Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів
Spin-probe methods studied the mechanisms of influence of polyethyleneglycols (PEG) on the fluidity of lipid membranes of erythrocytes, the mechanisms of possible membrane lipid membrane and mechanisms of violation of the integrity of membranes of red blood cells over time. The administration of 15%...
Збережено в:
| Дата: | 2019 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine
2019
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/671 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Surface |
| Завантажити файл: |  |
Репозитарії
Surface| _version_ | 1869291831028613120 |
|---|---|
| author | Ivanov, L. V. Scherbak, O. V. Kartel, M. T. |
| author_facet | Ivanov, L. V. Scherbak, O. V. Kartel, M. T. |
| author_institution_txt_mv | [
{
"author": "L. V. Ivanov",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
},
{
"author": "O. V. Scherbak",
"institution": "Харківська державна зооветеринарна академія"
},
{
"author": "M. T. Kartel",
"institution": "Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України"
}
] |
| author_sort | Ivanov, L. V. |
| baseUrl_str | |
| collection | OJS |
| datestamp_date | 2019-04-18T08:53:59Z |
| description | Spin-probe methods studied the mechanisms of influence of polyethyleneglycols (PEG) on the fluidity of lipid membranes of erythrocytes, the mechanisms of possible membrane lipid membrane and mechanisms of violation of the integrity of membranes of red blood cells over time. The administration of 15% PEG-1500 in human erythrocytes and rats showed increased fluidity of membranes of erythrocytes by 16 or 30 %, but then membrane fluidity decreased due to dehydration and cell compression. The introduction of hydrophilic poloxamer 407 and 338 into erythrocytes led to the melting of lipid membranes (the effect of increasing the fluidity of membranes 50-70 %), but the integrity of most cells remained. Before the destruction of the membranes, the viscosity of the cytosol decreased sharply and anisotropy of the EPR spectra was observed, which was associated with significant changes in the structure of the red cell cytosol. Involving the experiment, poloxamers containing ethylene glycol and propylene glycol, showed the mechanisms of genuine melting of membranes with a maximum increase in lipidity (70 % effect), which is bounded by partial hemolysis and cell coagulation. Melting of phospholipids of membranes of erythrocytes under the action of poloxamers 407 and 338 showed that the real reason for melting are hydrophobic methylene groups of PEG or propylene glycol poloxamers, which destroy the structure of cell membranes from all directions. |
| doi_str_mv | 10.15407/Surface.2018.10.299 |
| first_indexed | 2025-07-22T19:34:53Z |
| format | Article |
| fulltext |
Поверхность. 2018. Вып. 10(25). С. 298–314 298
УДК 546.26:615.099.092 doi: 10.15407/Surface.2018.10.299
ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛІВ
ВЕЛИКОЇ МОЛЕКУЛЯРНОЇ МАСИ І ДЕКІЛЬКОХ
ПОЛОКСАМЕРІВ НА ЦІЛІСНІСТЬ І ПЛИННІСТЬ
МЕМБРАН ЕРИТРОЦИТІВ МЕТОДОМ СПІНОВИХ ЗОНДІВ
Л.В. Іванов1, О.В. Щербак2, М.Т. Картель1
1Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України,
вул. Генерала Наумова, 17, Київ, 03164, Україна, E-mail: nikar@kartel.kiev.ua;
2Харківська державна зооветеринарна академія, вул. Академічна, 1, смт. Мала
Данилівка, Дергачівський район, Харківська обл., 62341, Украина, info@hdzva.edu.ua
Методом спінових зондів вивчені механізми впливу поліетиленгліколів (ПЕГ)
на плинність ліпідів мембран еритроцитів, можливого плавлення ліпідів мембран і
порушення цілісності мембран еритроцитів з часом. Введення 15 % ПЕГ-1500 в
еритроцити людини і щура показало збільшення плинності ліпідів мембран еритроцитів
на 16 або 30 %, але потім плинність мембран зменшувалась внаслідок дегідратації і
стиснення клітини. Введення гідрофільних полоксамерів 407 і 338 в еритроцити
приводило до плавлення ліпідів мембран (ефект збільшення плинності мембран 50 – 70 %),
але цілісність більшості клітин зберігалася. Перед руйнуванням мембран в'язкість
цитозолю різко знижувалась, спостерігалася анізотропія спектрів ЕПР спінових зондів,
що пов’язано з суттєвими змінами в структурі цитозолю еритроцитів. Залучення до
експерименту полоксамерів, що містять етиленглікольні та пропіленглікольні ланки,
показало механізми справжнього плавлення мембран з максимальним збільшенням
плинності ліпідів (ефект 70 %), що межує з частковим гемолізом і коагуляцією клітин.
Плавлення фосфоліпідів мембран еритроцитів під дією полоксамерів 407 і 338 показало,
що справжньою причиною плавлення виступають гідрофобні метиленові групи ПЕГ або
ланки пропіленгліколю полоксамерів, що руйнують структуру мембран клітин з усіх
напрямків.
Ключові слова: плинність ліпідів, плавлення, мембрани еритроцитів, аксон сідничного
нерва, поліетиленгліколі, метод спінових зондів, дегідратація клітин, цілісність
еритроцитів.
Поліетиленгліколі (ПЕГ) різної молекулярної маси активно використовуються у
кріобіології як кріопротектори [1 – 5]. Кон’югація різних лікарських препаратів, систем
доставки лікарських речовин (ЛР) в організм або вуглецевих наночастинок різної
структури з ПЕГ великої молекулярної маси призводить до підвищення біосумісності цих
об'єктів із клітинами організму [6 – 8]. Крім цього, синтезують кон'югати ПЕГ із
ферментами, білками і різними ЛР, отримуючи більш ефективні препарати пролонгованої
дії – значне підвищення (у десятки разів) періоду напівжиття лікарських препаратів –
нативних білків після пегілювання їхніх макромолекул [8].
Останнім часом з’явилися неодноразові повідомлення про здатність ПЕГ-2000 та
ПЕГ-3350 плавити розірвані кінці аксонів і швидко відновлювати цілісність аксонів (PEG-
злиття) між проксимальним і дистальним сегментами аксонів щурів, вилучених із
розрізаного і розчавленого матеріалу, in vitro та in vivo після розчавлення сідничного нерва
у щура [9 – 13]. Автори повідомили, що PEG-злиття не тільки відновлює цілісність
299
розщеплених крихітних сціатичних аксонів, як це вимірюється відновленою провідністю
потенціалів дії з'єднання (CAP) і внутрішньо аксональною дифузією флуоресцентного
барвника через місце ураження, але також забезпечує більш швидке відновлення
відповідної поведінки руху на хребці [10].
Пряме застосування ПЕГ до розщеплення сідничного нерва зазвичай (97 % всіх
спроб) швидко відновлює фізіологічну і морфологічну безперервність деяких аксонів у
сідничному нерві. Дійсно, безперервність може бути відновлена для багатьох прокси-
мальних і дистальних частинок аксонів (з невідомими специфічними особливостями). FF-
оцінки асиметрії дають кількісну оцінку поведінки рухливості задніх кінцівок і демон-
струють значно більш швидке відновлення функціональної поведінки, пов'язаної з прямим
застосуванням ПЕГ до розбитого сідничного нерва.
Це відповідає вимірам фізіологічної та морфологічної безперервності відновленої
тканини аксона. Відео-спостереження FF-випробувань і відкритих польових випробувань
також відображає швидке поліпшення поведінки, пов'язаної з прямим застосуванням ПЕГ
для зруйнованих сідничних нервів. Тобто всі дані узгоджуються з інтерпретацією того, що
ПЕГ з’єднується з проксимальною та дистальною аксональними половинами (ПЕГ-злиття)
з достатньою специфічністю, щоб забезпечити значно більш швидке поліпшення рухової
поведінки задніх кінцівок, опосередковане сідничним нервом. Отримані дані свідчать, що
ПЕГ індукує як фізіологічну (виміряну відновленою провідністю потенціалів дії через
місце ураження), так і морфологічну безперервність (внутрішньосудинна дифузія
флуоресцентних барвників через місце ураження) між зрізаними або подрібненими
кінцями мієлінових аксонів ссавців.
Попередні дослідження, присвячені оцінці поведінкового відновлення після ПЕГ-
терапії розрізаних або розчавлених аксонів, були сфокусовані на моделях травм аксонів
ЦНС. Повідомлялося, що підшкірні ін’єкції ПЕГ частково відновлюють м’язовий рефлекс
cutaneus trunchi у морських свинок після травми при роздавлюванні спинного мозку
середнього росту [10]. Щури, які отримували внутрішньовенну ін’єкцію ПЕГ після травми
компресії спинного мозку при Т4, показали поліпшені показники локомоторно в
порівнянні з обробленими фізіологічним розчином контрольними групами, вимірюваними
за допомогою моторної шкали Hindlimb з відкритим полем Basso – Beattie – Bresnahan.
У попередньому дослідженні, присвяченому комп’ютерному управлінню поведін-
ковим тестом на відкритому полі, повідомлялось про поліпшену розвідувальну поведінку
тварин, які отримують підшкірну ін’єкцію ПЕГ після травматичного пошкодження
головного мозку в порівнянні з необробленими тваринами [10].
