Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї
Вивчали взаємодiю “корового” олiгоаденiлату (2′,5′-A₃) та його аналогiв iз альбумiном, iнтерфероном, iнсулiном, iмуноглобулiном та кальмодулiном методом флуоресцентної спектроскопiї та мас-спектрометрiї. Показано, що всi дослiджуванi олiгоаденiлати гасять власну флуоресценцiю цих бiлкiв рiзною мiр...
Saved in:
| Published in: | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Date: | 2015 |
| Main Authors: | , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2015
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/95848 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї / В.В. Ткачук, С.М. Левченко, А.В. Ребрiєв, Л.В. Ткачук, С.I. Черних, З.Ю. Ткачук // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2015. — № 2. — С. 158-164. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859642560094404608 |
|---|---|
| author | Ткачук, В.В. Левченко, С.М. Ребрiєв, А.В. Ткачук, Л.В. Черних, С.I. Ткачук, З.Ю. |
| author_facet | Ткачук, В.В. Левченко, С.М. Ребрiєв, А.В. Ткачук, Л.В. Черних, С.I. Ткачук, З.Ю. |
| citation_txt | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї / В.В. Ткачук, С.М. Левченко, А.В. Ребрiєв, Л.В. Ткачук, С.I. Черних, З.Ю. Ткачук // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2015. — № 2. — С. 158-164. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Доповіді НАН України |
| description | Вивчали взаємодiю “корового” олiгоаденiлату (2′,5′-A₃) та його аналогiв iз альбумiном,
iнтерфероном, iнсулiном, iмуноглобулiном та кальмодулiном методом флуоресцентної
спектроскопiї та мас-спектрометрiї. Показано, що всi дослiджуванi олiгоаденiлати гасять власну флуоресценцiю цих бiлкiв рiзною мiрою i це гасiння має концентрацiйну
залежнiсть. 2′,5′-А₃ та його аналоги 2′,5′-А₃-thio, 2′,5′-A₃-ino i 2′,5′-A₃-cord iстотно гасять флуоресценцiю протеїнiв при збудженнi молекул довжиною хвилi 280 нм
i значно менше при збудженнi 296 нм, що може свiдчити про можливу роль тирозину
в процесах зв’язування цих препаратiв з бiлками. Разом з тим у випадку 2′,5′-А₃-epo
i 2′,5′-А₃-NH₂ їх взаємодiя з бiлками може вiдбуватися за участю тирозину i триптофану, оскiльки спостерiгається значне збiльшення гасiння флуоресценцiї бiлкiв при довжинi хвилi збудження 296 нм, особливо для 2′,5′-А₃-NH₂. Обговорюються можливi
механiзми взаємодiї олiгоаденiлатiв з дослiджуваними бiлками.
Изучали взаимодействие “корового” олигоаденилата (2′,5′-A₃) и его аналогов с альбумином,
интерфероном, инсулином, иммуноглобулином и кальмодулином методом флуоресцентной
спектроскопии и масс-спектрометрии. Показано, что все исследуемые олигоаденилаты тушат собственную флуоресценцию этих белков в разной степени и это тушение имеет концентрационную зависимость. 2′,5′-А₃ и его аналоги 2′,5′-А₃-thio, 2′,5′-A₃-ino i 2′,5′-A₃-cord
существенно тушат флуоресценцию протеинов при возбуждении молекул длиной волны
280 нм и значительно меньше при возбуждении 296 нм, что может свидетельствовать
о возможной роли тирозина в процессах связывания этих препаратов с белками. В то же
время в случае 2′,5′-А₃-epo и 2′,5′-A₃-NH₂ их взаимодействие с белками может происходить с участием тирозина и триптофана, поскольку наблюдается значительное увеличение тушения флуоресценции белков при длине волны возбуждения 296 нм, особенно для
2′,5′-А₃-NH₂. Обсуждаются возможные механизмы взаимодействия олигоаденилатов с исследуемыми белками.
