РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ

The influence of exopolysaccharideacrylamide (EPAA) in a liquid medium on the growth, retaining of viability and virulence of soybean rhizobia under the periodic cultivation conditions was investigated. It was observed that maximum titer of B. japonicum M-8 (B-7198) and B. japonicum 36 (B-1798) at t...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Date:2011
Main Author: Каменєва , І.О.
Format: Article
Language:Ukrainian
Published: Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine 2011
Subjects:
Online Access:https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/261
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Agriciltural microbiology
Download file: Pdf

Institution

Agriciltural microbiology
_version_ 1871465839652241408
author Каменєва , І.О.
author_facet Каменєва , І.О.
author_institution_txt_mv [ { "author": "І.О. Каменєва ", "institution": "Південна дослідна станція Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН України" } ]
author_sort Каменєва , І.О.
baseUrl_str https://smic.in.ua/index.php/journal/oai
collection OJS
datestamp_date 2026-07-22T10:10:46Z
description The influence of exopolysaccharideacrylamide (EPAA) in a liquid medium on the growth, retaining of viability and virulence of soybean rhizobia under the periodic cultivation conditions was investigated. It was observed that maximum titer of B. japonicum M-8 (B-7198) and B. japonicum 36 (B-1798) at thickening of medium has increased by 31.4% and 79.4% respectively. In the phase of exponential growth the upward trend in growth activity of rhizobia in the gel medium was observed. It was shown that the B. japonicum 36 is more sensitive than B. japonicum M-8 to the changes in the medium composition and the cultivation conditions. Absolute speed of B. japonicum 36 growth has increased in 5 times while the generation time has decreased in almost 3 times in comparison to the liquid medium. The viability and virulence of both rhizobium strains have remained over five months. It was established that the EPAA is a technological agent for the medium thickening and stabilization of the created on the basis of the soybean nodule bacteria gel preparation.
doi_str_mv 10.35868/1997-3004.13.108-116
first_indexed 2025-07-17T12:24:48Z
format Article
fulltext 108 УДК 576.8:633.114 РІСТ Bradyrhizobium japonicum ПРИ КультивуваннІ у гельному сереДОВИЩі Каменєва І.О. Південна дослідна станція Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН України, вул. К. Маркса, 107, смт. Гвардійське, АР Крим, 97513 E-mail: irina.kameneva.7@mail.ru Досліджено вплив екзополісахаридакриламіду (ЕПАА) у рідкому середовищі на ріст, зберігання життєздатності і віру- лентності ризобій сої за умов періодичного культивування. Відмічено, що при загущуванні середовища титр Bradyrhizobium japonicum М-8 та B. japonicum 36 збільшується на 31,4 та 79,4 %, відповідно. У фазу експоненційного росту відмічено тенденцію підвищення ростової активності ризобій за умов культивування в гельному середовищі. Встановлено, що B. japonicum 36 чут- ливіший, ніж B. japonicum М-8 до змін у складі середовища та умов культивування. Абсолютна швидкість росту B. japonicum 36 у 5 разів збільшилася, а час генерації зменшився майже у 3 рази в порівнянні з рідким середовищем. Життєздатність обох штамів ризобій і їх вірулентність зберігаються впродовж п’яти місяців. Встановлено, що ЕПАА є технологічною добавкою для загущення середовища і стабілізації отриманого гельного препарату на основі бульбочкових бактерій сої. Ключові слова: ризобії, Bradyrhizobium japonicum, титр, життєздатність, вірулентність, гельний препарат. Передпосівна