Раніше Л.В.Івановим із співавторами була опублікована серія робіт, присвячена
дослідженню мембранотропних властивостей ПЕГ різної молекулярної маси, вивченню
процесів дегідратації і набухання клітин еритроцитів під дією осмотично активних ПЕГ,
проведена оцінка можливого впливу ряду фармацевтичних розчинників на біодоступність
різних лікарських речовин [14 – 18]. Для цього використовували метод спінових зондів,
що широко застосовується в молекулярній біології і біофізиці для оцінки тонких
конформаційних змін у білках і мембранах клітин під впливом різних фізико-хімічних
факторів, дослідження мікров’язкості мембран клітин і в’язкості внутрішньоклітинної
рідини, проникності і цілісності мембран клітин тощо [19, 20]. Показано, що різні
фармацевтичні розчинники мають спорідненість до мембран модельних і нативних клітин.
Взаємодія осмотично активних ПЕГ з мембранами клітин на першому етапі супровод-
жується дегідратацією клітин і зменшенням їх внутрішньоклітинного об’єму, а потім
набуханням клітин внаслідок проникнення низькомолекулярних розчинників усередину
клітин через цитоплазматичну мембрану і вирівнювання осмотичного тиску зовні і
всередині клітин. Для високомолекулярних розчинників, які не проникають крізь
мембрану, спостерігалася стійка дегідратація клітин [17]. Останнім часом для ряду клітин
300
і тканин були вивчені і проаналізовані спектри ЕПР ряду водорозчинних і ліпофільних
спінових зондів у цитоплазмі і мембранах клітин, які дозволили отримати нову
інформацію про особливості реологічних властивостей компонентів біоповерхонь і
прогнозувати можливість трансмембранної дифузії для різних наночастинок [21, 22].
Демонстрація ПЕГ-терапії розрізаних або розчавлених дробу аксонів хребта тварин,
здатності ПЕГ безпосередньо плавити і зрощувати кінці аксонів, а також 40-річний досвід
робіт стосовно вивчення механізмів впливу ПЕГ на модельні і нативні мембрани клітин
вимагає уважного дослідження механізмів взаємодії і впливу ПЕГ-1500, ПЕГ-4000 і ПЕГ-
6000 на мікров'язкість фосфоліпідів мембран різних клітин.
У роботі залучені дані власних досліджень впливу сополімерів етиленгліколю та
пропіленгліколю, полоксамерів 407 і 338 на плинність ліпідів мембран еритроцитів, у яких
експериментально показано різке збільшення плинності ліпідів у 1,5 – 1,7 разів, що
демонструють плавлення ліпідів мембран клітин [28].
Метою цієї роботи є дослідження умов і механізмів плавлення фосфоліпідів
мембран під дією ряду полоксамерів і ПЕГ, механізмів порушення цілісності мембран
клітин при цьому. Для цього досліджували вплив ряду осмотично активних ПЕГ великої
молекулярної маси на мікров'язкість мембран еритроцитів крові щурів методом спінових
зондів в часі із залученням експериментальних даних за впливом ряду полоксамерів на
плинність мембран еритроцитів. Отримані дані зможуть розширити знання про реальний
діапазон граничних завантажень на мембрани еритроцитів, а також про практичне
використання високомолекулярних ПЕГ та гідроксильних полоксамерів.
Матеріали і методи досліджень
У роботі використаний метод спінових зондів, згідно з яким за спектрами елек-
тронного парамагнітного резонансу (ЕПР) стабільних нітроксильних радикалів з ліпофіль-
ним органічним замісником (що дозволяє їм потрапити в ліпофільний шар мембран еритро-
цитів) оцінювали час кореляції броунівської обертальної дифузії зондів у мембранах клітин.
Було обрано два спінових зонди на основі пальмітинової кислоти. Зонд 1 –нітро-
ксильний радикал 4-пальмітоіламідо-ТЕМПО і водорозчинний зонд 3 ТЕМПОЛ– одержа-
ні за методиками [23]; зонд 2 – нітроксильний радикал 4-(N,N-диметил-N-гексадеци-
ламоніо) -ТЕМПО містить у своєму складі четвертинний амонійний фрагмент, завдяки
чому може розглядатися як іоногенний ПАР (рис. 1).
N
O
HN
O
зонд 1 зонд 2
N CH3
CH3
CH3
CH3
O
.
OH
зонд 3
Рис. 1. Спінові зонди, застосовані у роботі.
Зонд 2 синтезований із зонду 1 за схемою [25]. Введення зондів 1 або 2 у водну
суспензію еритроцитів здійснювали додаванням концентрованого розчину зонду в ДМСО
таким чином, щоб кінцева концентрація ДМСО в суспензії еритроцитів була в межах 0,5 –
301
1 %. Реєстрацію спектрів ЕПР здійснювали на радіоспектрометрі «ESR Spectrometer
CMS8400» («Adani», Білорусь).
Вимірювання мікров'язкості мембран еритроцитів проводилось на основі обробки
інтенсивності і ширини ліній триплету ЕПР-спектрів нітроксильних радикалів – спінових
зондів 1 та 2, що знаходяться в ліпідному бішарі мембран еритроцитів [19 – 22]. Для
розрахунку часу кореляції броунівської обертальної дифузії зонду ( ) використовуються
такі характеристики спектрів: ширина центральної компоненти ( oH ), інтенсивності
компонентів спектра ЕПР ( 110 ,, hhh ) з магнітним квантовим числом ядра
14N )1,1,0( M , ізотропна константа розщеплення (Аіso).
Базовим рівнянням для оцінки в'язкості будь-яких середовищ є рівняння Стокса –
Ейнштейна
kTa 3/4 3 , (1)
де в'язкість середовища, a ефективний радіус спінового зонда [19 – 22];
1/с (+1) = 2·108 / (h0/h+1)
1/2 – 1)] ∆H0 с
-1 (2 а)
1/с (-1) = 3,6·109 / (h0/h-1)
1/2 – 1)] ∆H0 с
-1 (2 б)
с (+1-1) = 6,65·10-10 ((h+1/h-1)
1/2 - 1)] ∆H+1 с. (2 в)
Використовували параметр анізотропії спектрів ЕПР
)]1)//[()]1)/[( 2/1
10
2/1
10 hhhh , який зв’язує експериментальний параметр анізотропії
спектрів ( ) з величиною анізотропії обертання радикала. Коли значення h+1 перевищує h0,
то с і мають від’ємне значення. Це буває, коли спектри ЕПР анізотропні і обертова
дифузія зонду також анізотропна. Взагалі це свідчить про зміни в структурі середовища,
де знаходиться спіновий зонд.
Для визначення місця знаходження нітроксильної головки спінового зонду в
мембрані оцінювали полярність мікрооточення нітроксильного фрагмента в присутності
або відсутності розчинників за допомогою параметра Аіsо [19]. При знаходженні
нітроксильного радикала у водному оточенні Аіsо становить 16,7 – 17,2 Гс, а в
ліпофільному оточенні в мембрані – 14,0 – 14,5 Гс.
З огляду на витягнуту еліпсоїдну структуру зондів 1 та 2, а також анізотропне обер-
тання їх навколо довгої осі молекули, при аналізі результатів впливу розчинників на мік-
ров'язкість мембран еритроцитів слід у першу чергу опиратися на час кореляції с+1/-1,
який враховує анізотропію спектрів ЕПР і анізотропне обертання зондів у мембрані [19,
20].
Розчини ПЕГ готували на середовищах суспендування еритроцитів і покапельно
вносили у суспензії клітин при постійному перемішуванні при температурі 0 °С до
кінцевої концентрації 15 %. Дану роботу виконували відповідно до «Загальних принципів
експериментів на тваринах», схвалених V Національним конгресом з біоетики (Київ, 2013)
і узгоджених з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що
використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986).
Еритроцити для досліджень отримували з крові білих щурів-самців. Для видалення
плазми і лейкоцитів кров центрифугували 5 хв при 1500 g. Лейкоцитарну плівку і
супернатант видаляли методом аспірації. Осад еритроцитів тричі відмивали
центрифугуванням при 1500 g впродовж 3 хв у 10-кратному обсязі фосфатно-сольового
буфера (0,15 моль/л NaCl, 0,01 моль/л фосфатний буфер, pH 7,4) і зберігали при 4°С
впродовж 4 год. Еритроцити людини отримували з свіжо консервованої донорської крові,
302
заготовленої на глюгіцировому консерванті. Кров отримували на Харківській обласній
станції переливання крові. З метою уніфікації об’єкта у роботі використовували кров II
групи. Після видалення плазми еритромасу тричі відмивали центрифугуванням при 1500 g
впродовж 3 хв у 10-кратному об’ємі фізіологічного розчину (0,15 моль/л хлориду натрію,
0,01 моль/л трис-буфер, pH 7,4).
