Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата
Клоновано ген фруктокiнази iз вишневидної та звичайної форм культурного томата. Проведено порiвняльну характеристику нуклеотидної послiдовностi гена FRK3 та ензиматичних властивостей iзоформи фруктокiнази, що ним кодується, у двох лiнiях культурного томата. Аналiз рiвня транскриптiв FRK3 за допомог...
Збережено в:
| Дата: | 2013 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2013
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/85879 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата / А.С. Кочевенко, А.Р. Ферні // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2013. — № 8. — С. 163–167. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-85879 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-858792025-02-09T13:54:29Z Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата Анализ аллельных вариантов гена фруктокиназы двух инбредных линий томата Analysis of allelic variants of the fructokinase gene in two tomato inbred lines Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. Біологія Клоновано ген фруктокiнази iз вишневидної та звичайної форм культурного томата. Проведено порiвняльну характеристику нуклеотидної послiдовностi гена FRK3 та ензиматичних властивостей iзоформи фруктокiнази, що ним кодується, у двох лiнiях культурного томата. Аналiз рiвня транскриптiв FRK3 за допомогою нозерн-блот гiбридизацiї не виявив вiдмiнностей у типi експресiї гена для двох даних алелей. Клонирован ген фруктокиназы из вишневидной и обычной форм культурного томата. Проведена сравнительная характеристика нуклеотидной последовательности гена FRK3 и энзиматических свойств изоформы фруктокиназы, которая им кодируется, в двух линиях культурного томата. Анализ уровня транскриптов FRK3 с помощью нозерн-блот гибридизации не выявил различий в типе экспрессии гена для двух данных аллелей. Allelic variants of the tomato fructokinase gene are cloned from a cherry tomato line and a large fruit line. Comparative analyses of the nucleotide sequences of FRK3 gene from two tomato lines and the enzymatic properties of encoded fructokinase isoforms are performed. Northern blot hybridization has revealed no differences in the types of expression for two studied alleles. 2013 Article Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата / А.С. Кочевенко, А.Р. Ферні // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2013. — № 8. — С. 163–167. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/85879 575.116.4:577.152.9 uk Доповіді НАН України application/pdf Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата Доповіді НАН України |
| description |
Клоновано ген фруктокiнази iз вишневидної та звичайної форм культурного томата.
Проведено порiвняльну характеристику нуклеотидної послiдовностi гена FRK3 та ензиматичних властивостей iзоформи фруктокiнази, що ним кодується, у двох лiнiях культурного томата. Аналiз рiвня транскриптiв FRK3 за допомогою нозерн-блот гiбридизацiї не виявив вiдмiнностей у типi експресiї гена для двох даних алелей. |
| format |
Article |
| author |
Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. |
| author_facet |
Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. |
| author_sort |
Кочевенко, А.С. |
| title |
Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата |
| title_short |
Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата |
| title_full |
Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата |
| title_fullStr |
Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата |
| title_full_unstemmed |
Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата |
| title_sort |
аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/85879 |
| citation_txt |
Аналіз алельних варіантів гена фруктокінази двох інбредних ліній томата / А.С. Кочевенко, А.Р. Ферні // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2013. — № 8. — С. 163–167. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT kočevenkoas analízalelʹnihvaríantívgenafruktokínazidvohínbrednihlíníjtomata AT ferníar analízalelʹnihvaríantívgenafruktokínazidvohínbrednihlíníjtomata AT kočevenkoas analizallelʹnyhvariantovgenafruktokinazydvuhinbrednyhlinijtomata AT ferníar analizallelʹnyhvariantovgenafruktokinazydvuhinbrednyhlinijtomata AT kočevenkoas analysisofallelicvariantsofthefructokinasegeneintwotomatoinbredlines AT ferníar analysisofallelicvariantsofthefructokinasegeneintwotomatoinbredlines |
| first_indexed |
2025-11-26T14:06:34Z |
| last_indexed |
2025-11-26T14:06:34Z |
| _version_ |
1849862122524114944 |
| fulltext |
УДК 575.116.4:577.152.9
А.С. Кочевенко, А.Р. Фернi
Аналiз алельних варiантiв гена фруктокiнази двох
iнбредних лiнiй томата
(Представлено академiком НАН України Ю.Ю. Глебою)
Клоновано ген фруктокiнази iз вишневидної та звичайної форм культурного томата.
