Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам

Проведена биолистическая трансформация сои с использованием конструкции pAHTUAm, содержащей мутантный ген α-тубулина, в качестве селективного маркерного гена, обеспечивающего устойчивость к динитроанилиновым гербицидам, а также дополнительной конструкции pAHTUB1, содержащей полноразмерный ген β-тубу...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2008
Hauptverfasser:	Емец, А.И., Радчук, В.В., Пахомов, А.В., Блюм, Я.Б.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2008
Schlagworte:	Оригинальные работы
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8310
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам / А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 6. — С. 61-68. — Бібліогр.: 42 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-8310
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-83102025-02-09T13:32:26Z Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам Біолістична трансформація сої з використанням нового селективного маркерного гена стійкості до динітроанілинів Biolictic transformation of soybean by new selective marker gene conferring resistance to dinitroanilines Емец, А.И. Радчук, В.В. Пахомов, А.В. Блюм, Я.Б. Оригинальные работы Проведена биолистическая трансформация сои с использованием конструкции pAHTUAm, содержащей мутантный ген α-тубулина, в качестве селективного маркерного гена, обеспечивающего устойчивость к динитроанилиновым гербицидам, а также дополнительной конструкции pAHTUB1, содержащей полноразмерный ген β-тубулина ячменя, для корректной коэкспрессии экзогенного тубулина в клетках трансгенных линий сои. Определено, что 10 мкМ является наиболее оптимальной селективной концентрацией трифлюралина при отборе трансформированных линий сои. Трансгенная природа отобранных регенерантов подтверждена при помощи Саузерн-блоттинга с использованием специфической пробы к селективному гену α-тубулина. Здійснено біолістичну трансформацію сої з використанням конструкції pAHTUAm, що містила мутантний ген α-тубуліну, як селективний маркерний ген, що забезпечує стійкість до динітроанілінових гербіцидів, а також додаткової конструкції pAHTUB1, яка містила повнорозмірний ген β-тубуліну ячменя, для коректної коекспресії екзогенного тубуліну в клітинах трансгенних ліній сої. Встановлено, що 10 мкМ трифлюралін є найоптимальнішою селективною концентрацією при відборі трансформованих ліній сої. Трансгенну природу відібраних регенерантів підтверджено за допомогою Саузерн-блотингу з використанням специфічної проби до селективного гена α-тубуліну. Biolistic transformation of soybean by construction carrying a mutant α-tubulin gene as selective marker gene conferring resistance to dinitroaniline herbicides, and by additional construction pAHTUB1 carrying a full-length barley β-tubulin gene for correct co-expression of exogeneous tubulin in cells of transgenic soybean lines has been realized. It was established that 10 μM trifluralin is the most optimal selective concentration to pick up transformed soybean lines. Transgenic nature of offained regenerants was confirmed by Southern blotting hybridization using specific probe to selective α-tubulin gene. 2008 Article Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам / А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 6. — С. 61-68. — Бібліогр.: 42 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8310 631.523.11 ru application/pdf Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Емец, А.И. Радчук, В.В. Пахомов, А.В. Блюм, Я.Б. Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
description	Проведена биолистическая трансформация сои с использованием конструкции pAHTUAm, содержащей мутантный ген α-тубулина, в качестве селективного маркерного гена, обеспечивающего устойчивость к динитроанилиновым гербицидам, а также дополнительной конструкции pAHTUB1, содержащей полноразмерный ген β-тубулина ячменя, для корректной коэкспрессии экзогенного тубулина в клетках трансгенных линий сои. Определено, что 10 мкМ является наиболее оптимальной селективной концентрацией трифлюралина при отборе трансформированных линий сои. Трансгенная природа отобранных регенерантов подтверждена при помощи Саузерн-блоттинга с использованием специфической пробы к селективному гену α-тубулина.
format	Article
author	Емец, А.И. Радчук, В.В. Пахомов, А.В. Блюм, Я.Б.
author_facet	Емец, А.И. Радчук, В.В. Пахомов, А.В. Блюм, Я.Б.
author_sort	Емец, А.И.
