Lyposome prepfration for directed transportation of drugs

The review is presents the results of the synthesis of liposomes for the targeted drug delivery into the tumor cells. The usage of the definite combination of saturated phospholipids and cholesterol leads to their stability increasing. On using unsaturated phospholipids for liposome preparation one...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2009
Hauptverfasser:	Turanskaya, S. P., Turov, V. V., Gorbyk, P. P.
Format:	Artikel
Sprache:	Russisch
Veröffentlicht:	Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine 2009
Online Zugang:	https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/343
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Surface
Завантажити файл:

Institution

Surface

_version_	1869291461812420608
author	Turanskaya, S. P. Turov, V. V. Gorbyk, P. P.
author_facet	Turanskaya, S. P. Turov, V. V. Gorbyk, P. P.
author_institution_txt_mv	[ { "author": "S. P. Turanskaya", "institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України" }, { "author": "V. V. Turov", "institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України" }, { "author": "P. P. Gorbyk", "institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України" } ]
author_sort	Turanskaya, S. P.
baseUrl_str
collection	OJS
datestamp_date	2018-11-27T09:40:12Z
description	The review is presents the results of the synthesis of liposomes for the targeted drug delivery into the tumor cells. The usage of the definite combination of saturated phospholipids and cholesterol leads to their stability increasing. On using unsaturated phospholipids for liposome preparation one could undertake precautions to minimize oxidation. Depending on the molar ratio of phospholipids and cholesterol, the size of magnetic liposomes is different. The liposomes of lesser diameter are preferable to larger ones because of their ability to escape phagocytosis by the cells of reticuloendothelial system and permeate from the bloodstream into the interstice easily. Among the liposomes, containing polyethylene glycol and antibodies, the most optimal ones are those, which contain the antibodies attached to distal edges of polyethylene glycol molecule chains. The antibody may be attached to polyethylene glycol molecule with the help of thioester or amide bond. In order to obtain sterically stabilized liposomes, water soluble carbodiimide should be taken.
first_indexed	2025-07-22T19:32:18Z
format	Article
fulltext	УДК 539.211:541.302 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЛИПОСОМ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С.П. Туранская, В.В. Туров, П.П. Горбик Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной академии наук Украины ул. Генерала Наумова, 17, 03164, Киев-164 Представлен обзор литературы по синтезу липосом для направленного транспорта лекарственных препаратов в опухолевые клетки. Использование определенной комбинации насыщенных фосфолипидов и холестерола в составе липосом приводит к повышению их стабильности. При использовании для приготовления липосом ненасыщенных фосфоли- пидов должны предприниматься меры для предотвращения окисления. В зависимости от молярного соотношения фосфолипидов и холестерола магнитные липосомы имеют различ- ные размеры. Липосомы меньшего диаметра имеют преимущества перед липосомами больших размеров, поскольку они после внутривенного введения могут избегать фаго- цитоза клетками ретикулоэндотелиальной системы и способны легко проникать из кровеносной системы в межклеточное пространство. Среди липосом, содержащих поли- этиленгликоль и антитела, оптимальными считаются липосомы, в которых антитела были прикреплены к дистальным концам цепей ПЭГ, связанного с липосомами. Антитела могут быть прикреплены к молекуле ПЭГ посредством тиоэфирной или амидной связи. Для получения пространственно стабилизированных липосом может использоваться раство- римый в воде карбодиимид. Введение По мере разработки и усовершенствования методик в противоопухолевой терапии все шире используются такие носители лекарственных препаратов, как липосомы – однослойные или многослойные липидные везикулы, содержащие в своем внутреннем пространстве растворенное в водной среде, либо нерастворимое, липофильное, лекарство. Липосомные мембраны обычно построены из двойного слоя молекул фосфолипидов, обра- щенных друг к другу неполярными «хвостами», и расположенных между ними молекул холестерола (рис. 1, 2). Липосома может содержать лекарства в одном или трех потенци- альных компартментах: растворимые в воде препараты – в водной фазе, которая захватыва- ется внутрь везикулы в процессе приготовления; липофильные препараты – в мембране; пептиды и малые белки – на границе раздела фаз липиды/вода [1]. Рис. 1. Схема строения однослойной липосомы [1]. фосфолипид холестерол водная фаза Рис. 2. Схема строения многослойной липосомы [1]. После внутривенного введения липосом они опсонизируются, т.е. связываются белками-опсонинами, распознаваемыми клетками иммунной системы, осуществляющими фагоцитоз. Таким образом происходит быстрая элиминация липосом из кровеносной системы (в течение нескольких минут) и накопление их в печени, селезенке, а также, в меньшем количестве, в костном мозге. Для увеличения времени циркуляции липосом в кровеносной системе и повышения вероятности достижения опухолевых клеток в состав липидных везикул вводят гидрофильный полимер полиэтиленгликоль либо фосфолипиды, образующие на поверхности липосом «щетину» – стерическое препятствие, не позволя- ющее молекулам опсонинов и макрофагам (клеткам иммунной системы, осуществляющим фагоцитоз) взаимодействовать с липосомами. Применение липосом, меченых антителами – молекулами, специфично распознава- емыми определенными рецепторами на поверхности только опухолевых клеток, позволяет вводить лекарство только в клетки-мишени, что значительно уменьшает сильное токсичес- кое воздействие противоопухолевых препаратов на организм. Поскольку на клетках не всех типов опухолей имеются рецепторы, распознаваемые антителами, применяются приемы направленного транспорта лекарственных препаратов к опухолевым клеткам, связанные с: - прикреплением к липосомам лигандов, распознаваемых определенными участками поверхности опухолевых клеток (олигосахаридов, витаминов, пептидов, белков); - включением в состав липосом холестерола, химически модифицированного лиганда- ми для специфичного связывания с определенными органами или типами клеток; - включением в состав липосом парамагнитных наночастиц, приводимых в движение при наложении статического магнитного поля, для подведения липосом непосредст- венно к больному органу. - Эти приемы позволяют обеспечить направленный транспорт препарата к клеткам- мишеням и, таким образом, существенно снизить побочное действие противоопухолевой терапии. После связывания лигандов, прикрепленных на поверхности липосом, с опреде- ленными участками поверхности клеток-мишеней (опухолевых клеток), происходит слияние липидных везикул – липосом с двойной липопротеидной мембраной клетки и проникновение содержимого липосом в клетку. Присутствие в липосомах парамагнитных наночастиц позволяет производить селективный нагрев клеток-мишеней при поглощении энергии переменного магнитного поля, приводящий к их гибели. 1. Состав и стабильность липосом Липосомы получают из чистых липидов или их комбинации. Обычный компонент липосом – фосфолипиды. Липосомы синтезируют из множества синтетических и натураль- ных фосфолипидов, и обычно включают в их состав холестерол [1]. Для направленного транспорта лекарственных препаратов и селективного воздейст- вия на опухолевые клетки были приготовлены термочувствительные липосомы с использо- ванием синтетических липидов, таких как дипальмитоил-фосфатидилхолин, дистеароил- фосфатидилхолин и холестерол, способные к локальному высвобождению лекарства в ответ на гипертермию. Термочувствительные липосомы были приготовлены с применением нату- ральных липидов, яичного фосфатидилхолина и холестерола (в молярном соотношении 7 : 1), и этанола (6 % по объему). Эти липосомы имеют температуру перехода 43 оС, в тем- пературном диапазоне, достижимом при локальной гипертермической обработке опухолей. Преимущества липосом фосфатидилхолин:холестерол – способность к биодеградации, нетоксичность, доступная цена по сравнению с липосомами, приготовленными из синтети- ческих липидов, для использования в разнообразной терапии рака [2]. В зависимости от соотношения фосфатидилхолина и холестерола полученные липо- сомы имели различные диаметры (рис. 3) и эффективность инкапсуляции магнитной жид- кости (рис. 4). Фосфатидилхолин:холестерол (мол.) Метод тонкослойной гидратации Метод двойной эмульсии С ре дн ий д иа ме тр , н м Рис. 3. Размеры магнитных липосом, полученных различными ме- тодами [3]. Фосфатидилхолин:холестерол (мол.) Э фф ек ти вн ос ть и нк ап су ля ци и, % Рис. 4. Эффективность инкапсуляции липосомами магнитной жид- кости. TFH – липосомы были приготовлены методом тон- кослойной гидратации; DE – липосомы приготовлены ме- тодом двойной эмульсии [3]. Эффективность инкапсуляции незначительно снижалась при включении в состав липосом 5 % мол. дистеарил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленглико- ля) 2000] (рис. 5). Э фф ек ти вн ос ть ин ка пс ул яц ии , % 1 2 Рис. 5. Эффективность инкапсуляции магнитной жидкости липосомами, не содержащими (1) и содержащими (2) дистеарил-sn- глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(по- лиэтиленгликоль) 2000] [3]. Из рис. 3 и 4 видно, что магнитные липосомы оптимального состава, имеющие наименьший диаметр и наибольшую эффективность инкапсуляции, были получены при соотношении яичного фосфатидилхолина и холестерола 2:1 с применением метода тонко- пленочной гидратации. При соотношениях 1:1 и 1:2 инкапсуляция происходила с меньшей эффективностью, что может объясняться увеличением жесткости мембраны при более высоком содержании холестерола (≥ 50 % мол.). Молекулы холестерола играют важную роль в фазовом переходе фосфолипидного бислоя. Когда они присутствуют в фосфоли- пидном бислое, образуется третья фаза, т.