Проведено порiвняльну характеристику нуклеотидної послiдовностi гена FRK3 та ен-
зиматичних властивостей iзоформи фруктокiнази, що ним кодується, у двох лiнiях
культурного томата. Аналiз рiвня транскриптiв FRK3 за допомогою нозерн-блот гiб-
ридизацiї не виявив вiдмiнностей у типi експресiї гена для двох даних алелей.
Томат Solanum lycopersicum є однiєю з найважливiших сiльськогосподарских культур. За
обсягами споживання у всьому свiтi томат займає другу позицiю пiсля картоплi серед ово-
чiв. На сучасному етапi зусилля селекцiонерiв значною мiрою сконцентровано на отриманнi
сортiв з високою стiйкiстю до захворювань, врожайнiстю, розмiром плодiв та високими ор-
ганолептичними якостями, як-то смак, запах, колiр, текстура плодiв та iн. Смак плодiв
томата переважно залежить вiд вмiсту кислот, насамперед лимонної та яблучної, i цукрiв,
а також їх спiввiдношення. Серед цукрiв найбiльше значення мають глюкоза i фруктоза;
вважається, що остання вiдiграє головну роль у виникненнi солодкого присмаку плодiв то-
мата [1, 2]. Бiльшiсть комерцiйних сортiв томата мають низький вмiст цукрiв у плодах,
тому збiльшення їх рiвня, особливо фруктози, є одним iз головних пiдходiв покращення
смакових властивостей плодiв [3]. Сорти культурного томата з дрiбними плодами (вишне-
виднi томати), а також деякi види диких томатiв, зокрема S. chmielewskii, S. habrochaites,
S. pimpinellifolium, можуть бути використанi як потенцiйнi донори генiв, що мiстять висо-
кий рiвень цукрiв у плодах.
Фруктокiназа (FRK, EC 2.7.1.4) вiдiграє важливу роль у вуглеводному метаболiзмi рос-
лин. FRK забезпечує фосфорилювання фруктози, що утворюється внаслiдок розщеплення
основного транспортного цукру сахарози сахарозосинтазою або iнвертазою, i таким чином
уможливлює її подальший метаболiзм. Чотири гени FRK1–FRK4, що кодують фруктокi-
назу в томатi, було клоновано i картовано. FRK гени мають вiдмiнно-специфiчний тип
експресiї, крiм цього, iзоформи фруктокiнази, що ними кодуються, вiдрiзняються за бiохi-
мiчними характеристиками, а саме спорiдненiстю до субстрату, нуклеотидною специфiч-
нiстю та iнгiбуванням iонами магнiю [4, 5]. FRK3 є одним з найбiльш експресовних генiв
з родини фруктокiназ у томата. Найбiльшу кiлькiсть FRK3 транскрипту виявлено в лист-
ках, апiкальних меристемах та плодах томата. FRK3 ген було локалiзовано на нижньому
кiнцi другої хромосоми мiж маркерами CD66 i TG154 у геномному регiонi, що становить
22,4 сМ [6]. У попереднiх дослiдженнях iз використанням iнтрогресивних лiнiй (IL) куль-
турного томата, отриманих вiд схрещування з культурними або дикими родичами, також
встановлено, що на хромосомi 2 локалiзовано три окремих локуси кiлькiсних ознак (QTLs)
Sugs2.1, Sugs2.2 i Sugs2.3, якi контролюють загальний вмiст цукрiв у плодах томата [7].
Таким чином, колокалiзацiя QT локусу Sugs2.2 iз геном FRK3 вказує на важливу роль
останнього в контролi вмiсту цукрiв у перикарпi томата.
© А.С. Кочевенко, А.Р. Фернi, 2013
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №8 163
Рис. 1. Локалiзацiя гена FRK3 на хромосомнiй картi культурного томата (а) та аналiз його експресiї (б ).