The interactions between “core” oligoadenylates (2′,5′-A₃) and its analogs with albumin, interferon,
insulin, immunoglobulin, and calmodulin are studied, by using fluorescence spectroscopy and mass
spectrometry. It is shown that all oligoadenylates quench the intrinsic fluorescence of these proteins
in varying degrees. Quenching degree depends on the olygoadenylates concentration. 2′,5′-A₃ and its
analogs 2′,5′-A₃-thio, 2′,5′-A₃-ino, and 2′,5′-A₃-cord substantially quench the proteins fluorescence
excited at a wavelength of 280 nm and do significantly less at an excitation wavelength of 296 nm
that may indicate the possible tyrosine role in the binding of these drugs to proteins. At the same
time, in the case of 2′,5′-A₃-epo and 2′,5′-A₃-NH₂, their interaction with proteins can occur via
tyrosine and tryptophan, as there is a significant increase in the proteins fluorescence quenching at
an excitation wavelength of 296 nm, especially for 2′,5′-A₃-NH₂. Possible mechanisms of interaction
between the investigated proteins and oligoadenylates are under discussion.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:23:24Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 577.113.6:577.322:543.51
В.В. Ткачук, С.М. Левченко, А.В. Ребрiєв, Л.В. Ткачук,
С. I. Черних, З. Ю. Ткачук
Дослiдження взаємодiї “корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв
iз деякими протеїнами методом флуоресцентної
спектроскопiї
(Представлено членом-кореспондентом НАН України Д.М. Говоруном)
Вивчали взаємодiю “корового” олiгоаденiлату (2′,5′-A3) та його аналогiв iз альбумiном,
iнтерфероном, iнсулiном, iмуноглобулiном та кальмодулiном методом флуоресцентної
спектроскопiї та мас-спектрометрiї. Показано, що всi дослiджуванi олiгоаденiлати га-
сять власну флуоресценцiю цих бiлкiв рiзною мiрою i це гасiння має концентрацiйну
залежнiсть. 2′,5′-А3 та його аналоги 2′,5′-А3-thio, 2′,5′-A3-ino i 2′,5′-A3-cord iстот-
но гасять флуоресценцiю протеїнiв при збудженнi молекул довжиною хвилi 280 нм
i значно менше при збудженнi 296 нм, що може свiдчити про можливу роль тирозину
в процесах зв’язування цих препаратiв з бiлками. Разом з тим у випадку 2′,5′-А3-epo
i 2′,5′-A3-NH2 їх взаємодiя з бiлками може вiдбуватися за участю тирозину i трип-
тофану, оскiльки спостерiгається значне збiльшення гасiння флуоресценцiї бiлкiв при
довжинi хвилi збудження 296 нм, особливо для 2′,5′-А3-NH2. Обговорюються можливi
механiзми взаємодiї олiгоаденiлатiв з дослiджуваними бiлками.
Вiдомо, що 2′,5′-олiгоаденiлати вiдiграють ключову роль у механiзмi противiрусної дiї iн-
терферону, беруть участь у процесах клiтинного росту та диференцiацiї, апоптозу i можуть
бути перспективними препаратами в онкологiї [1]. Бiологiчна активнiсть олiгоаденiлатiв
пов’язана з активуванням ферменту РНКази L, яка специфiчно розщеплює вiруснi мРНК
i, таким чином, забезпечує противiрусну дiю. Активацiя можлива тiльки фосфорильовани-
ми 2′,5′-А, фосфатнi групи яких забезпечують зв’язування з ензимом. Дефосфорильованi
(“коровi“) 2′,5′-А не зв’язуються з РНКазою L та не активують її [1, 2]. Проте “коровi” олiго-
аденiлати є iнгiбiторами вiдторгнення тканин пiсля трансплантацiї, мають кардiопротектор-
ну дiю, стимулюють пролiферацiю стовбурових клiтин кiсткового мозку [3, 4]. Механiзм дiї
“корових” 2′,5′-А вивчено недостатньо. Невiдомi всi протеїни-мiшенi даних сполук, тому по-
шук цих протеїнiв та вивчення їх взаємодiї з 2′,5′-А обумовленi необхiднiстю зрозумiти дiю
цих речовин у клiтинi.
Одним iз пiдходiв до вивчення механiзмiв бiлково-нуклеїнових взаємодiй є застосування
методу флуоресцентної спектроскопiї, який дав би можливiсть вiдiбрати ефективнi препа-
рати для подальшого вивчення. В роботi дослiджували вплив 2′,5′-А3 та його аналогiв на
власну флуоресценцiю альбумiну, iнтерферону, iнсулiну, iмуноглобулiну G та кальмодулiну.
Ми припускаємо, що 2′,5′-олiгоА можуть дiяти за принципом аптамерiв, якi здатнi взаємо-
дiяти з певними бiлками. Якщо аптамери пригнiчують активнiсть цих бiлкiв, то виступають
як потужний специфiчний агент. Такi аптамери одержанi на ряд бiлкiв ВIЛ [5]. Ми вважали
за доцiльне перевiрити досить широкий спектр бiлкiв.
Унiверсальнiсть транспортної функцiї альбумiну забезпечується його унiкальною здат-
нiстю зв’язувати лiганди рiзної хiмiчної природи. Крiм низькомолекулярних лiгандiв, аль-
бумiн зв’язує також i бiополiмери, наприклад пептиди i нуклеїновi кислоти. Вивчення дiї
© В.В. Ткачук, С.М. Левченко, А.В. Ребрiєв, Л.В. Ткачук, С. I. Черних, З. Ю. Ткачук, 2015
158 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2015, №2
олiгонуклеотидiв на альбумiн є перспективним в планi розширення знань про роль i функ-
цiї альбумiн-нуклеїнових комплексiв у процесах життєдiяльностi людини в нормi та при
патологiї i також може сприяти розробцi нових дiагностичних методiв та лiкiв. Альбу-
мiн взаємодiє з багатьма ендогенними i екзогенними сполуками, якi зв’язуються з ви-
сокоафiнними сайтами з типовими константами зв’язування (Kзв) 104–106 М−1. Показа-
но, що водневi та гiдрофобнi зв’язки вiдiграють головну роль у даному процесi, Kзв =
= 104 М−1 [6].