обробка насіння ризобіями є екологічно і економічно доцільним прийомом підвищення продуктивності рослин у сучасних агротехнологіях вирощування бобових культур [1, 2]. Сільськогосподарський ринок України має великий асортимент вітчизняних та імпортних мікробних препаратів на основі високоефективних штамів бульбочкових бактерій і попит на них зростає. Разом з тим підвищуються вимоги щодо якості і конкурентоспроможності інокулянтів. Найкращими вважаються поліфункціональні біопрепарати з тривалим терміном зберігання життєздатності і функціональної активності клітин, низькозатратні при виготовленні та технологічні при застосуванні. Перспективним напрямом у мікробіологічному виробництві 109 є гельні (желеподібні) препарати на основі агрономічно-корисних мікроорганізмів. В основу розробки гельного препарату було закладено здатність ґрунтових мікроорганізмів різних таксономіч- них груп до синтезу екзополісахаридів (ЕПС) і збільшення іх чисельності при оптимізації середовища і умов культивування [3]. Більшість бульбочкових бактерій, зокрема сої, при куль- тивуванні у рідких середовищах синтезують недостатню кількість ЕПС для гелеутворення [4]. Один із способів отримання гельних препаратів базується на використанні загущувачів різного походження. Отже пошук компонентів гельного субстрату для культивування ризобій сої є актуальним питанням у технології одержання мікробних препаратів. У рослинництві як прилипач пестицидів та регуляторів росту рослин широко застосовують препарат екзополісахарид- акриламіду (ЕПАА-10) [5]. У мікробіології ЕПАА рекомендується для часткової заміни агар-агару у щільних поживних середовищах при культивуванні деяких мікроорганізмів [6]. Метою нашої роботи було дослідити ріст, зберігання життєздатності і вірулентності ризобій сої за умов культивування у гельному субстраті. Матеріали і методи. Об’єктами наших досліджень були виробничий і перспективний штами Bradyrhizobium japonicum М-8 (В-7198) і B. japonicum 36 (В-1798), отримані методом аналітичної селекції у Південній дослідній станції Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН. Штами є біологічною основою мікробного препарату Ризобофіту, який в Україні застосовують для передпосівної обробки насіння сої (Glycine   max (L.) Merr). Розробку технології виготовлення гельного препарату про- водили за методичними рекомендаціями А.В. Хотяновича [7]. Як компонент при формуванні гельного середовища використовували біологічний гель – препарат екзополісахаридакриламіду (ЕПАА- 10). Загущувач вносили у рідке поживне середовище, рекомендо- ване для культивування B. japonicum у експериментально встановленій кількості – 5 % від об’єму поживного середовища. Рідкий та гельний препарати отримували за умов періодич- ного культивування ризобій на качалці зі швидкістю 220 обертів на хвилину при 25-28 °С. Титр препаратів визначали шляхом серійних розведень з наступним висівом в агаризоване горохове середовище 110 [8]. Динаміку росту культур вивчали за умов періодичного культивування впродовж 60 годин з моменту інокуляції середовища та розраховували кінетичні показники у фазу інтенсивного росту бактерій [9]. Динамічну в’язкість культур визначали за допомогою капілярного віскозиметра ВПЖ-2, дотримуючись правил роботи з віскозиметром [10]. При визначенні тривалості зберігання життєздатності і вірулентності ризобій отримані препарати зберігали у об’ємах, що відповідають одній порції препарату на гектар, при температурі 5-8 оС. Вермикулітний препарат виготовляли за технічними умо- вами ТУ У 319.00494456-006-2002. Вірулентність бульбочкових бактерій вивчали у вегетацій- них дослідах у посудинах об’ємом 250 мл з стерильним вермику- літом [11]. Підготовлене