Lev — iнбредна лiнiя Levovil; Cer — iнбредна лiнiя Cervil; сiрий прямокутник — iнтрогресивний хромосомний
сегмент в лiнiї IL-L2. б — результати нозерн-блотингу: 1 — листки; 2 — зеленi плоди; 3 — червонi плоди
Завданням даного дослiдження було клонування гена FRK3 iз вишневидної (Cervil)
i великоплiдної (Levovil) лiнiй томата, вивчення алельних вiдмiнностей експресiї цього гена
та кiнетичних характеристик iзоформи фруктокiнази FRKIII, що ним кодується.
Оскiльки геном томата було сиквеновано, то, використовуючи публiчно доступну нук-
леотидну послiдовнiсть геному S. lycopersicum, спочатку нами було проведено уточнення
локалiзацiї гена FRK3. За результатами аналiзу, геномний регiон було зменшено до сег-
мента у 3 сМ (рис. 1, a), який включає локуси T1400 i U150724. Встановлено добрий збiг
мiсцезнаходження гена FRK3 iз локалiзацiєю QT локусу Sugs2.2, який було картовано на
хромосомi 3 мiж маркерами TG167 i GC187 [8]. Таким чином, ген FRK3 дiйсно може роз-
глядатися як ген-кандидат, що вiдповiдає за виникнення QTL Sugs2.2 у iнтрогресивних
лiнiях томата.
Як рослинний матерiал використовували рослини iнтрогресивної лiнiї томата IL-L2,
одержаної вiд схрещування двох iнбредних лiнiй Levovil (рекурентна батькiвська форма)
i Cervil (донорна батькiвська форма). Cervil (Solanum lycopersicum var cerasiforme) є виш-
невидною формою томата з дрiбними плодами масою 8–10 г, тодi як Levovil (Solanum
lycopersicum L.) формує плоди, якi досягають 120–150 г.
Нами було проведено аналiз вмiсту розчинних цукрiв у червоних плодах рослин IL-L2 та
батькiвських лiнiй томата. Для цього перикарпну тканину (120 мг) спочатку заморожували
в рiдкому азотi i гомогенiзували в 1 мл 100% етанолу. Екстракт iнкубували 90 хв при 70 ◦C,
центрифугували (11000 g, 10 хв). Вмiст сахарози, фруктози та глюкози в супернатантi ви-
мiрювали за допомогою ензиматичного методу згiдно з [9]. За отриманими даними, вмiст
розчинних цукрiв у плодах рослин лiнiї Cervil був досить високим i сягав 50–60 мг/г сирої
речовини. Натомiсть вмiст цукрiв у плодах другої батькiвської лiнiї Levovil був удвiчi мен-
шим (див. рис. 1, а). Рослини IL-L2 характеризувалися пiдвищеним вмiстом цукрiв у плодах
порiвняно з Levovil, що обумовлюється наявнiстю генетичного регiону донора (Cervil), який
мiстить TG167 i GC187 локуси i становить приблизно 11 cM. У цiлому ж ефект замiни але-
ля по цьому QTL становив 19–20%.
Сумарну РНК з плодiв IL-L2 i Levovil iзолювали за допомогою Trizol реагенту (“Invi-
trogen“, Нiмеччина). Реакцiї зворотної транскрипцiї та амплiфiкацiї повнорозмiрної коду-
164 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, №8
Рис. 2. Вмiст розчинних цукрiв у перикарпi на стадiї повної стиглостi (а) на ензиматична активнiсть
FRK3 (б ). Lev — iнбредна лiнiя Levovil; Cer — iнбредна лiнiя Cervil; IL-L2 — iнтрогресивна лiнiя томата
ючої послiдовностi обох алелiв гена FRK3 проводили вiдповiдно до ранiше опублiкованих
методик [10]. Для амплiфiкацiї використовували такi геноспецифiчнi праймери:
прямий — CACCATGGCTCTTCATGCTACTGCTTTC,
зворотний — TGCAACTGACTTGAGCAAGG.
