Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули
Дослiджено вплив монАТ II-5с, епiтоп якого локалiзований в Аα20–78 фрагментi Е-регiону молекули фiбриногену, на експозицiю неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с у ходi трансформацiї фiбриногену в фiбрин. Iз застосуванням IФ, ППР й електрофоретичного аналiзу встановлено, що монАТ II-5с iнгiбує зв’я...
Saved in:
| Published in: | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Date: | 2014 |
| Main Authors: | , , , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2014
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/87716 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули / Л.П. Урвант, Є.М. Макогоненко, Т.А. Позняк, М.О. Пидюра, I.М. Колеснiкова, П.Ю. Цап, Г.К. Березницький, Е.В. Луговськой, С.В. Комiсаренко // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 5. — С. 149-156. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-87716 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Урвант, Л.П. Макогоненко, Є.М. Позняк, Т.А. Пидюра, М.О. Колеснікова, І.М. Цап, П.Ю. Березницький, Г.К. Луговськой, Е.В. Комісаренко, С.В. 2015-10-23T19:22:45Z 2015-10-23T19:22:45Z 2014 Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули / Л.П. Урвант, Є.М. Макогоненко, Т.А. Позняк, М.О. Пидюра, I.М. Колеснiкова, П.Ю. Цап, Г.К. Березницький, Е.В. Луговськой, С.В. Комiсаренко // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 5. — С. 149-156. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/87716 547.962.4;612.115 Дослiджено вплив монАТ II-5с, епiтоп якого локалiзований в Аα20–78 фрагментi Е-регiону молекули фiбриногену, на експозицiю неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с у ходi трансформацiї фiбриногену в фiбрин. Iз застосуванням IФ, ППР й електрофоретичного аналiзу встановлено, що монАТ II-5с iнгiбує зв’язування монАТ I-3с з фiбрином, тромбiну з фiбрином i вiдщеплення фiбринопептиду А вiд фiбриногену в системах фiбриноген+тромбiн i Х-фрагмент фiбриногену+тромбiн. Цi данi пiдтверджують нашу гiпотезу про тромбiн-фiбриногеновий субстратний комплекс як тригер структурної перебудови Е-регiонiв молекули фiбриногену, що супроводжується формуванням у Bβ126–135 дiлянцi фiбрину неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с. Исследовано влияние монАТ II-5с, эпитоп которого локализован в Аα20–78 фрагменте Е-региона молекулы фибриногена, на экспозицию неоантигенной детерминанты монАТ I-3с в ходе трансформации фибриногена в фибрин. С применением ИФ, ППР и электрофоретического анализа установлено, что монАТ II-5с ингибирует связывание монАТ I-3с с фибрином, тромбина с фибрином и отщепление фибринопептида А от фибриногена в системах фибриноген+тромбин и Х-фрагмент фибриногена+тромбин. Эти данные подтверждают нашу гипотезу о тромбин-фибриногеновом субстратном комплексе как триггере структурной перестройки Е-регионов молекулы фибриногена, что сопровождается формированием в Bβ126–135 участке фибрина сайта неоантигенной детерминанты монАТ I-3с. The influence of mAb II-5c, epitope of which was localized within Aα20–78 fragment of the E-region of fibrinogen molecule, on the exposure of mAb I-3c neoantigenic determinant at the transformation of fibrinogen to fibrin has been investigated. Using ELISA, SPR, and electrophoretic analysis, we have found that mAb II-5c inhibited the binding of mAb I-3c to fibrin, thrombin to fibrin, and thrombin cleavage of fibrinopeptide A from fibrinogen in fibrinogen + thrombin and X-fragment fibrinogen + thrombin systems. These data support our hypothesis that the thrombin-fibrinogen substrate complex is a trigger of the restructuring of a fibrinogen molecule at the transformation in fibrin, which is accompanied by the formation of neoantigenic determinants of mAb I-3c within Bβ126–135 site of a molecule. uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біохімія Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули Связывание монАТ II-5c с Aα20–78 участком фибриногена ингибирует экспозицию неоантигенной детерминанты в Bβ126–135 сайте молекулы Binding of mAb II-5c to Aα20–78 fragment of fibrinogen inhibits a neoantigenic determinant exposure within Bβ126–135 site of a molecule Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули |
| spellingShingle |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули Урвант, Л.П. Макогоненко, Є.М. Позняк, Т.А. Пидюра, М.О. Колеснікова, І.М. Цап, П.Ю. Березницький, Г.К. Луговськой, Е.В. Комісаренко, С.В. Біохімія |
| title_short |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули |
| title_full |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули |
| title_fullStr |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули |
| title_full_unstemmed |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули |
| title_sort |
зв'язування монат ii-5c з aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в bβ126–135 сайті молекули |
| author |
Урвант, Л.П. Макогоненко, Є.М. Позняк, Т.А. Пидюра, М.О. Колеснікова, І.М. Цап, П.Ю. Березницький, Г.К. Луговськой, Е.В. Комісаренко, С.В. |
| author_facet |
Урвант, Л.П. Макогоненко, Є.М. Позняк, Т.А. Пидюра, М.О. Колеснікова, І.М. Цап, П.Ю. Березницький, Г.К. Луговськой, Е.В. Комісаренко, С.В. |
| topic |
Біохімія |
| topic_facet |
Біохімія |
| publishDate |
2014 |
| language |
Ukrainian |
| container_title |
Доповіді НАН України |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Связывание монАТ II-5c с Aα20–78 участком фибриногена ингибирует экспозицию неоантигенной детерминанты в Bβ126–135 сайте молекулы Binding of mAb II-5c to Aα20–78 fragment of fibrinogen inhibits a neoantigenic determinant exposure within Bβ126–135 site of a molecule |
| description |
Дослiджено вплив монАТ II-5с, епiтоп якого локалiзований в Аα20–78 фрагментi Е-регiону молекули фiбриногену, на експозицiю неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с
у ходi трансформацiї фiбриногену в фiбрин. Iз застосуванням IФ, ППР й електрофоретичного аналiзу встановлено, що монАТ II-5с iнгiбує зв’язування монАТ I-3с з фiбрином, тромбiну з фiбрином i вiдщеплення фiбринопептиду А вiд фiбриногену в системах
фiбриноген+тромбiн i Х-фрагмент фiбриногену+тромбiн. Цi данi пiдтверджують нашу гiпотезу про тромбiн-фiбриногеновий субстратний комплекс як тригер структурної перебудови Е-регiонiв молекули фiбриногену, що супроводжується формуванням у
Bβ126–135 дiлянцi фiбрину неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с.
Исследовано влияние монАТ II-5с, эпитоп которого локализован в Аα20–78 фрагменте Е-региона молекулы фибриногена, на экспозицию неоантигенной детерминанты монАТ I-3с в ходе трансформации фибриногена в фибрин. С применением ИФ, ППР и электрофоретического анализа установлено, что монАТ II-5с ингибирует связывание монАТ I-3с с фибрином, тромбина с фибрином и отщепление фибринопептида А от фибриногена в системах
фибриноген+тромбин и Х-фрагмент фибриногена+тромбин. Эти данные подтверждают
нашу гипотезу о тромбин-фибриногеновом субстратном комплексе как триггере структурной перестройки Е-регионов молекулы фибриногена, что сопровождается формированием в
Bβ126–135 участке фибрина сайта неоантигенной детерминанты монАТ I-3с.
The influence of mAb II-5c, epitope of which was localized within Aα20–78 fragment of the E-region
of fibrinogen molecule, on the exposure of mAb I-3c neoantigenic determinant at the transformation
of fibrinogen to fibrin has been investigated. Using ELISA, SPR, and electrophoretic analysis, we
have found that mAb II-5c inhibited the binding of mAb I-3c to fibrin, thrombin to fibrin, and
thrombin cleavage of fibrinopeptide A from fibrinogen in fibrinogen + thrombin and X-fragment
fibrinogen + thrombin systems. These data support our hypothesis that the thrombin-fibrinogen
substrate complex is a trigger of the restructuring of a fibrinogen molecule at the transformation
in fibrin, which is accompanied by the formation of neoantigenic determinants of mAb I-3c within
Bβ126–135 site of a molecule.