е. жидкая упорядоченная фаза, вместо твердой упорядоченной или жидкой неупорядоченной фазы. Поэтому молекула холестерола, взаи- модействуя с двумя молекулами фосфолипида, предотвращает их переход через гель в жидко-кристаллическую фазу. При оптимальной концентрации 33 % мол. (2:1) указанный переход не наблюдается, т.к. все фосфолипиды мембраны образуют жидкую упорядочен- ную фазу [3]. При определенной температуре происходит фазовый переход фосфолипидной мемб- раны липосом из гелеобразной фазы в жидко-кристаллическую фазу, при этом повышается проницаемость мембран для растворенных веществ и воды. В этих условиях в образцах парамагнитных термочувствительных липосом значительно увеличивается время продоль- ной релаксации Т1 (по данным ЯМР спектроскопии), что связано с выходом парамагнит- ного материала из липосом и (или) увеличением скорости обмена воды между внутренним содержимым липосомы и окружающей средой [4]. Исследовали выход лекарственного препарата из липосом, приготовленных из смеси синтетических липидов, таких как дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфа- тидилхолин, у которых температура фазового перехода гель-золь на несколько градусов выше физиологической температуры. Максимальный выход препарата из липосом, у которых температура фазового перехода 41,4 оС, наблюдали при 42 оС (83 %) и менее 5 % – при температурах ниже 37 оС (рис. 6) [5]. Выход препарата из липосом при физиологической температуре (37 оС) и темпера- туре фазового перехода образующих липосому липидов (около 42 оС) исследовали также в работе [6] (рис. 7). Включение холестерола в липидную бислойную мембрану обычно приводит к повы- шению стабильности липосом в сыворотке, уменьшению проницаемости мембран к раство- римым в воде молекулам и повышению текучести или микровязкости бислоя. Наиболее часто используются для приготовления липосом такие фосфолипиды, как яичный фосфати- дилхолин, синтетические дипальмитоил-DL-α-фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, сфин- гомиелин, фосфатидилинозитол. Обычно в качестве основного липида для приготовления липосом используется цвиттер-ионный или неионный липид. Поверхностный заряд липосомы можно модифицировать включением в состав положительно заряженных липи- дов, таких как стеариламин, или отрицательно заряженных, таких как диацетилфосфат, фосфатидилглицерол, фосфатидилсерин. Присутствие отрицательно или положительно заряженных липидов приводит к увеличению общего объема водной фазы во внутреннем пространстве липосомы (в результате отталкивания соседних бислоев) и уменьшению вероятности агрегации липосом после их приготовления. Катионные липосомы могут иметь цитолитическую и цитотоксическую активность. Катионные липосомы, содержащие стеа- риламин, были токсичными для кроликов, поскольку вызывали гемолиз эритроцитов. Этот эффект был непосредственно связан с количеством стеариламина, присутствующего в составе липосом. К ол ич ес тв о пр еп ар ат а, вы ш ед ш ег о из л ип ос ом , % Температура, ◦С К ол ич ес тв о пр еп ар ат а, вы ш ед ш ег о из л ип ос ом , % Время инкубации, мин Рис. 6. Выход лекарственного препарата из липосом при повышении тем- пературы [5]. Рис. 7. Выход лекарственного препарата из липосом при повышении температуры [6]. Поскольку лекарственные препараты имеют ограниченную растворимость, количест- во лекарства, растворимого в воде, во внутреннем пространстве липосомы, зависит от объе- ма захваченной внутрь липосомы водной фазы. Крупные молекулы (например, пептиды и белки) лучше удерживаются внутри липосом, чем молекулы меньшего размера, которые могут медленно диффундировать сквозь липидные слои. Эффективность включения липофильных препаратов в липидные слои липосомы мо- жет достигать 100 %, в зависимости от типа и состава липосом. При помещении липосом в водное биологическое окружение гидрофобные лекарства хорошо удерживаются в липосо- мах благодаря их высоким коэффициентам разделения липид-вода. Утечка растворителя из липосом зависит от проницаемости мембран и от взаимо- действия с компонентами биологических жидкостей. Для уменьшения утечки растворителя можно контролировать текучесть мембран включением в состав липидного бислоя холесте- рола, или изменяя гидрофобно-липофобный характер бислоев, например, при использова- нии фторированного липида. Многомембранные везикулы менее склонны к утечке, чем одномембранные. С целью уменьшения утечек липосомы хранят в виде высушенных после замораживания порошков. Липидные везикулы могут подвергаться химической деградации. Гидролитическая деградация липидов или лекарственных препаратов во многих случаях зависит от рН и может быть предотвращена высушиванием (в замороженном виде) липосом до получения порошков. При использовании для приготовления липосом ненасыщенных фосфолипидов, должны предприниматься следующие меры для уменьшения окисления: использование светонепроницаемых контейнеров, применение антиоксидантов, таких как α-токоферол, деаэрация с применением аргона или азота для максимального уменьшения контакта с кислородом, удаление тяжелых металлов из среды [1]. 2. Методы приготовления липосом К настоящему времени многие сотни лекарств, включая противоопухолевые и противомикробные препараты, хелатирующие агенты, пептидные гормоны, ферменты, другие белки, вакцины и генетический материал, были включены в водные или липидные фазы липосом различного размера, состава и др. характеристиками с применением всевоз- растающего количества методик. Липосомы прошли эволюцию от простых эксперимен- тальных инструментов до индустриально производимых продуктов для клинического и ветеринарного использования. Этот успех зависит от усовершенствованных методик, позво- ляющих производить эффективную инкапсуляцию лекарственных препаратов и получать высокую стабильность продуктов. Конвекционный метод и усовершенствованные методи- ки, основанные на применении этого метода, обсуждаются ниже [1]. В Институте химии поверхности им. А.А. Чуйко НАН Украины изучалась возмож- ность получения магнитолипосом различными способами из модифицированных высоко- дисперсных порошков железа (ВДПЖ), проводилось изучение морфологии полученных препаратов и исследование проницаемости мембраны магнитолипосом. Для сравнительного изучения физико-химических характеристик магнитолипосом, а именно, степени связывания ВДПЖ с липосомами различного химического состава и их устойчивости, были использованы методики встряхивания-перемешивания, озвучивания, упаривания в «обращенной фазе». Для исследования влияния заряда липосомальной мембраны на физико-химические характеристики магнитолипосом были исследованы следующие составы фосфолипидных смесей: лецитиновые (нейтральные), лецитин-стеариламиновые (положительный заряд липосомальной мембраны) и лецитин-дицетилфосфатные (отрицательный заряд). Коли- чественное соотношение липосомального липида и модифицированного ВДПЖ составило 3 и 25 мг, соответственно. Для отделения полученных магнитолипосом от несвязавшегося ВДПЖ и радиоактив- ного маркера водной полости (14-С-инсулина) использовали метод гель-фильтрации на колонках с Сефакрилом S-1000. Для отделения 22-Na+, не включившегося в водную полость липосом, использовали метод разделения на колонках с СМ-сефадексом G-25. Как альтер- нативный метод отделения магнитолипосом использовали метод центрифугирования образцов при 6000 об. в течение 10 – 15 мин. Для количественного определения липосомированного ВДПЖ использовалась коло- риметрическая методика определения ионов железа по интенсивности окрашивания комплекса железа с о-фенантролином. Определение проводилось по калибровочному гра- фику, построенному по стандартным растворам железа, содержащим и не содержащим липид (0.0 – 7,5 мг липида в пробе). Определение включения радиоактивных маркеров в магнитолипосомы осуществляли методом радиометрирования. Получены данные по влиянию модифицирования поверхности ВДПЖ на степень связывания с липосомальными препаратами, изготовленными методом упаривания в «обращенной фазе». Достоверно не установлено различий по влиянию модифицирования поверхности ВДПЖ (олеиновой кислотой и γ-АПТЭС) на связывание с липосомами, мемб- рана которых сформирована из лецитин-стеариламина. Аналогичные данные получены и для чистых лецитиновых липосом. Для липосом, сформированных из лецитин-дицетилфос- фата, отмечено увеличение степени связывания в 3,75 - 4,0 раза для обеих поверхностей. Таким образом, для получения магнитолипосом, ассоциированных с ВДПЖ, пред- ставляется целесообразным вводить в состав липосомальной мембраны зарядоформеры (лецитин-стеариламин, лецитин-дицетилфосфат и др.). Целесообразно применять метод упаривания в «обращенной фазе» как наиболее эффективный. В качестве метода отделения несвязавшегося ВДПЖ рекомендуется использовать метод мягкого центрифугирования. Липосомы, полученные методом упаривания в «обращенной фазе», позволяют увеличить включение высокомолекулярного радиоактивного маркера 14-С-инсулина в водную полость магнитолипосом в 6,9 – 7,4 раза, по сравнению с методом встряхивания – перемешивания. Перед липосомированием препарат ВДПЖ должен быть в виде коллоида с размером частиц не более 50 нм, стабилизированного от последующего агрегирования, а также от возможного химического взаимодействия с липидом мембран. Стабилизация поверхности ВДПЖ различными модификаторами не оказывает существенного влияния на степень свя- зывания с липосомами. Препараты ВДПЖ, ассоциированные с липосомами, практически не оказывают влияния на проницаемость липосомальной мембраны для высокомолекулярных радиомаркеров (14-С-инсулин) и увеличивают скорость выхода низкомолекулярного радио- маркера (22-Na+). При электронномикроскопическом исследовании включение одиночных частиц ВДПЖ внутрь водной полости липосом практически не выявляется. 