Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase
Adsorption and covalent anchorage of alkaline phosphatase on the surface of amine-containing chemically modified silicas have been studied
Gespeichert in:
| Datum: | 2007 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine
2007
|
| Online Zugang: | https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/213 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Surface |
| Завантажити файл: |  |
Institution
Surface| _version_ | 1869291317829304320 |
|---|---|
| author | Bereza-Kindzerskaya, L. V. Kondakova, L. V. Tertykh, V. A. Yanishpolskiy, V. V. Vovk, A. I. |
| author_facet | Bereza-Kindzerskaya, L. V. Kondakova, L. V. Tertykh, V. A. Yanishpolskiy, V. V. Vovk, A. I. |
| author_institution_txt_mv | [
{
"author": "L. V. Bereza-Kindzerskaya",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
},
{
"author": "L. V. Kondakova",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
},
{
"author": "V. A. Tertykh",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
},
{
"author": "V. V. Yanishpolskiy",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
},
{
"author": "A. I. Vovk",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
}
] |
| author_sort | Bereza-Kindzerskaya, L. V. |
| baseUrl_str | |
| collection | OJS |
| datestamp_date | 2018-11-27T09:40:57Z |
| description | Adsorption and covalent anchorage of alkaline phosphatase on the surface of amine-containing chemically modified silicas have been studied |
| first_indexed | 2025-07-22T19:31:09Z |
| format | Article |
| fulltext |
Химия, физика и технология поверхности. 2007. Вып 13. С.99-104
99
УДК 541.183:577.152.1
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ КРЕМНЕЗЕМНЫЕ НОСИТЕЛИ
ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ
Л.В. Береза-Киндзерская, Л.В. Кондакова,
В.В. Янишпольский, В.А. Тертых
Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной академии наук Украины
ул. Генерала Наумова, 17, 03164, Киев-164
Изучена адсорбция и ковалентное связывание щелочной фосфатазы на поверх-
ности аминосодержащих химически модифицированных кремнеземов.
Adsorption and covalent anchorage of alkaline phosphatase on the surface of amine-
containing chemically modified silicas have been studied.
Введение
Образование и гидролиз фосфорилированных низкомолекулярных соединений, а
также фосфорилирование и дефосфорилирование белков, происходящие под действием
специфических и неспецифических фосфатаз [1, 2], относятся к ключевым стадиям
многих биохимических процессов, важных для функционирования живых организмов.
Иммобилизация фосфатаз на поверхности носителя позволяет с более благоприятных
позиций исследовать свойства биокатализатора и дает ряд существенных преимуществ
при его использовании в биотехнологических процессах.
В работе исследованы некоторые возможности получения гетерогенных
препаратов щелочной фосфатазы путем иммобилизации фермента на поверхности
химически модифицированных кремнеземов. Белковая часть фермента содержит амино-
и карбоксильные группы, по которым можно осуществить связывание с поверхностью
кремнезема [3].
Экспериментальная часть
Был синтезирован ряд носителей на основе кремнезема с амино- и карбониль-
ными группами в поверхностном слое. Для получения аминоорганокремнеземов прово-
дили реакцию поверхностных силанольных групп с 3-аминопропилтриэтоксисиланом
[4, 5], а также использовали адсорбцию природного полисахарида хитозана [6], макро-
молекулы которого содержат амино- и гидроксильные группы. Для получения носителя
с карбонильными группами в привитом модифицирующем слое применяли взаимо-
действие аминокремнезема с аскорбиновой кислотой и ее окисленной формой – дегидро-
аскорбиновой кислотой [7]. Предполагалось при этом, что упомянутые реагенты и
мягкие условия активации поверхности должны благоприятствовать получению актив-
ных препаратов иммобилизованной щелочной фосфатазы.
