаторами глюкози, але зовсім не здатні ферментувати ксилозу. Відомо також, що шта� ми дикого типу S. сerevisiae метаболізують кси� лозу вкрай неефективно і лише за певних умов [21, 38, 47], оскільки ендогенні КР і КДГ не розпізнають ксилозу як субстрат. На про� тивагу конвенційним дріжджам, P. stipitis є найкращим відомим ксилозоутилізуючим мік� роорганізмом. Було створено рекомбінантні штами S. сerevisiae, які містили гени XYL1 і XYL2 P. stipitis, що кодують КР і КДГ відповідно. Вибір P. stipitis як донорного організму базував� ся на здатності КР використовувати НАДН як кофактор. Проте рекомбінантні штами S. cere� visiae, які містили КР і КДГ, забезпечували низьку продукцію етанолу і характеризували� ся значним накопиченням ксиліту [52]. Формування ксиліту зменшується, якщо ре� циркуляція НАДН�НАД відбувається в одному ферменті, де НАДН окислюється в домені КР, а утворений НАД використовується в домені КДГ. Було створено серію КР/КДГ�гібридних білків. Для збереження обох активностей КР і КДГ важливою є локалізація доменів, КДГ – на N�кінці, а КР – на С�кінці гібридного білка. Важливе значення має також довжина і струк� тура зв’язуючого пептида [53]. Створений гіб� ридний білок виявляв лише 10 % активностей КР і КДГ порівняно з двома ферментами, які експресувалися окремо. При коекспресії гіб� ридного білка та нативних КР і КДГ сумарна активність ферментів відповідала активності вихідного штаму, а накопичення ксиліту при цьому істотно зменшувалось [53]. Були здійснені спроби змінити кофакторну специфічність КР і КДГ. Для цього були вико� ристані методи білкової інженерії. [54]. Дріжд� жова КР містить консервативний НАДФН� зв’язуючий домен – Lys270– Ser271– Asn272– Thr273. За допомогою сайт�специфічного мута� генезу було показано, що у P. stipitis лізин�270, який знаходиться в консервативному домені КР, безпосередньо бере участь у зв’язуванні ксилози і НАДФН. У випадку заміни лізину на метіонін спостерігалося істотне зменшення спорідненості КР до НАДФН і незначна зміна спорідненості до НАДН. Лізин�270 зв’язуєть� ся з 2’�фосфатною групою НАДФН, адже єди� ною відмінністю між цими двома кофакторами є наявність фосфатної групи у НАДФН [55]. У рекомбінантного штама S. сerevisiae, який містив КДГ P. stipitis та посилену ендогенну КК, було експресовано мутантну форму КР P. stipitis, що мала підвищену спорідненість до НАДН [55]. Такий штам характеризувався під� вищеним виходом етанолу з ксилози і зниже� ною кількістю ксиліту. Додатковий аналіз пока� зав, що рекомбінантний штам засвоює більшу кількість НАДН порівняно зі штамом, що міс� тить нативну КР. Штами з додатковою копією модифікованої КР за рівнем алкогольної фер� ментації ксилози не відрізнялись [56]. Для подальшого підвищення спорідненості КР до НАДН проводили заміни амінокислот у межах консервативного кофакторзв’язуючого домену. Було створено модифіковані фермен� ти з наступними модифікаціями: 1) лізин в положенні 270 замінено на аргінін (K270�R); така мутантна КР мала знижену спо� рідненість до НАДФН, проте спорідненість до НАДН залишалася незмінною порівняно з КР дикого типу; 2) лізин в положенні 270 замінено на гліцин (K270�G), aктивність мутантної КР істотно знижувалась при використанні як НАДН, так і НАДФН, можливо така мутація призводила до втрати структурної стабільності ферменту; 3) серин в положенні 271 замінено на ала� нін, в такої КР вищою була спорідненість до НАДФН; 4) аспарагін в положенні 272 замінено на ас� парагінову кислоту; спорідненість до НАДФН була вищою, ніж спорідненість до НАДН; 5) триптофан в положенні 273 замінено на серин; у мутантної КР істотно знижувалась загальна активність ферменту, по аналогії з мутацією K270�G. Було отримано рекомбінантні штами S. сere� visiae, які експресували модифіковану КР K270�R і нативну КДГ P. stipitis. Сконструйо� вані штами характеризувалися зменшенням накопичення ксиліту порівняно зі штамом, що містив нативну КР P. stipitis, проте вихід етанолу залишався на рівні вихідного штаму [57]. У нашій лабораторії за допомогою методу сайт�специфічного мутагенезу було сконст� руйовано модифіковану форму КР H. polymor� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 76 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний pha. Для цього лізин в положенні 341 було за� мінено на аргінін, а аспарагін в положенні 343 було замінено на аспарагінову кислоту. Було отримано рекомбінантні штами, в яких ендогенний ген було замінено на ген, що ко� дує модифіковану або нативну КР, під контро� лем сильного конститутивного промотора гена, що кодує гліцеральдегід�3�фосфатдегідрогена� зу. Було показано, що спорідненість модифіко� ваної КР до НАДН є вищою, ніж в нативної КР. Рівень ферментації ксилози до етанолу у шта� мів, що містили модифіковану КР, також під� вищився. Отже, часткове усунення дисбалансу нікотинамідних кофакторів забезпечує підви� щення виходу етанолу (рис. 2). Було показано, що КР C. parapsilosis володіє спорідненістю до НАДН в 100 разів вищою по� рівняно з НАДФН. Ген XYL1 C. parapsilosis бу� ло клоновано і експресовано в С. tropicalis. Отримані рекомбінантні штами характеризу� валися підвищеним рівнем продукції етанолу із ксилози [32]. Було здійснено спроби змінити кофакторну специфічність КДГ з НАД на НАДФ. Однак стеричні властивості залишку аспартату коен� зимзв’язуючого домену і відштовхування між негативно зарядженими групами фосфату НАДФ і карбоксильною групою аспартату пе� решкоджали зв’язуванню НАДФ. Стеричні та електростатичні перешкоди були ліквідовані заміною аспартату на гліцин. Спостерігалось зменшення спорідненості