title	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
title_short	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
title_full	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
title_fullStr	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
title_full_unstemmed	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
title_sort	биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/8310
citation_txt	Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам / А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42, № 6. — С. 61-68. — Бібліогр.: 42 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT emecai biolističeskaâtransformaciâsoisispolʹzovaniemnovogoselektivnogomarkernogogenaustojčivostikdinitroanilinam AT radčukvv biolističeskaâtransformaciâsoisispolʹzovaniemnovogoselektivnogomarkernogogenaustojčivostikdinitroanilinam AT pahomovav biolističeskaâtransformaciâsoisispolʹzovaniemnovogoselektivnogomarkernogogenaustojčivostikdinitroanilinam AT blûmâb biolističeskaâtransformaciâsoisispolʹzovaniemnovogoselektivnogomarkernogogenaustojčivostikdinitroanilinam AT emecai bíolístičnatransformacíâsoízvikoristannâmnovogoselektivnogomarkernogogenastíjkostídodinítroanílinív AT radčukvv bíolístičnatransformacíâsoízvikoristannâmnovogoselektivnogomarkernogogenastíjkostídodinítroanílinív AT pahomovav bíolístičnatransformacíâsoízvikoristannâmnovogoselektivnogomarkernogogenastíjkostídodinítroanílinív AT blûmâb bíolístičnatransformacíâsoízvikoristannâmnovogoselektivnogomarkernogogenastíjkostídodinítroanílinív AT emecai biolictictransformationofsoybeanbynewselectivemarkergeneconferringresistancetodinitroanilines AT radčukvv biolictictransformationofsoybeanbynewselectivemarkergeneconferringresistancetodinitroanilines AT pahomovav biolictictransformationofsoybeanbynewselectivemarkergeneconferringresistancetodinitroanilines AT blûmâb biolictictransformationofsoybeanbynewselectivemarkergeneconferringresistancetodinitroanilines
first_indexed	2025-11-26T06:07:59Z
last_indexed	2025-11-26T06:07:59Z
_version_	1849832020034715648
fulltext	УДК 631.523.11 А.И. ЕМЕЦ, В.В. РАДЧУК 1, А.В. ПАХОМОВ, Я.Б. БЛЮМ Інститут клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев E�mail: alyemets@univ.kiev.ua 1 Институт генетики растений и исследований культурных растений, Гатерслебен, 06466, Германия БИОЛИСТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СОИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВОГО СЕЛЕКТИВНОГО МАРКЕРНОГО ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ К ДИНИТРОАНИЛИНАМ Проведена биолистическая трансформация сои с ис� пользованием конструкции pAHTUAm, содержащей му� тантный ген α�тубулина, в качестве селективного мар� керного гена, обеспечивающего устойчивость к динитро� анилиновым гербицидам, а также дополнительной кон� струкции pAHTUB1, содержащей полноразмерный ген β� тубулина ячменя, для корректной коэкспрессии экзогенного тубулина в клетках трансгенных линий сои. Определено, что 10 мкМ является наиболее оптимальной селектив� ной концентрацией трифлюралина при отборе транс� формированных линий сои. Трансгенная природа отоб� ранных регенерантов подтверждена при помощи Сау� зерн�блоттинга с использованием специфической пробы к селективному гену α�тубулина. Введение. На сегодняшний день для созда, ния трансгенных линий растений используется более 50 маркерных генов, перспективы ком, мерческого применения каждого из которых всесторонне изучаются с точки зрения их эф, фективности, дешевизны и безопасности [1]. Используемые селективные маркерные гены объединяют в несколько групп в зависимости от того, обеспечивает ли их использование позитивную (выживание трансформированных клеток) или негативную (гибель трансформи, рованных клеток) селекцию, а также является ли селекция зависимой от присутствия допол, нительных субстратов. Именно простота и удобство применения определили наиболее широкое распространение позитивных мар, керных генов, позволяющих осуществить се, лекцию с использованием таких агентов, как антибиотики, гербициды и другие биологи, чески активные вещества. Эффективными маркерными генами часто оказываются репортерные гены, позволяющие отбирать трансформированные клетки визуаль, но. Разработаны пути селекции, предполагаю, щие удаление маркерных генов с помощью индуцибельных промоторов, которые обеспе, чивают вырезание предусмотренных последо, вательностей [2]. Все шире применяются пози, тивные селективные маркерные гены, экс, прессия которых влияет на физиологические процессы, управляющие развитием растения [3, 4]. Однако, несмотря на такое большое коли, чество предложенных маркерных генов, в ге, нетической инженерии растений используют, ся всего лишь несколько из них. Этот выбор определяется многими факторами, в число которых входит дешевизна и простота исполь, зования селективных генов в проводимых ис, следованиях, а также необходимость исключе, ния их побочных эффектов. Хотя до сих пор не показано никаких негативных эффектов от используемых маркерных генов устойчивости к антибиотикам с точки зрения биобезопаснос, ти, существующие опасения в обществе уже оп, редели их полный запрет в странах ЕС с 1,го января 2009 г. (Директива ЕС 2001.18.