2.1. Конвекционный метод Конвекционный метод был впервые описан авторами [7] для приготовления много- слойных везикул. Согласно этому методу, фосфолипиды растворяются в органическом растворителе (обычно в смеси хлороформ/метанол) и откладываются из растворителей в виде тонкой пленки на стенках круглодонной колбы при использовании роторного испари- теля, в условиях пониженного давления. Многослойные везикулы спонтанно формируются при добавлении к высушенной липидной пленке избыточного объема водного буфера, со- держащего лекарство. Содержащие лекарство липосомы можно отделить от несодержащих центрифугированием или гель-фильтрацией. Количество водного буфера (или раствора лекарства), заключенного во внутренних компартментах многослойных везикул, опреде- ляется временем гидратации высушенной пленки и условиями перемешивания. Например, сообщалось [8], что большее количество водной фазы может захватываться в случае, когда липид гидратируется в течение 20 ч при слабом перемешивании, по сравнению со временем гидратации 2 ч, при сильном встряхивании колбы, хотя распределение многослойных вези- кул по размеру не зависело от этих процедур. 2.2. Звуковой метод Этот метод, используемый для приготовления малых однослойных везикул [9], включает последующую звуковую обработку многослойных везикул, приготовленных конвекционным методом. Принцип звуковой обработки состоит в использовании пуль- сирующих звуковых волн высокой частоты. При такой обработке суспензии многослойных везикул происходит их разрыв с образованием однослойных везикул диаметром 15 – 50 нм. Таким образом, цель звуковой обработки заключается в получении гомогенной дисперсии малых везикул, способных к проникновению в ткань. Основной недостаток приготовления липосом с использованием звуковой обработ- ки – окисление ненасыщенных связей в цепях остатков жирных кислот фосфолипидов и гидролиз фосфолипидов с образованием лизофосфолипидов и свободных жирных кислот. Другой недостаток – денатурация или инактивация некоторых термочувствительных ве- ществ (например, ДНК, некоторых белков и др.), включаемых в липосомы [1]. 2.3. Экструзионный метод высокого давления Согласно этому методу, суспензии многослойных везикул, приготовленных конвек- ционным методом, повторно пропускаются через фильтры – поликарбонатные мембраны с очень малым диаметром пор (0,8-1,0 мкм) под высоким давлением [8]. Подбирая фильтры с подходящим размером пор, можно получить липосомы желаемых диаметров. При продав- ливании многослойных липосом сквозь малые поры снимаются последовательные слои мембран, и остается только один слой. Кроме уменьшения размера липосом, экструзионный метод позволяет получить липосомы с гомогенным распределением по размеру. С примене- нием этого метода может использоваться большое разнообразие различных липидов для получения стабильных липосом [10, 11]. Экструзия при низких давлениях (≤ 1 МПа) возможна при низкой концентрации липидов, но наиболее часто используемые давления – около 5 МПа [12]. Метод применим только для приготовления небольших количеств липосом. Для преодоления этого недостатка был разработан экструзионный прибор, действующий при высоких давлениях – до 10,5 МПа, преимущество которого – высокий выход продукта [13]. 2.4. Метод растворения и удаления детергента Этот метод, используемый для приготовления больших одномембранных везикул [14], включает применение детергента (неионного, анионного или катионного сурфактанта) для растворения липидов. Процедура включает растворение липидов в водном растворе детергента и белков, подлежащих инкапсуляции. Детергент должен иметь высокую крити- ческую концентрацию мицеллообразования, так что он легко удаляется диализом или колоночной хроматографией [15]. При удалении детергента образуются большие одномемб- ранные везикулы диаметром 0,08 – 0,2 мкм. Этот метод оказался подходящим для инкап- суляции белков биомедицинского назначения [16]. 2.5. Методика испарения с обращением фаз Методика, предложенная авторами [17], состоит в быстром введении водного раст- вора лекарства в органический растворитель, содержащий растворенные липиды, при одновременной звуковой обработке смеси, что приводит к образованию капель воды в органическом растворителе (эмульсии типа «вода в масле»). Полученная эмульсия высуши- вается до полутвердого геля в роторном испарителе. Далее, гель подвергается сильному механическому воздействию до получения фазового изменения из дисперсии «вода в масле» в «масло в воде» (т.е. водную суспензию везикул). В ходе механического воздейст- вия некоторые капли воды образуют внешнюю фазу, в то время как другие – замкнутый внутри везикул водный объем. Таким образом получаются большие однослойные везикулы диаметром 0,1 – 1 мкм. Этот метод используется для инкапсуляции как малых молекул, так и макромолекул (РНК и различные ферменты, без потери активности) [1, 17]. Липосомы, полученные методом испарения с обращением фаз, имеют больший объем захватываемой водной среды и большую эффективность инкапсуляции гидрофиль- ных лекарств, по сравнению с липосомами, полученными гидратацией тонкой пленки с последующей звуковой обработкой [5]. В некоторых случаях метод может иметь ограничение: выдержка материала, подле- жащего инкапсуляции, в органических растворителях, а также механическая обработка, может привести к денатурации некоторых белков или разрыву цепей ДНК [1]. 3. Лиганды для направленного транспорта липосом в клетки-мишени Для направленной доставки липосом к определенным органам или клеткам-мишеням в состав таких липосом в процессе их приготовления вводили химически модифицирован- ный холестерол, к которому был присоединен лиганд для распознавания и взаимодействия с определенным органом или типом клеток. Таким лигандом может быть длинноцепочечная жирная кислота, аминокислота, олигосахарид, гормон, производное аминокислоты, белок, гликопротеид, модифицированный белок и т.п. Полученные таким образом липосомы, содержащие цитотоксический или терапевтический препарат, или молекулы генетического материала, после введения в организм быстро накапливаются преимущественно в опреде- ленных органах. Такие липосомы могут быть одно- или многослойными, их можно полу- чать из любых липидов, обычно используемых для приготовления липосом, звуковой обработкой суспензии липидов, гидратацией кристаллизованных липидов или с примене- нием любой другой обычной процедуры. Полученные липосомы обычно имеют размеры между 0,001 и 10 мкм. Для модифицирования холестерола используется гидроксильная группа в 3 позиции молекулы холестерола, потому что эта группа расположена на внешней стороне поверхности липидного бислоя. Модифицированный холестерол добавляется к липидам в процессе приготовления липосом, обычно в концентрации между 0,1 и 5 % мол. общего содержания липидов, предпочтительно между приблизительно 1,0 и 3,0 % мол [18]. Были разработаны долгоциркулирующие препараты липосом, содержащих опреде- ленные лиганды (“stealth”-липосомы), стерически стабилизированные липидными произ- водными полиэтиленгликоля, применение которых повышает вероятность взаимодействия с мишенью при достижении определенной популяции клеток in vivo. Такими лигандами могут быть олигосахариды, витамины, пептиды, белки, в том числе молекулы антител. 4. Мечение липосом антителами 4.1. Прикрепление антител через тиоэфирную связь Способ прикрепления моноклональных антител к концу молекулы полиэтилен- гликоля (ПЭГ, PEG) [19] состоит в использовании синтезированного для этой цели производного функционализированного по концевой группе ПЭГ, связанного с липидом, – пиридилтиопропионоиламин-ПЭГ-дистеароилфосфатидилэтаноламина (PDP-PEG-DSPE). После включения PDP-PEG-DSPE в “stealth”-липосомы и тиолиза PDP-групп, происходя- щего в мягких условиях, на периферии липидных пузырьков образовывались реакционно способные тиольные группы. Малеимид-производные антител могут эффективно прикреп- ляться к липосомам в мягких условиях, и даже при содержании функционализированного ПЭГ-липида менее 1 % общего количества липидов. Полученные иммунолипосомы были эффективными переносчиками лекарственного средства, которое медленно высвобожда- лось, и находились в кровеносной системе в течение более длительного времени, чем липо- сомы, не содержащие полиэтиленгликоля. В работе [20] для получения катионных липосом в качестве главных липидных ком- понентов (рис. 8) использовали фосфатидилхолин из желтков куриных яиц – пальмитоило- леоилфосфатидилхолин, холестерин и катионный липид DDAB – диметилдиоктадецилам- моний бромид (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, USA). Катионный липид в составе липосом обеспечивает им эффективное связывание с отрицательно заряженными молекулами малых интерферирующих (миРНК). В качестве флуоресцентной метки для проведения цитохими- ческого анализа культуры клеток к липосомам на стадии смешения липидных компонентов добавляли индикатор Dil (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат; Fluka) (λвозб = 549 нм, λисп = 565 нм). Рис. 8. Липиды, используемые для приготовления катионных липосом [20]. Для устранения основного недостатка липосом первого поколения – их быстрой элиминации из системного кровотока – в состав липосомных мембран вводили конъюгат липида с химически инертным гидрофильным полимером, DSPE-PEG – 1,2-дистеароил-sn- глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]. Данный липид пред- ставляет собой дистеароилфосфатидилэтаноламин, конъюгированный с ПЭГ-2000 – цепоч- кой полиэтиленгликоля с молекулярной массой 2000 Да, присоединенной к этаноламинной группе липида (рис. 9). DSPE-PEG Рис. 9. Химическое строение молекулы производного липида DSPE-PEG: 1,2-дистеароил- sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] [20]. За счет цепочек ПЭГ на внешней оболочке липосомы образовывалась как бы допол- нительная “щетина”, что приводило к значительному продлению срока жизни таких стерически стабилизированных липосом в кровотоке (рис. 10) [21]. Механизм этого явления остается до конца неизученным и предполагает, что подвижные и биохимически инертные цепочки полимера