КДГ до НАД, однак появи спорідненості ферменту до НАДФ до� сягти не вдалось. До того ж специфічна актив� ність модифікованої КДГ зменшувалась у два рази порівняно з нативним ферментом [58]. Кофакторзв’язуючий домен НАДФ�залежної алкогольдегідрогенази із Thermoаnаerobium brockii було перенесено у КДГ P. stipitis. Утво� рений гібридний фермент виявляв 31 % спе� цифічної активності, спорідненість до НАДФ зменшувалась у 9 разів, спорідненість до НАД залишилася незмінною. Модифікований фер� мент було коекспресовано в S. cerevisiae разом з КР P. stipitis. Отримані рекомбінантні штами S. cerevisiae виявляли здатність до росту в се� редовищі з ксилозою [58]. Watanabe et al. [59], використовуючи метод сайт�специфічного мутагенезу, проводили до� слідження функцій амінокислотних залишків Asp207, Ile208, Phe209 і Asn211 при зв’язуванні КДГ P. stipitis НАД або НАДФ. Заміна однієї аміно� кислоти у складі КДГ, зокрема аспарагінової кислоти в положенні 207 на аланін (D207�A), ізолейцину в положенні 208 на аргінін (I208� R), фенілаланіну в положенні 209 на серин (F209�S) або аспарагіну в положенні 211 на ар� гінін (N211�R), виявлялася у 5–48�кратному підвищенні каталітичної активності ферменту при використанні НАДФ порівняно з натив� ною КДГ. Водночас модифіковані форми КДГ зберігали достатньо високу активність з НАД. Мутантні форми ферменту з подвійними замі� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 Рис. 2. Активність КР (по вертикалі, МО/мг білка) при використанні різних кофакторів (НАДФН і НАДН) у штамів H. polymorpha (а) та вихід етанолу (по вертика� лі, г/л) при ферментації ксилози штамами H. polymorpha (б): 1 – вихідний штам CBS4732 leu2; 2 – штам, що міс� тить модифіковану КР 77 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання нами (D207�A/I208�R і D207�A/F209�S) харак� теризувалися подібними ознаками. Мутантні форми КДГ з трьома (D207�A/I208�R/F209�S) та чотирма замінами (D207�A/I208�R/F209� S/N211�R) характеризувалися 4500�кратним підвищенням каталітичної активності фер� менту при використанні НАДФ порівняно з використанням НАД КДГ дикого типу. Однак термостабільність більшості НАДФ�залежних мутантів КДГ істотно поступалась ферменту дикого типу. Для підвищення термостабіль� ності в модифіковану КДГ було введено до� даткові атоми цинку. Окрім стабілізації білка, це призвело і до додаткового підвищення ка� талітичної активності ферменту при викори� станні НАДФ [59]. Рекомбінантні S. cerevisiae, які містили нативну КР P. stipitis і різні типи модифікованих НАДФ�залежних КДГ [59], характеризувалися підвищенням продукції етанолу із ксилози до 41 % та зменшенням утворення побічного продукту ксиліту [60]. Експресія ксилозоредуктази і ксилітолдегідрогенази у S. cerevisiae В S. cerevisiae досліджували ендогенний шлях метаболізму ксилози. Було показано, що над� експресія власних генів GRE3 і XYL2 забезпе� чує здатність S. cerevisiae рости на середовищі з ксилозою в присутності глюкози за аеробних умов. Проте, порівняно зі штамами S. cerevisi� ae, які експресують гени XYL1 і XYL2 P. stipitis, штами з ендогенними генами ростуть на кси� лозі значно повільніше і акумулюють більшу кількість ксиліту. Різницю у швидкості росту пов’язують зі строгою специфічністю КР до НАДФН на відміну від КР P. stipitis, яка вияв� ляє подвійну специфічність як до НАДФН, так і до НАДН [61]. За допомогою методів еволюційної інженерії вдалося отримати мутанти S. cerevisiae, здатні рости в середовищі з ксилозою. Для цього S. cerevisiae безперервно культивували в умовах селекційного тиску в середовищі з ксилозою протягом декількох тижнів. Отримані мутант� ні штами виявляли 80�кратне зростання ак� тивності власної КДГ, чотирикратне підви� щення активності КР, тоді як активність КК залишилася незміненою [47]. Було показано, що у штамів S. cerevisiae, які надекспресують гени, що кодують КР і КДГ P. stipitis, рівень ферментації ксилози до етанолу підвищується у два рази, а формування ксиліту знижується порівняно зі штамом з незмінною активністю цих ферментів [62]. При підвищен� ні активності лише КР та незмінній активності КДГ спостерігається значне зниження кількос� ті ксиліту, проте рівень алкогольної фермента� ції ксилози залишається незмінним. Висока активність КДГ є необхідною для покращання алкогольної ферментації ксилози, оскільки за� безпечує посилення відтоку ксиліту та збіль� шення кількості ксилулози. Вважають, що надмірне підвищення активності КР призво� дить до збільшення кількості гліцерину за ра� хунок неспецифічного відновлення дигідрок� сиацетон�3�фосфату до гліцерол�3�фосфату за участю КР. В результаті відбувається регенера� ція НАД, який використовується у реакції КДГ, що в свою чергу призводить до зменшен� ня кількості побічного продукту – ксиліту [63]. Ксилозоізомераза Дисбалансу кофакторів, який створюється у двох перших реакціях метаболізму ксилози, можна уникнути, якщо б ксилоза безпосеред� ньо перетворювалась у ксилулозу за участю прокаріотного ферменту ксилозоізомерази (КІ) (ЕС 5.3.1.5) [64]. КІ каталізує ізомериза� цію D�ксилози (або D�глюкози) до D�ксилу� лози (або D�фруктози). КІ не потребує кофак� торів і тому не створює їх дисбаланс під час анаеробної ферментації ксилози. КІ бактерій поділяються на дві основні групи залежно від фізичних властивостей і структурної гомології [65]. КІ бактерій (Actinoplanes, Streptomyces, Arthrobacter і Thermus) належать до першої групи. Ці ферменти мають молекулярну масу �45 кДа з оптимальним рН у лужній області. До фер� ментів другої групи належать усі інші КІ (E. сoli, Bacillus, Clostriclium, Thermologa), включа� ючи