ЕС). Испытание и внедрение новых маркерных генов, несущих генетическую информацию исключительно растительного происхожде, ния, составляет потенциально значимый прак, тический интерес для решения насущных ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 6 61 © А.И. ЕМЕЦ, В.В. РАДЧУК, А.В. ПАХОМОВ, Я.Б. БЛЮМ, 2008 проблем генетической инженерии растений. Подобная задача может быть решена за счет использования в качестве маркерного гена ка, кого,либо из генов конститутивных белков клетки, способного подвергаться регуляции со стороны соответствующего селективного аген, та. Этим условиям соответствует тубулин, формирующий микротрубочки как неотъемле, мый структурный компонент цитоскелета лю, бой эукариотической клетки [5]. Именно об, наружение природных биотипов растений с мутантным тубулином, обладающим устойчи, востью к антимикротрубочковым гербицидам, а также селекция аналогичных мутантов in vitro [5, 6] открыли возможность использова, ния аналогичного подхода в генетической ин, женерии растений. Одна из таких попыток, направленная на использование мутантных генов тубулина в качестве селективных маркеров в генетичес, кой инженерии растений, была предпринята группой исследователей, которые разработали стратегию применения в качестве маркерного признака устойчивость тубулина к фенилкар, баматам, в частности, к этил,N,фенилкарбама, ту, ЭФК [7]. Эта разработка предполагала ис, пользование микротрубочковых мутантов риса, устойчивых к ЭФК [8], где в качестве источ, ника селективного гена планировалось взять мутантный ген α,тубулина, который способен кодировать молекулу этого белка, лишенную C,концевой части [9]. Однако в силу недоста, точных доказательств существования такого механизма устойчивости к ЭФК и связанных с этим технологических сложностей в осущест, влении практической разработки этот подход не получил должного развития. Параллельно нами был описан подход для использования мутантного гена тубулина, оп, ределяющего устойчивость к динитроанилинам (в частности, к трифлюралину, пендиметалину и оризалину), а также к фосфоротиоамидатам (таким как амипрофосметил, АПМ), в качестве нового маркерного гена для селекции трансген, ных растений [10, 11]. Необходимо отметить, что эти соединения характеризуются очень вы, соким сродством к растительным тубулинам по сравнению с тубулинами животных, которые проявляют к ним крайне низкую чувствитель, ность [12]. Разработанный подход был успеш, но апробирован при получении трансгенных растений льна, в результате чего мутантный ген α,тубулина был использован не только в ка, честве маркерной селективной системы, но и обеспечил высокую степень резистентности трансгенных растений к динитроанилинам [11]. В связи с растущим интересом к широко, масштабному культивированию трансгенных сортов сои в разных странах мира, начало ко, торому было положено успешным введением на рынок биотехнологической компанией «Монсанто» (США) в 1996 г. генетически мо, дифицированной сои, устойчивой к гербици, ду глифосату [13], значительную актуальность приобретает возможность использования сов, ременных биотехнологических подходов для улучшения хозяйственно ценных характерис, тик сортов сои как зарубежной, так и отечест, венной селекции [14, 15]. Поскольку для трансформации сои геном устойчивости к глифосату («Раундап») – енолпируватшики, матфосфатсинтетазы из почвенной бактерии Agrobacterium – были применены простые и ставшие уже классическими подходы для се, лекции трансгенных растений in vitro, попытки создания и усовершенствования генных мар, керных систем для получения трансгенных ли, ний сои интенсивно развиваются [4, 16–18]. Это связано с тем, что в случае трансформа, ции сои невозможно использовать для селек, ции трансгенных линий ген фосфоманнозо, изомеразы pmi из Escherichia coli, который получил недавно распостранение как практи, чески идеальный альтернативный селективный маркер для трансформации как однодольных, так и двудольных растений, в том числе льна [19], риса [20], пшеницы и кукурузы [21]. Как известно, манноза является токсичной для рас, тительных клеток, ибо способна конвертиро, ваться в них до маннозо,6,фосфата – ингиби, тора гликолиза, а многие растения не содержат фосфоманнозоизомеразы, которая превраща, ет маннозо,6,фосфат в фруктозо,6,фосфат (интермедиатный продукт гликолиза). Однако бобовые, и во том числе соя, обладают фосфо, маннозоизомеразной активностью, поэтому данный селективный ген для этих растений неприменим [22]. Несмотря на успех применения генетичес, ки модифицированной сои с устойчивостью к ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 662 А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм глифосату, существуют несколько других классов гербицидов, широко используемых в сельском хозяйстве, к которым соя чувстви, тельна. Одним из таких классов гербицидов, нарушающих митоз, являются динитроанили, ны. К ним относятся такие известные соеди, нения, как трифлюралин (трефлан, нитран), которым в больших масштабах обрабатывают хлопчатник, сою, подсолнух, капусту, томаты и другие культуры, а также его аналоги – пен, даметалин (стомп, проул), нитралин и ориза, лин [23, 24]. Использование генов устойчивос, ти к таким гербицидам может дать воз, можность не только внедрения новых селек, тивных маркерных систем, но и привести в случае их успешного применения к оптими, зации условий выращивания и удешевлению производства сои. Целью настоящей работы было создание векторных конструкций, содержащих мутант, ный ген α,тубулина TuAm1 из природного ди, нитроанилин,устойчивого биотипа растения Eleusine indica, и изучение возможности ис, пользования этого гена в качестве маркерного для селекции трансгенных растений сои после биолистической трансформации. Материалы и методы. Конструкции для трансформации. Для биолистической транс, формации растений были созданы две конст, рукции – pAHTUAm и pAHTUB1 (рис. 1). Конструкция pAHTUAm содержала кДНК му, тантного гена α,тубулина (TUAm1) гусиной травы [25] под контролем убихитинового про, мотора кукурузы и терминатора нопалинсин, тетазы (NOS). Для создания конструкции ген TUAm1 был вырезан с помощью частичного переваривания с использованием эндонуклеаз EcoRI и SacI и в дальнейшем клонирован в те же рестрикционные сайты между промотором и терминатором в векторе pAHC25 [26]. Для создания конструкции pAHTUB1 ген β,тубу, лина 1 (HvTUB1) из ячменя [27] был амплифи, цирован с помощью полимеразной цепной реак, ции с использованием праймеров 5',TCG, CCCGGGATGAGGGAGATCCTGCAC,3' (подчеркнут встроенный сайт рестрикции для эндонуклеазы SmaI) и 5',CACACAGACCTCC, GAGCTCTTACATG,3' (подчеркнут сайт ре, стрикции для SacI) и клонирован в вектор pAHC25 между убихитиновым промотором и nos,терминатором по рестрикционным сай, там SmаI/SacI. Обе конструкции дополнитель, но содержали ген bar также под убихитиновым промотором и nos,терминатором. Правиль, ность клонирования была проверена с помо, щью рестрикционного анализа и сиквенирова, нием. Обе конструкции были использованы для котрансформации эксплантов сои в оди, наковой концентрации, поскольку, как было показано ранее [28], только трансгенные расте, ния, экспрессирующие обе субъединицы эк, зогенного тубулина, могут быть жизнеспособ, ными. Растительный материал. В качестве расти, тельного материала использовали каллус высо, коэмбриогенного сорта сои Киевская,91, кото, рый индуцировали из незрелых зародышей и выращивали на соответствующих средах [14]. Определение селективной концентрации три� флюралина. Был проведен анализ чувствитель, ности клеток каллуса сои к действию трифлю, ралина («DowElanco», США) с целью определе, ния селективной концентрации вещества. Концентрацию трифлюралина определяли, как описано ранее [29, 30]. Тестирование кал, луса на выживаемость проводили в диапазоне концентраций трифлюралина от 0,1 до 50 мкМ. Для этого трифлюралин растворяли в диме, тилсульфоксиде (ДМСО) и добавляли его в соответствующих концентрациях в охлаж, денную стерильную питательную среду для каллусообразования сои. Генетическая трансформация сои. Биолис, тическую трансформацию каллуса осуществ, ляли согласно методу [31] с некоторыми мо, дификациями. По 2 мкг ДНК конструкций pAHTUAm и pAHTUB1 добавяли к смеси, со, держащей 25 мкл 2,5 M CaCl2 и 10 мкл 0,1 M спермидина, затем осаждали на вольфрамовых микрочастичках, которые промывали в этаноле и подсушивали на фильтре на протяжении 10 мин. Каллусные экспланты размером 2–3 см размещали по центру чашки Петри, содержа, щей осмотическую среду [31], на 4 ч до и на 16 ч после бомбардирования. Биолистическую трансформацию каллуса сои осуществляли с использованием следующих параметров: дав, ление гелия – 0,7 MПа, уровень вакуума – 0,9 бар, дистанция полета микрочастиц – 7 см. Для эксперимента было взято 100 каллусных ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 6 63 Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного эксплантов. Спустя неделю после бомбардиро, вания экспланты переносили на соответству, ющую питательную среду [14], которая содер, жала селективную концентрацию трифлюра, лина, для селекции трансгенных линий сои. Молекулярно�генетический анализ трансфор� мантов. Для блоттинг,гибридизации по Саузер, ну тотальную ДНК выделяли из молодых по, бегов регенерантов сои с помощью DNeasy Plant Mini Kit («Qiagen», Германия). Затем 5 мкг растительной ДНК трансформированных и контрольных линий обрабатывали эндонук, леазой HindIII («Roche Diagnostics», Германия) в течение ночи при 37 °С. Рестрикционные фрагменты ДНК разделяли в 1%,ном агароз, ном геле и переносили на нейлоновый фильтр Hybond,NX («Amersham», США) согласно