препятствуют опсонизации липосом соответствующими компонентами плазмы крови, что необходимо для последующего фагоцитоза (рис. 11). Рис. 10. Схема строения ПЭГилированной катионной липосомы [20]. Рис. 11. Схема предупреждения процесса опсонизации за счет наличия цепочек ПЭГ у стерически стабилизированных (“stealth”) липосом [20]. Для дальнейшего конъюгирования моноклональных антител с липосомами в состав последних вводили малеимидное производное фосфатидилэтаноламина DSPE-PEG-M (1,2- дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимидо(полиэтиленгликоль)-2000]). В его молекуле малеимидная группа присоединена к терминальному звену цепочки полиэтиленгликоля, конъюгированного с этаноламинной группой фосфолипида (рис. 12). DSPE-PEG-M Рис. 12. Химическое строение молекулы производного липида DSPE-PEG-M: 1,2-дистеаро- ил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимидо(полиэтиленгликоль)-2000] [20]. Отобранные в соответствии с расчетом количества липидных компонентов (фосфа- тидилхолина, холестерина, DDAB, DSPE-PEG-M, DSPE-PEG, Dil) растворяли в смеси хлороформа с метанолом (9:1) в концентрации 10-20 мг суммарных липидов в 1 мл раст- ворителя. Эти растворы смешивали в молярном соотношении 23 : 16 : 4,4 : 1 : 1,6 : 0,4. Растворитель удаляли упариванием на роторном испарителе при пониженном давлении в атмосфере аргона. Затем смесь липидов растворяли в сухом циклогексане, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали. Все манипуляции по приготовлению липосом (за исклю- чением кратковременных – взвешивание и т.п.) осуществляли в атмосфере аргона высокой чистоты. Для загрузки в липосомы нуклеиновых кислот (миРНК длиной 21 пар нуклеотидов) за основу была выбрана методика N. Shi (2000) [22]. Модифицирование заключалось в том, что загрузка миРНК проводилась на стадии эмульгирования липидной пленки. Обработка ультразвуком и серия циклов замораживания – оттаивания исключались за ненадобностью. Таким образом, модифицированная методика оказалась менее трудоемкой и адекватно обеспечивала выполнение поставленных задач. Полученный липоплекс пропускали через поликарбонатные фильтры (Nucleopore) с размерами пор 400, 200, 100 и 50 нм с помощью ручного мини-экструдера (Avanti) для получения липосом определенного размера (рис. 13). После этого эмульсию липосом можно разбавлять до необходимых концентраций, подвергать мягкому химическому модифициро- ванию, операциям гель-фильтрации, центрифугирования и т.п. Количество связавшихся с липосомами миРНК определяли люминесцентным методом следующим образом: полученный препарат липосом, загруженных миРНК, подвергали ультрафильтрации через конические поликарбонатные мембраны с порогом отсечения 50 кДа (CentriFlo, Amicon, Голландия) при центрифугировании в течение 1 ч при 3000 об/мин. В ультрафильтрате определяли количество РНК с помощью коммерческой системы Quant-iT RNA Assay Kit (Invitrogen, США) и флуориметра Qubit (Invitrogen, США). Результаты показали, что в ультрафильтрате РНК обнаружено не было (предел чувствительности данной флуориметрической системы 20 нг/мл), т.е. все молекулы миРНК связались с липосомами. Рис. 13. Схема загрузки миРНК в липосомы на этапе эмульгирования липидной пленки [20]. Конъюгацию липосом с векторным белком (моноклональными антителами) прово- дили малеимидным способом в соответствии со стандартной методикой [23]. Сохранность иммунокомпетенции антител на всех этапах тиолирования и конъюгации тестировали мето- дом иммуногистохимии на срезах мозга крыс. Малеимидная группа DSPE-PEG-M, входящего в состав полученных липосом, способна связываться со свободной сульфгидрильной группой белка, образуя прочный тиоэфирный конъюгат. По этой причине молекулы белка перед конъюгацией с липосомами необходимо тиолировать, т.е. ввести в них дополнительные свободные сульфгидрильные группы. Для этого моноклональные антитела (MAT) подвергали взаимодействию с 2-иминотиоланом (реактив Траута), который реагировал со свободными первичными аминогруппами белка, например, с ε-аминогруппами остатков лизина, присоединяя к ним SH-содержащий радикал (рис. 14). Реакцию проводили в атмосфере инертного газа, чтобы избежать окисления вве- денных сульфгидрильных групп и побочных реакций неспецифического конъюгирования. Антитела инкубировали с 20-кратным молярным избытком тиолирующего агента. Отделе- ние продукта реакции проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G25. Контроль за движением препарата осуществляли фотометрическим детектором при λ = 280 нм. моноклональные антитела с ε- аминогруппами остатков лизина 2-ИГ Ar, PBS, t комн Рис. 14. Реакция тиолирования антител реактивом Траута [20]. Для конъюгирования с векторным белком свежеприготовленные липосомы инкуби- ровали 12 ч со свежетиолированными антителами в темноте при слабом перемешивании в атмосфере инертного газа (рис. 15). Рис. 15. Реакция конъюгирования малеимидного производного липида липосомы с тиоли- рованным моноклональным антителом [20]. Реакцию останавливали введением 100-кратного молярного избытка (по отношению к белку) N-этилмалеимида, который блокировал оставшиеся несвязанными сульфгидриль- ные группы. После этого целевые иммунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакционной смеси гель-фильтрацией на колонке с сефарозой СL-4B. Контроль за движе- нием образца осуществляли визуально по окраске Dil. В результате был получен препарат в виде эмульсии, содержащий иммунолипосомы размером 100 нм, загруженные миРНК (рис. 16). Лецитин Холестерин Катионный липид DDAB Фосфолипид, конъюгированный с ПЭГ (DSPE-PEG) ПЭГ Антитело Рис. 16. Схема строения иммунолипосомы, загруженной миРНК [20]. Методом динамического светорассеяния на гониометре, оборудованном He-Ne лазе- ром (Photocor Instruments), проводили измерение гидродинамических радиусов невекторных катионных липосом и иммунолипосом, конъюгированных с векторными антителами. Флуктуации интенсивности света регистрировали с помощью 288-канального коррелятора Photocor FC. Для обработки полученных данных использовали программное обеспечение Dyna LS. Величины гидродинамических радиусов рассчитывали с использованием урав- нения Стокса в приближении для сферических частиц [20]. Среди разнообразных лигандов, используемых для конъюгации молекул антител с липосомами, эффективность двух из них – N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетата (SATA) – исследовалась в работе [24]. Моноклональные антитела, модифицированные SPDP и SATA, через тиоэфирные связи образовывали конъюгаты с липосомами, функционализированными различными липофиль- ными соединениями малеимида, такими как метиловый эфир N-(3-малеимидопропионил)- N2-пальмитоил-L-лизина (MP-PL), N-(3-малеимидопропионил)фосфатидилэтаноламид (MP- PE), метиловый эфир N6-(6-малеимидокапроил)-N2-пальмитоил-L-лизина (EMC-PL) и N-(6- малеимидокапроил)-фосфатидилэтаноламин (EMC-PE). Состав матриксных липидов для приготовления липосом был следующим: соевый фосфатидилхолин/холестерол/DL-α-токо- ферол в соотношении 1:0,2:0,01 мольных долей при начальной концентрации фосфатидил- холина 20 мг/мл. Производные малеимида MP-PL, MP-PE, EMC-PL и EMC-PЕ добавлялись в концентрациях 0,02 – 0,05 мольных долей, и цитостатический препарат арабинозид N4-олеилцитозина – 0,2 мольных долей. Для включения в липосомные мембраны исполь- зовался липофильный флуоресцентный краситель N,N`-бис-(1-гексилгептил)-3,4:9,10- периленбис(дикарбоксимид) в концентрации 0,006 мольных долей. В некоторых случаях липосомы были мечены прибавлением следовых количеств 1,2-дипальмитоил-L-3-фосфа- тидил[N-метил-3Н]холина или включением в состав используемых компонентов 0,003 мольных долей липофильного хелатирующего агента моностеарата диэтилентриаминпента- уксусной кислоты, с которыми радиоактивные ионы марганца (54Mn2+) образовывали комп- лексное соединение после формирования липосом. Органические растворители удаляли на роторном испарителе. Препараты липосом фильтровали через стерильные фильтры с размером пор 0,45 мкм (Sartorius) и хранили при 4 оС. Размер и гомогенность липосом определяли мето- дами рассеивания лазерных лучей и электронной микроскопии с негативным контрастиро- ванием и получением поверхности излома образца. Концентрации реакционноспособных малеимидных групп, расположенных на внеш- ней поверхности липосом, определяли реакцией с избытком цистеина, после чего непрореа- гировавший цистеин определяли реактивом Эллмана. Липосомы, содержащие 0,02 мольных долей производных малеимида MP-PL, MP- PE, EMC-PL и EMC-PЕ, имели средний диаметр 50 нм и при хранении при 4 оС были физически устойчивы в течение более 60 дней. При содержании 0,05 мольных долей производных малеимида липосомы были сравнительно устойчивы, исключая MP-PL содер- жащие липосомы, которые образовывали осадок вскоре после приготовления. Для всех типов функционализированных липосом наблюдалось снижение их связывающей активнос- ти при хранении. Антитела метили N-сукцинимидил[2,3-3Н]пропионатом (3H-NSP). Проводили реакцию растворов антител (1 мг/мл) в борате натрия (0,1 М)/HCl (0,1 М), NaCl (0,5 М), рН 0,5 с 3H-NSP, который добавляли в молярном избытке 50 %, в течение 1 ч при 0 оС. Непровзаимодействовавшие молекулы 3H-NSP удаляли в процессе диализа против 1000- кратных объемов 67 мМ фосфатного буфера. К раствору антител (10 – 40 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере/0,1 М NaCl, рН 7,5 медленно добавляли при комнатной температуре раствор SPDP (150 мМ) в этаноле, до молярного соотношения антител к SPDP 1:24, 1:12 или 1:6. Реакцию проводили в течение 60 мин, затем смесь подвергали диализу против двух 1000-кратных объемов фосфатного буфера при 4 оС более 24 ч для удаления непровзаимодействовавших молекул SPDP. После диализа модифицированные SPDP антитела хранили при 4 оС. Для определения количества связавшихся с антителами молекул SPDP в аликвотах восстанавливали дисульфидные связи при добавлении раствора дитиотрейтола, затем измеряли адсорбцию 2-тиопиридона при 343 нм. Растворы модифицированных