Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека

Из иммунной и неиммунной комбинаторных библиотек кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мыши получена панель одноцепочечных антител (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) против рекомбинантного интерферона β1b человека (rhIFN-β1b), которые были экспрессированы в клетках Escherichia coli. Для изолир...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2008
Main Authors:	Павлова, М.В., Николаев, Ю.С., Иродов, Д.М., Окунев, О.В., Кордюм, В.А., Гильчук, П.В.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Subjects:	Оригинальные работы
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8208
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека / М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 3-11. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-8208
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-82082025-02-09T17:02:42Z Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека Характеристика панелі одноланцюгових антитіл миші проти рекомбінантного інтерферону β1b людини Characterization of a panel of mouse single-chain antibodies Павлова, М.В. Николаев, Ю.С. Иродов, Д.М. Окунев, О.В. Кордюм, В.А. Гильчук, П.В. Оригинальные работы Из иммунной и неиммунной комбинаторных библиотек кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мыши получена панель одноцепочечных антител (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) против рекомбинантного интерферона β1b человека (rhIFN-β1b), которые были экспрессированы в клетках Escherichia coli. Для изолированных из иммунной библиотеки продуцентов показана разница в уровнях продукции ScFv’s в периплазму и среду для культивирования, а также стабильность экспрессии при пересевах и хранении. После секвенирования целевой ДНК было проведено множественное выравнивание и структурный анализ последовательностей ScFv’s с разной первичной структурой, в результате чего были выявлены существенные отличия как в антиген-связывающих (CDR), так и в каркасных (FR) участках их вариабельных доменов. Методами ELISA и вестерн-блоттинга показана специфичность взаимодействия полученных из иммунной библиотеки ScFv’s как с нативным, так и с денатурированным rhIFN-β1b, а также их стабильность при хранении. Для каждого представителя панели ScFv’s были определены константы аффинности, которые находились в диапазоне от 1,96•10^-8 до 1,69•10^- 9 М. З імунної та неімунної комбінаторних бібліотек кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші одержано панель одноланцюгових антитіл (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) проти рекомбінантного інтерферону β1b людини (rhIFN-β1b), які експресовано в клітинах Escherichia coli. Для ізольованих з імунної бібліотеки продуцентів показано різницю у рівнях продукції ScFv’s до периплазми та середовища культивування, а також стабільність експресії при пересівах та зберіганні. Після секвенування цільової ДНК проведено множин не вирівнювання та структурний аналіз послідовностей ScFv’s з різною первинною структурою, в результаті чого було виявлено істотні відмінності як у антигензв’язувальних (CDR), так і у каркасних (FR) ділянках їхніх варіабельних доменів. Методиками ELISA та вестерн-блотингу показано специфічність взаємодії одержаних з імунної бібліотеки ScFv’s як з нативним, так і денатурованим rhIFN-β1b, а також їхню стабільність при зберіганні. Для кожного представника панелі ScFv’s встановлено константи афінності, які знаходились у діапазоні від 1,96 • 10^–8 до 1,69 • 10^–9 М. A panel of single-chain antibodies (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) against recombinant human interferon beta 1b (rhIFN-β1b) has been obtained from immune and naїve combinatorial cDNA libraries of the mouse variable immunoglobulin genes. ScFv’s were expressed into Escherichia coli cells. For producers isolated from the immune library a difference in production yield of ScFv’s in periplasm and incubation medium as well as their expression stability in passages and storage stability have been demonstrated. After sequencing of target DNA the multiple alignment and structural analysis of ScFv’s sequences with different primary structures were carried out and significant difference in both complementarity-determining (CDR) and framework (FR) regions of their variable domains has been shown. For the ScFv’s isolated from the immune library, specificity of their binding with native and denatured rhIFN-β1b in ELISA and Western-blotting as well as their high storage stability have been shown. The affinity constants for each representatives of the ScFv’s panel were in the range from 1.96 • 10^–8 to 1.69 • 10^–9 M. Авторы работы выражают благодарность А. Ламану за предоставленную для исследований неиммунную библиотеку ScFv’s мыши, а также сотрудникам отдела функциональной геномики ИМБиГ НАН Украины за секвенирование ДНК. 2008 Article Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека / М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 3-11. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8208 579.69: 577.12 ru application/pdf Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Павлова, М.В. Николаев, Ю.С. Иродов, Д.М. Окунев, О.В. Кордюм, В.А. Гильчук, П.В. Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
description	Из иммунной и неиммунной комбинаторных библиотек кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мыши получена панель одноцепочечных антител (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) против рекомбинантного интерферона β1b человека (rhIFN-β1b), которые были экспрессированы в клетках Escherichia coli. Для изолированных из иммунной библиотеки продуцентов показана разница в уровнях продукции ScFv’s в периплазму и среду для культивирования, а также стабильность экспрессии при пересевах и хранении. После секвенирования целевой ДНК было проведено множественное выравнивание и структурный анализ последовательностей ScFv’s с разной первичной структурой, в результате чего были выявлены существенные отличия как в антиген-связывающих (CDR), так и в каркасных (FR) участках их вариабельных доменов. Методами ELISA и вестерн-блоттинга показана специфичность взаимодействия полученных из иммунной библиотеки ScFv’s как с нативным, так и с денатурированным rhIFN-β1b, а также их стабильность при хранении. Для каждого представителя панели ScFv’s были определены константы аффинности, которые находились в диапазоне от 1,96•10^-8 до 1,69•10^- 9 М.