насіння сої [12] сорту Аннушка обробляли водною суспензією бактерій, дотримуючись рекомендацій застосування рідкого і сипучого препаратів [7]. Статистичну обробку одержаних результатів проводили методом дисперсійного аналізу [13]. Результати та їх обговорення. Попередні дослідження показали, що в агаризованому середовищі з частковою заміною агару екзополісахаридакриламідом (ЕПАА) не змінюються морфологічні властивості B. japonicum [14]. Встановлено, що ЕПАА є перспективним загущувачем для отримання гельних препаратів на основі технологічних і перспективних штамів різних мікроорганізмів, у тому числі ризобій [15]. На наступному етапі досліджували вплив ЕПАА на ріст B. japonicum за періодичного культивування у виробничому рідкому середовищі. Дослідження динаміки розвитку бульбочкових бакте- рій сої (рис. 1) у гельному субстраті не виявили зміни характеру росту, але максимальний титр B. japonicum М-8 та B. japonicum 36, зареєстрований через 54 години культивування, був більшим, ніж у рідкому середовищі, на 31,4 та 79,4 %, відповідно. У гельному субстраті відмічено підвищення ростової активності ризобій (табл. 1), яка більше виражена у B. japonicum 36. Так, при культивуванні B. japonicum 36 у гельному субстраті абсолютна швидкість росту бактерій збільшилась у 5 разів, а час генерацій зменшився майже у 3 рази в порівнянні з рідким середовищем. 111 а) штам B. japonicum М-8 b) штам B. japonicum 36 Рис. 1. Динаміка росту B. japonicum у гельному та рідкому середовищах Таблиця 1. Активність росту B. japonicum за умов культивування у гельному субстраті Показники B. japonicum 36 B. japonicum М-8 рідкий гельний рідкий гельний Максимальний титр бактерій, млрд в 1 см3 4,4 7,9 5,2 6,7 Абсолютна швидкість росту, млрд в 1 см3/год. 0,1 0,5 0,1 0,1 Питома швидкість росту, год-1 0,06 0,1 0,05 0,06 Час генерацій, год. 12 4,6 15 12 Кількість поколінь 1,0 2,6 1,6 2,0 Загущення середовища за внесення полімеру ЕПАА у встановленій нами кількості збільшує його коефіцієнт в’язкості в 1,7 раза, при цьому відбувається стимуляція синтезу ЕПС 0 2 4 6 8 12 18 24 30 36 42 48 54 60 , , ./ 3 0 2 4 6 8 10 12 18 24 30 36 42 48 54 60 , , ./ 3 112 B. japonicum і збільшення в’язкості на 31,7-33,1 % (рис. 2). Після культивування бактерій в’язкість рідкого середовища з B. japonicum на 8,5-11,1 % перевищує контроль. Рис. 2. Зміна в’язкості культур бульбочкових бактерій сої   за умов культивування у гельному середовищі Важливою технологічною характеристикою мікробних пре- паратів є тривалість їх зберігання. Встановлено, що у гельному препараті збільшується термін зберігання життєздатності різобій сої до п’яти місяців (табл. 2), тоді як титр рідкого препарату вже через три місяці зберігання суттєво знижується у порівнянні з вихідним. Що характеризує ЕПАА і як ефективний стабілізую- чий компонент при формуванні гельного середовища для культивування B. japonicum. У біотехнології створення мікробних препаратів на основі бульбочкових бактерій сої, поряд з життєздатністю клітин, акту- альною проблемою залишається зберігання їх вірулентності. Відмічено, що у гельному препараті B. japonicum 36 тривалий час зберігає здатність колонізувати коріння сої. У вегетаційному досліді ми отримали 100 % утворення бульбочок у варіантах з гель- ним препаратом при зберіганні впродовж 5 місяців. За кількістю бульбочок суттєвої різниці між свіжовиготовленими гельним і вермикулітним препаратами не виявлено (рис. 3). Аналогічні резу- льтати отримано при дослідженні вірулентності B. japonicum М-8. 