SPDP антител подвергали диализу против ацетатного буфера (0,1 М ацетат натрия/0,1 М уксусная кислота, 0,1 М NaCl, рН 4,5) при 4 оС более 24 ч. Добавляли дитиотрейтол до конечной концентрации 25 мМ, проводили инкубацию при 25 оС в течение 60 мин. Затем реакционную смесь фракционировали при комнатной температуре на колонке Sephadex G-50 (30×1 см) при использовании 67 мМ фосфатного буфера (рН 6,0). При скорости течения 0,5-1 мл/мин активированные антитела (АТ-P-SH) отделялись от дитиотрейтола и 2-тиопиридона. Конъюгацию с малеимид-содержащими липосомами производили при 25 оС сразу после отделения активированных антител на колонке, в соотношениях АТ-P-SH к малеимиду в липосомах 1:10, 1:20 и 1:40. Концентра- ции антител варьировали между 0,15 и 0,6 мг/мл, концентрации липидов (фосфатидил- холина) – 1 – 5 мг/мл. Конъюгацию осуществляли в атмосфере азота при умеренном перемешивании через различные промежутки времени. Для остановки реакции добавляли N-этилмалеимид, растворенный в минимальном объеме 67 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), в 24-кратном избытке по отношению к концентрации антител. Проводили реакцию взаимодействия антител с SАТА, в течение 60 мин при 25 оС, в атмосфере азота, при слабом перемешивании (концентрация антител – 4 – 10 мг/мл (0,25 – 1·10-9 М) в 50 мМ фосфатном буфере/1 мМ EDTA (рН 7,5), концентрация SАТА – 150 мМ; сначала SАТА был растворен в минимальном объеме диметилформамида). Молярные соотношения антител к SАТА составляли 1:24, 1:12 и 1:6. Непровзаимодействовавшие молекулы SАТА отделяли диализом при 4 оС против 1000-кратного объема того же буфера более 24 ч. Для измерения количеств модифицированных SАТА антител, аликвоты деацетили- ровали гидроксиламином, после чего определяли свободные сульфгидрильные группы при использовании реактива Эллмана. 1 мл раствора модифицированных SАТА антител деаце- тилировали добавлением 0,1 мл гидроксиламина·HCl (0,5 М в 50 мМ фосфатном буфере /25 мМ EDTA, рН 7,5) в течение 60 мин при 25 оС, в атмосфере азота, при перемешивании. Конъюгацию активированных антител (АТ-А-SH) с малеимид-содержащими липосомами производили немедленно после деацетилирования при рН 6,0 и молярных соотношениях АТ-А-SH (взятых в концентрации 0,3 мг/мл) к малеимид-содержащим молекулам в составе липосом 1:10, 1:20 и 1:40, при 25 оС. Через 0,2 – 20 ч реакцию останавливали N-этилмале- имидом в молярном соотношении 1:24. Преимущество использования SАТА по сравнению с SPDP – в отсутствии потреб- ности использовать восстанавливающий агент, такой как дитиотрейтол, для активации тиольных групп. Остающиеся следовые количества восстанавливающего агента уменьшают эффективность реакции конъюгации. Активация SАТА производится гидроксиламином, что имеет дополнительное преимущество – повышает стабильность свободных тиольных групп. Антитела, модифицированные SPDP, формировали осадок при восстановлении дитио- трейтолом при рН 4,5. Антитела, модифицированные SАТА, не выпадали в осадок при активации. Конъюгация через SPDP происходила наиболее эффективно при соотношении этих молекул к антителам 24:1 – 20 – 25 % через 1 – 4 ч инкубации. При использовании SАТА в качестве сшивающего агента, более высокие активности были получены при более низких соотношениях SАТА:антитело – при соотношении 6:1 степень связывания составляла 20 %, при соотношении 12:1 – 60 – 65 %, при инкубации 2 – 4 ч. Инкубация в течение более 4 ч не приводила к повышению эффективности конъюгации. Эффективность связывания антител B8-24.3 была максимальной при рН 6 (62 % через 2 ч инкубации) и снижалась при рН 5 (48 %) и 4 (34 %). Непровзаимодействующие, активированные антитела отделяли от иммунолипосом методом флотации на прерывистом градиенте метризамида. Раствор иммунолипосом с антителами смешивали в нитроцеллюлозной ультрацентрифужной пробирке (объемом 5 мл) с 60 %-ным метризамидом до конечной концентрации метризамида 20 %, покрывали 2 мл 10 %-ного метризамида, затем 0,5 мл 67 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) – верхний слой. Градиент плотности центрифугировали в течение 12 – 16 ч при 95000 g при 4 оС в ультра- центрифуге L8-9M (Beckman). Всплывшие иммунолипосомы, видимые как розовая флуоресцентная полоса, тщательно отбирали от нижележащих фаз метризамида, после чего дважды проводили диализ против 400 мл 67 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) для удаления обратимо связанного метризамида [24]. Стабильные липосомы отделяли от промежуточных продуктов реакции при исполь- зовании непрерывного градиента сахарозы (5 – 20 %, 30 мл) и сахарозной подушки (65 %, 3,5 мл). Суспензию перед загрузкой на градиент нагревали при 43 оС 20 мин. Максимальная вместимость загрузки составляла 35 мг в 1 мл буфера. Препаративные градиенты сахарозы центрифугировали при 2,5 × 104 об/мин в течение 16 ч. Липосомы собирали на границе раздела буфер / 5 % сахароза и диализовали против фосфатного буфера при рН 8,0 в течение 8 ч [25]. 4.2. Взаимодействие с образованием амидной связи Карбодиимиды – агенты поперечного связывания, которые могут спонтанно реаги- ровать с белками с образованием поперечных связей между аминокислотными боковыми цепями. Общая формула карбодиимидов – R1-N=C=N-R2, где R1 и R2 – любая химическая группа, при условии, что она не содержит сильный нуклеофил. Карбодиимиды имеют очень высокую реакционную способность, и присутствие нуклеофильной группы в R1 или R2 приведет к внутри- и межмолекулярным реакциям молекул карбодиимидов. R1 и R2 незави- симо выбираются из любых разветвленных или с прямой цепью, насыщенных или ненасы- щенных, алкильных, алкенильных, арильных, аралкильных, аралкенильных групп или их вариантов с галогенными, третичными аминными, эфирными, кетонными или другими заместителями. Одна или обе R1, R2 могут содержать дополнительную карбодиимидную группу, например как поликарбодиимид. Предпочтительно, выбираются карбодиимиды водорастворимые, однако суспензия тщательно диспергированного нерастворимого в воде карбодиимида, такого как диметил- аминопропилкарбодиимид, может также использоваться в реакции поперечного связывания альбумина и других белков. При варьировании групп R1, R2 изменяется растворимость, иммуногенность и токсичность карбодиимида, как и способность взаимодействовать с молекулами альбумина. Могут быть выбраны R-группы, содержащие дополнительные фотоактивируемые группы. Может использоваться также водорастворимый карбодиимид, присоединенный к полиэтиленгликолю, общая формула которого – R1O-PEG-R2-N=C=N-R3-PEG-OR4, где R1, R2, R3, R4 независимо выбираются, как описано выше. Например, это могут быть –NCO (изоцианаты), приводящие к образованию бифункционального ПЭГ и поли(ПЭГ-карбо- димида). R2 и R3 могут также содержать расщепляемые в процессе гидролиза или ферментативных реакций группы, так что связанный поперечными цепями продукт реакции при их расщеплении будет подвергаться биодеградации. Основанный на полиэтиленгликоле карбодиимид синтезируется в реакции алкокси- ПЭГ-изоцианатов в присутствии подходящего катализатора: R1O-PEG-R2-NCO + R4О-PEG-R3-NCO → R1O-PEG-R2-N=C=N-R3-PEG-OR4. Карбодиимиды образуют поперечные связи между молекулами альбумина, взаи- модействие происходит при рН между 5 и 7. Свободная карбоксильная группа молекулы альбумина (–СООН-конца или боковой цепи остатков глутаминовой или аспарагиновой кислоты) атакует молекулу карбодиимида, что приводит к образованию промежуточных соединений: X-COOH + R1-N=C=N-R2 → X- (C=O)-O- (C=N-R1)-NH-R2 + X- (C=O)-O- (C=N-R2)-NH-R1. Далее, свободная аминогруппа той же или другой молекулы альбумина (–NН2-конца или боковой цепи остатков лизина или аргинина) атакует одно из этих промежуточных соединений, что приводит к образованию поперечно-связанного альбумина [26]. Для получения магнитных частиц, конъюгированных с антителами и содержащих полиэтиленгликоль, использовали производное полиэтиленгликоля с карбоксильными группами α,ω-дикарбоксиполиэтиленгликоль. Карбоксильные группы активировали с при- менением карбодиимида: к раствору 5 г (2,5 ммоль) α,ω-дикарбоксиполиэтиленгликоля (со средним молекулярным весом 4000) и 288 мг (2,5 ммоль) N-гидроксисукцинимида в 15 мл диметилформамида добавляли 1 мл диметилформамида, содержащего 618 мг дицикло- гексилкарбодиимида. К производному полиэтиленгликоля с активированными карбоксильными группами (600 мг) прибавляли 10 мл водного раствора (фосфатный буфер, рН 7,0), содержащего анти- тела к аспарагиназе, полученные из кроликов, иммунизированных аспарагиназой. Реакцию проводили при 25 ° C в течение 90 мин, и получали конъюгат полиэтиленгликоль-антитело. рН раствора 1 г полиэтиленгликоль-антитело в 1,3 мл воды доводили до 8,0 водным раствором аммония, затем к нему прибавляли 0,6 мл водного раствора, содержащего 64 мг хлорида железа (II) и 151 мг хлорида железа (III). Прибавляя раствор по каплям, рН под- держивали между 8,0 – 8,5 водным раствором аммония, и смесь тщательно перемешивали, при комнатной температуре. После диализа реакционной смеси против воды, конъюгат маг- нитный материал-антитело получали при лиофилизации. Этот конъюгат, содержащий 34 % магнитного материала и 25 % белка, диспергиро- вали в водных растворах и органических растворителях, таких как бензол, толуол, хлороформ, хлорированные углеводороды, и полностью получали из этих растворов при наложении магнитного поля ~6000 эрстед в течение 5 мин. Конъюгат магнитный материал-антитело в водном растворе и органических раст- ворителях не осаждался центрифугированием при 2000 g, и его мутность не изменялась в течение 24 – 60 ч в измерениях при 600 нм. Таким образом, конъюгат обладал высокой дисперсионной стабильностью. Методом электронной микроскопии было установлено, что конъюгат состоит из частиц размером 10 – 40 нм. Конъюгат магнитный материал-антитело имел высокое сродство к аспарагиназе и активность 70 % по сравнению с антителами к аспарагиназе, не образующими конъюгат с магнитным материалом [27]. Pеакция с карбодиимидом может использоваться для