format	Article
author	Павлова, М.В. Николаев, Ю.С. Иродов, Д.М. Окунев, О.В. Кордюм, В.А. Гильчук, П.В.
author_facet	Павлова, М.В. Николаев, Ю.С. Иродов, Д.М. Окунев, О.В. Кордюм, В.А. Гильчук, П.В.
author_sort	Павлова, М.В.
title	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
title_short	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
title_full	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
title_fullStr	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
title_full_unstemmed	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
title_sort	характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8208
citation_txt	Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека / М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 4. — С. 3-11. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT pavlovamv harakteristikapaneliodnocepočečnyhantitelmyšiprotivrekombinantnogointerferonab1bčeloveka AT nikolaevûs harakteristikapaneliodnocepočečnyhantitelmyšiprotivrekombinantnogointerferonab1bčeloveka AT irodovdm harakteristikapaneliodnocepočečnyhantitelmyšiprotivrekombinantnogointerferonab1bčeloveka AT okunevov harakteristikapaneliodnocepočečnyhantitelmyšiprotivrekombinantnogointerferonab1bčeloveka AT kordûmva harakteristikapaneliodnocepočečnyhantitelmyšiprotivrekombinantnogointerferonab1bčeloveka AT gilʹčukpv harakteristikapaneliodnocepočečnyhantitelmyšiprotivrekombinantnogointerferonab1bčeloveka AT pavlovamv harakteristikapanelíodnolancûgovihantitílmišíprotirekombínantnogoínterferonub1blûdini AT nikolaevûs harakteristikapanelíodnolancûgovihantitílmišíprotirekombínantnogoínterferonub1blûdini AT irodovdm harakteristikapanelíodnolancûgovihantitílmišíprotirekombínantnogoínterferonub1blûdini AT okunevov harakteristikapanelíodnolancûgovihantitílmišíprotirekombínantnogoínterferonub1blûdini AT kordûmva harakteristikapanelíodnolancûgovihantitílmišíprotirekombínantnogoínterferonub1blûdini AT gilʹčukpv harakteristikapanelíodnolancûgovihantitílmišíprotirekombínantnogoínterferonub1blûdini AT pavlovamv characterizationofapanelofmousesinglechainantibodies AT nikolaevûs characterizationofapanelofmousesinglechainantibodies AT irodovdm characterizationofapanelofmousesinglechainantibodies AT okunevov characterizationofapanelofmousesinglechainantibodies AT kordûmva characterizationofapanelofmousesinglechainantibodies AT gilʹčukpv characterizationofapanelofmousesinglechainantibodies
first_indexed	2025-11-28T09:01:41Z
last_indexed	2025-11-28T09:01:41Z
_version_	1850024154508558336
fulltext	Оригинальные работы УДК 579.69: 577.12 М.В. ПАВЛОВА 1, Ю.С. НИКОЛАЕВ 1, Д.М. ИРОДОВ 2, О.В. ОКУНЕВ 2, В.А. КОРДЮМ 2, П.В. ГИЛЬЧУК 2 1 Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко 2 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев E/mail: gilchuk@ukr.net ХАРАКТЕРИСТИКА ПАНЕЛИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ МЫШИ ПРОТИВ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА ββ1b ЧЕЛОВЕКА Из иммунной и неиммунной комбинаторных биб� лиотек кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мыши получена панель одноцепочечных антител (ScFv’s – single�chain Fv�antibodies) против рекомби� нантного интерферона β1b человека (rhIFN�β1b), ко� торые были экспрессированы в клетках Escherichia coli. Для изолированных из иммунной библиотеки про� дуцентов показана разница в уровнях продукции ScFv’s в периплазму и среду для культивирования, а также стабильность экспрессии при пересевах и хра� нении. После секвенирования целевой ДНК было про� ведено множественное выравнивание и структурный анализ последовательностей ScFv’s с разной первич� ной структурой, в результате чего выявлены сущес� твенные отличия как в антиген�связывающих (CDR), так и в каркасных (FR) участках их вариабельных доменов. Методами ELISA и вестерн�блоттинга по� казана специфичность взаимодействия полученных из иммунной библиотеки ScFv’s как с нативным, так и с денатурированным rhIFN�β1b, а также их ста� бильность при хранении. Для каждого представителя панели ScFv’s были определены константы аффин� ности, которые находились в диапазоне от 1,96 · 10–8 до1,69 · 10 –9 М. Введение. Конструирование больших ком� бинаторных библиотек кДНК вариабельных ге� нов иммуноглобулинов человека и животных, а также возможность изолирования с таких биб� лиотек иммунореагентов с необходимыми ан� тиген�связывающими характеристиками от� крыли принципиально новые возможности использования моноклональных антител в био� логии и медицине [1, 2]. Наиболее распростра� ненным форматом для конструирования ре� комбинантных антител являются одноцепо� чечные антитела ScFv’s, полученные путем трансляции объединенных в один ген вариа� бельных доменов тяжелой и легкой цепей им� муноглобулинов. Благодаря особенностям своей структуры ScFv’s сохраняют конформа� цию активного центра природного антитела, что обеспечивает высокую специфичность их взаимодействия с антигеном [3]. Основным преимуществом ScFv’s является возможность их продуцирования в клетках прокариотов с относительно