еукаріотну КІ Hordeum vulgare [66]. Фер� менти цієї групи мають видовжений N�термі� нальний регіон і, як наслідок, дещо більшу молекулярну масу �50 кДа, їх оптимальне рН наближається до нейтрального. Експресія ксилозоізомерази в S. cerevisiae Перші спроби експресії KІ у S. cerevisiae бу� ли невдалими. Трансформанти штамів S. cere� visiae генами хylA, що кодують KІ Actioplanes ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 78 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний missouriensis [67] і Clostridium thermosulphuro� genes, не виявляли активності КІ, хоча специ� фічна мPHК була присутня. Гетерологічна експресія генів xylA E. сoli і Bacillus subtilis при� зводила до утворення великої кількості в біль� шості нерозчинного білка, який був каталітич� но неактивним [67]. Ген xylA Streptomyces rubiginosus було клоновано і експресовано у дріжджів S. сerevisiae, проте специфічна ак� тивність у трансформантів не визначалась. Утворений білок був нерозчинним і виділявся із клітинних лізатів лише за допомогою екс� тракції детергентами. Неефективні спроби експресії прокаріотних КІ в дріжджах пояс� нювали посттрансляційними модифікаціями, формуванням інтер� або інтрамолекулярних дисульфідних містків, неоптимальним рівнем рН у дріжджовій клітині [68]. КІ термофільної бактерії Thermus ther� mophilus успішно експресували в S. cerevisiae, фермент виявляв специфічну активність [69]. При культивуванні рекомбінантного штама в середовищі з ксилозою в умовах обмеженої аерації спостерігалось трикратне покращання утилізації субстрату у порівнянні з вихідним штамом. Проте продукція етанолу залишалась на низькому рівні. Одна з причин неефектив� ної ферментації полягала у недостатній актив� ності КІ T. thermophilus, адже при мезофільній температурі фермент має лише залишкову ак� тивність – 0,04 МО/мг, хоча при температур� ному оптимумі (85 °С) активність КІ є висо� кою і становить 1 МО/мг. Іншим негативним чинником є формування ксиліту, головним чином за участю неспецифічної НАДФН�за� лежної альдозоредуктази. Формування ксиліту спричинює подвійний негативний ефект на вихід етанолу: по�перше, відтік вуглецю, який потенційно міг би перетворитися в етанол; по�друге, ксиліт конкурентно інгібує КІ. Із збільшенням внутрішньоклітинної концент� рації ксиліту зменшується спорідненість КІ до ксилози [69]. Для усунення інгібування актив� ності КІ ксилітом у штамі, що містив КІ T. ther� mophilus, було делетовано ген GRE3, що кодує КР S. cerevisiae, і надекспресовано ген, що ко� дує ендогенну КК. При цьому формування ксиліту зменшувалось у два рази, проте штам залишався не здатним до росту на ксилозі [70]. Для збільшення питомої активності КІ при фі� зіологічних температурах ген хylA T. ther� mophilus було мутагенізовано з використанням методу помилкової полімеразної реакції. Отри� мані мутантні форми КІ виявляли підвищену активність при 30 °С. Найкращий мутантний білок характеризувався десятикратним зростан� ням швидкості реакції у порівнянні з вихідною формою КІ. Водночас спорідненість до ксилі� ту була істотно знижена [71]. Ген araA, що кодує КІ із анаеробних целю� лолітичних грибів виду Piromyces sp. E2, був успішно експресований у дріжджів S. cerevisi� ae. При температурі 30 °С активність гетероло� гічної КІ у безклітинних екстрактах становила 0,3–1,1 МО/мг білка. Сконструйований ре� комбінантний штам S. сerevisiae ріс на середо� вищі з ксилозою дуже повільно [72]. Адапто� ваний за допомогою методів еволюційної селекції штам S. cerevisiae набував суттєво по� кращеної здатності до росту в середовищі з ксилозою [21]. Експресія ксилозоізомерази у метилотрофних дріжджів H. polymorpha Термотолерантні дріжджі H. polymorpha здат� ні до ефективної алкогольної ферментації кси� лози – основного цукру гідролізатів лігноцелю� лозних відходів при підвищеній температурі. Цей мікроорганізм слід розглядати як один з найбільш перспективних для застосування в алкогольній ферментації лігноцелюлозної си� ровини шляхом одночасної сахарифікації та ферментації [73]. На перших етапах метаболіз� му ксилози у H. polymorpha, як і у інших кси� лозоферментуючих дріжджів, задіяні два фер� менти – КР і КДГ. Була запропонована ідея замінити початковий етап дріжджового метабо� лізму ксилози на бактерійний. Для цього було сконструйовано делеційний штам H. polymorpha з пошкодженими КР і КДГ. Отриманий штам не здатний рости в середовищі з ксилозою. Експресія КІ E. coli або Streptomyces coelicolor під контролем сильного конститутивного про� мотора гена, що кодує гліцеральдегід�3�фос� фатдегідрогеназу, призводила до відновлення здатності мутантів H. рolymorpha з делетовани� ми генами XYL1 та XYL2 рости в середовищі, що містить ксилозу, як єдине джерело вугле� цю. Активність КІ у трансформантів досягала 20–25 % від активності цього ферменту у E. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 79 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання coli. Проте підвищення рівня алкогольної фер� ментації ксилози порівняно зі штамом дикого типу не спостерігалось [33]. В геномі H. рoly� morpha було ідентифіковано паралог гена КДГ, позначений як XYL2�В. Зворотна активність додаткової КДГ забезпечує перетворення кси� лулози, утвореної в реакції КІ, в ксиліт, який інгібує КІ. Штам з делецією трьох генів XYL1, XYL2�A і XYL2�B та надекспресією бактерійної ізомерази характеризувався високою активніс� тю КІ, що становила 80 % активності фермен� ту у донорного штама бактерії. Однак істотного покращання алкогольної ферментації ксилози не спостерігалось [73]. Ксилулокіназа Ксилулоза фосфорилюється до ксилулозо� 5�фосфата за участю третього ферменту в шля� ху ксилозного метаболізму – КК. Ксилулозо� 5�фосфат потрапляє в ПФШ і гліколіз, пере� творюючись до етанолу. КК є першим кроком ксилозного метаболізму, що є спільним для бактерій і грибів [74]. Бактеріальний ген xylB, що кодує КК, вперше був клонований у E. coli ще в 1984 р. [75]. У 1989 р. Ho і Chang [76] клонували ген, що кодує КК S. сerevisiae, який отримав назву XKS1. Richard et al. [1] показали, що у S. сere� visiae КК є єдиним шляхом метаболізму ксилу� лози. Штами S. сerevisiae з делецією гена XKS1 не здатні рости на середовищі з ксилу� лозою як єдиним джерелом вуглецю [1]. Активність КК P. tannophilus і C. shehatae є приблизно на порядок вищою порівняно з ак� тивністю цього ферменту у S. сerevisiae при рості в середовищі з ксилозою. У ксилозофер� ментуючих дріжджів відбувається 20�кратна індукція КК при рості в середовищі з ксило� зою. Цікавим є те, що на відміну від КК P. stipitis, КК S. сerevisiae як субстрат може вико� ристовувати, окрім ксилулози, і рибулозу [1, 77]. Rodriguez�Pena et al. [78], порівнюючи ге� номи різних мікроорганізмів, виявили знач� ний ступінь гомології генів КК S. сerevisiae і бактерій. Було здійснено делецію гена XKS1 S. cerevisiae для виявлення його фізіологічного ефекту. Мутант �xks1 добре ріс в середовищі з глюкозою, але був нездатним рости на кси� лулозі. При введенні гена XKS1 у отриманих трансформантів відновлювалась здатність рос� ти в середовищі з ксилулозою навіть краще, ніж у штама дикого типу. У 1998 р. були успішно сконструйовані ре� комбінантні штами S. сerevisiae, здатні до ефек� тивної алкогольної ферментації глюкозо�кси� лозних сумішей. Унікальність цих штамів по� лягала в тому, що, окрім генів XYL1 і XYL2 P. stipitis, вони несли надекспресовний алель влас� ного гена XKS1 [79]. Рекомбінантні дріжджі S. сerevisiae, які містять гени ксилозного метабо� лізму XYL1 і XYL2 P. stipitis, були здатні рости на середовищі з ксилозою за аеробних умов і продукувати етанол за умов обмеженої аерації, проте вихід етанолу був невисоким [80]. Надек� спресія ендогенної КК у таких рекомбінантних штамів S. сerevisiae підвищувала вихід етанолу на середовищі з ксилозою, проте ці штами ферментували ксилозу значно гірше порівняно з P. stipitis і C. shehatae [81]. Відомо, що надексп� ресія трьох генів ксилозного метаболізму XYL1, XYL2 і XYL3 P. stipitis у пекарських дріжджах значно підвищує вихід етанолу на середовищі з ксилозою [82]. КК P. stipitis істотно відрізня� ється від своїх найближчих гомологів. Філоге� нетичний аналіз показав, що відкрита рамка зчитування гена XYL3 P. stipitis лише на 28 % ідентична за амінокислотною послідовністю до гена XKS1 S. сerevisiae. КК P. stipitis містить декілька консервативних доменів, характерних для ферментів родини кіназ, серед яких важли� вим є домен, задіяний у зв’язуванні фосфату АТФ. Мутантні штами P. stipitis з делецією гена XYL3 погано ростуть і зовсім не продукують етанол в середовищі з ксилозою, проте утворю� ють значну кількість ксиліту [83]. Здатність до незначного росту на ксилозі пояснюється існуванням іншого альтернативного шляху ме� таболізму ксилози у цих дріжджів [84]. До� сліджуючи властивості мутантних штамів P. stipitis з делецією гена XYL3, Jin et al. [83] встано� вили, що ксилулоза за участю арабінітолдегідро� генази спочатку перетворюється до арабінітолу, який за участю рибулозоредуктази відновлюєть� ся до рибулози, з наступним фосфорилюванням рибулокіназою до рибулозо�5�фосфату, який надалі потрапляє в ПФШ (рис. 1). Альтернатив� ний шлях метаболізму ксилози потребує підви� щеного рівня аерації порівняно зі звичайним шляхом і не призводить до синтезу етанолу у мутантних штамів �xyl3 P. stipitis. Отримані ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 80 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний результати добре збігаються з даними про те, що P. stipitis повільно росте і продукує незначні кількості етанолу на середовищі з арабінозою, хоча активність КК є в три рази вищою за актив� ність рибулозокінази при рості на ксилозі [84]. Для підвищення рівня алкогольної фер� ментації ксилози у штамі H. polymorpha �xyl1 �xyl2�A�xyl2�B було коекспресовано ген xylA, що кодує КІ E. сoli, і ген XYL3, що кодує влас� ну КК. Сконструйований штам характеризу� вався двократним підвищенням активності КК, рівень ферментації ксилози до етанолу збільшився в 4 рази порівняно з вихідним штамом [73]. Порівняння ефективності початкових шляхів ферментації ксилози у рекомбінантних дріжджів Два рекомбінантні штами S. сerevisiae було використано для порівняння ефективності по� чаткових шляхів ферментації ксилози. Штам TMB 3057 містив гени XYL1 і XYL2 P. stipitis, тоді як штам TMB 3066 містив ген, що кодує КІ Piromyces sp. В обох штамах були також надекс� пресовані гени, що кодують КК і ферменти не� окислювальної частини ПФШ (транскетолаза, трансальдолаза, рибулозо�5�фосфатізомераза, і рибулозо�5�фосфатепімераза), а також деле� товано ген GRE3, що кодує неспецифічну аль� дозоредуктазу. Було показано, що за умов фер� ментації в мінеральному середовищі ксилоза в 2,4 раза краще утилізувалась штамом TMB 3057 (КР�КДГ) порівняно зі штамом TMB 3066 (КІ). Вихід етанолу у штама TMB 3057 (КР�КДГ) також був у два рази вищим. Проте штам TMB 3066 (КІ) на відміну від штама TMB 3057 (КР�КДГ) під час ферментації практично не нагромаджував побічних про� дуктів, таких як ксиліт, ацетат і гліцерин [85]. Отже, конструювання ефективних фермента� торів ксилози на основі бактеріальної КІ по� требує подальшого