конъюгации белков, таких как антитело или антиген, с поверхностью оксида железа, содержащей карбоксильные группы цитрата [28]. В водных средах оксиды железа содержат незанятые атомные орбитали, которые могут участвовать в образовании координационной связи на поверхности с гидроксил-ионами воды. Координационная связь на поверхности оксида железа с цитрат- ионами образуется за счет разделения единственной электронной пары кислорода кар- боксильных групп цитрата. Взаимодействие белков с поверхностью оксида железа осуществлялось ковалентным связыванием через аминогруппы с гидроксильными группами поверхности, посредством либо амидной связи, в случае цитратных лигандов, либо эфирной связи, в случае гидроксильных лигандов. Конъюгацию производили при использовании водорастворимого 1-этил-3-диметил-карбодиимида, при рН 5, в буферной среде (NaCl, MES, PBS, HCl в диапазоне концентраций 20-100 мМ). Реакцию проводили при следующих концентрациях компонентов: 2 мг/мл феррожидкости, 5 г/л белка (поликлональные IgG антитела), 5 мг/мл карбодиимида в буфере, в результате получали стабильный реагент на основе частиц оксида железа, активный в иммунных реакциях агглютинации. Предвари- тельное активирование феррожидкости карбодиимидом в течение 2 ч при комнатной температуре перед инкубацией с антителами в течение 12 ч приводило к повышению иммунной активности продукта, что связано с уменьшением поперечного связывания в сравнении со случаем, когда все компоненты смешиваются одновременно. После инку- бации необходимы четыре последовательных разделения центрифугированием и отмывки при оптимальном составе дисперсионной среды для удаления нежелательных продуктов реакции и получения коллоидного устойчивого реагента в виде частиц, способного к имму- ноагглютинации. Оптимизация состава среды производится для каждых антител, поскольку они имеют, например, различные изоэлектрические точки. Желательно использовать поли- этиленгликоль, оптимально ПЭГ 6000 в концентрации 0,001 % вес/объем. ПЭГ способст- вует коллоидной устойчивости частиц в течение длительного времени, повышая их плавучесть в суспензии, и ускорению преципитации в реакции иммуноагглютинации, действуя по механизму стерического исключения. Другие полимеры, такие как маннитол, глицерол и декстраны, также могут использоваться для повышения гомогенности частиц. Описанные условия были применимы в случаях феррожидкостей, в которых лиган- дами выступали и цитрат-, и гидроксил-ионы. В качестве координируемых лигандов выбираются, предпочтительно, производные цитрата, но могут также использоваться производные сукцината, глутарата, тартрата, азала- та, ЭДТА, ЭГТА, или гидроксил-ионы. Для достижения поверхностной координации цитрата, феррожидкость центрифуги- ровали при 2500 об/мин 10 мин, и половину супернатанта удаляли и заменяли 25 мМ раст- вором лимонной кислоты. После ресуспендирования образцы подвергали кратковременно- му встряхиванию. Эта же процедура применима при использовании других карбоксильных кислот, перечисленных выше. Смесь оставляли при слабом перемешивании на 12 ч, при комнатной температуре. Избыток цитрата удаляли в процессе повторной отмывки водой и центрифугированием (четыре раза, при 20000 об/мин в течение 20 мин, при комнатной температуре). Конечный состав среды для конъюгации – 50 мМ фосфат натрия/ 0,9 % NaCl, рН 5 (PBS). После диализа 20 мл антител в 500 мл 50 мМ PBS в течение 12 ч, антитела центрифу- гировали при 2500 об/мин 5 мин, отбирали надосадочную жидкость. Концентрацию белка измеряли методом спектрофотометрии, при 280 нм, в 10 аликвотах при разведении в буфере 1:50. Конъюгацию производили при инкубации 5,85 мл PBS, 1,5 мл феррожидкости (после взаимодействия с цитратом, 1 мг/мл) и 150 ультрал 1-этил-3-диметил-карбодиимида (5 мг/мл) при 30 0С в течение 2 ч. Реагент на основе частиц оксида железа центрифугировали со скоростью 20000 об/мин 20 мин при комнатной температуре, промывали дважды в буфере PBS и ресуспендировали в 3 мл среды, состоящей из 1,1 мл антител и 1,5 мл PBS с добавлением поверхностно-активного агента Gafac (0,04 %), затем проводили инкубацию 12 ч при комнатной температуре. Полученную смесь промывали три раза раствором 0,2 М глицин/ 0,9 % NaCl (GBS), содержащим бычий сывороточный альбумин (1 %) и азид натрия (0,004 %), рН 7,5, и ресуспендировали двухкратной звуковой обработкой по 15 с интенсивностью 20 u на ледяной бане с перерывом между импульсами 1 мин. Раствор, готовый для использования, хранили при 4 оС. Аликвоту надосадочной жидкости после первого центрифугирования отбирали для измерения концентрации белка, так что количество присоединенных к феррожидкости частиц может быть рассчитано вычитанием из начального количества. Контроль агглютинации проводили при 340 нм, согласно закону рассеяния света для частиц размером < 70 нм [28]. 5. Магнитные липосомы Магнитолипосомы для гипертермической обработки опухолевых клеток были при- готовлены покрытием частиц магнетита фосфолипидом. Оптимальным для достижения хорошей диспергируемости был следующий состав фосфолипида: соотношение фосфати- дилхолина к фосфатидилэтаноламину 2:1. Средний размер магнитолипосом, сердцевиной которых были агрегаты частиц магнетита размером 10 нм, составлял 80 нм. Магнитоли- посомы покрывали гидразид-пуллуланом для стабилизации фосфолипидных капсул и обеспечения адсорбции антител. С применением этого метода, на одной частице (магнито- липосоме) были иммобилизованы 90-180 молекул моноклональных антител. При инкубации липосом, конъюгировавших с антителами, с опухолевыми клетками, они адсорбировались на клеточной поверхности и проникали в клетки в 12 раз более эффективно, чем в контроле, в течение 4 ч. Количество проникшего магнетита – 0,61 – 3,6 пг/клетку, в зависимости от системы антиген-антитело [29]. В литературе описаны различные методы приготовления магнитных липосом. Способ приготовления магнитных катионных липосом для гипертермической обработки опухолевых клеток описан в [30]. Могут использоваться любые магнитные наночастицы, такие как железо, кобальт, никель и их соединения, в частности магнетит, диаметром от 10 до 70 нм, предпочтительно около 40 нм. Наночастицы покрывали катионным фосфолипидом; в некоторых случаях, катион- ные липосомы с прикрепленными антителами, специфичными к определенным опухолевым клеткам, фиксировали на поверхности покрытых карбоксиметилцеллюлозой магнитных наночастиц; или магнитные наночастицы диспергировали в растворе карбоксиметил- целлюлозы; или использовали кристаллы магнитных наночастиц игольчатой формы. Катионные липосомы в [30] представляют собой магнитные наночастицы, например магнетита, покрытые двойными мембранами фосфолипида, содержащими катионный ли- пид. В качестве фосфолипида предпочтительно использовать глицерофосфолипиды, такие как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол, дифосфатидилглицерол, фосфатидную кислоту и т.д., и сфинголипид, такой как сфингомиелин и др., это может быть единственный липид или смесь, в частности, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерол предпочтительны, их можно использовать отдельно или приготовить смесь. В качестве катионного липида можно использовать липид с углеродным номером 10-18, в частности, N-(альфа-триметиламмоний- ацетил)-дидодецил-О-глутамат. Соотношение фосфолипида и катионного липида составляет от 10:1 до 1:1, предпоч- тительно от 4:1 до 3:1. Толщина двойных фосфолипидных мембран – от 5 до 40 нм, пред- почтительно около 10 нм. Катионный липид готовили следующим образом. Раствор вышеупомянутой смеси липидов в хлороформе помещали в яйцеобразную колбу, затем хлороформ испаряли в ротационном приборе при давлении ниже атмосферного, при этом смесь липидов испаряя- ется до получения внутри колбы пленки. Далее, магнитные наночастицы в виде коллоидных частиц добавляли в колбу в подходящем количестве, и содержимое подвергали ультра- звуковой обработке. В соответствии с этой методикой получают катионный липид, содержащий магнетит в виде магнитных наночастиц, называемый магнетит-содержащей катионной липосомой. Покрытые карбоксиметилцеллюлозой магнитные наночастицы готовили, как опи- сано ниже. Магнитные наночастицы в количестве от 0,1 до 1,5 г, предпочтительно 0,3 г, помещали в прибор для перемешивания, добавляли дистиллированную воду до объема 10 мл и нагревали в ячейке термостата при 6 0C, затем добавляли от 10 до 30 мл (предпочти- тельно 20 мл) 6%-ного раствора карбоксиметилцеллюлозы. После перемешивания получен- ной смеси в течение 30 мин производили обработку ультразвуком (15 мин). Получали покрытые карбоксиметилцеллюлозой магнитные наночастицы. Композиты магнитных наночастиц игольчатой формы готовили так. Магнитные наночастицы и карбоксиметилцеллюлозу растворяли в воде в весовом соотношении от 4:1 до 15:1, предпочтительно 8:1, и перемешивали в течение 90 мин. Композиты игольчатой формы формировали при использовании экструзионного прибора с диаметром от 0,1 до 2,0 мм и подходящей длиной, предпочтительно в соответствии с размером опухоли, предпочтительна упаковка с размером 80 мм. После просушивания на воздухе в течение 2-х дней производили горячую сушку при вращении в интервале 80 – 100 оC, и продукт был готов. Гипертермию опухоли с применением магнетит-содержащих катионных липосом (МКЛ) производили следующим образом. Приготовленные МКЛ вводили в опухолевый очаг либо непосредственно, либо внутрь артерии или вены, после чего МКЛ специфически адсорбируются опухолевой тканью. При наложении магнитного поля происходит селектив- ное поглощение тепла и гибель клеток, адсорбировавших МКЛ [30]. Метод тонкопленочной гидратации, который оказался более эффективным для инкапсулирования водной магнитной жидкости, содержащей наночастицы покрытого лауриновой кислотой феррита марганца MnFe2O4, чем метод двойной эмульсии, описан в [31]. 