Застосовували такі неводні розчинники та полоксамери: ПЕГ фірми ''Merk'' з
молекулярною масою ПЕГ-1500, ПЕГ-4000 ПЕГ-6000, а також гідрофільні полоксамери –
338 та 407 (табл. 1), які представлені загальною формулою (European pharmacopoeia 7.0):
HO – (CH2-CH2-O) а- (CH2-CH2-CH3-O) б- (CH2-CH2-O) а-H. Номери полоксамерів містять
три цифри – перші дві цифри помножені на 100 приблизно відповідають молекулярній
масі гідрофобного ППГ блоку, а остання цифра помножена на 10 показує процентний
вміст гідрофільного ПЕГ блоку. 30 %- або 15 %-водні розчини полоксамерів вводили до
суспензії еритроцитів додаванням у завись еритроцитів по краплях у різних
співвідношеннях.
Розчинники ПЕГ також вводили у суспензію еритроцитів при додаванні у
суспензію по краплях 30 %- або 15 %-водних розчинів у різному співвідношенні. Для
статистичної обробки отриманих даних застосовували пакет прикладних програм
«Statistica 6.0» (США). Результати дослідження представлені у вигляді середніх значень,
відхилення – стандартної помилки середнього. Статистичну значимість розбіжностей
між значеннями оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента, значущими вважали
відмінності при р <0,05.
Результати та їх обговорення
Використані ліпофільні спінові зонди відрізняються величиною позитивного
заряду на атомі азоту поблизу нітроксильної «головки». Таким чином, вони можуть дещо
по-різному вбудовуватися в ліпідний бішар мембран клітин. Так, зонд 2 вбудовується в
мембрану подібно фосфатидилхоліну, що має позитивно заряджену холінову «головку» і
два алкільних «хвоста». Нітроксильний фрагмент зонду 2 із неспареним електроном
знаходиться в ліпідах на межі розділу вода–мембрана і чутливий до зв'язування з
мембраною великих об'єктів, непроникаючих крізь мембрану.
Нейтральний зонд 1 не так жорстко структурований (орієнтований) в ліпідному
бішарі мембран еритроцитів і може знаходитися трохи глибше в мембрані еритроцитів.
Тому його спектр ЕПР не змінюється при введенні в суспензію еритроцитів фериціаніду
(розширювача сигналу), тобто нітроксильний фрагмент зонду 1 недоступний воді.
Обертальна рухливість зонду 1 у мембрані еритроцитів вища, ніж у зонду 2.
Раніше для вивчення цілісності ізольованих клітин і клітин зразків тканин при
будь-яких фізико-хімічних факторах був запропонований кількісний експрес-метод оцінки
цілих клітин з використанням методу спінових зондів [26]. У цьому методі в суспензію
клітин вводять водорозчинний спіновий зонд 3, який швидко проникає всередину клітин.
Далі додаються парамагнітні розширювачі спектрів ЕПР – фериціанід калію, або
хлористий нікель, які у нормі не проникають всередину клітин, але розширюють спектр
ЕПР зондів у позаклітинній воді до нуля (обмінна взаємодія). У результаті цього ми
реєструємо спектр ЕПР зонду, що знаходиться виключно всередині клітин. При
порушенні цілісності мембран – появі дефектів, розривів, дірок у мембрані – парамагнітні
фериціанід калію або хлористий нікель миттєво проникають усередину клітин і сигнал
ЕПР зонду всередині клітин зникає. Інтенсивність спектру ЕПР зонду, що знаходиться в
цитозолі клітин, пропорційна кількості цілих клітин в суспензії (в %). Помилка методу у
визначеннях непошкоджених клітин не перевищує 3 %.
Таким чином, за допомогою спінових зондів 1 – 3 можливо отримувати інформацію
про вплив ПЕГ і полоксамерів на мікров'язкість (плинність, величина, зворотна в'язкість)
303
ліпідів у поверхневому шарі мембран еритроцитів та цілісність мембран клітин. Аналіз
впливу досліджуваних високомолекулярних ПЕГ на мікров’язкість мембран еритроцитів є
непростим завданням, тому що осмотично активні розчинники одночасно викликають
різноспрямовані ефекти, що формують мікров’язкість. Серед них слід відзначити такі:
1) збільшення мікров’язкості мембран на етапі дегідратації та стиснення клітин,
2) зменшення мікров’язкості мембран клітин внаслідок деструкції рідиннокрис-
талічної структури мембран, зниження впорядкованості фосфоліпідів у мембрані,
3) зменшення мікров’язкості мембран внаслідок порушення білок-ліпідної
взаємодії у мембрані при зв’язуванні ПЕГ за допомогою метиленових груп з мембранними
білками за гідрофобним механізмом,
4) зміна мікров’язкості ліпідного бішару мембран у часі внаслідок дифузії ПЕГ
всередину мембран.
Тому в роботі використовували зонд 2, що дає інформацію про конформаційну
рухливість поверхневого мембранного шару, і зонд 1, що знаходиться в більш глибоких
ліпідних шарах мембран еритроцитів. Реєстрацію спектрів ЕПР проводили через 5, 30 і 60
хв після введення розчинника у суспензію еритроцитів, що дозволило оцінити в часі зміну
конформаційної рухливості ліпідів мембран під дією розчинників і стежити за наслідком
дифузії розчинників усередину мембрани. Деякі параметри інформативних спектрів ЕПР
для зондів 2 і 1 в еритроцитах в присутності ряду розчинників представлені на рис. 2, а в
табл. 1 наведені значення часу кореляції с цих зондів у мембрані (пропорційні в’язкості )
для кожного конкретного розчинника в суспензії клітин еритроцитів.
Із рис. 2 випливає, що при введенні розчинників, включаючи ПЕГ, відбувається
швидка дегідратація еритроцитів. Це призводить до стрибка в’язкості цитозолю клітин, а
потім впродовж години відбувається повільне зниження в’язкості внутрішньоклітинної
рідини до норми внаслідок трансмембранної дифузії низькомолекулярних ПЕГ і
розчинників у внутрішньоклітинну рідину, за винятком ПЕГ-2000, який не проникає через
мембрану всередину клітин і залишається на поверхні мембрани (рис.2, крива 6) [22].
Ці результати показують, що для досліджуваних ПЕГ-1500, ПЕГ-4000 і ПЕГ-6000
змінюється характер їх впливу на ліпіди і мікров’язкість мембран клітин. Основна дія
високомолекулярних ПЕГ на мембрани пов’язана з дегідратацією клітин, їх стисненням
(збільшення мікров’язкості ліпідів мембран) і руйнуванням рідиннокристалевої структури
поверхні мембран і білково-ліпідної взаємодії, що знижує мікров’язкість мембран клітин.
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
1 ,5
1 ,6
1 ,7
1 ,8
1 ,9
2 ,0
2 ,1
2 ,2
h о / h - 1
6
5
1
2
3
4
Т , х в
Рис. 2. Вплив розчинників (ПЕГ) на параметр hо/h-1 спектра ЕПР (пропорційний в’язкості)
зонда 3 в цитозолі еритроцитів: 1 – контроль; 2 – пропіленгліколь; – гліцерин; 4 – ПЕГ-300;
5 – ПЕГ-600; 6 – ПЕГ-2000.
Раніше при вивченні впливу ПЕГ на структуру макромолекули сироваткового
альбуміну бика (САБ) було показано, що ПЕГ різної молекулярної маси здатні витісняти
304
ліпофільний спін-мічений прогестерон із гідрофобних порожнин САБ за гідрофобним
конкурентним механізмом за рахунок метиленових -СН2-СН2- груп ПЕГ [22]. Аналогічний
процес відбувається при взаємодії ПЕГ з мембранами клітин – ослаблення гідрофобної
взаємодії між ліпідами і периферійними або інтегральними білками (ферментами)
мембран клітин, коли молекули ПЕГ проникають у місце контактів фосфоліпідів і білків
мембрани. Крім цього, взаємодія ПЕГ з мембранами роз’єднує гідрофобну взаємодію між
алкільними хвостами фосфоліпідів у мембранах різних клітин. Все це призводить до
руйнування рідиннокристалевої структури мембран клітин і ослаблення білок-ліпідної
взаємодії в мембранах. На зміни білок-ліпідної взаємодії у мембранах клітин при взаємодії
з кріопротекторами вказується в деяких статтях [24], але без експериментального
підтвердження і наукового обґрунтування.
"Плавлення'' роздріблених аксонів сідничного нерва щурів під дією ПЕГ-2000 і
ПЕГ-3350 з подальшим загоєнням, про який згадувалося на початку нашої роботи [9, 10],
у перекладі на мову параметрів мембран означає різке збільшення плинності ліпідів
мембран нейронів (зменшення в’язкості). Таке явище ніколи не спостерігалось для ПЕГ
середньої молекулярної маси – ПЕГ-300, ПЕГ-400, ПЕГ-600. Тільки при вивченні впливу
на мікров’язкість мембран еритроцитів сополімерів поліетиленгліколю і поліпропі-
ленгліколю полоксамерів (10 %), які мають велику гідрофобність в основному за рахунок
ланок пропіленгліколю, нами спостерігався ефект плавлення мембран еритроцитів, при
якому плинність мембран зростає в 1,5 – 1,7 разів до критичного рівня – появи часткового
гемолізу і коагуляції еритроцитів (див. нижче). Це при тому, що мембрана еритроцитів
прошита тривимірною сіткою білка спектрина дуже міцна (тому ніжна тканина нейронів
повинна плавитися подібно олову при нагріванні) [28].