Наступним дослiджуваним бiлком був iнтерферон людини, вивчення якого могло б вка-
зати на новий механiзм противiрусної дiї “корових” олiгоаденiлатiв. Вiдомо, що 26-членний
олiгонуклеотидний аптамер специфiчно зв’язується з iнтерфероном i змiнює його вторинну
i третинну структуру [7]. Серед лiтературних джерел ми не знайшли даних щодо зв’язу-
вання iнсулiну з олiгонуклеотидами, але збiльшується число доказiв, що рецептори iнсулi-
ну i iнсулiноподiбного фактору росту являють собою важливi мiшенi для розвитку нових
способiв лiкування дiабету i раку. Характеристики зв’язування iнсулiну з його рецепторами
вивчались методом флуоресцентної спектроскопiї [8]. У випадку iмуноглобулiнiв дослiджу-
валися конформацiйнi змiни протеїнiв, що вiдбуваються при взаємодiї антиген–антитiло [9].
Кальмодулiн є одним iз найбiльш детально вивчених Са-зв’язуючих бiлкiв, якi здатнi регу-
лювати активнiсть аденiлатациклази, NO-синтетази, фосфодiестерази, тобто брати участь
в метаболiзмi циклiчних АМФ i ГМФ [10]. На нашу думку, доцiльним є дослiдити взаємо-
дiю олiгоаденiлатiв з кальмодулiном.
Матерiали i методи. У дослiдженнi використовували iнтерферон людини (“Iнтер-
фармбiотек”, Україна) iмуноглобулiн G людини (“Octapharma”, Швейцарiя), альбумiн сиро-
ватки людини “Бiофарм”, Україна), рекомбiнантний людський iнсулiн (завод “Iндар”, Укра-
їна) та кальмодулiн. Дослiджували взаємодiю цих протеїнiв з природним тримером 2′,5′-А
та його аналогами, що мiстять в 3′ положеннi залишки 8-амiноаденозину (2′,5′-А-NH2), iно-
зину (2′,5′-А-ino), кордицепiну (2′,5′-А-cord), епоксиаденозину (2′,5′-А-epo), тiофосфатний
аналог тримера (2′,5′-А-thio). Препарати 2′,5′-А одержанi методами, описаними в [11].
Флуоресцентнi дослiдження. Реакцiю зв’язування 2′,5′-А з вiдповiдними протеїнами
проводили в буферi трис-НCl (20 мM, pH 7,6), який мiстив 100 мM NaCl та 5 мM MgCl2,
iнкубуючи 10 хв при 37 ◦С. Спектри флуоресценцiї записували на спектрофлуориметрi Cary
Eclipse (Австралiя) при довжинi хвилi збудження 280 та 296 нм у кварцовiй кюветi 10 мм.
Концентрацiя бiлкiв у всiх випадках становила 3,5 мкМ, крiм iнсулiну (35 мкМ), а 2′,5′-олi-
гоА — 0,5 мкМ. Величину гасiння флуоресценцiї Q визначали, як вiдносне зниження iн-
тенсивностi емiсiї протеїну за наявностi олiго-А3 порiвняно з контролем — iнтенсивнiстю
емiсiї самого протеїну:
Q =
F0 − F
F0
· 100%,
де F — iнтенсивнiсть флуоресценцiї протеїну за наявностi 2′,5′-олiгоА, F0 — iнтенсивнiсть
флуоресценцiї самого протеїну в тих самих умовах.
Мас-спектрометричний аналiз проводили на MALDI-TOF-спектрометрi Voyager DE
PRO (“Applied Biosystems”, США). Паспортна точнiсть вимiрювання мас становить 0,05%,
вимiрювання проводили в дiапазонi 700–50 000 m/z. Застосовували Н+-матричну iонiзацiю
бiлкiв i олiгонуклеотидiв за допомогою синапiнової кислоти (“Sigma-Aldrich”, США). Мо-
лекулярну масу визначали, вiднiмаючи вiд значення m/z однозарядженого iона одиницю
(молекулярна маса Н+ становить 1,007 Да). Проводили калiбрування приладу з викорис-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №2 159
танням калiбрувальної сумiшi calmix3 вiд виробника мас-спектрометра. Матричний реагент
готували, розчиняючи синапiнову кислоту (10 мг/мл) в сумiшi рiвних об’ємiв ацетонiтри-
лу та 0,1%-го водного розчину трифтороцтової кислоти (“Sigma-Aldrich”). Для нанесення
брали 1,5–2 мкл сумiшi розчинiв дослiджуваного зразка й реагенту (1 : 1). Використову-
вали лiнiйний режим роботи часоперельотного детектора, прикладена напруга становила
25 кВ, час затримки екстракцiї iонiв 500 нс. Коливання значення молекулярної маси для од-
нiєї речовини в рiзних спектрах пояснюється змiною роздiльної здатностi приладу залежно
вiд параметрiв аналiзу й неповною вiдтворюванiстю геометрiї пiкiв. Зменшення роздiльної
здатностi призводить до уширення пiкiв i, як наслiдок, до збiльшення рiзницi мiж експе-
риментально отриманою та розрахованою масою.