|
| issn |
1025-6415 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/87716 |
| citation_txt |
Зв'язування монАТ II-5c з Aα20–78 ділянкою фібриногену інгібує експозицію неоантигенної детермінанти в Bβ126–135 сайті молекули / Л.П. Урвант, Є.М. Макогоненко, Т.А. Позняк, М.О. Пидюра, I.М. Колеснiкова, П.Ю. Цап, Г.К. Березницький, Е.В. Луговськой, С.В. Комiсаренко // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2014. — № 5. — С. 149-156. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT urvantlp zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT makogonenkoêm zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT poznâkta zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT pidûramo zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT kolesníkovaím zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT cappû zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT bereznicʹkiigk zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT lugovsʹkoiev zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT komísarenkosv zvâzuvannâmonatii5czaα2078dílânkoûfíbrinogenuíngíbuêekspozicíûneoantigennoídetermínantivbβ126135saitímolekuli AT urvantlp svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT makogonenkoêm svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT poznâkta svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT pidûramo svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT kolesníkovaím svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT cappû svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT bereznicʹkiigk svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT lugovsʹkoiev svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT komísarenkosv svâzyvaniemonatii5csaα2078učastkomfibrinogenaingibiruetékspoziciûneoantigennoideterminantyvbβ126135saitemolekuly AT urvantlp bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT makogonenkoêm bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT poznâkta bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT pidûramo bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT kolesníkovaím bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT cappû bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT bereznicʹkiigk bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT lugovsʹkoiev bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule AT komísarenkosv bindingofmabii5ctoaα2078fragmentoffibrinogeninhibitsaneoantigenicdeterminantexposurewithinbβ126135siteofamolecule |
| first_indexed |
2025-11-27T02:12:38Z |
| last_indexed |
2025-11-27T02:12:38Z |
| _version_ |
1850793207790567424 |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
5 • 2014
БIОХIМIЯ
УДК 547.962.4;612.115
Л.П. Урвант, Є. М. Макогоненко, Т.А. Позняк, М. О. Пидюра,
I.М. Колеснiкова, П. Ю. Цап, Г. К. Березницький,
член-кореспондент НАН України Е. В. Луговськой,
академiк НАН України С. В. Комiсаренко
Зв’язування монАТ II-5c з Aα20–78 дiлянкою
фiбриногену iнгiбує експозицiю неоантигенної
детермiнанти в Bβ126–135 сайтi молекули
Дослiджено вплив монАТ II-5с, епiтоп якого локалiзований в Аα20–78 фрагментi Е-ре-
гiону молекули фiбриногену, на експозицiю неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с
у ходi трансформацiї фiбриногену в фiбрин. Iз застосуванням IФ, ППР й електрофо-
ретичного аналiзу встановлено, що монАТ II-5с iнгiбує зв’язування монАТ I-3с з фiбри-
ном, тромбiну з фiбрином i вiдщеплення фiбринопептиду А вiд фiбриногену в системах
фiбриноген+тромбiн i Х-фрагмент фiбриногену+тромбiн. Цi данi пiдтверджують на-
шу гiпотезу про тромбiн-фiбриногеновий субстратний комплекс як тригер структур-
ної перебудови Е-регiонiв молекули фiбриногену, що супроводжується формуванням у
Bβ126–135 дiлянцi фiбрину неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с.
Ранiше було встановлено, що експозицiя неоантигенної детермiнанти монАТ I-3с (НАД)
i сайту латеральної асоцiацiї протофiбрил у фiбриногенi (Fg) вiдбувається внаслiдок вiдщеп-
лення вiд молекули тромбiном (Thr) або рептилазою фiбринопептиду А (FpA) [1, 2]. Було
знайдено, що НАД локалiзована в Bβ126–135 фрагментi фiбрину (Fn) i не iснує в Fg [2, 3]. Її
експозицiя не пов’язана з вiддаленням αС-регiону вiд суперспiрального конектора молекули
або iз взаємодiєю “A”–“a” сайтiв полiмеризацiї Fn, а є результатом структурних перебудов
в Е-регiонi молекули [2]. Було висловлено припущення, що тригером структурної перебудо-
ви Е-регiону молекули Fg, яка супроводжується формуванням у вiддаленiй на ∼9,5 нм вiд
FpA Bβ126–135 дiлянцi Fg стабiльного сайту НАД, є фермент-фiбриногеновий субстратний
комплекс — ES-комплекс. Для перевiрки цiєї гiпотези нами дослiджено вплив моноклональ-
ного антитiла II-5с, епiтоп якого локалiзовано в Аα20–78 фрагментi Е-регiону молекули
i яке iнгiбувало полiмеризацiю Fn, на зв’язування монАТ I-3с з Fn i desA Х1-фрагментом,
© Л.П. Урвант, Є. М. Макогоненко, Т. А. Позняк, М. О. Пидюра, I.М. Колеснiкова, П.Ю. Цап,
Г.К. Березницький, Е.В. Луговськой, С. В. Комiсаренко, 2014
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №5 149
на зв’язування Thr з Fn та на вiдщеплення Thr або анцистроном Н FpA вiд Fg i Х1-фраг-
мента Fg.
МонАТ II-5с було отримано за ранiше описаним методом [4]. Епiтоп монАТ знаходився
в дiлянцi Аα20–78 Fn. Константа дисоцiацiї для реакцiї асоцiацiї його з фiбрином станови-
ла 2,8 · 10−9 моль/л [5]. Отриманi монАТ та його Fab-фрагменти iнгiбували полiмеризацiю
Fn desAB.
Фiбриноген i тромбiн були видiленi з плазми кровi донорiв методами Варецької [6]
i Fenton [7] вiдповiдно. Х-Фрагмент Fg отримано, згiдно з методом, описаним у статтi [8].