ПЛР амплiфiкованi продукти розмiром 1167 п. н. було клоновано у вектор pYES-DEST52
(“Invitrogen“, Нiмеччина) i сиквеновано. За результатами аналiзу нуклеотидних послiдовно-
стей виявлено декiлька однонуклеотидних полiморфiзмiв (SNP) мiж алельними варiантами
Cervil i Levovil гена FRK3.
Деякi з виявлених нуклеотидних замiн, наприклад, у складi кодонiв 223 i 383 призводи-
ли до змiн амiнокислотного складу протеїнiв. Так, для FRKIII, що кодується Cervil алелем,
було характерно замiщення аспарагiнової кислоти на гiстидин (D → H) та аланiну на тре-
онiн (A → T) у положеннях 223 i 383 вiдповiдно.
Експресiю рекомбiнантних протеїнiв проводили в мутантному штамi дрiжджiв (Saccha-
romyces cerevisiae) DFY632 iз втраченою здатнiстю до фосфорилювання гексоз. Очищення
цiльових протеїнiв здiйснювали методом металоафiнної хроматографiї на Ni2+-NTA агарозi
(“Qiagen”, Нiмеччина) згiдно з рекомендацiями фiрми-виробника. Активнiсть очищеного
протеїну визначали спектрофотометрично за методом [4].
Графiк залежностi швидкостi реакцiї вiд концентрацiї субстрату наведено на рис. 2.
Активнiсть ферментiв обох алелей зростає з пiдвищенням концентрацiї фруктози вiд 0,1
до 2,0 мМ. Максимальна активнiсть FRK3 спостерiгається при 2 мМ фруктози i стано-
вить 94,9 та 652,7 нМ/хв на 1 мг бiлка для ферментiв, що кодуються Cervil i Levovil але-
лями вiдповiдно. Слiд також зазначити, що для Levovil ферменту було характерно явище
субстратного iнгiбування. Зокрема, при пiдвищеннi концентрацiї фруктози в середовищi
iнкубацiї вiд 2 до 5 мМ активнiсть ферменту знижувалася. На вiдмiну вiд Levovil для
Cervil FRKIII ензиму такого пригнiчення активностi ферменту не вiдмiчено. За даними
трьох незалежних експериментiв проводили розрахунок кiнетичних параметрiв реакцiї (KМ,
Vmax) за рiвнянням Мiхаелiса–Ментен (табл. 1). Розрахованi величини iстотно вiдрiзняли-
ся мiж собою для двох алелiв. Для ферментiв, що кодуються Levovil та Cervil алелями,
величини KМ для фруктози становили 0,16 i 0,30 мМ вiдповiдно. Це вказує на те, що спо-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №8 165
Таблиця 1. Кiнетичнi параметри реакцiї фосфорилювання фруктози Levovil та Cervil FRKIII ензимiв; M±m,
n = 6
Алель KМ, мМ Vmax, нМ/(хв · мг бiлка) Vmax/KМ
Cervil 0,30 ± 0,12 111,50 ± 10,68 0,38
Levovil 0,16 ± 0,05 665,80 ± 36,56 4,04
рiдненiсть ферменту FRKIII Levovil до фруктози перевищує таку для Cervil у два рази
(див. табл. 1).
Оскiльки молекулярнi основи алельних варiацiй QTL можуть полягати не тiльки у змiнi
функцiї протеїнiв, але й у змiнi експресiї генiв, то додатково нами проведено аналiз експресiї
гена FRK3 за допомогою нозерн-блот гiбридизацiї в листках, а також зелених та червоних
плодах томата (див. рис. 1, б ). Отриманi данi виявили, що ген FRK3 має транскрипцiйну
активнiсть у перикарпi томата, яка незначно нижча, нiж у листовiй тканинi. Разом з тим
будь-яких вiдмiнностей у рiвнi експресiї мiж алелями Cervil i Levovil не виявлено.
Отриманi результати аналiзу транскрипцiйної активностi FRK3 гена, а також дослi-
дженi бiохiмiчнi особливостi Cervil i Levovil алелей свiдчать на користь того, що ген FRK3
вiдiграє ключову роль у пiдвищеннi рiвня цукрiв у плодах iнтрогресивних лiнiй томата.