На цьому етапі, згідно з даними табл. 1, можна відзначити, що полоксамер 407
містить найбільшу кількість гідрофобних ланок пропіленгліколю з вивчених (в абсолют-
них величинах) і значну макромолекулу (друге місце). На другому місці полоксамер 338
(перше місце за розміром макромолекули), який має достатню кількість ланок пропілен-
гліколю і дуже велику кількість ланок етиленгліколю, що містять гідрофобні метиленові
групи і компенсують нестачу ланок пропіленгліколю в порівнянні з полоксамером 407.
Таблиця 1. Характеристики полоксамерів
Тип
полоксамеру
Ланки етиленоксиду (а)
Ланки
пропіленоксиду (б)
Вміст
оксиетилену, %
Середня молекулярна
маса
188 75-85 (мол. м. 3500) 25–30 79,9–83,7 7680–9510
237 60-68 (мол. м. 2800) 35–40 70,5–74,3 6840–8830
338 137-146 (мол. м. 6200) 42–47 81,4–84,9 12700–17400
407 95-105 (мол. м. 4400) 54–60 71,5–74,9 9840–14600
Таким чином, ефект збільшення плинності ліпідів мембран клітин (ефект
плавлення ліпідів) залежить від абсолютної кількості гідрофобних ланок у молекулі
полоксамеру, що припадають на одну клітину еритроцитів, які здатні ефективно
трансформувати структуру поверхні мембран (непроникаючі ПЕГ) у бік збільшення
плинності мембран.
Із рис. 3 – 5 видно, що рухливість ліпофільного спінового зонда 2 у ліпідах
мембран еритроцитів помітно зростає з часом (через 30 хв) для полоксамерів 407 і 338. У
роботах кріобіологів, де ПЕГ-1500 використовують як кріопротектор, показано, що ПЕГ-
1500 необхідно по краплях додавати до еритроцитів на холоду, в результаті чого
утворюється його міцний комплекс з мембраною, який при відмиванні ПЕГ-1500 викликає
розрив клітин еритроцитів (гемоліз) [24]. У табл. 2 представлені дані про вплив
високомолекулярних ПЕГ і ряду полоксамерів на час кореляції спінового зонда 2 в ліпідах
мембран еритроцитів.
305
Рис. 3. Спектри ЕПР спінового зонда 1 у
мембранах еритроцитів людини:
1 – контроль, 2 – у присутності 5%
полоксамеру 407 через 30 хв після
введення в еритроцити при 25С.
Рис. 4. Спектри ЕПР зонда 2 в
еритроцитах при 25°С: 1 –
контроль; 2 – через 30 хв після
введення ПЕГ-1500 (15%) у
суспензію еритроцитів, 3 – через
5 хв після введення ПЕГ-4000
(15%) у суспензію еритроцитів.
Рис. 5. Спектри ЕПР зонда 2 в
еритроцитах при 25°С: 1 – через
5 хв після введення полоксамеру
338 (10 %) у суспензію
еритроцитів; 2 – через 30 хв
після введення полоксамеру 338
(10 %) у суспензію еритроцитів,
3 – через 60 хв після введення
полоксамеру 338 (10 %) у
суспензію еритроцитів.
306
Таблиця 2. Значення величин часу кореляції τ, розраховані із спектрів ЕПР зонда 2 в
мембранах еритроцитів щурів, у присутності фармацевтичних розчинників при
температурі 25оС
Фармацевтичні розчинники τ+1·109 , с τ-1·109, с τ+-1·109, с
Контроль 8,21 1,54 5,15
ПЕГ 6000 15 % 5 хв 7,89 1,63 4,97
ПЕГ 6000 15 % 30 хв 9,7 1,74 5,88
ПЕГ 6000 15 % 60 хв 9,04 1,7 4,7
ПЕГ 4000 15 % 5 хв 9,7 1,78 5,61
ПЕГ 4000 15 % 30 хв 6,94 1,46 4,52
ПЕГ 4000 15 % 60 хв 8,93 1,57 4,98
ПЕГ 1500 15 % 5 хв 7,1 (-14%) 1,32 (-14%) 3,52 (-32%)
ПЕГ 1500 15 % 30 хв 8,71 (+6%) 2,1 (+36%) 6,39 (+24%)
ПЕГ 1500 15 % 60 хв 7,82 (-5%) 1,77 (+15%) 5,05 (-2%)
Poloxamer 407 10 % 5 хв 4,34 (-47%) 0,82 (-46%) 1,61 (-69%)
Poloxamer 407 10 % 30 хв 3,87 (-53%) 0,84 (-45%) 1,6 (-69%)
Poloxamer 407 10 % 60 хв 4,1 (-50%) 0,89 (-42%) 1,72 (-66%)
Poloxamer 338 10 % 5 хв 3,37 (-59%) 0,84 (-45%) 2,24 (-57%)
Poloxamer 338 10 % 30 хв 3,2 (-61%) 0,87 (-43%) 2,03 (-61%)
Poloxamer 338 10 % 60 хв 3,82 (-53%) 0,95 (-38%) 2,16 (-58%)
* В табл. 2 для деяких розчинників приводяться величини ефектів зниження (-) і підвищення (+) в'язкості
мембран еритроцитів (в %).
Таблиця 3. Значення величин часу кореляції τ, розраховані із спектрів ЕПР зонда 2 в
мембранах еритроцитів людини, в присутності ПЕГ-1500 при температурі
25оС
Неводні розчинники τ-1·109, с τ+1/-1·109, с
Контроль 1,80 ± 0,89 7,0 ± 4,20
ПЕГ-1500 (10%) 5 хв 1,77 ± 0,88 6,80 ± 4,10
ПЕГ-1500 (10%) 30 хв 1,56 ± 0,70* 6,70 ± 4,01
ПЕГ-1500 (10%) 60 хв 1,5 ± 0,85 (-16%) 6,0 ± 3,65*(-15%)
Вище зазначалося, що час кореляції τ +/–1 ліпофільних зондів 1 і 2 в ліпідах
мембран еритроцитів більш чутливий до змін у структурі мембран, ніж час кореляції,
розрахований за іншими формулами, про що свідчать дані табл. 2. Введення ПЕГ-1500 у
суспензію еритроцитів відразу призводить до досить великого підвищення плинності
мембран (ефект 32%) внаслідок порушення білково-ліпідних взаємодій і руйнування всієї
рідиннокристалевої структури поверхні мембран еритроцитів. Та через 30 хв внаслідок
повільної дегідратації, стиснення клітини і багатоточкової взаємодії полімерного
ланцюжка ПЕГ-1500 із компонентами мембрани спостерігається іммобілізація мембрани з
наступним виходом практично на вихідну мікров’язкість мембран. Таке коливання
мікров’язкості мембран еритроцитів спостерігалося навіть для проникаючих усередину
клітин ПЕГ. Введення ПЕГ-1500 у суспензію еритроцитів людини демонструє поступове і
планомірне збільшення плинності мембран еритроцитів людини – фази зниження
плинності мембрани не спостерігається.
Якщо врахувати, що фаза зниження плинності мембран під дією ПЕГ в основному
пов'язана з дегідратацією, багатоточковим зв'язуванням ланцюжка полімеру ПЕГ-1500 з
елементами мембрани і утворенням міцного комплексу з мембраною, то склад
307
інгредієнтів поверхні мембран еритроцитів людини дещо відрізняється від такого у щура.
На це вказують наші порівняльні результати впливу фармацевтичних допоміжних речовин
на мембрани еритроцитів людини і щура [27].
Введення ПЕГ-4000 у суспензію еритроцитів щура (табл. 2) впродовж усього
експерименту супроводжувалося іноді частковим гемолізом, іноді несподіваними
результатами – у нашому випадку (див. табл. 2) швидким підвищенням мікров’язкості
мембран, замість зниження і подальшого зниженням в’язкості мембран еритроцитів.
Можливо, при цій молекулярній масі у макромолекули ПЕГ-4000 формується інша
конформація полімеру і виникають нові аспекти впливу на плинність мембран клітини. У
роботі [9] для відновлення розчавленого і роздробленого сідничного нерва щурів
використовували ПЕГ з молекулярною масою 3350, а в роботі [10] – ПЕГ-2000. Причому
ці полімери безпосередньо вводили в щілину трубки нейрона з роздрібненого тканиною
аксона в 50% концентрації, де фосфоліпіди були захищені від значного зменшення свого
обсягу в процесі дегідратації постійним розміром нейротрубки. У цьому контексті фактор
дегідратації, що протистоїть збільшенню плинності ліпідів, нівелювався і при
безпосередній взаємодії 50% концентрації ПЕГ міг реалізуватися стрибок збільшення
плинності ліпідів аксону – плавлення ліпідів.