небольшими затратами. Качество полученных ScFv’s определяется многими характеристиками, среди которых наиболее важными являются специфичность, растворимость, аффинность, стабильность и уровень экспрессии продуцентом. С использо� ванием подходов генной и белковой инжене� рии можно получать ScFv’s, которые с высо� кой селективностью распознают гомологичные белки или разные изоформы одного белка. В сочетании с известными методами селекции комбинаторных библиотек кДНК in vitro, та� кими как фаговый дисплей или дисплей рибо� сом, возможен направленный отбор ScFv’s против конкретной антигенной детерминан� ты, что очень важно для определения характе� ристик биомолекул, а также для получения антител диагностического и терапевтического назначения [1, 4]. В большинстве случаев при селекции ком� бинаторных библиотек кДНК основной це� лью является получение ScFv’s с высокими показателями аффинности, специфичности и стабильности, особенно когда планируется их дальнейшее применение in vivo [1, 3]. В слу� чае необходимости распознания нескольких эпитопов одного антигена или разных эпито� пов пространственно сближенных антигенов повышение аффинности достигается констру� ированием мультивалентных форм рекомби� нантных антител, которые имеют в своем сос� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 3 © М.В. ПАВЛОВА, Ю.С. НИКОЛАЕВ, Д.М. ИРОДОВ, О.В. ОКУНЕВ, В.А. КОРДЮМ, П.В. ГИЛЬЧУК, 2008 таве одинаковые (миниантитела) или разные (гетероантитела) антиген�связывающие цент� ры [5]. В ряде случаев возникает необходи� мость получения ScFv’s, которые специфично распознают разные эпитопы или конформа� ционные состояния целевого антигена, а так� же характеризуются высокой стабильностью и разными характеристиками связывания. Это позволяет значительно расширить потенциал использования ScFv’s – от хроматографичес� кой очистки целевого антигена до его эффек� тивной инактивации in vivo (в случае вирусных или опухолевых антигенов). Однако необходимо учитывать возмож� ность эффективного продуцирования полу� ченных ScFv’s в клетках прокариотов, что оп� ределяется особенностями их первичной струк� туры [3]. С учетом этого важным этапом явля� ется получение из комбинаторной библиотеки панели ScFv’s против заданного антигена с целью дальнейшего обора кандидатов моле� кул, которые отвечают всем необходимым требованиям. Рекомбинантный интерферон β1b челове� ка – это аналог природного цитокина, одоб� ренный FDA (Food and Drug Administration, США) для лечения рассеянного склероза, ви� русных заболеваний [6] и терапии некоторых форм рака [7]. Получение панели высокоспе� цифических ScFv’s против rhIFN�β1b являет� ся актуальным как для исследования свойств упомянутого антигена, так и для мониторинга его концентрации in vivo. В предыдущей работе нами была создана и охарактеризована комбинаторная библиотека кДНК V�генов иммуноглобулинов мышей, иммунизированных rhIFN�β1b [8]. Настоящая работа посвящена получению панели ScFv’s против rhIFN�β1b из иммунной и неиммун� ной библиотек кДНК и определению их ха� рактеристик. Материалы и методы. Для получения ScFv’s против rhIFN�β1b использовали созданную ранее иммунную библиотеку кДНК V�генов иммуноглобулинов мыши [8], а также неим� мунную библиотеку, любезно предоставленную для исследований А. Ламаном (Пущинский на� учный центр, РФ). Рекомбинантный интер� ферон β1b, а также лизат клеток – продуцен� тов rhIFN�β1b получали на ПНДК «Фарм� Биотек» (г. Киев). В работе использовали фаг� хелпер М13К07, штаммы E. coli TG1 и E. coli HB2151 из набора реактивов «Expression Mo� dule Recombinant Phage Antibody System» («GE Healthcare», США). Для экспрессии клониро� ванных генов использовали фагмиду pCANTAB 5E и pHEN�1. В процедурах молекулярного клонирования применяли ферменты произ� водства «Fermentas» (Литва). Манипуляции с ДНК проводили соответственно стандарт� ным методам [9]. Для анализа блотов и статис� тической обработки полученных результатов использовали программы TotalLab 2.00 и OriginPro 7.0. Аффинная селекция неиммунной библиотеки кДНК V�генов мыши. Для отбора ScFv’s против rhIFN�β1b из неиммунной библиотеки ис� пользовали четыре схемы. В схемах I–III rhIFN�β1b (20 мкг/мл) иммобилизировали в лунках полистиролового планшета для ELISA («Nunc», Дания) и инкубировали 14 ч при 4 °С. Схема селекции IV состояла в том, что rhIFN� β1b был представлен для связывания с фагами через иммобилизированные поликлональные антитела против rhIFN�β1b («Sigma», США). После блокирования мест неспецифического связывания фосфатно�солевым буфером (PBS), который содержал 0,1 % твина 20 (PBSТ), в лунку вносили амплифицированные реком� бинантные фаги (1011 сfu) в буфере PBSТ и ин� кубировали 2 ч при 37 °С. Элюирование спе� цифически связавшихся фагов проводили разными способами. В схеме I для элюирова� ния использовали 0,1 М триэтаноламин, II – поликлональные антитела против rhIFN�β1b, для схем III и IV – rhIFN�β1b в концентрации 50 мкг/мл. Полученные фаги амплифицировали в E. coli штамма TG1 и использовали для последу� ющих