Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона β1b человека - Павлова, М.В.; Николаев, Ю.С.; Иродов, Д.М.; Окунев, О.В.; Кордюм, В.А.; Гильчук, П.В. (Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, 2008)
Из иммунной и неиммунной комбинаторных библиотек кДНК вариабельных генов иммуноглобулинов мыши получена панель одноцепочечных антител (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) против рекомбинантного интерферона β1b человека (rhIFN-β1b), которые были экспрессированы в клетках Escherichia coli. Для изолированных из иммунной библиотеки продуцентов показана разница в уровнях продукции ScFv’s в периплазму и среду для культивирования, а также стабильность экспрессии при пересевах и хранении. После секвенирования целевой ДНК было проведено множественное выравнивание и структурный анализ последовательностей ScFv’s с разной первичной структурой, в результате чего были выявлены существенные отличия как в антиген-связывающих (CDR), так и в каркасных (FR) участках их вариабельных доменов. Методами ELISA и вестерн-блоттинга показана специфичность взаимодействия полученных из иммунной библиотеки ScFv’s как с нативным, так и с денатурированным rhIFN-β1b, а также их стабильность при хранении. Для каждого представителя панели ScFv’s были определены константы аффинности, которые находились в диапазоне от 1,96•10^-8 до 1,69•10^- 9 М. З імунної та неімунної комбінаторних бібліотек кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші одержано панель одноланцюгових антитіл (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) проти рекомбінантного інтерферону β1b людини (rhIFN-β1b), які експресовано в клітинах Escherichia coli. Для ізольованих з імунної бібліотеки продуцентів показано різницю у рівнях продукції ScFv’s до периплазми та середовища культивування, а також стабільність експресії при пересівах та зберіганні. Після секвенування цільової ДНК проведено множин
не вирівнювання та структурний аналіз послідовностей ScFv’s з різною первинною структурою, в результаті чого було виявлено істотні відмінності як у антигензв’язувальних (CDR), так і у каркасних (FR) ділянках їхніх варіабельних доменів. Методиками ELISA та вестерн-блотингу показано специфічність взаємодії одержаних з імунної бібліотеки ScFv’s як з нативним, так і денатурованим rhIFN-β1b, а також їхню стабільність при зберіганні. Для кожного представника панелі ScFv’s встановлено константи афінності, які знаходились у діапазоні від 1,96 • 10^–8 до 1,69 • 10^–9 М. A panel of single-chain antibodies (ScFv’s – single-chain Fv-antibodies) against recombinant human interferon beta 1b (rhIFN-β1b) has been obtained from immune and naїve combinatorial cDNA libraries of the mouse variable immunoglobulin genes. ScFv’s were expressed into Escherichia coli cells. For producers isolated from the immune library a difference in production yield of ScFv’s in periplasm and incubation medium as well as their expression stability in passages and storage stability have been demonstrated. After sequencing of target DNA the multiple alignment and structural analysis of ScFv’s sequences with different primary structures were carried out and significant difference in both complementarity-determining (CDR) and framework (FR) regions of their variable domains has been shown. For the ScFv’s isolated from the immune library, specificity of their binding with native and denatured rhIFN-β1b in ELISA and Western-blotting as well as their high storage stability have been shown. The affinity constants for each representatives of the ScFv’s panel were in the range from 1.96 • 10^–8 to 1.69 • 10^–9 M.