Незважаючи на те що у ПЕГ-6000 молекулярна маса помітно вища, частковий
гемоліз, часткова коагуляція і повне порушення цілісності еритроцитів (зникнення
сигналу ЕПР) відбувалося саме з ПЕГ-4000 (див. нижче). При введенні ПЕГ-6000 в
еритроцити з'являлися хвилеподібні збільшення і зменшення плинності мембран, які
свідчать про тривалість процесів, що призводять до зміни мікров’язкості мембран клітин
внаслідок переплетіння полімерного ланцюжка ПЕГ з компонентами поверхні мембран
еритроцитів. Для з'ясування механізмів і умов плавлення ліпідів мембран клітин у роботі
вивчали вплив сополімерів етиленгліколю та пропіленгліколю з різною структурою і
молекулярною масою. Ці дані наведені в табл. 2 і показують найсильніший стрибок
плинності ліпідів мембран еритроцитів відразу ж при введенні полоксамерів 407 або 388 в
еритроцити щура. Плинність ліпідів мембран у присутності у суспензії еритроцитів
полоксамеру 407 (10%) зростає майже на 70%, а полоксамеру 388 – на 60 %. Таким
чином, ці величини для клітин еритроцитів являються критичними, тому що паралельні
досліди з оцінки цілісності мембран за допомогою зонду 3 фіксують порушення цілісності
мембран у 10 – 13 % суспензії еритроцитів (можливо у старих клітинах). Крім цього,
спостерігається частковий гемоліз і часткова коагуляція. Мабуть це і є плавлення ліпідів
мембран клітин. Однак дуже чутливий тест за допомогою спінового зонда 3 демонструє
збереження цілісності мембран еритроцитів у 88 – 90 % клітин. Слід зазначити, що
спектри ЕПР зонда 2 у мембрані еритроцитів свідчать про те, що в присутності
полоксамерів мембрани всіх клітин мають однакову високу плинність, а максимальна
плинність мембран настає, як правило, після 30 хв інкубації полоксамеру з клітинами, а
потім трохи падає. Дані табл. 2 показують великий діапазон зміни плинності мембран, що
пов'язано з фізіологічною функцією еритроцитів – доставляти кисень до всіх тканин і
органів, проникати в дуже дрібні капіляри, сильно змінюючи форму клітини і
витягаючись буквально в ниточку.
Слід зазначити, що в табл. 3 представлені значення часу кореляції водорозчинного
зонда 3 у внутрішньоклітинному середовищі (цитозоль) клітин еритроцитів, що
пропорційні мікров’язкості цитозолю. Мікров’язкість цитозолю в середньому на порядок
нижча, ніж мікров’язкість ліпідів мембран еритроцитів, тому що в цитоплазмі знаходяться
в основному водорозчинні макромолекули гемоглобіну. Обертальна рухливість зонда 3 в
цитоплазмі чутлива до процесів дегідратації (стиснення клітини) і набухання (збільшення
обсягу цитозоля). Введення полоксамеру 338 в еритроцити призводить до поступової
повільної дегідратації клітин впродовж години, причому значення τ+1 через 1 год інкубації
308
стають від’ємними, що пов'язано з анізотропією обертальної рухливості зонду в
цитоплазмі (і, з досвіду, передує порушенню цілісності клітин). Введення ПЕГ-1500 в
еритроцити відразу призводить до стійкого в часі зменшення мікров'язкості цитозолю
еритроцитів, що пов'язано з набуханням клітин. Введення в суспензію еритроцитів ПЕГ-
4000 відразу призводить до зменшення мікров'язкості цитозолю. Потім настає фаза
дегідратації клітини (підвищення в'язкості цитозолю до норми), і врешті решт цілісність
мембран повністю порушується – спектр ЕПР зникає. І знову перед руйнуванням клітини
τ+1 набуває від’ємного значення. Введення ПЕГ-6000 в еритроцити призводить спочатку
до набухання клітини, потім до стиснення клітини, і нарешті знову до набрякання
еритроцитів.
Таблиця 4. Значення величин часу кореляції, розраховані зі спектрів ЕПР зонда 3 у
внутрішньоклітинної рідини еритроцитів щурів, у присутності фармацевти-
них розчинників при температурі 25оС
Фармацевтичні розчинники τ+1·1010, с τ-1·1010, с τ+-1·1010 , с
Контроль 4,2 0,85 2,2
ПЕГ 6000 15% 5 хв 5,2 0,7 1,5
ПЕГ 6000 15% 30 хв 2,8 0,9 2,11
ПЕГ 6000 15% 60 хв 2,7 0,7 1,9
ПЕГ 4000 15% 5 хв 2,5 0,6 1,4
ПЕГ 4000 15% 30 хв -0,9 1,0 2,2
ПЕГ 4000 15% 60 хв - - -
ПЕГ 1500 15% 5 хв 5,0 0,7 1,6
ПЕГ 1500 15% 60 хв 4,5 0,7 1,6
Poloxamer 338 10% 5 хв 1,8 0,5 1,1
Poloxamer 338 10% 30 хв 2,4 0,6 1,2
Poloxamer 338 10% 60 хв -0,2 0,6 1,5
ГГ 15% 5 хв -4,8 1,0 2,6
ГГ 15% 30 хв -5,9 0,2 0,5
ГГ 15% 60 хв - - -
N-MP 7,5% 5 хв -3,6 0,7 1,7
N-MP 7,5% 30 хв - - -
N-MP 7,5% 60 хв - - -
Для з’ясування причин пошкодження цілісності мембран еритроцитів в присут-
ності ПЕГ у роботі застосували дані про вплив на мембрани цитотоксичних гексилен-
гліколю (ГГ) і N-MP (метилпіролідону), які також представлені в табл. 4. Руйнуванню
клітин (зникненню спектрів ЕПР) під дією гексиленгліколю передувало різке зниження
мікров'язкості цитозолю еритроцитів (у 5 разів), а також поява негативних значень τ+1, що
зруйнувало клітину при набуханні. Для N-MP перед розривом мембран і зникненням
спектрів ЕПР також виникають від’ємні значення τ+1 і спостерігається падіння мікро-
в’язкості мембран. Можлитво, у нашому випадку, руйнуванню мембрани еритроцитів
передують значні спотворення обсягу цитозоля еритроцитів (зміна анізотропії оберту
зонда 3 всередині клітин, зміна поверхневого натягу мембран) плюс різке набухання
клітин (потоншення мембран), що призводить до розриву мембран еритроцитів.
309
Висновки
На основі низки зарубіжних публікацій проведено ретельний аналіз причин
плавлення і ПЕГ-злиття роздроблених і розчавлених кінців аксона сідничного нерва щура
під безпосереднім впливом ПЕГ-2000 і ПЕГ-3350 з подальшим поступовим відновленням
рухливості задніх кінцівок щура. Необхідною умовою плавлення фосфоліпідів аксонів є
різке зростання плинності фосфоліпідів при безпосередній взаємодії 50% розчину ПЕГ з
фосфоліпідами в нейронній трубці. Для вивчення механізмів та умов різкого зростання
плинності (плавлення) фосфоліпідів мембран клітин у роботі за допомогою методу
спінових зондів досліджували вплив ряду високомолекулярних ПЕГ на плинність
фосфоліпідів мембран еритроцитів людини і щура. Показано, що введення ПЕГ у
суспензію еритроцитів супроводжується двома різноспрямованими за дією на плинність
ліпідів мембран процесами – збільшення плинності ліпідів внаслідок ослаблення
(порушення) білково-ліпідних та фосфоліпідних взаємодій і зниження плинності ліпідів в
результаті дегідратації і стиснення клітин еритроцитів. Введення 15% ПЕГ-1500 в
еритроцити людини показало планомірне збільшення плинності ліпідів мембран
еритроцитів впродовж години (величина ефекту 15–16%). Введення 15% ПЕГ-1500 в
еритроцити щура відразу приводило до збільшення плинності ліпідів мембран більш ніж
на 30%, проте у подальшому плинність ліпідів зніжувалась внаслідок дегідратації і
стиснення клітини. Для всіх високомолекулярних ПЕГ розвитку процесу збільшення
плинності ліпідів мембран еритроцитів перешкоджав процес дегідратації клітини. В
аналогічних зарубіжних експериментах стадія дегідратації (стиснення обсягу мембрани з
фосфоліпідами) знівельована нейронною трубкою, що обмежує зміну обсягу, в якій
знаходяться фосфоліпіди з ПЕГ, а 50 % розчин ПЕГ має можливість безпосередньо різко
збільшити плинність ліпідів, що звільнилися від гідрофобних взаємодій в мембрані.
Залучення до експерименту полоксамерів, що містять етиленглікольні та
пропіленглікольні ланки, показало механізми справжнього плавлення мембран з
максимальним збільшенням плинності ліпідів (ефект 70 %), що межує з частковим
гемолізом і коагуляцією клітин. Плавлення фосфоліпідів мембран еритроцитів під дією
полоксамерів 407 і 338 показало, що справжньою причиною плавлення виступають
гідрофобні метиленові групи ПЕГ або ланки пропіленгліколю полоксамерів, що руйнують
структуру мембран клітин з усіх напрямків.
Література
1. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. // К.: Наук. Думка. – 1994. – 432 с.
2. Ivanov L.V., Gavrilova I.I., Moiseyev V.A. Investigation of the membrane integrity of
human erytrocytes at low temperatures ising spin probes //Cryo-Lettes. – 1881. – Vol. 2.