Результати та їх обговорення. З наведених у табл. 1 результатiв простежується за-
гальна тенденцiя, а саме гасiння флуоресценцiї дослiджуваних протеїнiв олiгоА3 та його
похiдними. Гасiння флуоресценцiї широко використовують для вивчення конформацiйної
динамiки бiополiмерiв [12]. На фонi загальних тенденцiй виявленi певнi вiдмiнностi у дiї
олiгоаденiлатiв на рiзнi бiлки. Так, 2′,5′-олiгоА3 майже однаково гасить флуоресценцiю всiх
дослiджуваних бiлкiв при λзб = 280 нм (41–47%), а кальмодулiну — на 69% i практично не
гасить її при λзб = 296 нм, крiм кальмодулiну (12,7%), що може свiдчити про ключову
роль тирозину у взаємодiї 2′,5′-А3 iз дослiджуваними протеїнами. Це пов’язано з тим, що
збудження молекул на довжинi хвилi 280 нм зумовлює флуоресценцiю i тирозину i три-
птофану, тодi як при збудженнi на довжинi хвилi 296 нм спостерiгається триптофанова
флуоресценцiя [13].
Аналог 2′,5′-А3-epo також при λзб = 280 нм гасить флуоресценцiю всiх бiлкiв (63–72%),
в той же час гасiння флуоресценцiї спостерiгається i при λзб = 296 нм (31–35%), крiм iнсу-
лiну, що свiдчить про роль триптофану у взаємодiї 2′,5′-А3-epo з дослiджуваними бiлками.
2′,5′-А3-thio гасить флуоресценцiю альбумiну та iмуноглобулiну на 33 i 27% вiдповiдно,
а iнтерферону та iнсулiну — на 50 i 59% вiдповiдно при λзб = 280 нм. При λзб = 296 нм
гасiння флуоресценцiї становить 5–14%, у випадку iнсулiну флуоресценцiя вiдсутня. Таким
чином, ми спостерiгаємо певнi вiдмiнностi у дiї 2′,5′-А3-thio на флуоресценцiю бiлкiв, що
також свiдчить про роль тирозину у зв’язуваннi бiлкiв з олiгоаденiлатами.
Найбiльш сильним гасником флуоресценцiї бiлкiв виявився 2′,5′-А3-NH2, який однако-
во гасив флуоресценцiю всiх дослiджуваних бiлкiв при довжинi хвилi збудження 280 нм
(54–68%) i 296 нм (46–57%), що свiдчить про роль i тирозину i триптофану у зв’язуваннi
цього похiдного олiгоаденiлату з альбумiном, iнтерфероном i iмуноглобулiном. Iнсулiн не
має триптофанових залишкiв у своїй молекулi, а має по чотири тирозинових залишка в А
i В ланцюгах.
Таблиця 1. Вплив 2′,5′-олiгоаденiлатiв на флуоресценцiю протеїнiв при λзб 280 та 296 нм
Олiгоаденiлат,
5 · 10−5 М
Гасiння флуоресценцiї Q, %
Альбумiн Iнтерферон Iнсулiн Iмуноглобулiн G Кальмодулiн
280 нм 296 нм 280 нм 296 нм 280 нм 296 нм 280 нм 296 нм 280 нм 296 нм
2′,5′-А3 47 4 41 0 47 0 42 0,6 69,0 12,7
2′,5′-А3-epo 69 33 63 31 72 0 67 35 54,5 16,5
2′,5′-A3-thio 33 9 50 14,3 59,3 0 27 4,8 — —
2′,5′-A3-NH2 60 46 67 57 68 0 54 53 — —
2′,5′-A3-ino 28 0 40 11 55 0 37,5 5 — —
2,5-A3-cord 31 0 58 15,4 61 0 60 16 — —
160 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2015, №2
Дослiдження впливу 2′,5′-А3-ino i 2′,5′-А3-cord на емiсiю тирозину i триптофану дослiд-
жуваних бiлкiв показало, що цi препарати сильнiше гасять тирозинову флуоресценцiю iн-
терферону (40 та 58% вiдповiдно), iнсулiну (55 та 61%), iмуноглобулiну (40 та 60%) i меншою
мiрою альбумiну (28 та 31%). Незначне гасiння триптофанової емiсiї спостерiгалося для iн-
терферону (11 та 15%) та iмуноглобулiну (5 та 16%). 2′,5′-А3-ino iстотно гасив тирозинову
флуоресценцiю iнсулiну (55%), iнтерферону (40%), iмуноглобулiну (37,5%), альбумiну (28%)
i практично не гасив триптофанову флуоресценцiю (iнтерферону на 11%, iмуноглобулiну
на 5%).