Анцистрон очистили з отрути Agkistrodon halys halys [9]. Електрофорез в ПААГ з SDS
виконували методом Laemli [10].
Експозицiю неоантигенної детермiнанти в Fg i Х-фрагментi визначали методом iму-
ноферментного аналiзу (IФА). Спочатку Fg або Х-фрагмент додавали до концентрацiї
5 мкг/мл в 0,02 моль/л HEPES буфер (pH 7,4), що мiстив 0,3 моль/л NaCl, 0,005% твiн 20,
в якому було присутнє в концентрацiї 1,25 мкг/мл або вiдсутнє монАТ II-5с. Пiсля 10 хв
передiнкубацiiї при 25 ◦С реакцiю вiдщеплення фiбринопептидiв вiд Fg i Х-фрагмента роз-
починали додаванням Thr або анцистрона Н до концентрацiї 0,03 NIH/мл. У вказанi момен-
ти часу реакцiю зупиняли додаванням iнгiбiторiв Thr до концентрацiї 1 ммоль/л (PMSF)
i плазмiну — 10 мкг/мл (контрикал). Алiквоти (100 мкл) вносили в лунки мiкропланшетiв,
в яких iммобiлiзованi монАT I-3с слугували “catch”-антитiлом. Наявнiсть епiтопу встанов-
лювали за кiлькiстю Fn, що зв’язався з монАT I-3с. Фiбрин визначали за допомогою монАТ
II-4d, мiченого бiотином, i стрептавiдин-HRP кон’югата.
Експозицiю неоантигенної детермiнанти в реальному часi детектували методом поверх-
невого плазмонного резонансу (ППР) на приладi Плазмон-6 (виробництво Iнституту фi-
зики напiвпровiдникiв iм. В.Є. Лашкарьова НАН України). На бiосенсорний чип кова-
лентно iммобiлiзували монАT I-3с. У контрольнiй комiрцi знаходився Fg або Х-фрагмент
у концентрацiї 5 мкг/мл в 0,02 моль/л HEPES (pH 7,4), 0,3 моль/л NaCl, 0,005% твiн 20,
у вимювiральнiй комiрцi — Fg або Х-фрагмент i монАТ II-5с у концентрацiї 1,5 мкг/мл.
Реакцiю активацiї Fg або Х-фрагмента у вимювiральнiй комiрцi iнiцiювали анцистроном Н
в концентрацiї 0,01 NIH/мл. В обидвi комiрки додавали синтетичний пептид GPRP у кон-
центрацiї 1 ммоль/л.
Iмуноферментний та ППР аналiз iнгiбування моноклональним АТ II-5с експозицiї
епiтопу моноклонального АТ I-3с. У попереднiх роботах було отримано данi, якi вка-
зували на вiдщеплення FpA вiд Fg, Х1- i Х2-фрагментiв Fg тромбiном або анцистроном
Н як iнiцiюючий момент експозицiї НАД сайту в молекулах Fn desA i desAB, desA Х1-
i Х2-фрагментах, що при цьому утворюються [1, 2]. Вiдщеплення FpA є результатом ка-
талiтичного акту, який здiйснюється Thr i анцистроном Н у складi ES-комплексу (тром-
бiн(анцистрон Н)-фiбриногенового). Для Thr i батроксобiну (ферменту, подiбному за спе-
цифiчнiстю до анцистрону Н) виявлено двi дiлянки зв’язування на Fg, якi важливi для
утворення ES-комплексу [11, 12]. Одна з дiлянок локалiзована на FpA i взаємодiє з “апо-
лярним” сайтом активного центру Thr [12, 13]. Друга утворена амiнокислотними залишка-
ми Трп33, Фен35, Асп38, Глу39 Аα-ланцюга, Ала68, Асп69 Вβ-ланцюга i Асп27 i Глу30
γ-ланцюга, зв’язується з екзосайтом 1 Thr [12]. Для батроксобiну (або анцистрону Н) дру-
га дiлянка зв’язування на Fg вiдрiзняється вiд такої для Thr i точне мiсце її локалiзацiї
не встановлено [13]. Тому першим нашим завданням було з’ясувати, яким шляхом здiйс-
нює монАТ II-5с iнгiбування полiмеризацiї Fn у системi Fg або Х1-фрагмент Fg+фермент:
шляхом створення стеричних перешкод для взаємодiї сайтiв полiмеризацiї Fn (А-а i С-с),
150 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №5
Рис. 1. Iмуноферментний аналiз iнгiбування моноклональним АТ II-5с зв’язування монАТ I-3с з Fg (а) i
X1-фрагментами Fg (б ), активованими тромбiном i iммобiлiзованими в комiрках мiкропланшета.