– P. 197–200.
3. Hеber U.W. Freezing injury is relation to loss of enzyme activities and protection against
freezing // Cryobiology. – 1968. –Vol. 5. – P. 188–201.
4. Nardid O.A., Dyubko T.S., Soloviova A.S et. al. Influence of some polyols on rythrocyte
cytoskeleton proteins // Cellular & Molecular Biology Letters.– 1998.– Vol. 3, № 2.– P.
187–188.
5. Нардид О.А., Цымбал Л.В., Гулевский А.К. Влияние криопротекторов на белок-
липидные взаимодействия в мембранах эритроцитов // Физико-химические
процессы в криобиологических системах: Сб. статей. – Харьков. – 1991. – С. 102–
106.
6. Murakami T., Fan J., Yudasaka M., Iijima S., Shiba K. Solubilization of single-wall
carbon nanohorns using a PEGdoxorubicin conjugate // Molecular Pharmaceutics. –
2006, V.3, P.407–414.
310
7. Matsumura S., Ajima K., Yudasaka M., Iijima S. and Shiba K. Dispersion of Cisplatin-
Loaded Carbon Nanohorns with a Conjugate Comprised of an Artificial Peptide Aptamer
and Polyethylene Glycol // Molecular Pharmaceutics. – 2007, V.4 N 5, – P.723–729.
8. Никитин И.Г., Байкова И.Е., Гогова Л.М. Клиническая фармакология.
Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние проблемы и
перспективы, Кафедра госпитальной терапии № 2 Лечебного факультета РГМУ //
Лечебное дело 4. – 2005. – С.18–24.
9. Shuai Ren, Ze Han Liu, Qiong Wu, Kuang Fu, Jun Wu, Li Ting Hou, Ming Li, Xin Zhao,
Qing Miao, Yun Long Zhao, Sheng Yu Wang, Yan Xue, Zhen Xue, Ya Shan Guo, Sergio
Canavero, Xiao Ping Ren. Polyethylene glycol-induced motor recovery after total spinal
transection in rats // CNS Neurosci Ther. V. 23 N 8. – P. 680–685.
10. Britt J.M., Kane J.R., Spaeth C.S., Zuzek A., Robinson G.L., Gbanaglo M.Y., Estler C.J.,
Boydston E.A., Schallert T., Bittner G.D.J. Polyethylene Glycol Rapidly Restores Axonal
Integrity and Improves the Rate of Motor Behavior Recovery After Sciatic Nerve Crush
Injury // J Neurophysiol. – 2010. V. 104. N 2. – P.695–703.
11. Borgens R.B, Bohnert D. Rapid recovery from spinal cord injury after subcutaneously
administered polyethylene glycol // J Neurosci Res.: – 2001. V. 66, N 6. – P. 1179–1186.
12. Ahkong Q.F., Desmazes J.P., Georgescauld D., Lucy J.A. Movements of fluorescent
probes in the mechanism of cell fusion induced by poly(ethylene glycol) // J Cell Sci. –
1987. V.88. N 3. – P. 389–398.
13. Bittner G.D., Ballinger M.L., Raymond M.A. Reconnection of severed nerve axons with
polyethylene glycol // Brain Res – 1986 V.367. – P. 351–355.
14. Иванов Л.В., Ляпунов Н.А., Цымбал Л.В. и др. Влияние состава двухкомпонентных
растворителей на биологические мембраны // Хим.-фармац. ж. – 1986. N 12. – С.
1437–1443.
15. Иванов Л.В., Орлова И.Н. Биофармацевтические исследования, направленные на
оптимизацию состава, свойств и пути введения лекарственных препаратов // В сб.
”Технология и стандартизация лекарств”. – Харьков. – 2000. –Т. 2. – С. 558–615.
16. Иванов Л.В. Изучение взаимодействия некоторых гидрофильных неводных
растворителей с биомембранами различных клеток методами спиновых и
флуоресцентных зондов // Фармаком. – 1999. – Т. 2. – С. 45–47.
17. Иванов Л.В. Изучение механизмов дегидратации клеток эритроцитов под
действием гидрофильных неводных растворителей // Фармаком. – 1998. – Т. 5 – C.
43–47.
18. Иванов Л.В., Георгиевский В.П. Изучение механизмов влияния вспомогательных
веществ на биодоступность // Материалы I Международной научно-практической
конференции ''Создание, производство, стандартизация, фармакоэкономика
лекарственных средств и биологических добавок'', Тернополь. – 2004. – 19 с.
19. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. // М.: Наука.
–1974. – С. 12–24.
20. Берлинера Л. Метод спиновых меток. Теория и применения // Москва: Мир. – 1979.
– 639 с.
21. Иванов Л.В., Картель Н.Т. Оценка микровязкости клеточных мембран различной
природы методом спиновых зондов // Доповіді НАН України. –2012. – Т. 5. –
С.139–145.
22. Иванов Л.В., Картель Н.Т. Характеризация реологических свойств поверхности
нанобиообъектов методом спиновых зондов // Поверхность. – 2012.- Вып. 4 № 19. –
С. 334–348.
23. Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. // Москва: Химия. – 1970. –
216 с.
311
24. Нардид О.А., Черкашина Я.О., Иванов Л.В., Нардид Э.О., Ляпунов А.Н.,
Мамонтов В.В. Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной
массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов // Проблемы криобиологии и
криомедицины. – 2016. –Т. 26, №1. –С. 35–44.
25. Иванов Л.В., Ляпунов А.Н., Картель Н.Т., Нардид О.А., Окотруб А.В., Кирилюк
И.А., Черкашина Я.О. Доставка липофильных спиновых зондов углеродными
нанотрубками в эритроциты и плазму крови // Поверхность. – 2014. – Вып. 6 № 21.
– С. 292–304.
26. Иванов Л.В., Моисеев В.А., Гаврилова и др. Способ определения степени
деструкции клеток // А. с. СССР 1049808. Опубл. 23.06.1983, Бюл. № 39.
27. Иванов Л.В., Ляпунов А.Н., Картель Н.Т. и др. Сравнительное изучение влияния
ряда фармацевтических вспомогательных веществ на микровязкость мембран
эритроцитов крови человека и крыс методом спиновых зондов // Фармакологія та
лікарська токсикологія. –2016. – Т. 47. –№1. – С. 72–78.
28. Іванов Л.В., Картель Н.Т., Ляпунов А.Н. та інші. Вивчення механізмів
цитотоксичності низки гідрофільних полоксамерів методом спінових зондів //
Фармакологія та лікарська токсикологія. –2 015. – Т. 45. –N 4–5.– С. 46–58.
References
1. Belous A.M., Grishchenko V.I. Cryobiology. // K. Science. Dumka. 1994: 432. [in
Russian].
2. Ivanov L.V., Gavrilova I.I., Moiseyev V.A. Investigation of the membrane integrity of
human erytrocytes at low temperatures ising spin probes // Cryo-Lettes. 1881. 2: 197.
3. Hеber U.W. Freezing injury is relation to loss of enzyme activities and protection against
freezing // Cryobiology. 1968. 5: 188.
4. Nardid O.A., Dyubko T.S., Soloviova A.S et. al. Influence of some polyols on rythrocyte
cytoskeleton proteins // Cellular & Molecular Biology Letters. 1998. 3(2): 187.
5. Nardid OA, Tsymbal L.V., Gulevsky A.K. Influence of cryoprotectants on protein-lipid
interactions in erythrocyte membranes // Physical and chemical processes in
cryobiological systems: Coll. articles. - Kharkov. 1991: 102. [in Russian].
6. Murakami T., Fan J., Yudasaka M., Iijima S., Shiba K. Solubilization of single-wall
carbon nanohorns using a PEGdoxorubicin conjugate // Molecular Pharmaceutics. 2006.
3: 407.
7. Matsumura S., Ajima K., Yudasaka M., Iijima S. and Shiba K. Dispersion of Cisplatin-
Loaded Carbon Nanohorns with a Conjugate Comprised of an Artificial Peptide Aptamer
and Polyethylene Glycol // Molecular Pharmaceutics. 2007. 4(5): 723.
8. Nikitin I.G., Baikova I.E., Gogova L.M. Clinical pharmacology. Pegylated Drugs:
Current State of the Problem and Prospects, Department of Hospital Therapy No. 2 of the
Medical Faculty, Russian State Medical University // Medicine 4. 2005: 18. [in Russian].
9. Shuai Ren, Ze Han Liu, Qiong Wu, Kuang Fu, Jun Wu, Li Ting Hou, Ming Li, Xin
Zhao, Qing Miao, Yun Long Zhao, Sheng Yu Wang, Yan Xue, Zhen Xue, Ya Shan Guo,
Sergio Canavero, Xiao Ping Ren. Polyethylene glycol-induced motor recovery after total
spinal transection in rats // CNS Neurosci Ther. 2017. 23(8): 680
10. Britt J.M., Kane J.R., Spaeth C.S., Zuzek A., Robinson G.L., Gbanaglo M.Y., Estler C.J.,
Boydston E.A., Schallert T., Bittner G.D.J. Polyethylene Glycol Rapidly Restores Axonal
Integrity and Improves the Rate of Motor Behavior Recovery After Sciatic Nerve Crush
Injury // J Neurophysiol. 2010. 104(2): 695.