Пiдсумовуючи отриманi результати, можна припустити, що взаємодiя триолiгоаденiла-
тiв з дослiджуваними бiлками в основному вiдбувається за участю залишкiв тирозину або
в безпосереднiй близькостi до них, а роль триптофану, як правило, менша, але у випадку
використання як лiганду 2′,5′-А3-NH2 i деякою мiрою 2′,5′-А3-еро ключову роль у взаємодiї
протеїнiв з ними може вiдiгравати триптофан. Згiдно з отриманими результатими, також
можна припустити iмовiрнiсть гасiння власної флуоресценцiї бiлкiв за рахунок перепогли-
нання молекулами аденiлатiв фотонiв збудження флуоресценцiї протеїну. Можливе, також,
перехоплення енергiї електронного збудження тирозинових груп молекулами олiгоаденiла-
тiв, вiдомо, що в молекулi альбумiну знаходиться 1 триптофанова група i 18 тирозинових
груп. Крiм того, можливе утворення комплексiв мiж похiдними 2′,5′-А3 та оптичними цент-
рами протеїну. I, нарештi, можливий варiант, коли вiдбувається змiна конформацiї мак-
ромолекул протеїну пiд час контакту з 2′,5′-А. Для бiльш глибокого розумiння взаємодiї
протеїнiв з молекулами олiгоаденiлатiв були проведенi додатковi дослiдження з викорис-
танням мас-спектрометрiї. Адже саме мас-спектрометрiя MALDI-TOF (matrix assisted laser
desorbtion and ionisation time-of-flight mass speсtrometry, часоперольотна мас-спектрометрiя
з матрично-активованою лазерною десорбцiєю/iонiзацiєю) є одним iз сучасних методiв, за
допомогою якого можна дослiдити цю проблему. Метод успiшно застосовується для до-
слiдження бiомолекул: амiнокислот, пептидiв i бiлкiв, олiгонуклеотидiв i нуклеїнових ки-
слот [14, 15].
В роботi методом мас-спектрометрiї MALDI-TOF дослiджували серiю коротких 2′,5′-А
та їх комплекси з бiлком — α-iнтерфероном. Перш за все з високою точнiстю (<1%) було
визначено молекулярну масу дослiджуваних речовин (табл. 2) та пiдтверджено їх чистоту.
Додавання до iнтерферону 2′,5′-А3 та його модифiкованих аналогiв призвело до значних
змiн у їх мас-спектрах. Зокрема, в спектрi системи iнтерферон–2′,5′-А3 з’являються пiки зi
значеннями m/z 20179, 21112, 22044, 22998 та 23899 (рис. 1, а). Вони вiдповiдають ком-
плексам, що складаються з одної молекули α-iнтерферону та одної–п’яти молекул 2′,5′-А3.
Вiдхилення експериментального значення m/z вiд розрахованого теоретично для компле-
ксiв бiлка з одною та двома молекулами 2′,5′-А3 становить вiдповiдно 0,09 та 0,06%.
У мас-спектрi сумiшi α-iнтерферону й 2′,5′-А3-epo (див. рис. 1, б ) з’являється новий
пiк з m/z = 20177, що свiдчить про зв’язування α-iнтерферону з молекулою 2′,5′-А3-epo
Таблиця 2. Розрахованi значення молекулярної маси олiгорибонуклеотидiв та значення m/z, отриманi без-
посередньо зi спектрiв
Олiгоаденiлат Хiмiчна формула Молекулярна маса, M m/z
2′,5′-A3 C30H37N15O16P2 925,65 928,12
2′,5′-A3-epo C30H35N15O15P2 907,65 913,27
2′,5′-A3-ino C30H36N14O17P2 926,63 927,66
2′,5′-A3-cord C30H36N15O15P2 908,64 910,78
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №2 161
Рис. 1. MALDI-мас-спектр сумiшi α-iнтерферону з 2′,5′-А3 (а), 2′,5′-А3-еро (б ), 2′,5′-А3-inо (в), 2′,5′-А3-
cоrd (г)
(вiдхилення вiд теоретичного значення молекулярної маси комплексу 0,06%). У спектрi при-
сутнi також два менш iнтенсивних пiки, що вiдповiдають комплексам молекули iнтерферону
i двох та трьох молекул олiгонуклеотиду. Отже, епоксианалог 2′,5′-А3 також зв’язується
з iнтерфероном.
Аналогiчна ситуацiя спостерiгалася i для iнозинвмiсного олiгомеру — 2′,5′-А3-ino (див.
рис. 1, в). Згiдно з отриманими даними, молекула iнтерферону може приєднувати тiльки
двi молекули 2′,5′-А3-ino.
Експериментальнi результати дещо вiдрiзняються у випадку сумiшi iнтерферону-2′,5′-
А3-cord (див. рис. 1, г). Крiм пiкiв, якi належать бiлку, його мас-спектр мiстить три додат-
ковi пiки, якi належать комплексам мiж молекулою iнтерферону з одною, двома i трьома
молекулами 2′,5′-А3-ino.