Кривi : 1 — у вiдсутностi та 2 — у присутностi монАТ II-5с
як у випадку desAB фiбрину, або також шляхом блокування утворення i функцiонування
ES-комплексу?
Для вирiшення цього питання нами дослiджено методом IФА вплив монАТ II-5c на
зв’язування Fg та його Х-фрагмента пiсля обробки тромбiном та iммобiлiзацiї в комiрках
мiкропланшета з монАТ I-3с. Fg i Х1-фрагмент попередньо iнкубували з монАТ II-5c у мо-
лярному спiввiдношеннi 2 : 1 впродовж 30 хв при 25 ◦С. В обох системах — Fg + монАТ
II-5с та Х1-фрагмент+монАТ II-5с — спостерiгали iнгiбування зв’язування монАТ I-3с з iм-
мобiлiзованими в комiрках мiкропланшета Fn i desA Х1-фрагментом Fg (рис. 1). Величина
пригнiчення їх зв’язування, яке характеризує рiвень експозицiї НАД, становила 30 i 15%
для Fg+Thr та Х1-фрагмент+Thr систем вiдповiдно. Цей дослiд показує, що монАТ II-5с
iнгiбує (частково) експозицiю вiддалених вiд FpA НАД сайтiв, а отже, й ES-комплексу. Звiд-
си випливає, що монАТ II-5с iнгiбує полiмеризацiю Fn у системах Fg + Thr i Х1-фрагмент
Fg + Thr також шляхом блокування, можливо частково, ES-комплексу.
Для того щоб виключити можливий вплив полiмеризацiї молекул фiбрину або desA
Х1-фрагментiв на доступнiсть сайту НАД до монАТ I-3с, нами дослiджено in situ в реаль-
ному часi зв’язування Fn i desA Х1-фрагментiв, якi формувались у системах Fg+анцистрон
Н+GPRP та Х1-фрагмент Fg+ анцистрон Н+GPRP, з iммобiлiзованим на чип монАТ I-3с
iз використанням методу ППР (рис. 2).
За цих умов олiгомеризацiя i полiмеризацiя Fn i desA Х1-фрагментiв були повнiстю бло-
кованi пептидом GPRP i iнгiбуючий вплив монАТ II-5с мiг повнiстю проявити себе. Ранiше
було показано, що GPRP пептид не впливає на експозицiю НАД у системi Fg + анцистрон
Н [2]. Як свiдчать результати, що представленi на рис. 2, монАТ II-5с зменшувало рiвень
експозицiї НАД в Fn i desA Х1-фрагментi Fg на 49 i 43% вiдповiдно. Оскiльки молярне вiд-
ношення монАТ II-5с до Fg/Х1-фрагмента становило 1 до 2, то рiвень iнгiбування експозицiї
НАД, коли фiбриноген/Х1-фрагмент знаходяться в мономернiй формi i антиполiмеризацiй-
на компонента дiї монАТ II-5с вiдсутня, наближається до теоретично можливого рiвня. Цей
експеримент пiдтверджує висновок про те, що монАТ II-5с iнгiбує експозицiю НАД, ймовiр-
но, перешкоджаючи роботi ES-комплексу Thr(анцистрон Н)-Fg. Крiм того, стає очевидним,
що iнгiбування полiмеризацiї Fn монАТ II-5с в умовах експерименту вiдбувається також i
шляхом блокування роботи ES-комплексу.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №5 151
Рис. 2. ППР аналiз iнгiбування моноклональним АТ II-5с зв’язування Fg (а) i X-фрагмента Fg (б ), активо-
ваних анцистроном Н, до монАТ I-3с, iммобiлiзованого на iмуносенсорний чип, у вiдсутностi (1 ) i в присут-
ностi (2 ) монАТ II-5с за умов блокування полiмеризацiї фiбрину i desA Х1-фрагмента пептидом GPRP
Рис. 3. ППР аналiз iнгiбування моноклональним АТ II-5с зв’язування тромбiну з фiбриногеном, сорбованим
на монAТ II-4d, яке ковалентно iммобiлiзоване на iмуносенсорний чип.
Суцiльною лiнiєю позначено сенсограму з робочої комiрки, пунктирною — сенсограму з контрольної комiр-
ки. Стрiлками показано момент введення в комiрки Fg, буферу для промивки, тромбiну. До контрольної
комiрки монАТ II-5с не додавали.