поліпшення. В підсумку варто додати, що на теперішній момент не іс� нує одностайної думки стосовно того, який з початкових шляхів утилізації ксилози є ефек� тивнішим, бактеріальний чи дріжджовий. І хо� ча перші ланки метаболізму ксилози є ліміту� ючими на шляху ефективної алкогольної ферментації цукрів лігноцелюлозних гідролі� затів, проте у синтезі етанолу залучені й інші, не менш важливі ланки та аспекти, яким при� свячено багато робіт, а саме ПФШ, гліколіз, окислення пірувату, блокування реутилізації утвореного етанолу, зниження чутливості мік� роорганізмів до синтезованого етанолу, обме� ження зростання біомаси, регуляція синтезу етанолу, розробка ефективних методів селекції продуцентів етанолу тощо. Враховуючи пер� шочерговість та гостроту світових проблем енергозабезпечення та екологічного балансу, слід сподіватися, що у недалекій перспективі будуть створені ефективні організми – проду� центи етанолу з поновлюваної сировини. SUMMARY. Plant biomass possesses a huge potential as a source for biofuel production. The main components of bio� mass are glucose and five�carbon sugar xylose. The yeast Saccharomyces cerevisiae that is used for industrial ethanol production from glucose is unable to xylose fermentation. Therefore a microorganism capable for efficient fermenta� tion of both glucose and xylose has to be found in nature or constructed for economically feasible biomass conversion to ethanol. The active xylose fermentation could be performed by increasing the efficiency of initial stages of xylose metabo� lism [1]. In this review the enzymes of initial stages of xylose metabolism in yeasts (xylose reductase, xylitol dehydroge� nase, xylulokinase) and bacteria (xylose isomerase and xylu� lokinase) are characterized. The ways for construction of yeast strains capable of efficient alcoholic xylose fermenta� tion are discussed. РЕЗЮМЕ. Растительная биомасса обладает огром� ным потенциалом в качестве сырья для производства биотоплива, в частности топливного этанола. Основ� ными составными растительной биомассы являются глюкоза и пятиуглеродный сахар ксилоза. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые используются для промышленного производства этанола из глюкозы, не способны ферментировать ксилозу. Следовательно, для обеспечения экономически выгодного превраще� ния растительной биомассы в этанол необходимо най� ти в природе или сконструировать микроорганизм, активно ферментирующий не только глюкозу, но и ксилозу. Обеспечить повышение ферментации ксило� зы можно, обеспечив эффективность начальных эта� пов метаболизма этой пентозы, которые определяют и эффективность алкогольной ферментации в целом. В настоящем обзоре детально охарактеризованы фер� менты, задействованные на начальных этапах метабо� лизма ксилозы у дрожжей (ксилозоредуктаза, ксили� толдегидрогеназа и ксилулокиназа) и бактерий (кси� лозоизомераза и ксилулокиназа), а также рассмотрены пути конструирования штаммов дрожжей – эффектив� ных продуцентов этанола из ксилозы. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 81 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Richard P., Toivari M.H., Pentilla M. The role of xylulo� kinase in Saccharomyces cerevisiae xylulose catabolism // FEMS Microbiol. Lett. – 2000. – 190. – P. 39–43. 2. Does A.L., Bisson L.F. Characterization of xylose uptake in the yeasts Pichia heedii and Pichia stipitis // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – 55. – P. 159–164. 3. Lucas C., Vanuden N. Transport of hemicellulose mono� mers in the xylose�fermenting yeast Candida shehatae // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1986. – 23. P. 491–495. 4. Leandro M.J., Goncalves P., Spencer�Martins I. Two glucose/xylose transporter genes from Candida inter� media: first molecular characterization of a yeast xylose�H+ symporter // Biochem. J. – 2006. – 395. – P. 543–549. 5. Weierstall T., Hollenberg C.P., Boles E. Cloning and characterization of three genes (SUT1–3) encoding glucose transporters of the yeast Pichia stipitis // Mol. Microbiol. – 1999. – 31. – P. 871–883. 6. Hamacher T., Becker J., Gardonyi M., Hahn�Hagerdal B., Boles E. Characterization of the xylose�transporting properties of yeast hexose transporters and their influ� ence on xylose utilization // Microbiology. – 2002. – 148(Pt 9). – P. 2783–2788. 7. Kotter P., Ciriacy M. Xylose fermentation by Saccha� romyces cerevisiae // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1993. – 38. – P. 776–783. 8. Kruckeberg A.L. The hexose transporter family of Saccharomyces cerevisiae // Arch. Microbiol. – 1996. – 166. – P. 283–292. 9. Boles E., Hollenberg C.P. The molecular genetics of hexose transport in yeasts // FEMS Microbiol. Rev. – 1997. – 21. – P. 85–111. 10. Bisson L.F. High�affinity glucose transport in Saccharo� myces cerevisiae is under general glucose repression control // J. Bacteriol. – 1988. – 170. – P. 4838–4845. 11. Bisson L.F., Fraenkel D.G. Expression of kinase�depend� ent glucose uptake in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol. – 1984. – 159. – P. 1013–1017. 12. Busturia A., Lagunas R. Catabolite inactivation of the glucose transport system in Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Microbiol. – 1986. – 132. – P. 379–385. 13. Hamaher T., Becker J., Gardonyi M., Hahn�Hagerdal B., Boles E. Characterization of the xylose�transporting properties of yeast hexose transporters and their influ� ence on xylose utilization // Microbiology. – 2002. – 148. – P. 2783–2788. 