четырех циклов селекции по схеме, приведенной ранее. Эффективность аффинного обогащения библиотеки определяли методом иммуноблот� тинга реплик колоний. Иммуноблоттинг реплик колоний. Получен� ными после аффинной селекции фагами ин� фицировали клетки E. coli штамма TG1, кото� рые высевали на агаризованную среду 2YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 2 % глюкозы (2YTAG). Иммунохимический скри� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 44 М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук нинг клонов проводили с использованием ме� тода, описанного нами в предыдущей работе [8]. В качестве первичных использовали моно� клональные антитела Anti�C�myc 9Е10 («Sig� ma»). Образовавшиеся иммунные комплексы проявляли вторичными антителами, конъюги� рованными с пероксидазой хрена – HRP/Anti Mouse conjugate («ИМТЕК», РФ), как хромо� генный субстрат использовали 4�хлоро�1� нафтол («Sigma»). Клонирование ScFv�ДНК в pCANTAB 5E. Пул фагмид, полученный после аффинной селекции неиммунной библиотеки, использо� вали как матрицу для проведения полиме� разной цепной реакции (ПЦР) с праймерами RS Primer Mix из набора реактивов «Mouse Module Recombinant Phage Antibody System» («GE Healthcare»). Полученную ScFv�ДНК (~750 п.н.) гидролизировали рестриктазами SfiI и NotI, лигировали с вектором pCANTAB 5E и использовали для трансформации E. coli штамма TG1. Экспрессия ScFv’s в E. coli. Изолированные из иммунной и неиммунной библиотек клоны E. coli, продуцирующие специфические ScFv’s против rhIFN�β1b, наращивали при 30 °С в 2–50 мл до А600 = 0,8. Индукцию экспрессии проводили внесением ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. Ферментацию ScFv’s осуществляли в условиях интенсивной аэра� ции при 30 °С в течение 2–12 ч. После индук� ции клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 4000 g), отбирали супернатант и по� лучали фракции периплазмы для дальнейшего анализа в ELISA. Секвенирование ДНК. Нуклеотидную после� довательность ScFv’s определяли методом Сенгера с использованием автоматического секвенатора IBI Prism 3130 («Applied Biosys� tems», США). ScFv�ДНК получали с помощью ПЦР с использованием праймеров pCANTAB� R1 5'�d [CCATGATTACGCCAAGCTTTGGA GCC]�3', pCANTAB�R2 5'�d [CGATCTAAAG TTTTGTCGTCTTTCC]�3' и рекомбинантных фагмид отобранных позитивных клонов как матрицы. Для секвенирования полученных ПЦР�продуктов (~1000 п.н.) использовали следующие праймеры pCANTAB 5�S3: 5'�d [GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGG]�3'; pCANTAB 5�S4: 5'�d [CCAGAGCCACCTCCG CCTGAACC]�3', pCANTAB 5�S1: 5'�d [CAACG TGAAAAAATTATTATTCGC]�3'; pCANTAB 5� S6: 5'�d [GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG]�3'. Для обработки и интерпретации результатов секвенирования использовали программу «Vector NTI» (Invitrogen). Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вариа� бельных доменов проводили с помощью элект� ронного ресурса IgBLAST Национального цен� тра биотехнологической информации (NCBI). Исследование связывания ScFv’s с rhIFN�β1b. 1) ELISA. В лунках полистиролового план� шета для ELISA («Titertek», США) иммобили� зировали rhIFN�β1b (10 мкг/мл). Буфером PBSТ последовательно разводили пробы ScFv’s, которые после блокирования мест неспеци� фического связывания вносили в соответству� ющие лунки и инкубировали 1 ч при 37 °С. Лунки промывали PBSТ и PBS, после чего проводили инкубацию с моноклональными антителами Аnti�E�tag Antibody («GE Health� care») в течение 1 ч при 37 °С. Образовавшие� ся иммунные комплексы проявляли вторич� ными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP/Anti Mouse conju� gate, «ИМТЕК»), как хромогенный субстрат использовали ТМВ («Sigma»). После развития окраски реакцию останавливали внесением 1 М серной кислоты и измеряли величину ад� сорбции А450 на многоканальном фотометре Multiscan MCC/340 («Titertek», США). 2) Вестерн�блоттинг. Лизат клеток проду� цента rhIFN�β1b после разделения в 15%�ном полиакриламидном геле с 0,1 % додецилсуль� фата натрия (ДСН�ПААГ) переносили на по� верхность нитроцеллюлозной мембраны Hy� bound�C Extra («GE Healthcare»). Места не� специфического связывания белков блокиро� вали буфером PBS, содержащим 0,3 % сухого обезжиренного молока (PBSМ). Мембрану промывали буфером PBSТ, после чего в тече� ние 1 ч инкубировали с разведенным в буфере PBSМ экстрактом периплазмы соответствую� щего продуцента ScFv’s. Мембрану промыва� ли PBSТ и обрабатывали с использованием описанной системы иммунореагентов. Обра� зовавшиеся иммунные комплексы визуализи� ровали с помощью метода ECL с использова� нием рентгеновской пленки производства «AGFA» (Германия). ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 5 Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона Определение уровня продукции ScFv’s. Пери� плазматические экстракты, а также белки из культуральной среды продуцентов ScFv’s раз� деляли в 15%�ном ДСН�ПААГ и переносили на поверхность нитроцеллюлозной мембраны для вестерн�блоттинга. Проявку мембраны осуществляли с использованием описанной системы иммунореагентов. Для количествен� ного определения уровня продукции целевых белков использовали ScFv’s с известной кон� центрацией. Полученные блоты сканировали и обсчитывали с использованием программы TotalLab 2.00. Константу аффинности ScFv’s определяли с помощью метода конкурентного ELISA, описанного в работе [10]. Результаты исследований и их обсуждение. В предыдущей работе нами описано создание и определение характеристик иммунной комби� наторной библиотеки кДНК V�генов мыши, с которой после аффинной селекции было изо� лировано ~30 продуцентов специфических к rhIFN�β1b ScFv’s [8]. Также было показано, что полученные ScFv’s специфически связываются в ELISA с rhIFN�β1b и не распознают rhIFN� α2b, который является структурно и функцио� нально подобным белком [11]. Однако неожи� данным результатом стало то, что для всех полученных методом ПДРФ�анализа ScFv’s было показано отсутствие гетерогенности их ДНК�последовательностей [8], что могло бы свидетельствовать про амплификацию од� ного клона во время селекции библиотеки. В то же время определенные ранее характеристи� ки этой иммунной библиотеки, в частности, ее размер и высокое исходное разнообразие ScFv�ДНК, позволяли надеяться на получение панели ScFv’s против rhIFN�β1b. Секвенирова� ние ДНК нескольких десятков ScFv’s представ� ляет собой достаточно рутинную процедуру, по� этому для выявления ожидаемого разнообразия полученных ScFv’s нами был использован сле� дующий поход. Для 12 случайно отобранных позитивных клонов E. coli с использованием метода вестерн�блоттинга были определены та� кие характеристики, как стабильность экспрес� сии, уровень продукции, а также динамика на� копления ScFv’s после индукции экспрессии ИПТГ. Стабильность экспрессии ScFv’s опре� деляли путем многоразовых пересевов клонов� продуцентов с единичной колонии на агаризо� ванной среде 2YTAG. После каждого пересева в клонах индуцировали экспрессию и определя� ли уровни продукции ScFv’s в бактериальной периплазме и культуральной среде. Стабильная экспрессия ScFv’s была показана всеми про� анализированными продуцентами как минимум в течение четырех пассажей. Для всех 12 проду� центов также определены уровни накопления целевых ScFv’s в периплазме (0,6–3,5 мг/л E. сoli) и культуральной среде (0,6–2,5 мг/л E. сoli) для вышеописанных условий ферментации (рис. 1). По результатам вестерн�блоттинга по� лученные продуценты по общему уровню син� теза ScFv’s условно можно разделить на не� сколько групп: клоны с низким уровнем накопления ScFv’s и тенденцией секреции в среду для культивирования (4#, 8#), клоны с высоким (1#, 2#, 3#, 5#, 6#, 9#, 10#, 12#) и низким (11#) уровнями продукции ScFv’s и их накоплением преимущественно в периплаз� ме (рис. 1). С использованием метода вестерн�блот� тинга также была исследована динамика накоп� 6 М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 Рис. 1. Гистограмма уровней продукции специфичес� ких к rhIFN�β1b ScFv’s в E. coli. Пробы периплазмати� ческих экстрактов и культуральных сред разных проду� центов после 3 ч индукции экспрессии разделены в 15%�ном ДСН�ПААГ, перенесены на нитроцеллю� лозную мембрану и проявлены с использованием мо� ноклональных Anti�E�tag антител и системы реаген� тов, описанных в разделе «Материалы и методы». Иммуноблоты обсчитаны с использованием програм� мы TotalLab 2.00. M ± m, n = 4; по вертикали – ScFv’s, мг/л; по горизонтали – продуцент ScFv’s. –пери� плазма, – культуральная среда ления ScFv’s разными клонами в течение 12 ч после начала индукции экспрессии. Показано, что уже на 4�м или 6�м часе в периплазме на� капливается максимальное для упомянутого клона количество ScFv’s, однако после 12 ч ферментации для некоторых клонов наблюда� лось значительное снижение количества (1#, 4#, 6#, 7#, 9#) или отсутствие (8#, 11#) про� дукта необходимого размера (30 кДа). Послед� нее сопровождалось появлением фрагмента меньшего размера (~14 кДа) и свидетельство� вало о частичной или полной деградации ScFv’s во время продолжительного культиви� рования клонов в выбранных условиях (см. «Материалы и методы»). При этом полная де� градация ScFv’s наблюдалась только для кло� нов с низкими уровнями экспрессии (рис. 2). Из литературы известно, что определяющим фактором, который влияет на секрецию и уровень накопления ScFv’s в E. coli, является их первичная структура [3]. Поэтому наличие нескольких разных групп продуцентов, в ко� торых ScFv’s стабильно продуцируются на оп� ределенном уровне, позволило сделать пред� положение о разнообразии выделенных из иммунной библиотеки кДНК и о перспективе получения панели ScFv’s против rhIFN�β1b. Для подтверждения этого предположения все проанализированные последовательности бы� ли секвенированы. Среди трех групп клонов с разными уровнями продукции ScFv’s были выявлены четыре варианта ScFv�ДНК, кото� рые кодируют разные полипептидные продук� ты – 1#, 2#, 4#, 11#. После проведения структурного анализа по� липептидных последовательностей получен� ных ScFv’s были показаны существенные от� личия