На вставцi представлено рiзницю мiж сенсограмами, отриманими з контрольної i робочої комiрок пiсля
введення в них тромбiну впродовж 3600–4800 с
ППР аналiз впливу монАТ II-5с на зв’язування тромбiну з фiбрин(оген)ом, iммобiлi-
зованим на iмуносенсорний чип. Для з’ясування питання, на якому етапi функцiонування
ES-комплексу, а саме: утворення комплексу, каталiтичного акту або передачi структурних
змiн вiд лeйкоподiбного домену Е-регiону до Bβ126–135 дiлянки Fg, — монАТ II-5с блокує
його роботу, було дослiджено вплив останнього на зв’язування Thr з iммобiлiзованим на
iмуносенсорний чип Fg. Зв’язування Thr з Fg є перший етап формування тромбiн-фiбри-
ногенового субстратного комплексу.
Для цього на чип було ковалентно iммобiлiзовано фiбриноген-специфiчне монАТ
II-4d [14]. Потiм в робочу i контрольну комiрки одночасно був введений Fg в 0,02 моль/л
HEPES буферi, pH 7,4, що мiстив 0,3 моль/л NaCl, 0,005% твiн 20, у концентрацiї 5 мкг/мл
(рис. 3). Пiсля вiдмивання комiрок буфером в робочу комiрку було введено монАТ II-5с
152 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №5
Рис. 4. Електрофоретичний i денситометричний аналiз пептидної смуги α-ланцюга фiбриногену, активова-
ного тромбiном, у присутностi та вiдсутностi монАТ II-5с. Активацiю тромбiном проведено у присутностi
1 ммоль/л GPRP
в тому самому буферi в концентрацiї 1,5 мкг/мл, а в контрольну комiрку — тiльки буфер-
ний розчин. Обидвi комiрки були вiдмитi буфером, що мiстив 0,15 моль/л NaCl, i в них
вводили розчин Thr у концентрацiї 10 NIH/мл (0,28 мкмоль/л) у цьому буферi. Як свiд-
чать сенсограми, що представленi на рис. 3, в контрольнiй комiрцi у вiдсутностi монАТ
II-5с зв’язування Thr було значно бiльше у порiвняннi з таким у робочiй комiрцi. На встав-
цi рис. 3 наведено рiзницю у вiдповiдях, зареєстрованих з контрольної i робочої комiрок
пiсля введення у них Thr. Отриманi данi вказують на те, що зв’язування монАТ II-5с з фiб-
риногеном iстотно блокує зв’язування Thr з Fg за участю екзосайта 1 Thr. У результатi
двосайтова взаємодiя Thr у субстратному Thr–Fg комплексi iстотно порушується i це ви-
кликає порушення в роботi ES-комплексу, що призводить до зменшення експозицiї епiтопу
монАТ I-3с (див. рис. 2). Результати дослiду також дозволяють припустити, що в епiтоп
монАТ II-5с входять амiнокислотнi залишки Трп33, Фен35, Асп38, Глу39 Аα-ланцюга Fg,
якi належать петлi, що охоплює лейкоподiбний домен Е-регiону молекули, i входять до
дiлянки зв’язування Thr на Fg [11].
Електрофоретичний аналiз iнгiбування монАТ II-5с вiдщеплення FpA вiд Fg i Х-фраг-
мента Fg тромбiном. Зв’язування монАТ II-5с з Fg iстотно блокує зв’язування Thr з Fg
(див. рис. 3) i пригнiчує експозицiю НАД (див. рис. 1, 2). Для з’ясування питання, який
з подальших етапiв роботи ES-комплекса — вiдщеплення тромбiном FpA вiд молекули або
передачу структурних змiн вiд лейкоподiбного домену до Bβ126–135 дiлянки Fg — iнгi-
бує монАТ II-5с, було дослiджено вплив останнього на вiдщеплення тромбiном FpA вiд Fg
i Х1-фрагмента Fg (рис. 4). Для цього Fg або X1-фрагмент, якi додавали до концентрацiї
0,2 мг/мл у 0,02 моль/л НЕРЕS (pH 7,4), що мiстив 0,3 моль/л NaCl i 0,005% твiн 20, iнку-
бували у присутностi або вiдсутностi монАТ II-5с впродовж 10 хв. Потiм в iнкубацiйне сере-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №5 153
довище додавали 1 ммоль/л GPRP, 0,1 ммоль/л ПХМБ i Thr до концентрацiї 0,1 NIH/мл.