5 различных молярных соотношений (1:0, 1:1, 1:2, 2:1, 3:2) яичного фосфатидилхолина и холестерола использовали для приготовления магнитных липосом. Нужное количество фосфатидилхолина и холестерола растворяли в смеси хлороформ/метанол в объемном соотношении 2:1 в круглодонной колбе. Затем растворитель испаряли в вакууме при комнатной температуре в ротационном испарителе для формирования тонкой липидной пленки. В колбу добавляли магнитную жидкость и проводили гидратацию в течение 30 мин при 40 оС. Образец подвергали звуковой обработке (20 кГц, 250 Вт) 15 мин для образования одномембранных магнитных липосом. К образцам добавляли 0,9 % раствор NaCl в объемном соотношении 1:1 для осаждения неинкапсулированных магнитных наночастиц. Только неинкапсулированные частицы осаждаются таким раствором благодаря ионным взаимодействиям. Затем проводили центрифугирование при 1000 g 10 мин при 4 оС. Отбирали супернатант и хранили образцы при 2 – 4 оС. Согласно методу двойной эмульсии [32], нужные количества яичного фосфати- дилхолина и холестерола растворяли в смеси хлороформ/метанол (2:1, по объему), затем добавляли магнитную жидкость. Производили звуковую обработку в течение 15 мин, получая первичную эмульсию. К первичной эмульсии медленно добавляли деионизиро- ванную воду, и смесь снова подвергали звуковой обработке в течение 15 мин. Таким образом, получали вторичную эмульсию. Растворитель удаляли из раствора на роторном испарителе под вакуумом при комнатной температуре. Для отделения неинкапсулирован- ных магнитных наночастиц производили те же процедуры, что и при получении липосом методом тонкопленочной гидратации. В зависимости от молярного соотношения яичного фосфатидилхолина и холестерола магнитные липосомы в полученных образцах [31] имели различные значения средних гид- родинамических диаметров. Липосомы меньшего диаметра имеют преимущества перед липосомами больших размеров, поскольку они могут избегать фагоцитоза клетками рети- кулоэндотелиальной системы и способны легко проникать в межклеточное пространство. Магнитные липосомы оптимального состава (полученные методом тонкопленочной гидратации при соотношении яичного фосфатидилхолина и холестерола 2:1) были выбраны на основе их наименьшего размера (средний диаметр 170 нм) и наибольшей эффективности инкапсуляции. Меньшая эффективность инкапсуляции при соотношениях 1:1 и 1:2 может объясняться увеличением жесткости мембраны при более высоком содержании холестерола (≥ 50 % мол.). При оптимальной концентрации 33 % мол. (2:1) все фосфолипиды мембраны образуют жидкую упорядоченную фазу. Долгоциркулирующие липосомы получали включением 5 % мол. дистеарил-sn- глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоля) 2000] в бислой магнитных липосом, полученных методом тонкопленочной гидратации при соотношении яичного фосфатидилхолина и холестерола 2:1. Эти липосомы могут использоваться для гипертерми- ческой обработки раковых опухолей. Более того, в дальнейшем они могут быть использова- ны для целенаправленной термо-химиотерапии опухолей [31]. Схема метода приготовления магнитных липосом, разработанная в [33] представлена на рис. 17. Согласно схеме, сначала синтезируются наночастицы Fe3O4 путем совместного осаждения ионов Fe2+ и Fe3+ в щелочной среде: 2Fe3+ + Fe2+ + 8OH- à Fe3O4 ↓ + 4H2O. Реакция проводится в присутствии цитрат-ионов, которые при адсорбции на ядрах оксидов железа ингибируют рост наночастиц и обеспечивают отрицательные электрические заряды на их поверхности, что препятствует агрегации [34]. После добавления соевых фосфолипи- дов и димиристоилфосфатидилхолина смесь подвергали звуковой обработке при рН 7,5 в атмосфере азота при 25 оС в течение 20 мин. Полученные однослойные везикулы отделяли от компонентов, не включившихся в их состав, диализом и гель-фильтрацией. Оксид железа осаждается внутри липосом, образуя внутреннюю оболочку, в процессе прохождения про- тонов сквозь мембрану после добавления основания (трис, NaOH) до рН 10-13. Осаждение Fe3O4 происходит при рН между 9 и 14, однако при рН ниже 10,5 осаждение оксида- гидроксида не было полным, а при рН выше 12 липосомы разрывались. Первичный оксид превращали в магнитную смесь нагреванием до 90 оС, после чего производили несколько раз отмывку и центрифугирование, при рН 7,5, первоначально в буфере борат-KCl (1 М). Формирование липосом и внутренней структуры оксида железа в буфере трис-KCl (1 М) наблюдали с применением развернутого по времени нейтронного рассеивания. Размер везикул оценивали методом динамического светорассеяния. Электронно-микроскопическое изображение липосом показано на рис. 18 [33]. Рис. 17. Схема получения магнитных липосом, содержащих лекарственный препарат [33]. Рис. 18. Электронно-микроскопическое изображение липосом, полученных из фосфатидил- холина сои. Толщина внутренней оболочки оксида железа около 6 нм [33]. Внутренняя оболочка оксида железа Люминесцентный краситель Липид Для получения магнитных липосом авторы [35] сначала готовили однослойные везикулы диаметром около 30 нм звуковой обработкой раствора фосфолипидов в смеси CHCl3/CH3OH (в объемном соотношении 9:1), испарением органических растворителей и гидратацией образовавшейся липидной пленки в соответствующем буфере. Звуковая обработка проводилась в течение 10 мин; далее сосуд охлаждали до температуры выше фазового перехода гель – жидко-кристаллическая фаза используемых фосфолипидов. Магнитные липосомы были приготовлены смешиванием избытка полученных везикул с раствором феррожидкости, стабилизированной лауриновой кислотой (при весовом соот- ношении фосфолипида к Fe3O4 5:1), после этого проводили диализ. Заключение Подбирая состав и метод приготовления липосом, можно варьировать их размеры и объем захватываемой водной среды, эффективно инкапсулировать лекарственные пре- параты с целью направленной доставки в органы- или клетки мишени. Состав среды оптимизируется с учетом физико-химических свойств инкапсулируемых веществ и при- соединяемых к липосомам молекул. Прикрепление к липосомам антител приводит к усилению их захвата фагоцитирующими клетками ретикулоэндотелиальной системы. Для уменьшения захвата липосом иммунокомпетентными клетками везикулы защищают, например, молекулами полиэтиленгликоля. Работа выполнена при поддержке Украинского научно-технологического центра (проект №3832). Литература 1. Uhumwangho M.U., Okor R.S. Current trends in the production and biomedical applications of liposomes: a review // JMBR: A Peer-review Journal of Biomedical Sciences. – 2005. – V. 4, № 1. – Р. 9 – 21. 2. Chelvi T.P., Ralhan R. Designing of thermosensitive liposomes from natural lipids for multimodality cancer therapy // International journal of hyperthermia. – 1995. – V. 11, № 5. – P. 685 – 695. 3. Preparation and characterization of manganese ferrite-based magnetic liposomes for hyperthermia treatment of cancer / А.P. Pradhan, J. Giri, R. Banerjee, J. Bellare, D. Bahadur // J. of Magnetism and Magnetic Materials. – 2007. – V. 311. – P. 208 – 215. 4. Paramagnetic thermosensitive liposomes for MR-thermometry / L.H. Lindner, M. Schlemmer, R. Stahl, M. Peller // International Journal of Hyperthermia. – 2005. – V. 21, № 6. – Р. 575 – 588. 5. Thermosensitive liposomes and localised hyperthermia – an effective bimodality approach for tumour management / B. Tiwari Sandip, N. Udupa, B.S.S. Rao, P. Uma Devi // Indian Journal of Pharmacology. – 2000. – V. 32. – Р. 214 – 220. 6. Gaber M.H. Physicochemical properties of thermosensitive liposomes encapsulating fluorescein diphosphate // Romanian J. Biophys. – 2004. – V. 14, № 1 – 4. – P. 43 – 52. 7. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids // J Mol Biol. – 1965. – V. 13. – P. 238 – 252. 8. Preparation of liposoms of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes / F. Olson, C.A. Hunt, F.C. Szoka, W.J. Vail, D. Papahadjopoulos // Biochim Biophys Acta. – 1976. – V. 557. – P. 9 – 23. 9. Single bilayer liposomes // S.M. Johnson, A.D. Bangham, M.W. Hill, E.D. Korn // Biochim Biophys Acta. – 1971. – V. 233. – P. 820 – 826. 10. Nayar R., Hope M.J., Cullis P.R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholine by extrusion techniques // Biochim Biophys Acta. – 1989. – V. 986. – P. 200 – 206. 11. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterisation of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential / M.J. Hope, M.B. Bally, G. Webb, P.R. Cullis // Biochim Biophys Acta. – 1985. –V. 812. – P. 55 – 65. 12. Amselem S., Gabizon A., Barenholz Y. A large-scale method for the preparation of sterile and non pyrogenic liposomal formulations of defined size distributions for clinical use. In: Gregoriadis G (Ed.). Liposome Technology. 2nd Edition. Boca Raton: CRC Press, 1993. – P. 501 – 525. 13. Generation of contrast-carrying liposomes of defined size with a new continuous high pressure extrusion method / T. Schneider, A. Sacfse, G. Robling, M. Brandl // Int J Pharm 1995. – V. 119. – P. 1 – 12. 14. Brunner J., Skrabai P., Hauser H. Single bilayer vesicles prepared without sonication. Physicochemical properties // BiochimBiophys Acta. – 1976. – V. 455. – P. 322 – 331. 15. Weiner N., Martin F., Riox M. Liposomes as drug delivery system // Drug Dev Ind Pharm. – 1989. – V. 15, № 10. – Р. 1523 – 1554. 16. Frezard F. Liposomes: from biophysics to the design of peptide vaccines // Braz J Biol Res. – 1999. – V. 32, № 2. – Р. 181 – 189. 17. Szoka F., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse phase // Proceeding to the National Academy of Sciences. – 1978. – V. 75. – P. 4194 – 4198. 18. Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting. United States Patent 4544545 (1985). 19. A new strategy for attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells / T.M. Allen, E. Brandeis, C.B. Hansen, G.Y. Kao, S. Zalip- sky // Biochimica et Biophysica Acta. – 1995. – V. 1237, № 2. – P. 99 – 108. 20. Цибулькина Е.А. Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК в клетки-мишени // Автореферат дис. канд. хим. наук. – М., 2008. 21. Lasic D.D., Papahadjopoulos D. Liposomes revisited // Science. – 1995. – V. 267. – P. 1275 – 1276. 