11. Borgens R.B, Bohnert D. Rapid recovery from spinal cord injury after subcutaneously
administered polyethylene glycol // J Neurosci Res. 2001. 66(6): 1179.
312
12. Ahkong Q.F., Desmazes J.P., Georgescauld D., Lucy J.A. Movements of fluorescent
probes in the mechanism of cell fusion induced by poly(ethylene glycol) // J Cell Sci.
1987. 88(3): 389.
13. Bittner G.D., Ballinger M.L., Raymond M.A. Reconnection of severed nerve axons with
polyethylene glycol // Brain Res. 1986 367: 351.
14. Ivanov L.V., Lyapunov N.A., Tsymbal L.V. et al., Effect of the Composition of Two-
Component Solvents on Biological Membranes // Chem. Pharmaceut. J. 1986. 12: 1437.
[in Russian].
15. Ivanov L.V., Orlova I.N. Biopharmaceutical studies aimed at optimizing the composition,
properties and route of administration of drugs // In coll. "Technology and
standardization of drugs." - Kharkov. 2000. 2: 558. [in Russian].
16. Ivanov L.V. Study of the interaction of some hydrophilic non-aqueous solvents with
biomembranes of various cells using spin and fluorescent probes // Farmakom. 1999. 2:
45. [in Russian].
17. Ivanov L.V. Study of the mechanisms of dehydration of erythrocyte cells under the action
of hydrophilic non-aqueous solvents // Farmakom.1998. 5: 43. [in Russian].
18. Ivanov L.V., Georgievsky V.P. Study of the mechanisms of influence of excipients on
bioavailability // Proceedings of the I International Scientific and Practical Conference ''
Creation, production, standardization, pharmacoeconomics of drugs and biological
additives '', Ternopil. 2004: 19. [in Russian].
19. Liechtenstein G.I. The method of spin labels in molecular biology // M.: Science. 1974:
12. [in Russian].
20. Berlera L. Method of spin labels. Theory and Applications // Moscow: World. 1979:
639.[in Russian].
21. Ivanov L.V., Cartel N.T. Evaluation of microviscosity of cell membranes of various
nature by the method of spin probes // Supplements of the National Academy of Sciences
of Ukraine. 2012. 5: 139. [in Russian].
22. Ivanov L.V., Cartel N.T. Characterization of the rheological properties of the surface of
nanobio objects by the method of spin probes // Surface. 2012. 4(19):С. 334. [in
Russian].
23. Rozantsev E.G. Free iminoxyl radicals // Moscow: Chemistry. 1970: 216. [in Russian].
24. Nardid OA, Cherkashina Ya.O., Ivanov L.V., Nardid E.O., Lyapunov A.N., Mamontov
V.V. Effect of propylene glycol and polyethylene glycol with a molecular weight of 1500
on the microviscosity of erythrocyte membranes // Problems of cryobiology and
cryomedicine. 2016. 26(1): 35. [in Russian].
25. Ivanov L.V., Lyapunov A.N., Cartel N.T., Nardid O.A., Okotrub A.V., Kirilyuk I.A.,
Cherkashina Ya.O. Delivery of lipophilic spin probes with carbon nanotubes to
erythrocytes and blood plasma // Surface. 2014. 6(21): 292. [in Russian].
26. Ivanov, LV, Moiseev, VA, Gavrilova, et al. Method for determining the degree of cell
destruction // A. p. USSR 1049808. Publ. 06/23/1983, Byul. N. 39. [in Russian].
27. Ivanov L.V., Lyapunov A.N., Cartel N.T. et al. Comparative study of the effect of a
number of pharmaceutical excipients on the microviscosity of the erythrocyte membranes
of human and rat blood by the method of spin probes // Pharmacology and licoric
toxicology. 2016. 47(1): 72. [in Russian].
28. Ivanov LV, Kartel N.T., Lyapunov AN and other. Study of mechanisms of cytotoxicity
of a number of hydrophilic poloxamers by spin probe // Pharmacology and drug
toxicology. 2015. 45(4–5): 46. [in Ukrainian].
313
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕЙ
БОЛЬШОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И НЕСКОЛЬКИХ
ПОЛОКСАМЕРОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ И ТЕКУЧЕСТЬ
МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДОМ СПИНОВОГО
ЗОНДА
Л.В. Иванов1, А.В. Щербак2, М.Т. Картель1
1Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной академии наук Украины,
ул. Генерала Наумова, 17, Киев, 03164, Украина, E-mail: nikar@kartel.kiev.ua;
2Харьковская зооветеринарная академия, ул. Академическая 1, пгт. Малая Даниловка,
Дергачевский район, Харьковская обл., 62341, Украина, info@hdzva.edu.ua
Методом спиновых зондов изучены механизмы влияния полиэтиленгликолей (ПЭГ)
на текучесть липидов мембран эритроцитов, возможного плавления липидов мембран и
нарушения целостности мембран эритроцитов со временем. Введение 15 % ПЭГ-1500 в
эритроциты человека и крысы показало увеличение текучести липидов мембран
эритроцитов на 16 или 30 %, но затем текучесть мембран уменьшалась в результате
дегидратации и сжатия клетки. Введение гидрофильных полоксамер 407 и 338 в
эритроциты приводило к плавлению липидов мембран (эффект увеличения текучести
мембран 50 - 70%), но целостность большинства клеток сохранялась. Перед
разрушением мембран вязкость цитозоля резко падала и наблюдалась анизотропия
спектров ЭПР, связанная с существенными изменениями в структуре цитозоля
эритроцитов. Привлечение к эксперименту полоксамеров, содержащих етиленгликольные
и пропиленгликольные звенья, показало механизмы истинного плавления мембран с
максимальным увеличением текучести липидов (эффект 70 %), граничащей с частичным
гемолизом и коагуляцией клеток. Плавления фосфолипидов мембран эритроцитов под
действием полоксамеров 407 и 338 продемонстировало, что настоящей причиной
плавления служат гидрофобные метиленовые группы ПЭГ или звенья пропиленгликоля
полоксамеров, разрушающих структуру мембран клеток по всем направлениям.
Ключевые слова: текучесть липидов, плавление, мембраны эритроцитов, аксон
седалищного нерва, полиэтиленгликоль, метод спиновых зондов, дегидратация клеток,
целостность эритроцитов.
314
INVESTIGATION OF THE EFFECT OF POLYETHYLENE
GLYCOLS OF THE GREAT MOLECULAR MASS AND A NINE
POLYCASSAMERS ON THE COMPATIBILITY AND
MOLECULARITY OF ERYTHROCYTE MEMBRANES BY THE
SPIN ZONE METHOD
L.V. Ivanov1, O.V. Scherbak2, MT Kartel1
1Chuiko Institute of Surface Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine,
17 General Naumov Str., Kyiv, 03164, Ukraine, e-mail: nikar@kartel.kiev.ua;
2Kharkov Veterinary Academy, 1 Academic Str., smt. Malaya Danilovka, Dergachevsky district,
Kharkiv region, 62341, Ukraine, info@hdzva.edu.ua
Spin-probe methods studied the mechanisms of influence of polyethyleneglycols (PEG) on
the fluidity of lipid membranes of erythrocytes, the mechanisms of possible membrane lipid
membrane and mechanisms of violation of the integrity of membranes of red blood cells over
time. The administration of 15% PEG-1500 in human erythrocytes and rats showed increased
fluidity of membranes of erythrocytes by 16 or 30 %, but then membrane fluidity decreased due
to dehydration and cell compression. The introduction of hydrophilic poloxamer 407 and 338
into erythrocytes led to the melting of lipid membranes (the effect of increasing the fluidity of
membranes 50-70 %), but the integrity of most cells remained. Before the destruction of the
membranes, the viscosity of the cytosol decreased sharply and anisotropy of the EPR spectra
was observed, which was associated with significant changes in the structure of the red cell
cytosol. Involving the experiment, poloxamers containing ethylene glycol and propylene glycol,
showed the mechanisms of genuine melting of membranes with a maximum increase in lipidity
(70 % effect), which is bounded by partial hemolysis and cell coagulation. Melting of
phospholipids of membranes of erythrocytes under the action of poloxamers 407 and 338 showed
that the real reason for melting are hydrophobic methylene groups of PEG or propylene glycol
poloxamers, which destroy the structure of cell membranes from all directions.