В работе использовали силохром С-120 (Ставропольский завод химреактивов и
люминофоров) с удельной поверхностью 120 м2/г и размером пор 24 нм. Концентрация
поверхностных силанольных групп составляет 1,2 – 1,7 мкмоль/м2 (0,2 ммоль/г). Исполь-
зовали также хитозан или поли(D-глюкозамин) (SIGMA) со степенью деацетилирования
85 %, 3-аминопропилтриэтоксисилан (Wacker-Silicone), щелочную фосфатазу (Fluka),
полученную из тонких кишок телят (активность 1,18 ед./мг белка). Готовили исходный
100
0,1 %-ный раствор хитозана растворением в 2 %-ой аскорбиновой кислоте. Применяли
1 %-ный раствор аскорбиновой кислоты (фарм., Укрхимэкспо), а также раствор
окисленной формы аскорбиновой кислоты, который готовили из 1 %-го раствора
аскорбиновой кислоты, оставив на неделю при контакте с кислородом воздуха.
Образующийся раствор дегидроаскорбиновой кислоты приобретает желтый цвет.
Аминокремнезем готовили следующим образом [4]. Один грамм кремнезема
нагревали при 673 К в течение 2 ч для удаления физически сорбированной воды, потом
заливали раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана в толуоле из расчета 0,2 г силана на
1 г кремнезема и кипятили в реакторе с обратным холодильником при постоянном пере-
мешивании 2 ч. После этого носитель отмывали толуолом и ацетоном до полного уда-
ления несвязавшегося силана, и сушили 4 ч при 353 К. Полноту отмывания несвязав-
шегося силана контролировали визуально по отсутствию цветной реакции промывной
жидкости с салициловым альдегидом (в присутствии первичных аминов появляется
желтое окрашивание). Содержание хемосорбированных аминогрупп определяли
спектрофотометрическим методом, аналогично описанному в работе [8]. Для этого к
аминокремнезему добавляли салициловый альдегид, носитель при этом окрашивался в
желтый цвет за счет хемосорбции альдегида на поверхностных аминогруппах. Потом
образец сушили и добавляли раствор моноэтаноламина в ацетоне. После десорбции
салицилового альдегида раствор желтел вследствие образования альдиминовой связи
между альдегидом и моноэтаноламином, и этот желтый раствор спектрофотометриро-
вали в области 400 нм. Количество привитых аминогрупп на 1 г кремнезема составляло
0,22 ммоль.
Для качественной и количественной характеризации хитозана осуществляли
реакцию комплексообразования между кислотной формой сульфафталеинового кра-
сителя и основной аминогруппой хитозана. Метод еще известен как белковая ошибка
индикатора [9]. В качестве сульфафталеинового красителя использовали бромпирогал-
лоловый красный в фосфатном буфере. Исходный красный раствор бромпирогаллоло-
вого красного при добавлении в раствор хитозана изменял окраску на фиолетовую.
Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине
волны l = 590 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве раствора сравнения применяли
раствор бромпирогаллолового красного.
Количество хемосорбированной аскорбиновой кислоты на кремнеземах опреде-
ляли по разнице между количеством кислоты, взятой для модификации, и ее остатком в
промывных жидкостях, определенное спектрофотометрическим методом, описанным в
работе [10]. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать
подкисленный раствор гептамолибдата аммония до молибденовой сини и измерении
оптической плотности синего раствора при 720 нм.
ИК-спектры образцов модифицированных кремнеземов регистрировали на
однолучевом ИК Фурье спектрометре Thermo Nicolet Nexus FT-IR в области частот 500 –
4000 см-1. Для этого модифицированные образцы смешивали со свежепрокаленным KBr
при массовом соотношении компонентов 0,015:0,3.
Результаты и их обсуждение
Для иммобилизации фермента вначале получали аминокремнезем (образец 1),
затем полученный модифицированный кремнезем обрабатывали аскорбиновой кислотой
(образец 2) или окисленной формой аскорбиновой кислоты (образец 3). Для этого 200 мг
аминокремнезема заливали 10 мл 1 %-го раствора аскорбиновой кислоты и соответст-
венно 10 мл раствора окисленной аскорбиновой кислоты, которую получали из 1 %-ой
аскорбиновой кислоты. Реакционную смесь выдерживали 24 ч при комнатной темпе-
ратуре, перемешивая. Потом образцы промывали дистиллированной водой и сушили
101
при 303 К два дня. Параллельно для сравнения подобным образом обрабатывали раст-
вором аскорбиновой кислоты (образец 4) или раствором окисленной аскорбиновой
кислоты (образец 5) поверхность исходного силохрома. Количество аскорбиновой кис-
лоты, привитой к поверхности аминокремнезема, и кислоты, сорбированной на силохро-
ме, составляет 0,095 и 0,020 ммоль/г соответственно. Следует отметить, что кремнезем
по ходу синтеза образцов 4, 5 изменял цвет на слегка желтоватый.