14. Wieczorke R., Krampe S., Wierstall T., Freidel K., Hollenberg C.P., Boles E. Concurrent knock�out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae // FEBS Lett. – 1999. – 464. – P. 123–128. 15. Diderich J.A., Schepper M., van Hoek P., Luttik M.A., van Dijken J.P., Pronk J.T. Glucose uptake kinetics and transcription of HXT genes in chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. – 1999. – 274. – P. 15350–15359. 16. Batista A.S., Miletti L.C., Stambuk B.U. Sucrose fer� mentation by Saccharomyces cerevisiae lacking hexose transport // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – 8. – P. 26–33. 17. Alexander M.A., Yang V.W., Jeffries T.W. Levels of pen� tosephosphate pathway enzymes from Candida she� hatae in continuous culture // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1988. – 29. – P. 282–288. 18. Verho R., Londesborough, Penttila M., Richard P. Engi� neering redox cofactor regeneration for improved pen� tose fermentation in Saccharomycer cerevisiae // Appl. and Environ. Microbiol. – 2003. – 10. – P. 5892–5897. 19. Bruinenberg P.M., de Bot P.H.M., van Dijken J.P., Scheffers W.A. The role of the redox balance in the anaer� obic fermentation of xylose by yeasts // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1983. – 18. – P. 287–292. 20. Wahlbom C.F., Hahn�Hagerdal B. Furfural, 5�hydrox� ymethyl furfural, and acetoin act as external electron acceptors during anaerobic fermentation of xylose in recombinant Saccharomycer cerevisiae // Biotechnol. Bioeng. – 2002. – 78. – P. 172–178. 21. Kuyper M., Winkler A.A., van Dijken J.P., Pronk J.T. Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cere� visiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle // FEMS Yeast Res. – 2004. – 4. – P. 655–664. 22. Blank L.M., Lehmbeck F., Sauer U. Metabolic�flux and network analysis in fourteen hemiascomycetous yeasts // FEMS Yeast Res. – 2005. – 5. – P. 545–558. 23. Bruinenberg P.M., van Dijken J.P., Scheffers W.A. An enzymic analуsis of NADPH production and con� sumption in Candida utilis // J. Gen. Microbiol. – 1983. – 129. – P. 965–971. 24. Nissen T.L., Anderlund M., Nielsen J., Villadsen J., Kielland�Brandt M.C. Expression of a cytoplasmic transhydrogenase in Saccharomycer cerevisiae results in formation of 2�oxoglutarate due to depletion of the NADPH pool // Yeast. – 2001. – 18. – P. 19–32. 25. Grimshaw C.E. Aldose reductase: model for a new para� digm of enzymic perfection in detoxification catalysis // Biochemistry. – 1992. – 34. – P. 8299–8308. 26. Amore R., Koetter P., Kuester C., Ciriacy M., Hollen� berg C.P. Cloning and expression in Saccharomyces cere� visiae of the NAD(P)H�dependent xylose reductase� encoding gene (XYL1) from the xylose�assimilating yeast Pichia stipitis // Gene. – 1991. – 109. – P. 89–97. 27. Hallborn J., Walfridsson M., Airaksinen U., Ojamo H., Hahn�Hagerdal B., Pentilla M., Keranen S. Xylitol pro� duction by recombinant Saccharomyces cerevisiae // Bio. Technology. – 1991. – 9. – P. 1090–1095. 28. Yokoyama S., Kinoshita Y., Suzuki T., Kawai K., Ho� ritsu H., Takamizawa K. Cloning and sequencing of two D�xylose reductase genes (xyrA and xyrB) from ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 82 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний Candida tropicalis // J. Ferment. Bioeng. – 1995. – 80. – P. 603–605. 29. Billard P., Menart S., Fleer R., Bolotin�Fukuhara M. Isolation and characterization of the gene encoding xylose reductase from Kluyveromyces lactis // Gene. – 1995. – 162. – P. 93–97. 30. Bolen P.L., Hayman G.T., Stepherd H.S. Sequence and analysis of aldose (xylose) reductase gene from the xylose�fermenting yeast Pachysolen tannophilus // Yeast. – 1996. – 12. – P. 1367–1375. 31. Neuhauser W., Haltrich D., Kulbe K.D., Nidetzky B. NAD(P)H�dependent aldose reductase from the xylose�assimilating yeast Candida tenuis. Isolation, characterization and biochemical properties of the enzyme // Biochem. J. – 1997. – 326. – P. 683–692. 32. Lee J.�K., Koo B.�S., Kim S.�Y. Cloning and character� ization of the XYL1 gene, encoding an NADP�prefer� ring xylose reductase from Candida parapsilopsis, and its functional expression in Candida tropicalis // Appl. and Environ. Microbiol. – 2003. – 69. – P. 6179–6188. 33. Voronovsky A.Y., Ryabovа O.B., Verba O.B., Ischuk O.P., Dmytruk K.V., Sibirny A.A. Expression of xylA genes encoding xylose isomerases from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res. – 2005. – 5. – P. 1055–1062. 34. Kuhn A., van Zyl C., van Tonder A., Prior B.A. Purification and partial characterization of an aldo� keto reductase from Saccharomyces cerevisiae // Appl. Environ. Microbiol. – 1995. – 61. – P. 1580–1585. 35. Verduyn C., van Kleef R., Frank J., Schreuder H., van Dijken J.P., Scheffers W.A. Properties of the NAD(P) H�dependent xylose reductase from the xylose�ferment� ing yeast Pichia stipitis // Biochem. J. – 1985. –226. – P. 669–677. 36. Bruinenberg P.M., de Bot P.H.M., van Dijken J.P., Scheffers W.A. NADH�linked aldose reductase: the key to ethanolic fermentation of xylose by yeasts // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1984. – 19. – P. 256–260. 37. Jin Y.S., Laplaza J.M., Jeffries T.W. Saccharomyces cerevisiae engineering for xylose metabolism exhibits a respiratory response // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – 70. – P. 6826–6825. 38. Garay�Arroyo A., Covarrubian A.A. Three genes whose expression is induced by stress in Saccharomyces cere� visiae // Yeast. – 1999. – 15. – P. 879–892. 