22. Shi N., Pardridge W.M. Noninvasive gene targeting to the brain // PNAS. – 2000. – V. 97, № 13. – Р. 7567 – 7572. 23. Studies on protein−liposome coupling using novel thiol-reactive coupling lipids: influence of spacer length and polarity / M. Fleiner, P. Benzinger, T. Fichert, U. Massing // Bioconjugate Chem. – 2001. – V. 12, № 4. Р. 470 – 475. 24. Comparative studies of the preparation of immunoliposomes with the use of two bifunctional coupling agents and investigation of in vitro immunoliposome-target cell binding by cytofluorometry and electron microscopy / R.A. Schwendener, T. Trüb, H. Schott, H. Lang- hals, R.F. Barth, P. Groscurth, H. Hengartner // Biochimica et Biophysica Acta. – 1990. – V. 1026, № 1. – Р. 69 – 79. 25. Sullivan S.M., Huang L. Preparation and characterization of heat-sensitive immunoliposomes // Biochimica et Biophysica Acta. – 1985. – V. 812, № 1. – Р. 116 – 126. http://www.pnas.org/search?author1=Ningya+Shi&sortspec=date&submit=Submit http://www.pnas.org/search?author1=William+M.+Pardridge&sortspec=date&submit=Submit 26. (WO/1999/066964) Сarbodiimide cross-linked albumin for bioadhesives, surgical sealants and implantable devices. 27. US Patent 4814098 - Magnetic material-physiologically active substance conjugate. 28. (WO/2003/031975) Homogeneous ligand binding assay. 29. Antibody-conjugated magnetoliposomes for targeting cancer cells and their application in hyperthermia / M. Shinkai, M. Suzuki, S. Iijima, T. Kobayashi // Biotechnology and applied biochemistry. – 1995. – V. 21, № 2. – Р. 125– 137. 30. Immunopotentiators in thermotherapy for cancer / T. Kobayashi, M. Shinkai, H. Honda, K. Ueno, K. Ohtsuka // European Patent EP1438971, 07/21/2004. 31. Preparation and characterization of manganese ferrite-based magnetic liposomes for hyperthermia treatment of cancer / P. Pradhan, J. Giri, R. Banerjee, J. Bellare, D. Bahadur // Journal of magnetism and magnetic materials. – 2007. – V. 311. – P. 208 – 215. 32. Microencapsulation of hemoglobin in liposomes using a double emulsion, film dehydration/rehydration approach / S. Zheng, Y. Zheng, R.L. Beissinger, R. Fresco // Biochim. Biophys. Acta. – 1994. – V. 1196. – P. 123 – 130. 33. Nawroth T., Rusp M., May R.P. Magnetic liposomes and entrapping : time-resolved neutron scattering TR-SANS and electron microscopy // Physica B. – 2004. – V. 350. – P. 635 – 638. 34. Synthesis and characterization of ultrafine well-dispersed magnetic nanoparticles / Z.L. Liu, H.B. Wang, Q.H. Lu, G.H. Du, L. Peng, Y.Q. Du, S.M. Zhang, K.L. Yao // J. Magn. Magn. Mater. – 2004. – V. 283. – P. 258 – 262. 35. Attachment of water-soluble proteins to the surface of (magnetizable) phospholipid colloids via neutravidin-derivatized phospholipids / M. De Cuyper, M. Hodenius, Z.G.M. Lacava, R.B. Azevedo, M. de F´atima da Silva, P. Cesar Morais, M. Helena Andrade Santana // J. Colloid and Interface Sci. – 2002. – V. 245. – P. 274 – 280. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЛИПОСОМ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С.П. Туранская, В.В. Туров, П.П. Горбик Chuiko Institute of Surface Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine General Naumov Str. 17, 03164, Kyiv-164 The review is presents the results of the synthesis of liposomes for the targeted drug delivery into the tumor cells. The usage of the definite combination of saturated phospholipids and cholesterol leads to their stability increasing. On using unsaturated phospholipids for liposome preparation one could undertake precautions to minimize oxidation. Depending on the molar ratio of phospholipids and cholesterol, the size of magnetic liposomes is different. The liposomes of lesser diameter are preferable to larger ones because of their ability to escape phagocytosis by the cells of reticuloendothelial system and permeate from the bloodstream into the interstice easily. Among the liposomes, containing polyethylene glycol and antibodies, the most optimal ones are those, which contain the antibodies attached to distal edges of polyethylene glycol molecule chains. The antibody may be attached to polyethylene glycol molecule with the help of thioester or amide bond. In order to obtain sterically stabilized liposomes, water soluble carbodiimide should be taken.
id	oai:ojs.pkp.sfu.ca:article-343
institution	Surface
keywords_txt_mv	keywords
language	Russian
last_indexed	2026-03-12T17:09:11Z
publishDate	2009
publisher	Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine
record_format	ojs
resource_txt_mv	surfacezbircomua/a5/d78dcb959efe42031dc2dcec5a3fdda5.pdf
spelling	oai:ojs.pkp.sfu.ca:article-3432018-11-27T09:40:12Z Lyposome prepfration for directed transportation of drugs Приготовление липосом для направленной доставки лекарственных препаратов Lyposome prepfration for directed transportation of drugs Turanskaya, S. P. Turov, V. V. Gorbyk, P. P. The review is presents the results of the synthesis of liposomes for the targeted drug delivery into the tumor cells. The usage of the definite combination of saturated phospholipids and cholesterol leads to their stability increasing. On using unsaturated phospholipids for liposome preparation one could undertake precautions to minimize oxidation. Depending on the molar ratio of phospholipids and cholesterol, the size of magnetic liposomes is different. The liposomes of lesser diameter are preferable to larger ones because of their ability to escape phagocytosis by the cells of reticuloendothelial system and permeate from the bloodstream into the interstice easily. Among the liposomes, containing polyethylene glycol and antibodies, the most optimal ones are those, which contain the antibodies attached to distal edges of polyethylene glycol molecule chains. The antibody may be attached to polyethylene glycol molecule with the help of thioester or amide bond. In order to obtain sterically stabilized liposomes, water soluble carbodiimide should be taken. Представлен обзор литературы по синтезу липосом для направленного транспорта лекарственных препаратов в опухолевые клетки. Использование определенной комбинации насыщенных фосфолипидов и холестерола в составе липосом приводит к повышению их стабильности. При использовании для приготовления липосом ненасыщенных фосфолипидов должны предприниматься меры для предотвращения окисления. В зависимости от молярного соотношения фосфолипидов и холестерола магнитные липосомы имеют различные размеры. Липосомы меньшего диаметра имеют преимущества перед липосомами больших размеров, поскольку они после внутривенного введения могут избегать фагоцитоза клетками ретикулоэндотелиальной системы и способны легко проникать из кровеносной системы в межклеточное пространство. Среди липосом, содержащих полиэтиленгликоль и антитела, оптимальными считаются липосомы, в которых антитела были прикреплены к дистальным концам цепей ПЭГ, связанного с липосомами. Антитела могут быть прикреплены к молекуле ПЭГ посредством тиоэфирной или амидной связи. Для получения пространственно стабилизированных липосом может использоваться растворимый в воде карбодиимид. The review is presents the results of the synthesis of liposomes for the targeted drug delivery into the tumor cells. The usage of the definite combination of saturated phospholipids and cholesterol leads to their stability increasing. On using unsaturated phospholipids for liposome preparation one could undertake precautions to minimize oxidation. Depending on the molar ratio of phospholipids and cholesterol, the size of magnetic liposomes is different. The liposomes of lesser diameter are preferable to larger ones because of their ability to escape phagocytosis by the cells of reticuloendothelial system and permeate from the bloodstream into the interstice easily. Among the liposomes, containing polyethylene glycol and antibodies, the most optimal ones are those, which contain the antibodies attached to distal edges of polyethylene glycol molecule chains. The antibody may be attached to polyethylene glycol molecule with the help of thioester or amide bond. In order to obtain sterically stabilized liposomes, water soluble carbodiimide should be taken. Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine 2009-08-02 Article Article application/pdf https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/343 Surface; No. 15 (2009): Chemistry, Physics and Technology of Surface; 189-214 Поверхность; № 15 (2009): Химия, физика и технология поверхности; 189-214 Поверхня; № 15 (2009): Хімія, фізика та технологія поверхні; 189-214 3154-8091 3154-8083 ru https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/343/340 Авторське право (c) 2009 S.P. Turanskaya, V.V. Turov, P.P. Gorbyk
spellingShingle	Turanskaya, S. P. Turov, V. V. Gorbyk, P. P. Lyposome prepfration for directed transportation of drugs
title	Lyposome prepfration for directed transportation of drugs
title_alt	Lyposome prepfration for directed transportation of drugs Приготовление липосом для направленной доставки лекарственных препаратов
title_full	Lyposome prepfration for directed transportation of drugs
title_fullStr	Lyposome prepfration for directed transportation of drugs
title_full_unstemmed	Lyposome prepfration for directed transportation of drugs
title_short	Lyposome prepfration for directed transportation of drugs
title_sort	lyposome prepfration for directed transportation of drugs
url	https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/343
work_keys_str_mv	AT turanskayasp lyposomeprepfrationfordirectedtransportationofdrugs AT turovvv lyposomeprepfrationfordirectedtransportationofdrugs AT gorbykpp lyposomeprepfrationfordirectedtransportationofdrugs AT turanskayasp prigotovlenieliposomdlânapravlennojdostavkilekarstvennyhpreparatov AT turovvv prigotovlenieliposomdlânapravlennojdostavkilekarstvennyhpreparatov AT gorbykpp prigotovlenieliposomdlânapravlennojdostavkilekarstvennyhpreparatov

Lyposome prepfration for directed transportation of drugs

Institution

Ähnliche Einträge