Как известно, аскорбиновая кислота под действием кислорода воздуха окисляется
до дегидроаскорбиновой кислоты, и в молекуле появляются три карбонильные группы
(рис. 1).
OHHO
O
OH
OH
O
O O
O
O
OH
OH
O2
Рис. 1. Реакция перехода аскорбиновой кислоты в окисленную форму.
Обе формы аскорбиновой кислоты были использованы, так как при взаимодейст-
вии с аминокремнеземом они связываются с поверхностью аналогичным способом
(рис. 2, 3), при этом кремнеземы окрашиваются в одинаковый цвет – оранжево-корич-
невый, который не меняется после промывания и высушивания, что свидетельствует о
присоединении одних и тех же поверхностных групп. Схемы происходящих при этом
химических реакций представлены на рис. 2, 3.
NH2
O O
O
O
OH
OH
+
O
O
O
OH
OH
NH2
O
O
OH
OH
NN N
SiO2
SiO2 SiO2
Фер-т
Фер-т
Рис. 2. Реакция взаимодействия аминокремнезема с окисленной формой аскорбиновой
кислоты.
NH2
OHHO
O
O
OH
OH
+
O
O
O
OH
OH
NH2
O
O
OH
OH
NN N
SiO2
SiO2 SiO2
O2
Фер-т
Фер-т
Рис 3. Реакция взаимодействия аминокремнезема с аскорбиновой кислотой.
102
Для иммобилизации фермента применяли также кремнезем, модифицированный
природным биополимером – хитозаном (образец 6). Хитозан, как известно, обладает
такими свойствами как гидрофильность, биосовместимость, и содержит в структуре
амино- и гидроксигруппы (рис. 4).
OH
O
H
H
H
H
H
H
O
O
OHOH
CH2OHCH2OH
H
H
n
NH2 NH2
Рис. 4. Структурная формула хитозана.
При этом использовали как способность хитозана к растворению в аскорбиновой
кислоте, так и возможность одновременной модификации входящих в состав полимера
аминогрупп под действием аскорбиновой кислоты. Синтез проводили следующим обра-
зом: к 200 мг силохрома прибавляли 1 мл 0,1 %-го раствора хитозана в 2 %-ой аскорби-
новой кислоте. Смесь выдерживали 24 ч при 303 К, промывали 25 мл дистиллированной
воды, за степенью отмывки хитозана следили качественно по реакции с бромпирогалло-
ловым красным. Модифицированный кремнезем сушили 5 ч при 353 К. Следует отме-
тить, что кремнезем также приобретал оранжево-коричневый цвет, что свидетельствует
о покрытии поверхности хитозаном и присоединении к поверхностным аминогруппам
окисленной формы аскорбиновой кислоты по реакции, представленной на рис. 3. Коли-
чество привитого хитозана составило 1,5 мг/г, количество хемосорбированной аскорби-
новой кислоты составило 0,04 ммоль/г.
Синтезированные образцы 1 – 6 были охарактеризованы методом ИК-спектро-
скопии и спектры сопоставлены со спектром чистого силохрома. Спектры представлены
на рис. 5, 6 (номера кривых соответствуют номерам образцов).
Как видно из спектров (рис. 5), аминокремнезем характеризуется поглощением в
области валентных колебаний С-Н связей при 2930 см-1, принадлежащим пропильным
группам, отсутствием характерной полосы поглощения изолированных силанольных
групп силохрома при 3750 см-1. Также проявляется полоса поглощения аминогрупп при
1520 см-1. Спектры аминокремнезем + аскорбиновая кислота, аминокремнезем + окис-
ленная аскорбиновая кислота, силохром + хитозан + аскорбиновая кислота схожи
(рис. 6), что свидетельствует о присутствии на поверхности одинаковых функциональ-
ных групп. Они имеют полосу поглощения при 2930 см-1 валентных колебаний С-Н
связей. Отсутствует характерная полоса поглощения изолированных силанольных групп
силохрома, появляется интенсивная полоса поглощения при 1660 см-1, принадлежащая
карбонильным группам, в области 1400 – 1540 см-1 проявляются также слабые полосы
деформационных колебаний углеводородной цепи. Спектры поглощения силохром +
аскорбиновая кислота и силохром + окисленная аскорбиновая кислота также подобны
(рис. 6), они не содержат полосу поглощения изолированных силанольных групп при
3750 см-1, но имеют интенсивную полосу в области поглощения карбонильных групп
при 1660 см-1.