в аминокислотном составе как для антиген�связывающих (CDR), так и для кар� касных (FR) участков их вариабельных доме� нов (результаты не представлены). Следующим заданием было изолирование специфических к rhIFN�β1b ScFv’s из неим� мунной библиотеки кДНК V�генов мыши представленностью ~108 независимых клонов. Работа с неиммунной библиотекой имеет ряд преимуществ, среди которых – отсутствие этапа иммунизации животных и возможность использования одной библиотеки для получе� ния ScFv’s против разных антигенов (при условии ее достаточного размера и разнообра� зия) [12]. В то же время изолированные из не� иммунной библиотеки ScFv’s могут иметь зна� чительно более низкие показатели аффинности и стабильности по сравнению с ScFv’s из им� мунной библиотеки, что часто делает невоз� можным их дальнейшее практическое при� менение. Разработка адекватной схемы селекции не� иммунной библиотеки является важным эта� пом, который в дальнейшем будет определять качество полученных ScFv’s. В настоящей ра� боте для селекции неиммунной библиотеки использовали несколько разных схем (см. «Ма� териалы и методы»), которые вместе с методом фагового дисплея обеспечили изолирование клонов E. coli, продуцирующих ScFv’s против rhIFN�β1b. Однако наиболее заметное обога� щение библиотеки было достигнуто только в случае использования схемы, предусматри� вающей экспонирование rhIFN�β1b через им� мобилизированные поликлональные антитела и конкурентную элюцию специфично связав� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 7 Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона Рис. 2. Динамика накопления специфических к rhIFN� β1b ScFv’s в E. coli. Периплазматические экстракты продуцентов ScFv’s, в которых индуцировали эксп� рессию в течение 2–12 ч (по горизонтали), были раз� делены в 15%�ном ДСН�ПААГ и проанализированы методом вестерн�блоттинга с использованием моно� клональных Anti�E�tag антител. Стрелками обозначе� но положение продукта деградации (~14 кДа), # – но� мер клона�продуцента ScFv’s. Приведены типичные данные трех независимых экспериментов шихся рекомбинантных фагов при помощи rhIFN�β1b (результаты не представлены). Следует отметить, что конструкция вектора pHEN�1, использованного для клонирования при создании неиммунной библиотеки, преду� сматривает экспрессию ScFv’s с С�концевой последовательностью аффинной метки С�myc. Для детекции таких ScFv’s используются Аnti� С�myc моноклональные антитела 9Е10, кото� рые менее чувствительны, чем Anti�E�tag мо� ноклональные антитела, которые применя� лись нами для детекции ScFv’s в иммунной библиотеке. Поэтому, чтобы упростить дальнейший анализ, пул ScFv�ДНК, полученный из неим� мунной библиотеки после ее обогащения по наиболее эффективной схеме, был перекло� нирован в вектор pCANTAB 5E. Последний предусматривает экспрессию ScFv’s с С�кон� цевой последовательностью E�tag. По результатам повторного иммунохими� ческого скринирования были отобраны клоны E. coli, продуцирующие ScFv’s против rhIFN� β1b. Для нескольких позитивных клонов, отобранных для дальнейшего анализа, пока� зан низкий уровень продукции ScFv’s, кото� рый составлял < 0,1 мг/л E. сoli, и существен� ный лизис клеток�продуцентов после индук� ции экспрессии в течение 3 ч (результаты не представлены). Показано также, что изолированные из не� иммунной библиотеки ScFv’s имеют низкую активность связывания с rhIFN�β1b в ELISA. Учитывая это, в дальнейшем мы сосредоточи� ли наше внимание на панели ScFv’s против rhIFN�β1b, изолированных из иммунной биб� лиотеки. Методом непрямого ELISA исследовано связывание разных разведений ScFv’s с натив� ным rhIFN�β1b. В качестве источника ScFv’s использовали фракцию периплазмы клеток� продуцентов после индукции экспрессии, в 8 М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 Рис. 3. Кривые связывания ScFv’s с иммобилизирован� ным rhIFN�β1b в ELISA: 1, 2, 4, 11 – представители по� лученной из иммунной библиотеки панели ScFv’s. Для детектирования иммунных комплексов использовали моноклональные Anti�E�tag антитела и систему реаген� тов, описанную в разделе «Материалы и методы». M ± ± m, n = 3; по вертикали – А450; по горизонтали – ScFv’s, нг/мл Рис. 4. Электрофореграмма тотального лизата клеток�продуцентов rhIFN�β1b (б) и иммунноблот (а), проявленный с использованием ScFv’s. Лизат бактериальных клеток�продуцентов rhIFN�β1b был разделен в 15%�ном ДСН� ПААГ, перенесен на нитроцеллюлозную мембрану и проявлен с использованием периплазматических экстрактов соответствующих продуцентов ScFv’s. Концентрация ScFv’s в каждом случае составляла 560 нг/мл. Образовавшие� ся иммунные комплексы визуализировали с использованием метода ECL и рентгеновской пленки «AGFA», время экспозиции 30 с; 1, 2, 4, 11 – представители полученной панели ScFv’s. Обозначено количество rhIFN�β1b, нанесен� ное на дорожку. Стрелками обозначено положение мономерной (~18 кДа) и димерной (~36 кДа) форм rhIFN�β1b. Приведены типичные данные трех независимых экспериментов которой методом вестерн�блоттинга предва� рительно определяли