Key words: lipid fluidity, melting, erythrocyte membrane, axillary proximal nerve,
polyethyleneglycols, spin probe method, cell dehydration, erythrocyte integrity.
|
| id | oai:ojs.pkp.sfu.ca:article-671 |
| institution | Surface |
| keywords_txt_mv | keywords |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2026-03-12T17:17:00Z |
| publishDate | 2019 |
| publisher | Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine |
| record_format | ojs |
| resource_txt_mv | surfacezbircomua/e3/85075d588fd09d7ccdbab85781cd8ce3.pdf |
| spelling | oai:ojs.pkp.sfu.ca:article-6712019-04-18T08:53:59Z Investigation of the effect of polyethylene glycols of the great molecular mass and a nine polycassamers on the compatibility and molecularity of erythrocyte membranes by the spin zone method Исследование влияния полиэтиленгликолей большой молекулярной массы и нескольких полоксамеров на целостность и текучесть мембран эритроцитов методом спинового зонда Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів Ivanov, L. V. Scherbak, O. V. Kartel, M. T. lipid fluidity melting erythrocyte membrane axillary proximal nerve polyethyleneglycols spin probe method cell dehydration erythrocyte integrity текучесть липидов плавление мембраны эритроцитов аксон седалищного нерва полиэтиленгликоль метод спиновых зондов дегидратация клеток целостность эритроцитов плинність ліпідів плавлення мембрани еритроцитів аксон сідничного нерва поліетиленгліколі метод спінових зондів дегідратація клітин цілісність еритроцитів Spin-probe methods studied the mechanisms of influence of polyethyleneglycols (PEG) on the fluidity of lipid membranes of erythrocytes, the mechanisms of possible membrane lipid membrane and mechanisms of violation of the integrity of membranes of red blood cells over time. The administration of 15% PEG-1500 in human erythrocytes and rats showed increased fluidity of membranes of erythrocytes by 16 or 30&nbsp;%, but then membrane fluidity decreased due to dehydration and cell compression. The introduction of hydrophilic poloxamer 407 and 338 into erythrocytes led to the melting of lipid membranes (the effect of increasing the fluidity of membranes 50-70&nbsp;%), but the integrity of most cells remained. Before the destruction of the membranes, the viscosity of the cytosol decreased sharply and anisotropy of the EPR spectra was observed, which was associated with significant changes in the structure of the red cell cytosol. Involving the experiment, poloxamers containing ethylene glycol and propylene glycol, showed the mechanisms of genuine melting of membranes with a maximum increase in lipidity (70&nbsp;% effect), which is bounded by partial hemolysis and cell coagulation. Melting of phospholipids of membranes of erythrocytes under the action of poloxamers 407 and 338 showed that the real reason for melting are hydrophobic methylene groups of PEG or propylene glycol poloxamers, which destroy the structure of cell membranes from all directions. Методом спиновых зондов изучены механизмы влияния полиэтиленгликолей (ПЭГ) на текучесть липидов мембран эритроцитов, возможного плавления липидов мембран и нарушения целостности мембран эритроцитов со временем. Введение 15&nbsp;% ПЭГ-1500 в эритроциты человека и крысы показало увеличение текучести липидов мембран эритроцитов на 16 или 30&nbsp;%, но затем текучесть мембран уменьшалась в результате дегидратации и сжатия клетки. Введение гидрофильных полоксамер 407 и 338 в эритроциты приводило к плавлению липидов мембран (эффект увеличения текучести мембран 50 - 70%), но целостность большинства клеток сохранялась. Перед разрушением мембран вязкость цитозоля резко падала и наблюдалась анизотропия спектров ЭПР, связанная с существенными изменениями в структуре цитозоля эритроцитов. Привлечение к эксперименту полоксамеров, содержащих етиленгликольные и пропиленгликольные звенья, показало механизмы истинного плавления мембран с максимальным увеличением текучести липидов (эффект 70&nbsp;%), граничащей с частичным гемолизом и коагуляцией клеток. Плавления фосфолипидов мембран эритроцитов под действием полоксамеров 407 и 338 продемонстировало, что настоящей причиной плавления служат гидрофобные метиленовые группы ПЭГ или звенья пропиленгликоля полоксамеров, разрушающих структуру мембран клеток по всем направлениям. Методом спінових зондів вивчені механізми впливу поліетиленгліколів (ПЕГ) на плинність ліпідів мембран еритроцитів, можливого плавлення ліпідів мембран і порушення цілісності мембран еритроцитів з часом. Введення 15&nbsp;% ПЕГ-1500 в еритроцити людини і щура показало збільшення плинності ліпідів мембран еритроцитів на 16 або 30&nbsp;%, але потім плинність мембран зменшувалась внаслідок дегідратації і стиснення клітини. Введення гідрофільних полоксамерів 407 і 338 в еритроцити приводило до плавлення ліпідів мембран (ефект збільшення плинності мембран 50&nbsp;–&nbsp;70&nbsp;%), але цілісність більшості клітин зберігалася. Перед руйнуванням мембран в'язкість цитозолю різко знижувалась, спостерігалася анізотропія спектрів ЕПР спінових зондів, що пов’язано з суттєвими змінами в структурі цитозолю еритроцитів. Залучення до експерименту полоксамерів, що містять етиленглікольні та пропіленглікольні ланки, показало механізми справжнього плавлення мембран з максимальним збільшенням плинності ліпідів (ефект 70&nbsp;%), що межує з частковим гемолізом і коагуляцією клітин. Плавлення фосфоліпідів мембран еритроцитів під дією полоксамерів 407 і 338 показало, що справжньою причиною плавлення виступають гідрофобні метиленові групи ПЕГ або ланки пропіленгліколю полоксамерів, що руйнують структуру мембран клітин з усіх напрямків. Chuiko Institute of Surface Chemistry National Academy of Sciences of Ukraine 2019-01-20 Article Article application/pdf https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/671 10.15407/Surface.2018.10.299 Surface; No. 10(25) (2018): Surface; 298-314 Поверхность; № 10(25) (2018): Поверхность; 298-314 Поверхня; № 10(25) (2018): Поверхня; 298-314 3154-8091 3154-8083 10.15407/Surface.2018.10 uk https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/671/674 Авторське право (c) 2018 L.V. Ivanov, O.V. Scherbak, M.T. Kartel |
| spellingShingle | плинність ліпідів плавлення мембрани еритроцитів аксон сідничного нерва поліетиленгліколі метод спінових зондів дегідратація клітин цілісність еритроцитів Ivanov, L. V. Scherbak, O. V. Kartel, M. T. Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| title | Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| title_alt | Investigation of the effect of polyethylene glycols of the great molecular mass and a nine polycassamers on the compatibility and molecularity of erythrocyte membranes by the spin zone method Исследование влияния полиэтиленгликолей большой молекулярной массы и нескольких полоксамеров на целостность и текучесть мембран эритроцитов методом спинового зонда |
| title_full | Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| title_fullStr | Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| title_full_unstemmed | Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| title_short | Дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| title_sort | дослідження впливу поліетиленгліколів великої молекулярної маси і декількох полоксамерів на цілісність і плинність мембран еритроцитів методом спінових зондів |
| topic | плинність ліпідів плавлення мембрани еритроцитів аксон сідничного нерва поліетиленгліколі метод спінових зондів дегідратація клітин цілісність еритроцитів |
| topic_facet | lipid fluidity melting erythrocyte membrane axillary proximal nerve polyethyleneglycols spin probe method cell dehydration erythrocyte integrity текучесть липидов плавление мембраны эритроцитов аксон седалищного нерва полиэтиленгликоль метод спиновых зондов дегидратация клеток целостность эритроцитов плинність ліпідів плавлення мембрани еритроцитів аксон сідничного нерва поліетиленгліколі метод спінових зондів дегідратація клітин цілісність еритроцитів |
| url | https://surfacezbir.com.ua/index.php/surface/article/view/671 |
| work_keys_str_mv | AT ivanovlv investigationoftheeffectofpolyethyleneglycolsofthegreatmolecularmassandaninepolycassamersonthecompatibilityandmolecularityoferythrocytemembranesbythespinzonemethod AT scherbakov investigationoftheeffectofpolyethyleneglycolsofthegreatmolecularmassandaninepolycassamersonthecompatibilityandmolecularityoferythrocytemembranesbythespinzonemethod AT kartelmt investigationoftheeffectofpolyethyleneglycolsofthegreatmolecularmassandaninepolycassamersonthecompatibilityandmolecularityoferythrocytemembranesbythespinzonemethod AT ivanovlv issledovanievliâniâpoliétilenglikolejbolʹšojmolekulârnojmassyineskolʹkihpoloksamerovnacelostnostʹitekučestʹmembranéritrocitovmetodomspinovogozonda AT scherbakov issledovanievliâniâpoliétilenglikolejbolʹšojmolekulârnojmassyineskolʹkihpoloksamerovnacelostnostʹitekučestʹmembranéritrocitovmetodomspinovogozonda AT kartelmt issledovanievliâniâpoliétilenglikolejbolʹšojmolekulârnojmassyineskolʹkihpoloksamerovnacelostnostʹitekučestʹmembranéritrocitovmetodomspinovogozonda AT ivanovlv doslídžennâvplivupolíetilenglíkolívvelikoímolekulârnoímasiídekílʹkohpoloksamerívnacílísnístʹíplinnístʹmembraneritrocitívmetodomspínovihzondív AT scherbakov doslídžennâvplivupolíetilenglíkolívvelikoímolekulârnoímasiídekílʹkohpoloksamerívnacílísnístʹíplinnístʹmembraneritrocitívmetodomspínovihzondív AT kartelmt doslídžennâvplivupolíetilenglíkolívvelikoímolekulârnoímasiídekílʹkohpoloksamerívnacílísnístʹíplinnístʹmembraneritrocitívmetodomspínovihzondív |