39. Traft K.L., Otero�Cordero R.R., Van Zyl W.H., Hahn� Hagerdal B. Deletion of the GRE3 aldose reductase gene and its influence on xylose metabolism in recom� binant strains of Saccharomyces cerevisiae expressing the xylA and XKS1 genes // Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – 67. – P. 5668–5674. 40. Traff K.L., Jonsson L.J., Hanh�Hagerdal B. Putative xylose and arabinose reductase in Saccharomyces cere� visiae // Yeast. – 2002. – 19. – P. 1233–1241. 41. Richard P., Toivari M.H., Penttil M. Evidence that the gene YLR070c of Saccharomyces cerevisiae encodes a xylitol dehydrogenase // FEBS Lett. – 1999. – 457. – P. 135–138. 42. Habenicht A., Motejadded H., Kiess M., Wegere A., Mattes R. Xylose utilization : Cloning and characterisation of the xylitol dehydrogenase from Galactocandida mastodermi� tis // Biol. Chem. – 1999. – 380. – P. 1405–1411. 43. Seiboth B., Hartl L., Pail M., Kubicek C.P. D�Xylose metabolism in Hypocrea jecorina : Loss of the xylitol dehy� drogenase step can be partially compensated for by lad1� Encoded L�arabinitol�4�dehydrogenase // Eukaryot. Cell. – 2003. – 2. – P. 867–875. 44. Tran L.H., Kitamoto N., Kawai K., Takamizawa K., Suzuki T. Cloning and expression of a NAD+�depend� ent xylitol dehydrogenase gene (xylA) of Aspergillus oryzae // J. Biosci. Bioeng. – 2004. – 97. – P. 419–422. 45. Boer E., Wartmann T., Schmidt S., Bode R., Gellissen G., Kunze G. Characterization of the AXDH gene and the encoded xylitol dehydrogenase from the dimorphic yeast Arxular adeninivorans // Antonie van Leeuwen� hoek. – 2005. – 87. – P. 233–243. 46. Ko B.S., Jung H.C., Kim J.H. Molecular cloning and characterization of NAD+�dependent xylitol dehydro� genase from Candida tropicalis ATCC 20913 // Biotechnol. Prog. – 2006. – 22. – P. 1708–1714. 47. Attfield P.V., Bell P.J. Use of population genetics to derive nonrecombinant Saccharomyces cerevisiae strains that grow using xylose as a sole carbon source // FEMS Yeast Res. – 2006. – 6. – P. 862–868. 48. Sarthy A.V., Schopp C., Idler K.B. Cloning and sequence determination of the gene encoding sorbitol dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae // Gene. – 1994. – 140. – P. 121–126. 49. Rizzi M., Harwart K., Buithanh N.A., Dellweg H. A kinetic�study of the NAD+�xylitol dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis // J. Ferment. Bioeng. – 1989. – 67. – P. 25–30. 50. Ko B.S., Kim J., Kim J.H. Production of xylitol from D� xylose by a xylitol dehydrogenase gene�disrupted mutant of Candida tropicalis // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – 72(6). – P. 4207–4213. 51. Ko B.S., Rhee C.H., Kim J.H. Enhancement of xylitol productivity and yield using a xylitol dehydrogenase gene�disrupted mutant of Candida tropicalis under fully aerobic conditions // Biotechnol. Lett. – 2006. – 28(15). – P. 1159–1162. 52. Hahn�Hagerdal B., Wahlbom C.F., Gardonyi M., van Zyl W.H., Cordero Otero R.R., Jonsson L.J. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose uti� lization // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. – 2001. – 73. – P. 53–84. 53. Anderlund M., Rådström P., Hahn�Hägerdal B. Expres� sion of bifunctional enzymes with xylose reductase and xylitol dehydrogenase activity in Saccharomyces cerevisi� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 83 Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ae alters product formation during xylose fermentation // Metab. Eng. – 2001. – 3(3). – P. 226–235. 54. Zhang Y., Lee H. Site�directed mutagenesis of the cys� teine residues in the Pichia stipitis xylose reductase // FEMS Microbiol. Lett. – 1997. – 147(2). – P. 227–232. 55. Kostrzynska M., Sopher C., Lee H. Mutational analysis of the role of the conserved lysine�270 in the Pichia stipitis xylose reductase // FEMS Microbiol. Lett. – 1998. – 159. – P. 107–112. 56. Jeppsson M., Bengtsson O., Katja F., Lee H., Hahn� Hagerdal B., Gorwa�Grauslund M.F. The expression of a Pichia stipitis xylose reductase mutant with higher KM for NADPH increases ethanol production from xylose recombinant Saccharomyces cerevisiae // Biotechnol. Bioeng. – 2006. – 93. – P. 665–673. 57. Watanabe S., Pack S.P., Salen A.A., Annaluru N., Kodaki T., Makino K. The positive effect of the decreased NADPH�preffering activity of xylose reduc� tase from Pichia stipitis on ethanol production using xylose�fermenting recombinant Saccharomyces cerevisi� ae // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2007. – 71(5). – P. 1365–1369. 58. Metzger M.H., Hollenberg C.P. Amino acid substitu� tions in the yeast Pichia stipitis xylitol dehydrogenase coenzyme�binding domain affect the coenzyme speci� ficity // Eur. J. Biochem. – 1995. – 228(1). – P. 50–54. 59. Watanabe S., Kodaki T., Makino K. Complete reversal of coenzyme specificity of xylitol dehydrogenase and increase of thermostability by the introduction of structural zink // J. Biol. Chem. – 2005. – 280(11). – P. 10340–10349. 60. Watanabe S., Saleh A.A., Pack S.P., Annaluru N., Kodaki T., Makino K. Ethanol production from xy� lose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP+�dependent xylitol dehydrogenase // J. Biotechnol. – 2007. – 130(3). – P. 316–319. 61. Toivari M.H., Salusjarvi L., Ruohonen L., Penttila M. Endogenous xylose pathway in Saccharomyces cerevisi� ae // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – 6. – P. 3681– 3686. 62. Karhumaa K., Fromanger R., Hahn�Hägerdal B., Gorwa�Grauslund M.F. High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improves xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – 73. – P. 1039–1046. 