стан, дартной процедуре [32]. Последующие гибри, дизацию, отмывку и экспозицию проводили, как описано ранее [33]. В качестве пробы ис, пользовали SacI,фрагмент гена α,тубулина (TUAm1) из вектора pAHTUAm (рис. 1), кото, рый метили 32P,dCTP с использованием Re, diprime II kit («Amersham», Великобритания). Результаты исследований и их обсуждение. В качестве эксплантов для биолистической транс, формации был использован высокоэмбриоген, ный каллус сои, индуцированный из незрелых зародышей семян. Такой подход базировался на ранее установленном и подтвержденном факте, показывающем, что успех генетической транс, формации в значительной степени зависит от ряда параметров, к числу которых относятся правильный выбор эксплантов и хорошо раз, работанный метод регенерации из них расте, ний [14, 15]. Поскольку различного рода мани, пуляции c асептическими клетками и тканями сои являются трудоемкими и нередко безре, зультатными, ранее нами были введены в культуру in vitro сорта сои, районированные в зоне украинских Лесостепи и Полесья, а также проведена оценка их эмбриогенного потенциала [14] с целью отбора наиболее перспективных генотипов для последующей генетической трансформации. У сортов Чернятка, Киевская, 27, Киевская,91, Васильковская, Марьяна, Чернобурая и Альтаир была проанализирована способность к каллусообразованию и регенера, ции растений. Установлено, что наиболее эф, фективная регенерация побегов из эмбрио, генного каллуса, полученного из незрелых семян сои, наблюдалась у сортов Киевская,91, Марьяна и Васильковская [14]. Среди этих трех генотипов был выделен и рекомендован для использования в опытах по биолистичес, кой трансформации сорт Киевская,91, по, скольку для него были отмечены самые высо, кие показатели регенерации растений [14]. Поскольку предполагалось использовать мутантный ген тубулина TUAm1 в качестве се, лективного маркерного гена, встроенного в созданную нами конструкцию pAHTUAm (рис. 1, вверху), был проведен анализ выжива, емости клеток каллуса сорта Киевская, 91 в присутствии различных концентраций трифлюралина для установления его эффек, тивной концентрации как селективного аген, та. Обнаружено, что эффективной концентра, цией трифлюралина, приводившей к гибели более 50 % клеток каллуса сои и полностью угнетавшей его регенерационную способ, ность, была концентрация 10 мкМ. Именно эта концентрация была использована для се, лекции трансгенных линий сои после проведе, ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 664 А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм Рис. 1. Схема конструкций pAHTUAm (вверху) и pAHTUB1 (внизу). P,ubiquitin – убихитиновый промотор кукуру, зы, Tuam1 – ген мутантного α,тубулина, Tnos – терминатор нопалинсинтетазы, HvTUB1 – ген β,тубулина ячменя, bar – ген устойчивости к глифосату. Указаны также сайты клонирования для TUAm1 и HvTUB1 генов. Серым бло, ком внизу схематически отмечен фрагмент последовательности гена TUAm1, который использовался для блоттинг, гибридизации по Саузерну ния биолистической трансформации каллуса. Эти данные согласуются с полученными ра, нее результатами по установлению селектив, ной концентрации трифлюралина для отбора трансгенных линий льна,долгунца после аг, робактериальной трансформации с использо, ванием того же мутантного гена тубулина [11]. Для успешной интеграции в геном G. max мутантного гена α,тубулина в процессе бом, бардирования и его экспрессии в реципиентных клетках нами был дополнительно осуществлен перенос гена β,субъединицы тубулина, изоли, рованного из Hordeum vulgare, который нахо, дился в векторе pAHTUB1 (рис. 1). Ранее было установлено, что наличие именно обеих субъ, единиц (α и β) экзогенного тубулина является предпосылкой его успешной коэкспрессии [11, 28] и дальнейшей их кополимеризации в структуры микротрубочек трансформирован, ных клеточных линий [28]. После бомбардирования микрочастицами экспланты сои выдерживали в течение недели на питательной среде для каллусогенеза без добавления селективного агента. Затем для ре, генерации побегов их переносили на соответ, ствующую питательную среду, которая содер, жала 10 мкМ трифлюралина для селекции гербицид,устойчивых линий [14]. Селектив, ное давление в культуре осуществляли на про, тяжении 3–4 месяцев. Линии, которые были способны выживать в присутствии трифлюра, лина (рис. 2, а), переносили для дальнейшего культивирования и размножения. В результа, те селекции нами отобраны шесть линий сои (S1–S6), способные к формированию эмбри, огенных структур и регенерирующих побегов в присутствии трифлюралина (рис. 2, б, в). Для установления наличия перенесенного гена α,тубулина был проведен молекулярно, ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 6 65 Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного Рис. 2.