103
4000 3000 2000 1000
0
50
100
150
П
ро
пу
ск
ан
ие
,
%
n, см-1
1
7
Рис. 5. ИК-спектры исходного силохрома (7) и аминокремнезема на его основе (1).
4000 3000 2000 1000
0
30
60
90
120
5
4
6
3
2
П
ро
пу
ск
ан
ие
,
%
n, см-1
Рис. 6. ИК-спектры аминокремнезема и силохрома, модифицированных аскорбиновой
кислотой (2 и 4 соответственно), или обработанных окисленной аскорбиновой
кислотой (3 и 5 соответственно); (6) – спектр силохрома, модифицированного
хитозаном в присутствии аскорбиновой кислоты.
В дальнейшем на всех полученных образцах носителей (образцы 1 – 6) была про-
ведена сорбция щелочной фосфатазы. При этом наибольшая активность фермента была
отмечена на аминоорганокремнеземе, она соответствует содержанию 1 мг биокатализа-
тора на 1 г носителя. На других носителях активность существенно не отличалась и
соответствовала 0,5 мг фермента на 1 г носителя. Активность сорбированной щелочной
фосфатазы на аминокремнеземе наблюдалась в течение 7 – 8 циклов работы, а на других
модифицированных кремнеземах активность уменьшалась за 3 – 4 цикла работы. Но
синтезированные носители, особенно силохром+ хитозан + аскорбиновая кислота, наи-
более перспективны для иммобилизации биологически-активных веществ вследствие
природного происхождения модифицирующего поверхность полимера. Полученные
104
препараты иммобилизованной щелочной фосфатазы могут быть использованы для
дальнейшего исследования их термостабильности и рН-зависимости.
Выводы
Синтезированы образцы кремнезема для иммобилизации щелочной фосфатазы.
Наряду с традиционным использованием аминоорганокремнеземов была исследована
возможность получения карбонильных групп закреплением аскорбиновой кислоты на
поверхности модифицированного кремнезема, а также методом покрытия поверхности
кремнезема хитозаном с одновременным присоединением аскорбиновой кислоты к
аминогруппам полимера. Проведена сорбция щелочной фосфатазы из тонких кишок
теленка на всех полученных носителях. Наибольшая активность фермента отмечена при
иммобилизации фермента на аминокремнеземе.
Благодарность
Авторы признательны профессору А.И. Вовку (Институт биоорганической химии
и нефтехимии НАН Украины) за предоставленные образцы фермента.
Литература
1. Admiraal S.J., Herschlag D. Mapping the transition state for ATP hydrolysis: implications
for enzymatic catalysis // Chem. Biol. – 1995. – V. 2, № 11. – P. 729 – 739.
2. Maegley K.A., Admiraal S.J., Herschlag D. Ras-catalyzed hydrolysis of GTP: a new
perspective from model studies // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1996. – V. 93, № 16. – P. 8160 –
8166.
3. Кольман Я., Рем К-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир. – 2000. – 469 с.
4. Иммобилизация a-амилазы на поверхности высокодисперсного кремнезема /
В.А. Тертых, В.В. Янишпольский, А.А. Чуйко, И.П. Галич, А.С. Цыперович,
Т.А. Ковальчук // Докл. АН УССР. Сер.Б. – 1977. – № 7. – С. 654 – 657.
5. Медицинская химия и клиническое применение диоксида кремния // Под ред.
А.А. Чуйко. – К.: Наук. думка, 2003. – 416 с.
6. Majeti N.V., Kumar R. A review of chitin and chitosan applications // Reactive &
Functional Polymers. – 2000. – V. 46. – P. 1 – 27.