Реакцiю зупиняли додаванням iнгiбiторiв Thr до концентрацiї 1 ммоль/л (PMSF) i плаз-
мiну — 10 мкг/мл (контрикал). Продукти реакцiї Fg i X1-фрагмента Fg з Thr у присут-
ностi та вiдсутностi монАТ II-5c пiддавали електрофоретичному аналiзу у вiдновлюваль-
них дисульфiднi зв’язки умовах. Денситометричний аналiз бiлкової смуги α-ланцюга Fg
показав зменшення її iнтенсивностi на 12% у присутностi монАТ II-5с (див. рис. 4). Iн-
тенсивнiсть смуги 24 кДа фрагмента α-ланцюга X1-фрагмента Fg у системi X1-фрагмент
Fg + Thr зменшувалась на 24% (не подано). Привертають увагу близькi значення пригнi-
чення рiвня експозицiї НАД та рiвня вiдщеплення FpA монАТ II-5с незалежно вiд того,
заблокована або нi полiмеризацiя та олiгомеризацiя Fn i desA Х1-фрагментiв Fg пепти-
дом GPRP (див. рис. 1). Отриманi результати свiдчать, що монАТ II-5с iнгiбує стадiю
вiдщеплення FpA тромбiном вiд молекули Fg, проте рiвень пригнiчення вiдщеплення FpA
менше рiвня iнгiбування зв’язування Thr з Fn i пригнiчення експозицiї НАД на мономер-
ному Fn.
Таким чином, результати проведеного дослiдження пiдтверджують гiпотезу про ES-ком-
плекс як тригер експозицiї НАД у Fn. Вони дозволяють припустити, що двоцентрова взає-
модiя Thr з Fg, ймовiрно, не є важливою для експозицiї НАД, оскiльки iнгiбування зв’язу-
вання Thr, опосередкованого взаємодiєю екзосайту 1 з сайтом, утвореним амiнокислотни-
ми залишками Трп33, Фен35, Асп38, Глу39 Аα-ланцюга, Ала68, Асп69 Вβ-ланцюга i Асп27
i Глу30 γ-ланцюга, iстотно не порушує каталiтичну функцiю субстратного комплексу — вiд-
щеплення FpA — i експозицiю НАД. Це погоджується з даними про те, що пептид Аα27–50
Fg iнгiбує полiмеризацiйну активнiсть Thr, але не впливає на каталiтичну активнiсть його
активного центру [15]. З iншого боку, блокування активного центру Thr не впливає на його
зв’язування з Е-гементиновим фрагментом Fg [11]. Обидва факти вказують на важливiсть
каталiтичного акту як тригера експозицiї НАД. Очевидно, що ключовою подiєю для не-
оборотної iндукцiї екпозицiї НАД у Fg є взaємодiя FpA з аполярним сайтом i активним
центром Thr i вiдщеплення FpA. Можна очiкувати, що дiлянка Аα1–27 молекули Fg, яка
включає FpA i фрагмент Аα17–27 у комплексi з ферментом, утворюють з лeйкоподiбним
доменом Е-регiону тимчасову структуру, яка стабiлiзує конформацiю усього Е-регiону моле-
кули (Аα1–110, Вβ1–138 i γ1–58)2. αС-регiони i Вβ1–42 пептиди не входить до цiєї структу-
ри, оскiльки в Х2-фрагментi Fg також експонується сайт НАД пiсля вiдщеплення FpA [2].
Вiдщеплення FpA руйнує цю структуру i iндукує структурнi перебудови у воронкоподiбно-
му субдоменi Е-регiону, якi за участю α-спiралей Аα-, Вβ- i γ-ланцюгiв транслокуються до
Bβ126–135 сайтiв молекули фiбрину.
1. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N. et al. A neoantigenic determinant in coiled coil region
of human fibrin β-chain // Thromb. Res. – 2009. – 123, No 5. – P. 765–770.
2. Урвант Л.П., Макогоненко Є.М., Березницький Г.К. та iн. Вiдщеплення фiбринопептиду А ви-
кликає структурнi перебудови в 118–134 дiлянцi Вβ-ланцюга молекули фiбрин(оген)у // Доп. НАН
України. – 2012. – № 7. – P. 170–175.
3. Урвант Л.П., Макогоненко Є.М., Пидюра М.О. та iн. Локалiзацiя епiтопу фiбрин-специфiчного
моноклонального антитiла I-3с в дiлянцi 118–134 Вβ-ланцюга фiбрину // Там само. – 2013. – № 10. –
С. 177–181.
4. Колеснiкова I.М., Луговська Н.Е., Луговськой Е. В. та iн. Моноклональнi антитiла, специфiчнi до
фiбрину людини // Там само. – 2006. – № 9. – С. 181–185.
5. Friguet B., Chaffotte A.F., Djavadi-Ochaniance Z., Goldberg M.E. Measurement of the true affinity
constant in solution of antigen-antibody complexes by ensyme-linked immunosorbent assay // J. Immunol.
Meth. – 1985. – 77, Nо 2. – P. 305–319.
154 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №5
6. Варецька Т.В. Мiкрогетерогеннiсть фiбриногену. Крiофiбриноген // Укр. бiохiм. журн. – 1960. – 32,
№ 1. – С. 13–24.