63. Jeppsson M., Träff K., Johansson B., Hahn�Hägerdal B., Gorwa�Grauslund M.F. Effect of enhanced xylose reduc� tase activity on xylose consumption and product distribu� tion in xylose�fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae // FEMS Yeast Res. – 2003. – 3. – P. 167–175. 64. Jeffries T.W., Jin Y.S. Ethanol and thermotolerance in the bioconversion of xylose by yeast // Adv. Appl. Microbiol. – 2000. – 47. – P. 221–268. 65. Bhosale S.H., Rao M.B., Deshpande V.V. Molecular and industrial aspects of glucose isomerase // Microbiol. Rev. – 1996. – 60(2). – P. 280–300. 66. Kristo P., Saarelainen R., Fagerstrom R., Aho S., Korhola M. Protein purification, and cloning and characterization of the cDNA and gene for xylose iso� merase of barley // Eur. J. Biochem. – 1996. – 237(1). – P. 240–246. 67. Amore R., Hollenberg C.P. Xylose isomerase from Actinoplanes missouriensis: primary structure of the gene and the protein // Nucl. Acids Res. – 1989. – 17(18). – P. 7515. 68. Gardonyi M., Hahn�Hagerdal B. The Streptomyces rubiginosus xylose isomerase is misfolded when expressed in Saccharomyces cerevisiae // Enzyme and Microbial. Technol. – 2003. – 32. – P. 252–259. 69. Walfridsson M., Bao X., Anderlund M., Lilius G., Bulow L., Hahn�Hägerdal B. Ethanolic fermentation of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the Thermus thermophilus xylA gene, which expresses an active xylose (glucose) isomerase // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – 62. – P. 4648–4651. 70. Träff K.L., Otero Cordero R.R., van Zyl W.H., Hahn� Hägerdal B. Deletion of the GRE3 aldose reductase gene and its influence on xylose metabolism in recom� binant strains of Saccharomyces cerevisiae expressing the xylA and XKS1 genes // Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – 67. – P. 5668–5674. 71. Lonn A., Gardonyi M., van Zyl W., Hahn�Hägerdal B., Otero R.C. Cold adaptation of xylose isomerase from Thermus thermophilus through random PCR mutagen� esis. Gene cloning and protein characterization // Eur. J. Biochem. – 2002. – 269. – P. 157–163. 72. Kuyper M., Harhangi H.R., Stave A.K., Winkler A.A., Jetten M.S., de Laat W.T., den Ridder J.J., Op den Camp H.J., van Dijken J.P., Pronk J.T. High�level functional expression of fungal xylose isomerase: the key to effi� cient ethanolic fermentation of xylose by Saccha� romyces cerevisiae // FEMS Yeast Res. – 2003. – 4. – P. 69–78. 73. Dmytruk O.V., Voronovsky A.Y., Abbas C.A., Dmytruk K.V., Ishchuk O.P., Sibirny A.A. Overexpression of bac� terial xylose isomerase and yeast host xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermo� tolerant yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res. – 2007. – l27 (PMID: 17662053). 74. Jeffries T.W. Utilization of xylose by bacteria, yeasts and fungi // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. – 1983. – 27. – P. 1–32. 75. Rosenfeld S.A., Stevis P.E., Ho N.W.Y. Cloning and characterization of the xyl genes from Escherichia coli // Mol. Gen. Genet. – 1984. – 194. – P. 410–415. 76. Ho N.W.Y., Chang S.F. Cloning of yeast xylulokinase gene by complementation of Escherichia coli and yeast mutations // Enzyme and Microbial. Technol. – 1989. – 11. – P. 417–421. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2 84 О.В. Дмитрук, К.В. Дмитрук, А.Я. Вороновський, А.А. Сибірний 77. Flanagan T., Waites M.J. Purification and characteri� zation of D�xylulokinase from the pentose�fermenting yeast Pichia stipitis CBS 5773 // Enzyme and Microbial. Technol. – 1992. – 14. – P. 975–979. 78. Rodriguez�Peña J.M., Cid V.J., Arroyo J., Nombela C. The YGR194c (XKS1) gene encodes the xylulokinase from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Lett. – 1998. – 162(1). – P. 155–160. 79. Ho N.W., Chen Z., Brainard A.P. Genetically endi� neered Saccharomyces yeast capable of effective cofer� mentation of glucose and xylose // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – 64. – P. 1852–1859. 80. Jin Y.S., Lee T.H., Choi Y.D., Ryu Y.W., Seo J.H. Convertion of xylose to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae containing genes for xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Pichia stipitis // J. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – 10. – P. 564–567. 81. Toivari M.H., Aristidou A., Ruohonen M., Penttila M. Conversion of xylose into ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae: importance of xylulokinase (XKS1) and oxygen availability // Metabol. Eng. – 2001. – 3. – P. 236–349. 82. Jeffries T.W. Engineering yeasts for xylose metabolism // Curr. Opin. Biotechnol. – 2006. – 17. – P. 320–326. 83. Jin Y.S., Cruz J., Jeffries T.W. Xylitol production by a Pichia tipitis D�xylulokinase mutant // Appl. Microbial. Biotechnol. – 2005. – 68. – P. 42–45. 84. Jin Y.S., Jones S., Shi N.Q., Jeffries T.W. Molecular cloning of XYL3 (D�xylulokinase) from Pichia stipitis and characterization of its physiological function // Appl. and Environ. Microbiol. – 2001. – 68. – P. 1232–1239. 85. Karhumaa K., Sanchez R.G., Hahn�Hägerdal B., Gorwa�Grauslund M.F. Comparison of the xylose reductase�xylitol dehydrogenase and the xylose iso� merase pathways for xylose fermentation by recombi� nant Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Cell Factor. – 2007. – 6. – P. 5. Надійшла 10.09.07 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 2

Метаболічна інженерія початкових етапів катаболізму ксилози у дріжджів з метою конструювання ефективних продуцентів етанолу з лігноцелюлози

Institution

Ähnliche Einträge