Таким чином, беручи до уваги результати наших дослiджень, можна зробити висновок, що
внутрiшньовидовi схрещування можуть успiшно застосовуватися з метою полiпшення якiс-
них показникiв, зокрема отримання солодкого присмаку у промислових сортiв томата. До
того ж внутрiшньовидовi схрещування дають можливiсть уникнути проблем, пов’язаних зi
стерильнiстю гiбридiв, що виникають у випадку використання диких видiв як донорiв.
1. Malundo T.M., Shewfelt R. L., Scott J.W. Flavor quality of fresh tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)
as affected by sugar and acid levels // Postharvest Biol. Technol. – 1995. – 6. – P. 103–110.
2. Stevens M.A. Tomato quality: Potential for developing cultivars with improved flavor // Acta Hort. –
1979. – 93. – P. 317–329.
3. Baldwin E.A., Scott J.W., Einstein M.A. et al. Relationship between sensory and instrumental analysis
for tomato flavor // J. Am. Hort. Sci. – 1998. – 123. – P. 906–915.
4. Petreikov M., Dai N., Granot D., Schaffer A. Characterization of native and yeast expressed tomato
fructokinases enzymes // Phytoch. – 2001. – 58. – P. 841–847.
5. German M.A., Dai N., Chmelnitsky I. et al. LeFRK4, a novel tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)
fructokinase specifically expressed in stamens // Plant Sci. – 2002. – 163. – P. 607–613.
6. German M.A., Asher I., Petreikov M. et al. Cloning, expression and characterization of LeFRK3, the
fourth tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) gene encoding fructokinase // Plant Sci. – 2004. – 166. –
P. 285–291.
7. Fulton T.M., Bucheli P., Voirol E. et al. Quantitative trait loci (QTL) affecting sugars, organic acids
and other biochemical properties possibly contributing to flavor, identified in four advanced backcross
populations of tomato // Euphytica. – 2002. – 127. – P. 163–177.
8. Lecomte L., Saliba-Colombani V., Gautier A. et al. Fine mapping of QTLs of chromosome 2 affecting the
fruit architecture and composition of tomato // Mol. Breed. – 2004. – 13. – P. 1–14.
9. Gomez L., Bancel D., Rubio E., Vercambre G. The microplate reader: an efficient tool for the separate
enzymatic analysis of sugars in plant tissues – validation of a micro-method // J. Sci. Food. Agric. – 2007. –
87. – P. 1893–1905.
10. Кочевенко А.С., Фернi А. Р. Характеристика гена IPMD-SSU1 Lycopersicon esculentum та його роль
у бiосинтезi лейцину // Доп. НАН України. – 2011. – № 9. – С. 153–158.
Надiйшло до редакцiї 04.01.2013Iнститут клiтинної бiологiї
та генетичної iнженерiї НАН України, Київ
Макс-Планк-Iнститут молекулярної
фiзiологiї рослин, Гольм, Нiмеччина
166 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2013, №8
А.С. Кочевенко, А.Р. Ферни
Анализ аллельных вариантов гена фруктокиназы двух инбредных
линий томата
Клонирован ген фруктокиназы из вишневидной и обычной форм культурного томата. Про-
ведена сравнительная характеристика нуклеотидной последовательности гена FRK3 и эн-
зиматических свойств изоформы фруктокиназы, которая им кодируется, в двух линиях
культурного томата. Анализ уровня транскриптов FRK3 с помощью нозерн-блот гибри-
дизации не выявил различий в типе экспрессии гена для двух данных аллелей.
A. S. Kochevenko, A.R. Fernie
Analysis of allelic variants of the fructokinase gene in two tomato inbred
lines
Allelic variants of the tomato fructokinase gene are cloned from a cherry tomato line and a large
fruit line. Comparative analyses of the nucleotide sequences of FRK3 gene from two tomato li-
nes and the enzymatic properties of encoded fructokinase isoforms are performed. Northern blot
hybridization has revealed no differences in the types of expression for two studied alleles.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2013, №8 167
|