7. Tiller J., Berlin P., Klemm D. A novel efficient enzyme-immobilization reaction on NH2
polymers by means of L-ascorbic acid // Biotechnol. Appl. Biochem. – 1999. – V. 30. –
P. 155 – 162.
8. Озольниш А.Я. Спектрофотометрические методы определения доступных амино- и
альдегидных групп на модифицированных силохромах // Труды Таллинского
политехн. ин-та. – 1980. – С. 33 – 43.
9. Кузнецов В.В. Определение рН // Соросовский образовательный журнал. – 2001.–
Т. 7, № 4. – С. 44 – 51.
10. Цап М.Л. Спектрофотометрический метод определения малых количеств аскорби-
новой кислоты в водных растворах // Биохимия. – 1956. – Т. 21, № 5. – С. 534 – 537.
Экспериментальная часть
|
| id | oai:ojs.pkp.sfu.ca:article-213 |
| institution | Surface |
| keywords_txt_mv | keywords |
| language | Russian |
| last_indexed | 2026-03-12T17:06:01Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine |
| record_format | ojs |
| resource_txt_mv | surfacezbircomua/ef/10e8e3b8811dd9e65e29fb6520ff46ef.pdf |
| spelling | oai:ojs.pkp.sfu.ca:article-2132018-11-27T09:40:57Z Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase Модифицированные кремнеземные носители для иммобилизации щелочной фосфатазы Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase Bereza-Kindzerskaya, L. V. Kondakova, L. V. Tertykh, V. A. Yanishpolskiy, V. V. Vovk, A. I. Adsorption and covalent anchorage of alkaline phosphatase on the surface of amine-containing chemically modified silicas have been studied Изучена адсорбция и ковалентное связывание щелочной фосфатазы на поверхности аминосодержащих химически модифицированных кремнеземов Adsorption and covalent anchorage of alkaline phosphatase on the surface of amine-containing chemically modified silicas have been studied Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine 2007-06-21 Article Article application/pdf https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/213 Surface; No. 13 (2007): Chemistry, Physics and Technology of Surface; 99-104 Поверхность; № 13 (2007): Химия, физика и технология поверхности; 99-104 Поверхня; № 13 (2007): Хімія, фізика та технологія поверхні; 99-104 3154-8091 3154-8083 ru https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/213/212 Авторське право (c) 2007 L.V. Bereza-Kindzerskaya, L.V. Kondakova, V.A. Tertykh, V.V. Yanishpolskiy, А.I. Vovk |
| spellingShingle | Bereza-Kindzerskaya, L. V. Kondakova, L. V. Tertykh, V. A. Yanishpolskiy, V. V. Vovk, A. I. Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| title | Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| title_alt | Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase Модифицированные кремнеземные носители для иммобилизации щелочной фосфатазы |
| title_full | Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| title_fullStr | Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| title_full_unstemmed | Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| title_short | Modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| title_sort | modified siliceous carrires for immobilization of alkaline phosphatase |
| url | https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/213 |
| work_keys_str_mv | AT berezakindzerskayalv modifiedsiliceouscarriresforimmobilizationofalkalinephosphatase AT kondakovalv modifiedsiliceouscarriresforimmobilizationofalkalinephosphatase AT tertykhva modifiedsiliceouscarriresforimmobilizationofalkalinephosphatase AT yanishpolskiyvv modifiedsiliceouscarriresforimmobilizationofalkalinephosphatase AT vovkai modifiedsiliceouscarriresforimmobilizationofalkalinephosphatase AT berezakindzerskayalv modificirovannyekremnezemnyenositelidlâimmobilizaciiŝeločnojfosfatazy AT kondakovalv modificirovannyekremnezemnyenositelidlâimmobilizaciiŝeločnojfosfatazy AT tertykhva modificirovannyekremnezemnyenositelidlâimmobilizaciiŝeločnojfosfatazy AT yanishpolskiyvv modificirovannyekremnezemnyenositelidlâimmobilizaciiŝeločnojfosfatazy AT vovkai modificirovannyekremnezemnyenositelidlâimmobilizaciiŝeločnojfosfatazy |