Таким чином, згiдно з даними, отриманими з мас-спектрiв, усi дослiдженi 2′,5′-олiго-
аденiлати характеризуються здатнiстю зв’язуватися з iнтерфероном. Варто зазначити, що
цi данi узгоджуються з результатами, отриманими методом флуоресцентної спектроскопiї.
Отже, за допомогою методiв флуоресцентної спектроскопiї та методу MALDI-TOF
мас-спектрометрiї дослiджено здатнiсть 2′,5′-олiгоаденiлатiв зв’язуватися з рiзними бiлка-
ми, зокрема з α-iнтерфероном, що входить до системи 2′,5′ОАС/РНКаза L, у кiлькостi вiд
одної до п’яти молекул лiганду на молекулу бiлка, i утворювати стiйкi комплекси.
162 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2015, №2
1. Player M.R., Torrence P. F. The 2–5A system: modulation of viral and cellular processes through accelera-
tion of RNA degradation // Pharmacol. Ther. – 1998. – 78, No 2. – P. 55–113.
2. Malmgaard L. Induction and regulation of IFNs during viral infections // J. Interferon Cytokine Res. –
2004. – 24, No 8. – P. 439–454.
3. Tkachuk Z., Kvasyuk E., Matsuka G., Mikhalopulo I. (2′-5′) Oligoadenylate analogues useful as inhibitors
of host-vs.-graft response // Pat. US 5571799. – Publ. 05.11.96.
4. Ткачук З.Ю., Дубей I.Я., Яковенко Т. Г. та iн. Синтез 2′-5′-олiгоаденiлатiв та їхнiй вплив на про-лi-
ферацiю i мiграцiю стовбурових клiтин кiсткового мозку мишей in vitro та in vivo // Biopolymers and
Cell. – 2007. – 23, № 1. – P. 14–20.
5. Sullenger B.A., Gilboa E. Emerging clinical applications of RNA // Nature. – 2002. – 418, Iss. 6894. –
P. 252–258.
6. Kandagal P. B., Shaikh S.M.T., Manjunatha D.H. et al. Spectroscopic studies on the binding of bioactive
phenothiazine compounds to human serum albumin // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. – 2007. – 189. –
P. 121–127.
7. Balasubramanian V., Nguen L.T., Balasubramanian S.V., Ramanathan M. Interferon-gamma-inhibitory
oligodeoxynucleotides alter the conformation of interferon-gamma // Mol. Pharmacol. – 1998. – 53, No 5. –
P. 926–932.
8. Zhonq Z.-H. Pramanik A., Ekberq K. et al. Insulin binding monitored by fluorescence correlation spectros-
copy // Diabetologia. – 2001. – 44, Iss. 9. – P. 1184–1188.
9. Hill R. J. Quenching of tryptophan fluorescence in rabbit and bovine IgG // Eur. J. Immunol. – 1973. –
3, No 6. – P. 330–334.
10. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. Ч. 2. Структура и механизм функционирова-
ния // Сорос. образоват. журн. – 1998. – № 5. – С. 11–16.
11. Дубей I.Я., Дубей Л.В. Синтез (2′-5′)-триаденiлатiв та їхнiх аналогiв з використанням О-нуклео-
фiльного каталiзу реакцiї мiжнуклеотидної конденсацiї // Biopolymers and Cell. – 2007. – 23, № 6. –
P. 538–544.
12. Lakowicz J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. – 3rd ed. – New York: Springer, 2006. – 954 p.
13. Seedher N., Kanojia M. Mechanism of interaction of hypoglycemic agents glimepiride and glipizide with
human serum albumin // Centr. Eur. J. Chem. – 2009. – 7, No 1. – P. 96–104.
14. Gogichaeva N.V., Williams T., Alterman M.A. MALDI-TOF tandem mass spectrometry as a new tool
for amino acid analysis // J. Amer. Soc. Mass Spectrom. – 2007. – 18, No 2. – P. 279–284.
15. McIver R.T. Jr., Li Y., Hunter R. L. High-resolution laser desorption mass spectrometry of peptides and
small proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – 91, No 11. – P. 4801–4805.
Надiйшло до редакцiї 29.10.2014Iнститут молекулярної бiологiї i генетики
НАН України, Київ
Iнститут бiохiмiї iм. О.В. Палладiна
НАН України, Київ
В.В. Ткачук, С. Н. Левченко, А.В. Ребриев, Л. В. Ткачук, С.И. Черных,
З.Ю. Ткачук
Исследование взаимодействия “коровых” 2′,5′-олигоаденилатов
с некоторыми протеинами методом флуоресцентной спектроскопии
Изучали взаимодействие “корового” олигоаденилата (2′,5′-A3) и его аналогов с альбумином,
интерфероном, инсулином, иммуноглобулином и кальмодулином методом флуоресцентной
спектроскопии и масс-спектрометрии. Показано, что все исследуемые олигоаденилаты ту-
шат собственную флуоресценцию этих белков в разной степени и это тушение имеет кон-
центрационную зависимость. 2′,5′-А3 и его аналоги 2′,5′-А3-thio, 2′,5′-A3-ino i 2′,5′-A3-cord
существенно тушат флуоресценцию протеинов при возбуждении молекул длиной волны
280 нм и значительно меньше при возбуждении 296 нм, что может свидетельствовать
о возможной роли тирозина в процессах связывания этих препаратов с белками. В то же
время в случае 2′,5′-А3-epo и 2′,5′-A3-NH2 их взаимодействие с белками может происхо-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2015, №2 163
дить с участием тирозина и триптофана, поскольку наблюдается значительное увели-
чение тушения флуоресценции белков при длине волны возбуждения 296 нм, особенно для
2′,5′-А3-NH2. Обсуждаются возможные механизмы взаимодействия олигоаденилатов с ис-
следуемыми белками.