концентрацию целевого белка. Для всех представителей панели была показана высокая антиген�связывающая ак� тивность, которая оказалась несколько более низкой для ScFv’s клона 4# (рис. 3). Минимальная концентрация ScFv’s, при которой наблюдался достоверный сигнал в ELISA при применении описанной системы реагентов (см. «Материалы и методы»), сос� тавляла от 3,91 до 7,81 нг/мл. Кроме того, ScFv’s не теряли иммунологической актив� ности при долгосрочном хранении периплаз� матических экстрактов в виде замороженных стоков (t = –20 °С), что свидетельствует об их высокой стабильности. Связывание полученных ScFv’s с денатури� рованным rhIFN�β1b анализировали методом вестерн�блоттинга. Для этого белки тотально� го лизата клеток�продуцентов rhIFN�β1b разде� ляли в ДСН�ПААГ и переносили на нитроцел� люлозную мембрану. Для выявления rhIFN�β1b использовали разведенные периплазматичес� кие экстракты соответствующих продуцентов, концентрация ScFv’s в которых составляла 560 нг/мл. Показано, что ScFv’s клонов 1# и 4# способ� ны выявлять rhIFN�β1b в количестве, меньшем чем 1,5 нг в случае использования описан� ной системы реагентов для проявки блотов (рис. 4). Кроме того обнаружено, что все полу� ченные ScFv’s также связывались с белком 36 кДа, который, как было позднее показано с использованием специфических поликло� нальных антител, является димерной формой rhIFN�β1b. Интересным фактом оказалась разница в чувствительности представителей полученной панели ScFv’s по отношению к нативному и де� натурированному rhIFN�β1b. Так, ScFv’s кло� нов 2# и 11# в одинаковой концентрации не выявляли 1,56 нг денатурированного rhIFN� β1b, хотя с более высокой активностью (по от� ношению к другим представителям панели) связывались с rhIFN�β1b в ELISA (рис. 3). ScFv’s клона 4# проявили самую низкую анти� ген�связывающую активность в ELISA, но с бо� лее высокой относительно других ScFv’s чувст� вительностью распознавали денатурированный rhIFN�β1b. Относительные различия в иммунологичес� кой активности представителей полученной па� нели ScFv’s к нативному и денатурированному rhIFN�β1b можно объяснить разной эпитопной специфичностью ScFv’s, однако высказанное предположение требует дальнейшего экспери� ментального подтверждения. Высокие показатели аффинности всегда являются желательной характеристикой, осо� бенно для диагностических антител [1, 3]. Для всех представителей панели ScFv’s была опре� делена Каф (рис. 5). Следует отметить, что полученный диапа� зон Каф ScFv’s (от 1,96 · 10–8 М до 1,69 · 10–9 М) достаточно узкий и не содержит другие, тео� ретически возможные при работе с иммунны� ми библиотеками, показатели аффинности. Такие результаты можно объяснить как осо� бенностями использованной нами системы дисплея ScFv’s, так и специфичностью выб� ранного нами метода селекции фаговой биб� лиотеки. Так, данная система дисплея не является моновалентной, поскольку при экспрессии на поверхности фага могут экспонироваться от одной до пяти копий ScFv’s [13]. Это очень усложняет отбор ScFv’s по показателям аф� финности и может привести к потере высоко� аффинных ScFv’s в случае использования не� достаточно жестких условий элюирования на этапе селекции фаговой библиотеки. В то же время отсутствие ScFv’s с низкими Каф мо� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 9 Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона Рис. 5. Сравнение констант аффинности представите� лей полученной панели ScFv’s (по горизонтали); по вертикали – Каф · 10–8, М жет быть результатом потери их в случае преоб� ладающего связывания с антигеном высоко� аффинных представителей на этапе селекции фаговой библиотеки. Это в значительной сте� пени зависит как от соотношения разных ScFv’s в исходной библиотеке, так и от кон� центрации антигена при проведении ее аф� финной селекции [3]. Выводы. Получена панель ScFv’s против rhIFN�β1b с высокими показателями специ� фичности, аффинности и стабильности при хранении. Показана стабильная продукция ScFv’s в E. coli и определены уровни их экспрессии. По� лученные результаты свидетельствуют о перс� пективности использования данных ScFv’s с диагностическими целями для иммунохи� мического обнаружения rhIFN�β1b с высокой чувствительностью. Авторы работы выражают благодарность А. Ламану за предоставленную для исследований неиммунную библиотеку ScFv’s мыши, а так� же сотрудникам отдела функциональной гено� мики ИМБиГ НАН Украины за секвенирование ДНК. M.V. Pavlova, I.S. Nikolaiev, D.M. Irodov, O.V. Okunev, V.A. Kordium, P.V. Gilchuk CHARACTERIZATION OF A PANEL OF MOUSE SINGLE�CHAIN ANTIBODIES AGAINST RECOMBINANT HUMAN INTERFERON β1b A panel of single�chain antibodies (ScFv’s – single� chain Fv�antibodies) against recombinant human interfer� on beta 1b (rhIFN�β1b) has been obtained from immune and naїve combinatorial cDNA libraries of the mouse vari� able immunoglobulin genes. ScFv’s were expressed into Escherichia coli cells. For producers isolated from the immune library a difference in production yield of ScFv’s in periplasm and incubation medium as well as their expres� sion stability in passages and storage stability have been demonstrated. After sequencing of target DNA the multiple alignment and structural analysis of ScFv’s sequences with different primary structures were carried out and significant difference in both complementarity�determining (CDR) and framework (FR) regions of their variable domains has been shown. For the ScFv’s isolated from the immune library, specificity of their binding with native and denatured rhIFN�β1b in ELISA and Western�blotting as well as their high storage stability have been shown. The affinity con� stants for each representatives of the ScFv’s panel were in the range from 1.96 · 10–8 to 1.69 ·10–9 M. М.