Селекция выживших каллусных тканей (указано стрелками) на среде, содержащей 10 мкМ трифлюралин (а) и регенерирующие побеги сои линий S1и S6 соответственно (б, в) в присутствии 10 мкМ трифлюралина. Мас, штаб: в 1 см – 0,9 мм (А), 0,35 мм (Б) и 0,2 мм (В) Рис. 3. Анализ трансгенных растений сои методом гиб, ридизации по Саузерну. Трансгенные линии сои (S1– S6) имеют одну дополнительную полосу (за исключени, ем линии S2), характерную для α,тубулина (стрелка), по сравнению с контролем (SK). Размер полосы соот, ветствует интегрированному мутантному гену альфа, тубулина (TUAm1) E. indica, обеспечивающему устойчи, вость к динитроанилиновому гербициду трифлюралину биологический анализ шести регенерирован, ных растений сои с использованием метода гибридизации по Саузерну. Геномные после, довательности α,тубулинов растений очень консервативны [34], поэтому в результате ана, лиза по Саузерну наблюдали наличие трех гибридизационных фрагментов как в регенери, рованных, так и в контрольном растении (рис. 3). Однако геном пяти регенерированных ли, ний характеризовался наличием дополнитель, ной гибридизационной полосы, которая по своей длине соответствовала длине полосы, рассчитанной для перенесенного мутантного гена TUAm1. Только линия S2 не показала до, полнительного гибридизационного сигнала (рис. 3). Именно эта линия не была способна к побегообразованию при дальнейшем куль, тивировании в условиях in vitro. Исходя из по, лученных данных молекулярно,биологичес, кого анализа можно заключить, что частота трансформации эмбриогенного каллуса для сорта Киевская,91 находилась в пределах 5–6 %. Необходимо отметить, что более высокие показатели эффективности трансформации сои достигнуты рядом авторов при усовер, шенствовании агробактериального метода пе, реноса желательных генов. Так, например, в некоторых работах показано, что при оптими, зации этого метода можно добиться увеличе, ния показателя частоты трансформации до 8,7 % [35], 11,7 % [36], 15,8 % [37] и 16,4 % [38], хотя очень часто этот показатель для сои может находиться в пределах 0,7 % [38] – 3,8 % [35, 36]. Недавно было продемонстрировано, что при использовании биолистической транс, формации с использованием в качестве селек, тивного маркерного гена мутантного гена аце, толактазсинтетазы, обеспечивающего устойчи, вость к гербициду имазапуру [39], частота трансформации сои может достигать 9 % [40]. Учитывая, что полученные данные по частоте трансформации сои являются сопоставимыми с результатами других авторов, можно заклю, чить, что разработанный метод селекции трансгенных линий растений с помощью предложенного нами селективного агента трифлюралина может быть применен для ряда других видов растений. Более того, селекция на трифлюралине уже была успешно осуществлена нами при получе, нии межвидовых и межтрибных соматических гибридов, где в качестве доноров использова, ли трифлюралин,устойчивые мутанты [41, 42]. В этих работах установлено, что селекция на трифлюралине обеспечивала интеграцию мутантного тубулина из клеток,доноров и их последующую стабильную экспрессию в клет, ках реципиентных видов [41, 42]. Совсем не, давно система для агробактериальной транс, формации растений на основе мутантного гена α,тубулина из гусиной травы и β,тубулина из ячменя была применена нами для трансфор, мации льна,долгунца. У трансгенных линий, отобранных на среде, содержащей трифлюра, лин, привнесенный мутантный тубулин не только стабильно экспрессировался [11], но и интегрировался в микротрубочки клеток транс, формантов, обеспечивая их устойчивость к де, полимеризации под действием упомянутого соединения. Таким образом, в работе впервые описаны результаты по осуществлению успешного пе, реноса мутантного гена тубулина, который обеспечивает устойчивость к динитроанилино, вым гербицидам, в растения сои с помощью биолистической трансформации с использо, ванием разработанной новой селективной мар, керной системы. Продемонстрирована возмож, ность селекции трансгенных линий сои на одном из самых эффективных динитроанили, новых гербицидов – трифлюралине. Успешная интеграция и экспрессия безопасного маркер, ного гена природного происхождения в отоб, ранных в результате селекции линиях подтвер, ждена с помощью блоттинг,гибридизации по Саузерну. Предложено использовать новый маркерный ген для генетической трансформа, ции других важных видов высших растений. A.I. Yemets, V.V. Radchuk, A.V. Pakhomov, Ya.B. Blume BIOLICTIC TRANSFORMATION OF SOYBEAN BY NEW SELECTIVE MARKER GENE CONFERRING RESISTANCE TO DINITROANILINES Biolistic transformation of soybean by construction carrying a mutant α,tubulin gene as selective marker gene conferring resistance to dinitroaniline herbicides, and by additional construction pAHTUB1 carrying a full,length ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 666 А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм barley β,tubulin gene for correct co,expression of exoge, neous tubulin in cells of transgenic soybean lines has been realized. It was established that 10 µM trifluralin is the most optimal selective concentration to pick up transformed soybean lines. Transgenic nature of offained regenerants was confirmed by Southern blotting hybridization using specific probe to selective α,tubulin gene. А.