7. Thompson A.R., Enfield D. L., Ericsson L.H. et al. Human thrombin: partial primary structure // Arch.
Biochem. Biophys. – 1977. – 178, No 2. – P. 356–367.
8. Медведь Л.В., Горкун О.В., Маняков В.Ф., Белицер В.А. αС-Домены молекулы фибриногена
как структуры, ускоряющие самосборку фибрина // Молекул. биология. – 1986. – 20, № 2. –
С. 461–470.
9. Solov’ev D.A., Ugarova T. P. Isolation and characteristics of alpha-specific thrombin-like enzymes from
venoms of the common pit viper (Agkistrodon halys halys) and the eastern pit viper (the central Asian
subspecies Agkistrodon halys blomhoffii) // Biokhimiia. – 1993. – 58, Nо 8. – P. 1221–1233.
10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //
Nature. – 1970. – 227, Nо 5259. – P. 680–685.
11. Pechik I., Madrazo J., Mosesson M.W. et al. Crystal structure of the complex between thrombin and the
central “E” region of fibrin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – 101, Nо 9. – P. 2718–2723.
12. Vu T.T., Stafford A.R., Leslie B.A. et al. Batroxobin binds fibrin with higher affinity and promotes
clot expansion to a greater extent than thrombin // J. Biol. Chem. – 2013. – 288, Nо 23. –
P. 16862–16871.
13. Stabbs M.T., Bode W.A. A player of many parts: a spotlights falls on thrombin structure // Thromb.
Res. – 1993. – 69, Nо 1. – P. 1–59.
14. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N. et al. Two monoclonal antibodies to D-dimer-specific
inhibitors of fibrin polymerization // Thromb Res. – 2004. – 113, Nо 3./4. – P. 251–259.
15. Biennie C.D., Lord S. T. A synthetic analog of fibrinogen alpha 27–50 is an inhibitor of thrombin //
Thromb. Haemost. – 1991. – 65, No 2. – P. 165–168.
Надiйшло до редакцiї 18.11.2013Iнститут бiохiмiї iм. О.В. Палладiна
НАН України, Київ
Л.П. Урвант, Е.М. Макогоненко, Т. А. Позняк, Н.А. Пыдюра,
И.H. Колесникова, П. Ю. Цап, Г. К. Березницкий,
член-корреспондент НАН Украины Э.В. Луговской,
академик НАН Украины С.В. Комисаренко
Связывание монАТ II-5c с Aα20–78 участком фибриногена
ингибирует экспозицию неоантигенной детерминанты в Bβ126–135
сайте молекулы
Исследовано влияние монАТ II-5с, эпитоп которого локализован в Аα20–78 фрагменте Е-ре-
гиона молекулы фибриногена, на экспозицию неоантигенной детерминанты монАТ I-3с в хо-
де трансформации фибриногена в фибрин. С применением ИФ, ППР и электрофоретиче-
ского анализа установлено, что монАТ II-5с ингибирует связывание монАТ I-3с с фибри-
ном, тромбина с фибрином и отщепление фибринопептида А от фибриногена в системах
фибриноген+тромбин и Х-фрагмент фибриногена+тромбин. Эти данные подтверждают
нашу гипотезу о тромбин-фибриногеновом субстратном комплексе как триггере структур-
ной перестройки Е-регионов молекулы фибриногена, что сопровождается формированием в
Bβ126–135 участке фибрина сайта неоантигенной детерминанты монАТ I-3с.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2014, №5 155
L.P. Urvant, Е.М. Makogonenko, Т. А. Pozniak, N.А. Pydiura,
I.N. Kolesnikova, P.Y. Tsap, G.К. Bereznitzkiy,
Corresponding Member of the NAS of Ukraine E.V. Lugovskoy,
Academician of the NAS of Ukraine S.V. Komisarenko
Binding of mAb II-5c to Aα20–78 fragment of fibrinogen inhibits a
neoantigenic determinant exposure within Bβ126–135 site of a molecule
The influence of mAb II-5c, epitope of which was localized within Aα20–78 fragment of the E-region
of fibrinogen molecule, on the exposure of mAb I-3c neoantigenic determinant at the transformation
of fibrinogen to fibrin has been investigated. Using ELISA, SPR, and electrophoretic analysis, we
have found that mAb II-5c inhibited the binding of mAb I-3c to fibrin, thrombin to fibrin, and
thrombin cleavage of fibrinopeptide A from fibrinogen in fibrinogen + thrombin and X-fragment
fibrinogen + thrombin systems. These data support our hypothesis that the thrombin-fibrinogen
substrate complex is a trigger of the restructuring of a fibrinogen molecule at the transformation
in fibrin, which is accompanied by the formation of neoantigenic determinants of mAb I-3c within
Bβ126–135 site of a molecule.
156 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2014, №5
|