В. Павлова, Ю.С. Ніколаєв, Д.М. Іродов, О.В. Окунєв, В.А. Кордюм, П.В. Гільчук ХАРАКТЕРИСТИКА ПАНЕЛІ ОДНОЛАНЦЮГОВИХ АНТИТІЛ МИШІ ПРОТИ РЕКОМБІНАНТНОГО ІНТЕРФЕРОНУ β1b ЛЮДИНИ З імунної та неімунної комбінаторних бібліотек кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші одержа� но панель одноланцюгових антитіл (ScFv’s – single� chain Fv�antibodies) проти рекомбінантного інтерферо� ну β1b людини (rhIFN�β1b), які експресовано в клі� тинах Escherichia coli. Для ізольованих з імунної бібліо� теки продуцентів показано різницю у рівнях продукції ScFv’s до периплазми та середовища культивування, а також стабільність експресії при пересівах та зберіганні. Після секвенування цільової ДНК проведено множин� не вирівнювання та структурний аналіз послідовностей ScFv’s з різною первинною структурою, в результаті чо� го було виявлено істотні відмінності як у антиген� зв’язувальних (CDR), так і у каркасних (FR) ділянках їхніх варіабельних доменів. Методиками ELISA та вес� терн�блотингу показано специфічність взаємодії одер� жаних з імунної бібліотеки ScFv’s як з нативним, так і денатурованим rhIFN�β1b, а також їхню стабільність при зберіганні. Для кожного представника панелі ScFv’s встановлено константи афінності, які знаходились у діапазоні від 1,96 · 10–8 до 1,69 · 10–9 М. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Moroney S., Pluckthun A. Modern antibody technolo� gy : The impact on drug development // Modern Bio� pharmaceuticals / Ed. J. Knablein. – Weinheim : Wi� ley�VCH Verlag GmbH and Co. KgaA, 2005. – 4. – P. 1147–1186. 2. Filpula D. Antibody engineering and modification tech� nologies // Biomol. Eng. – 2007. – 24, № 2. – P. 201– 215. 3. Bradbury A., Marks J.D. Antibodies from Phage antibo� dy libraries // J. Immun. Meth. – 2004. – 290. – P. 29– 49. 4. Parsons H.L., Earnshaw J.C., Wilton J. Johnson K.S., Schueler P.A., Mahoney W., McCafferty J. Directing phage selections towards specific epitopes // Protein Eng. – 1996. – 9, № 11. – P. 1043–1049. 5. Holliger P., Hudson P.J. Engineering antibody frag� ments and the rise of single domains // Nature Biotech. – 2005. – 23, № 9. – P. 1126–1136. 6. Tyring S.K. Interferons: biochemistry and mechanisms of action // Amer. J. Obstet. Gynecol. – 1995. – 172. – P. 1350–1353. 7. Damdinsuren B., Nagano H., Wada H., Kondo M., Ota H., Nakamura M., Noda T., Natsag J., Yamamoto H., Do� ki Y., Umeshita K., Dono K., Nakamori S., Sakon M., Monden M. Stronger growth�inhibitory effect of inter� 10 М.В. Павлова, Ю.С. Николаев, Д.М. Иродов, О.В. Окунев, В.А. Кордюм, П.В. Гильчук ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 feron (IFN)�beta compared to IFN�alpha is mediated by IFN signaling pathway in hepatocellular carcinoma cells // Int. J. Oncol. – 2007. – 30, № 1. – P. 201– 208. 8. Павлова М.В., Гільчук П.В., Похоленко Я.О., Нікола� єв Ю.С., Кордюм В.А. Cтворення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіа� бельних генів імуноглобулінів миші // Цитология и генетика. – 2008. – 42, № 2. – С. 10–15. 9. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. – Cold Spring Harbor Laboratory (Second edition). – 1989. – vol. 1. 10. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi�Ohaniance L., Goldberg M.E. Measurements of the true affinity con� stant in solution of antigen�antibody complexes by enzyme�linked immunosorbent assay // J. Immun. Meth. – 1985. – 77, № 2. – P. 305–319. 11. Karpusas M., Whitty A., Runkel L., Hochman P. The structure of human interferon�beta: implications for activity // Cell. Mol. Life. Sci. – 1998. – 54, № 11. – Р. 1203–1216. 12. Sheets M.D., Amersdorfer P., Finnern R., Sargent P., Lindquist E., Schier R., Hemingsen G., Wong C., Gerhart J.C., Marks J.D. Efficient construction of a large non� immune phage antibody library: the production of high�affinity human single�chain antibodies to protein antigens // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1998. – 95, № 11. – P. 6157–6162. 13. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display // Chem. Rev. – 1997. – 97, № 2. – P. 391–410. Поступила 26.10.07 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 4 11 Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона

Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека

Institution

Similar Items