І. Ємець, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм БІОЛІСТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ СОЇ З ВИКОРИСТАННЯМ НОВОГО СЕЛЕКТИВНОГО МАРКЕРНОГО ГЕНА СТІЙКОСТІ ДО ДИНІТРОАНІЛИНІВ Здійснено біолістичну трансформацію сої з викори, станням конструкції pAHTUAm, що містила мутант, ний ген α,тубуліну, як селективний маркерний ген, що забезпечує стійкість до динітроанілінових гербіци, дів, а також додаткової конструкції pAHTUB1, яка містила повнорозмірний ген β,тубуліну ячменя, для коректної коекспресії екзогенного тубуліну в клітинах трансгенних ліній сої. Встановлено, що 10 мкМ три, флюралін є найоптимальнішою селективною концен, трацією при відборі трансформованих ліній сої. Тран, сгенну природу відібраних регенерантів підтверджено за допомогою Саузерн,блотингу з використанням специфічної проби до селективного гена α,тубуліну. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Miki B., McHugh S. Selectable marker genes in trans, genic plants: applications, alternatives and biosafety // J. Biotechnol. – 2004. – 107. – P. 193–232. 2. Zuo J., Niu Q.W., Moller S.G., Chua N.H. Chemical, regulated, site,specific DNA excision in transgenic plants // Nature Biotechnol. – 2001. – 19. – P. 157– 161. 3. Richael C.M., Kalyaeva M., Chretien R.C., Yan H., Adimulam S., Stivison A., Weeks J.T., Rommens C.M. Cytokinin vectors mediate marker,free and backbone, free plant transformation // Transgenic Res. – 2008. – 17, № 5. – Р. 905–917. 4. Ye X., Williams E.J., Shen J., Esser J.A., Nichols A.M., Petersen M.W., Gilbertson L.A. Plant development inhibitory genes in binary vector backbone improve quality event efficiency in soybean transformation // Transgenic Res. – 2008. – 17, № 5. – P. 827–838. 5. Емец А.И., Блюм Я.Б. Устойчивость растений к герби, цидам с антимикротрубочковым механизмом дей, ствия: от природных мутантов до переноса генов // Физиол. растений. – 1999. – 46, № 6. – C. 899– 907. 6. Baird V., Blume Ya.B., Wick S.M. Microtubular and cytoskeletal mutants // Plant microtubules,potential targets for biotechnological applications / Ed. P. Nick – Frankfurt; Berlin : Springer Verlag, 2000. – P. 155– 187. 7. Nick P., Christou P., Breviario D. Generating transgenic plants by minimal addition of exogenous DNA – a novel selection marker based on plant tubulins // AgBiotechNet. – 2003. – 5. – ABN 105. 8. Nick P., Yatou O., Furuya M., Lambert A.�M. Auxin, dependent microtubule responses and seedling devel, opment are affected in a rice mutant resistant to EPC // Plant J. – 1994. – 6. – P. 651–663. 9. Wiesler B., Wang Q.�Y., Nick P. The stability of cortical microtubules depends on their orientation // Plant J. – 2002. – 32. – P. 1023–1032. 10. Емец А.И., Блюм Я.Б. Мутантные гены тубулинов растений как маркерные селективные гены для ге, нетической инженерии // Цитология и генетика. – 2007. – 41, № 3. – C. 29–43. 11. Емец А.И., Баер О.А., Радчук В.В., Блюм Я.Б Агро, бактериальная трансформация льна,долгунца му, тантным геном тубулина, несущим устойчивость к динитроанилиновым гербицидам // Генетика. – 2009. – № 2 (принята к опубликованию). 12. Blume Ya.B., Yemets A.I., Nyporko A.Yu., Baird W.V. Structural modeling of plant α,tubulin interaction with dinitroanilines and phosphoroamidates // Cell Biol. Int. – 2003. – 27. – P. 171–174. 13. Dill G.M., Cajacob C.A., Padgette S.R. Glyphosate,resist, ant crops: adoption, use and future considerations // Pest. Manag. Sci. – 2008. – 64, № 4. – P. 326–331. 14. Пахомов А.В., Емец А.И., Ху Ч.�Е., Блюм Я.Б. Оценка эмбриогенного потенциала сортов сои, райониро, ванных в зоне украинских Лесостепи и Полесья, как необходимый этап для их дальнейшей транс, формации // Цитология и генетика. – 2004. – 38, № 1. – С. 49–54. 15. Пахомов А.В., Емец А.И., Блюм Я.Б. Сравнительный анализ эмбриогенного потенциала сортов сои, районированных в различных эколого,геoграфи, ческих зонах мира // Цитология и генетика. – 2005. – 39, № 5. – С. 20–27. 16. Inaba Y., Brotherton J.E., Ulanov A., Widholm J.M. Expression of a feedback insensitive anthranilate syn, thase gene from tobacco increases free tryptophan in soybean plants // Plant Cell Rep. – 2007. – 26, № 10. – P. 1763–1771. 17. Inaba Y., Zhong W.Q., Zhang X.H., Widholm J.M. Specificity of expression of the GUS reporter gene (uidA) driven by the tobacco ASA2 promoter in soy, bean plants and tissue cultures // J. Plant Physiol. – 2007. – 164, № 7. – P. 824–834. 18. Nishizawa K., Kita Y., Kitayama M., Ishimoto M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soy, bean // Plant Cell Rep. – 2006. – 25, № 12. – P. 1355– 1361. 