V.V. Tkachuk, S.M. Levchenko, A.V. Rebriev, L. V. Tkachuk,
S. I. Chernykh, Z. Yu. Tkachuk
Investigation of the interaction of “core” 2′,5′-oligoadenylates with some
proteins by fluorescence spectroscopy
The interactions between “core” oligoadenylates (2′,5′-A3) and its analogs with albumin, interferon,
insulin, immunoglobulin, and calmodulin are studied, by using fluorescence spectroscopy and mass
spectrometry. It is shown that all oligoadenylates quench the intrinsic fluorescence of these proteins
in varying degrees. Quenching degree depends on the olygoadenylates concentration. 2′,5′-A3 and its
analogs 2′,5′-A3-thio, 2′,5′-A3-ino, and 2′,5′-A3-cord substantially quench the proteins fluorescence
excited at a wavelength of 280 nm and do significantly less at an excitation wavelength of 296 nm
that may indicate the possible tyrosine role in the binding of these drugs to proteins. At the same
time, in the case of 2′,5′-A3-epo and 2′,5′-A3-NH2, their interaction with proteins can occur via
tyrosine and tryptophan, as there is a significant increase in the proteins fluorescence quenching at
an excitation wavelength of 296 nm, especially for 2′,5′-A3-NH2. Possible mechanisms of interacti-
on between the investigated proteins and oligoadenylates are under discussion.
164 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2015, №2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-95848 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:23:24Z |
| publishDate | 2015 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Ткачук, В.В. Левченко, С.М. Ребрiєв, А.В. Ткачук, Л.В. Черних, С.I. Ткачук, З.Ю. 2016-03-06T10:50:23Z 2016-03-06T10:50:23Z 2015 Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї / В.В. Ткачук, С.М. Левченко, А.В. Ребрiєв, Л.В. Ткачук, С.I. Черних, З.Ю. Ткачук // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2015. — № 2. — С. 158-164. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/95848 577.113.6:577.322:543.51 Вивчали взаємодiю “корового” олiгоаденiлату (2′,5′-A₃) та його аналогiв iз альбумiном, iнтерфероном, iнсулiном, iмуноглобулiном та кальмодулiном методом флуоресцентної спектроскопiї та мас-спектрометрiї. Показано, що всi дослiджуванi олiгоаденiлати гасять власну флуоресценцiю цих бiлкiв рiзною мiрою i це гасiння має концентрацiйну залежнiсть. 2′,5′-А₃ та його аналоги 2′,5′-А₃-thio, 2′,5′-A₃-ino i 2′,5′-A₃-cord iстотно гасять флуоресценцiю протеїнiв при збудженнi молекул довжиною хвилi 280 нм i значно менше при збудженнi 296 нм, що може свiдчити про можливу роль тирозину в процесах зв’язування цих препаратiв з бiлками. Разом з тим у випадку 2′,5′-А₃-epo i 2′,5′-А₃-NH₂ їх взаємодiя з бiлками може вiдбуватися за участю тирозину i триптофану, оскiльки спостерiгається значне збiльшення гасiння флуоресценцiї бiлкiв при довжинi хвилi збудження 296 нм, особливо для 2′,5′-А₃-NH₂. Обговорюються можливi механiзми взаємодiї олiгоаденiлатiв з дослiджуваними бiлками. Изучали взаимодействие “корового” олигоаденилата (2′,5′-A₃) и его аналогов с альбумином, интерфероном, инсулином, иммуноглобулином и кальмодулином методом флуоресцентной спектроскопии и масс-спектрометрии. Показано, что все исследуемые олигоаденилаты тушат собственную флуоресценцию этих белков в разной степени и это тушение имеет концентрационную зависимость. 2′,5′-А₃ и его аналоги 2′,5′-А₃-thio, 2′,5′-A₃-ino i 2′,5′-A₃-cord существенно тушат флуоресценцию протеинов при возбуждении молекул длиной волны 280 нм и значительно меньше при возбуждении 296 нм, что может свидетельствовать о возможной роли тирозина в процессах связывания этих препаратов с белками. В то же время в случае 2′,5′-А₃-epo и 2′,5′-A₃-NH₂ их взаимодействие с белками может происходить с участием тирозина и триптофана, поскольку наблюдается значительное увеличение тушения флуоресценции белков при длине волны возбуждения 296 нм, особенно для 2′,5′-А₃-NH₂. Обсуждаются возможные механизмы взаимодействия олигоаденилатов с исследуемыми белками. The interactions between “core” oligoadenylates (2′,5′-A₃) and its analogs with albumin, interferon, insulin, immunoglobulin, and calmodulin are studied, by using fluorescence spectroscopy and mass spectrometry. It is shown that all oligoadenylates quench the intrinsic fluorescence of these proteins in varying degrees. Quenching degree depends on the olygoadenylates concentration. 