19. Lamblin F., Aimé A., Hano C., Roussy I., Domon J.M., ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 6 67 Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного Van Droogenbroeck B., Lainé E. The use of the phos, phomannose isomerase gene as alternative selectable marker for Agrobacterium,mediated transformation of flax (Linum usitatissimum) // Plant Cell Rep. – 2007. – 26, № 6. – P. 765–772. 20. Lucca P., Ye X., Potrykus I. Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent // Mol. Breed. – 2001. – 7. – P. 43–49. 21. Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Reed J., Kramer C., Chang Y., Novitzky R., Wang H., Artim� Moore L. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as selectable marker // Plant Cell Rep. – 2001. – 20. – P. 429–436. 22. Chiang Y.C., Kiang Y.T. Genetic analysis of mannose, 6,phopsphate isomerase in soybeans // Genome. – 1988. – 30. – P. 808–811. 23. Мельников Н.Н. Пестициды: химия, технология, применение. – М.: Химия, 1987. – 711 с. 24. Брицун В.М., Ємець А.І., Лозинський М.О., Блюм Я.Б. 2,6, Динітроаніліни: синтез, пестицидні та антипрото, зойні властивості // Ukr. Biorganica Acta. – 2008. – 6, № 2. – P. 43–56. 25. Yamamoto E., Zeng L., Baird W.V. α,Tubulin missense mutations correlate with antimicrotubule drug resist, ance in Eleusine indica // Plant Cell. – 1998. – 10. – P. 297–308. 26. Christensen A.H., Quail P.H. Ubiquitin promoter,based vectors for high level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants // Transgenic Res. – 1996. – 5. – P. 213–218. 27. Radchuk V.V., Sreenivasulu N., Blume Y., Weschke W. Distinct tubulin genes are differentially expressed dur, ing barley grain development // Physiol. Plant. – 2007. – 131. – P. 571–580. 28. Anthony R., Waldin T., Ray J., Bright S., Hussey P. Herbicide resistance caused by spontaneous mutation of the cytoskeletal protein tubulin // Nature. – 1998. – 393. – P. 260–263. 29. Yemets A.I., Kundel’chuk O.P., Smertenko A.P. et al. Transfer of amiprophosmethyl,resistance from a Nicotiana plumbaginifolia mutant by somatic hybridiza, tion // Theor. Appl. Genet. – 2000. – 100. – Р. 847– 857. 30. Yemets A.I., Klimkina L.A., Tarassenko L.V., Blume Ya.B. Efficient callus formation and plant regeneration from dinitroaniline,resistant and susceptible biotypes of Eleusine indica (L.) // Plant Cell Rep. – 2003. – 21. – Р. 503–510. 31. Abumhadi N., Trifonova A., Takumi S., Nakamura C., Todorovska E., Getov L., Christov N., Atanassov A. Development of the particle inflow gun and optimizing the particle bombardment method for efficient genetic transformation in mature embryos of cereals // Biotech. Equip. – 2001. – 15, № 2. – P. 87–96. 32. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning : A labo, ratory manual / Cold Spring Harbour Press: Cold Spring Harbour, NY. – 2001. – 999 p. 33. Radchuk V.V., Sreenivasulu N., Blume Y., Weschke W. Distinct tubulin genes are differentially expressed dur, ing barley grain development // Physiol. Plant. – 2007. – 131. – P. 571–580. 34. Radchuk V.V. The transcriptome of tubulin genes in plants // The Plant Cytoskeleton: Key Tool for Agro, Biotechnologi / Eds Ya. Blume, W. Baird, A. Yemets and D. Breviario). – Berlin etc. : Springer,Verlag, 2008. – P. 231–253. 35. Paz M.M., Martinez J.C., Kalvig A.B., Fonger T.M., Wang K. Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium,mediated soybean transformation // Plant Cell Rep. – 2006. – 25, № 3. – P. 206–213. 36. Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q. The effect of cocultiva, tion and selection parameters on Agrobacterium,medi, ated transformation of Chinese soybean varieties // Plant Cell Rep. – 2008. – 27, № 3. – P. 489–498. 37. Liu H.K., Yang C., Wei Z.M. Efficient Agrobacterium tumefaciens�mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system // Planta. – 2004. – 219, № 6. – P. 1042–1049. 38. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary,node method // Planta. – 2003. – 216, № 5. – P. 723–735. 39. Sathasivan К., Haughn G.W., Murai N. Nucleotide sequence of a mutant acetolactate syntase gene from an imidazolinone resistant Arabidopsis thaliana var. Columbia // Nucl. Acids Res. – 1990. – 18. – P. 2888. 40. Rech E.L., Vianna G.R., Aragao F.J.L. High,efficiency transformation by biolistics of soybean, common bean and cotton transgenic plants // Nature Protocols. – 2003. – 3, № 3. – P. 410–418. 41. Blume Ya.B., Kundelchuk O.P., Solodushko V.G. et al. Asymmetric somatic hybrids of higher plants resistant to trifluralin // Proc. Int. Symp. Weed Crop Resist. to Herbicides (Cordoba, Spain, 1995) / Eds R. De et al. – Univ. Cordoba, 1996. – P. 182–185. 42. Yemets A.I., Strashnyuk N.M., Blume Ya.B. Plant mutants and somatic hybrids with resistance to triflu, ralin // Cell Biol. Int. – 1997. – 21. – Р. 912–914. Поступила 17.07.08 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2008. № 668 А.И. Емец, В.В. Радчук, А.В. Пахомов, Я.Б. Блюм

Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам

Institution

Ähnliche Einträge