2′,5′-A₃ and its analogs 2′,5′-A₃-thio, 2′,5′-A₃-ino, and 2′,5′-A₃-cord substantially quench the proteins fluorescence excited at a wavelength of 280 nm and do significantly less at an excitation wavelength of 296 nm that may indicate the possible tyrosine role in the binding of these drugs to proteins. At the same time, in the case of 2′,5′-A₃-epo and 2′,5′-A₃-NH₂, their interaction with proteins can occur via tyrosine and tryptophan, as there is a significant increase in the proteins fluorescence quenching at an excitation wavelength of 296 nm, especially for 2′,5′-A₃-NH₂. Possible mechanisms of interaction between the investigated proteins and oligoadenylates are under discussion. uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біохімія Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї Исследование взаимодействия “коровых” 2′;5′-олигоаденилатов с некоторыми протеинами методом флуоресцентной спектроскопии Investigation of the interaction of “core” 2′;5′-oligoadenylates with some proteins by fluorescence spectroscopy Article published earlier |
| spellingShingle | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї Ткачук, В.В. Левченко, С.М. Ребрiєв, А.В. Ткачук, Л.В. Черних, С.I. Ткачук, З.Ю. Біохімія |
| title | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї |
| title_alt | Исследование взаимодействия “коровых” 2′;5′-олигоаденилатов с некоторыми протеинами методом флуоресцентной спектроскопии Investigation of the interaction of “core” 2′;5′-oligoadenylates with some proteins by fluorescence spectroscopy |
| title_full | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї |
| title_fullStr | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї |
| title_full_unstemmed | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї |
| title_short | Дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї |
| title_sort | дослiдження взаємодiї "корових” 2′,5′-олiгоаденiлатiв iз деякими протеїнами методом флуоресцентної спектроскопiї |
| topic | Біохімія |
| topic_facet | Біохімія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/95848 |
| work_keys_str_mv | AT tkačukvv doslidžennâvzaêmodiíkorovih25oligoadenilativizdeâkimiproteínamimetodomfluorescentnoíspektroskopií AT levčenkosm doslidžennâvzaêmodiíkorovih25oligoadenilativizdeâkimiproteínamimetodomfluorescentnoíspektroskopií AT rebriêvav doslidžennâvzaêmodiíkorovih25oligoadenilativizdeâkimiproteínamimetodomfluorescentnoíspektroskopií AT tkačuklv doslidžennâvzaêmodiíkorovih25oligoadenilativizdeâkimiproteínamimetodomfluorescentnoíspektroskopií AT černihsi doslidžennâvzaêmodiíkorovih25oligoadenilativizdeâkimiproteínamimetodomfluorescentnoíspektroskopií AT tkačukzû doslidžennâvzaêmodiíkorovih25oligoadenilativizdeâkimiproteínamimetodomfluorescentnoíspektroskopií AT tkačukvv issledovanievzaimodeistviâkorovyh25oligoadenilatovsnekotorymiproteinamimetodomfluorescentnoispektroskopii AT levčenkosm issledovanievzaimodeistviâkorovyh25oligoadenilatovsnekotorymiproteinamimetodomfluorescentnoispektroskopii AT rebriêvav issledovanievzaimodeistviâkorovyh25oligoadenilatovsnekotorymiproteinamimetodomfluorescentnoispektroskopii AT tkačuklv issledovanievzaimodeistviâkorovyh25oligoadenilatovsnekotorymiproteinamimetodomfluorescentnoispektroskopii AT černihsi issledovanievzaimodeistviâkorovyh25oligoadenilatovsnekotorymiproteinamimetodomfluorescentnoispektroskopii AT tkačukzû issledovanievzaimodeistviâkorovyh25oligoadenilatovsnekotorymiproteinamimetodomfluorescentnoispektroskopii AT tkačukvv investigationoftheinteractionofcore25oligoadenylateswithsomeproteinsbyfluorescencespectroscopy AT levčenkosm investigationoftheinteractionofcore25oligoadenylateswithsomeproteinsbyfluorescencespectroscopy AT rebriêvav investigationoftheinteractionofcore25oligoadenylateswithsomeproteinsbyfluorescencespectroscopy AT tkačuklv investigationoftheinteractionofcore25oligoadenylateswithsomeproteinsbyfluorescencespectroscopy AT černihsi investigationoftheinteractionofcore25oligoadenylateswithsomeproteinsbyfluorescencespectroscopy AT tkačukzû investigationoftheinteractionofcore25oligoadenylateswithsomeproteinsbyfluorescencespectroscopy |