0 5 10 15 20 25 , , , . japonicum -8 B. japonicum 36 113 Таблиця 2. Зберігання життєздатності B. japonicum у гельному препараті Форма препарату Титр бактерій при зберіганні препаратів, млрд КУО/см3 вихідний 1 місяць 3 місяці 4 місяці 5 місяців B. japonicum М-8 Рідка 7,3±0,02 4,7±0,01 0,2±0,06 0 не визн. Гельна 6,0±0,00 3,5±0,05 2,7 ±0,01 2,0±0,01 0,8±0,06 B. japonicum 36 Рідка 4,9±0,04 2,1±0,01 0,7±0,06 0 не визн. Гельна 3,7±0,00 3,5±0,05 2,3 ±0,01 1,8±0,01 0,6±0,06 Рис. 3. Зберігання вірулентності B. japonicum 36   у гельному препараті (у дужках зазначено термін зберігання, місяці) Таким чином, проведені дослідження показали, що за умов періодичного культивування у гельному середовищі з ЕПАА у фазу інтенсивного росту підвищується ростова активність ризобій, збільшується термін зберігання їх життєздатності і вірулентності. Перспективний штам B. japonicum 36 виявився чутливішим до змі- ни умов культивування при загущуванні середовища, що прояви- лося у збільшенні швидкості росту бактерій у 5 разів і зменшенні часу генерацій майже у 3 рази в порівнянні з рідким середовищем. Встановлено, що ЕПАА є перспективною технологічною добавкою для загущення середовища і стабілізації отриманого гельного препарату на основі бульбочкових бактерій сої. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (0) (0) (5) , ./ 114 1. Потенциальные возможности симбиотической азотфиксации при выращивании сои на юге Украины /Толкачев Н.З. //Мікробіол. журн. – 1997. – Т. 59, № 4. – С. 34-41. 2. Біологічний азот /[Патика В.П., Коць С.Я., Волкогон В.В. та ін.]. – К.: Світ, 2003 – 422 с. 3. Пат. № 56032 Україна, МПК (2002) С05F 11/08 С12N 1/20. Спосіб виготовлення препарату на основі азотфіксуючих бактерій–продуцентів екзополісахаридів /Патика В.П., Мельничук Т.М., Шерстобоєв М.К. та ін. – заявл. 12.09.2002; опубл. 17. 01.2005, Бюл. № 1. 4. Шерстобоева Е.В. Биопрепараты азотфиксирующих бактерий: проблемы и перспективы применения /Шерстобоева Е.В., Дудинова И.А., Крамаренко С.Н., Шерстобоев Н.К. //Мікробіол. журн. – 1997. – Т. 59, № 4.– С. 109-116. 5. Воцелко С.К. ЕПАА – універсальний біологічний прилипач пестицидів і регуляторів росту рослин (Методичні рекомендації) //Воцелко С.К., Гвоздяк Р.І., Данькевич Л.А, Литвинчук О.О., Патика В.П. – К., 2007. – 26 с. 6. Ващенко Л.Н. Желирующие свойства экзополисахаридакри- ламида в композиции с агар-агаром /Ващенко Л.Н., Литвинчук О.А., Гвоздяк Р.И., Воцелко С.К. //Мікробіол. журн. – 2004. – Т. 66, № 6. – С. 37- 43. 7. Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе /А.В. Хотянович. – Л., 1991, – 60 с. 8. Большой практикум по микробиологии /под ред Б.А. Селибера. – М.: Высшая школа, 1962. – С. 490. 9. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія /Т.П. Пирог. – К.: НУХТ, 2004. – С. 124-125. 10. Балезин С.А. Определение вязкости при помощи капиллярного віскозиметра /Балезин С.А. //Практикум по физической и коллоидной химии. – М.: Просвещение, 1972. – С. 249-256. 11. Толкачев Н.З. Модифицированный метод определения коли- чества клубенькових бактерій сои в почве /Толкачев Н.З. //Тр. ВНИИСМ. – 1990. – Т. 60. – C. 37-43. 12. Бегун С.А. Способы, приемы изучения и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Методы аналитической селекции (методические рекомендации) /С.А. Бегун, В.А. Тильба. – Благовещенск, 2005. – 70 с. 13. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) /А.Б. Доспехов. – М.: Агропромиздат, 1985. – 351 с. 14. Kameneva I.A. Peculiarity of manufacturing of gel preparation on the 115 basis of Bradyrhizobium japonicum and Mesorhizоbium ciceri /Kameneva I.A., Gritchina L.J. //Int. Sci. Conf. «S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology» (Yalta, October 8-12, 2007): abstr. – Yalta, 2007. – P. 108. 15. Перспектива розробки гельних препаратів на основі агроно- мічно корисних мікроорганізмів /[Каменєва І.А., Грітчина Л.Ю., Мельничук Т.М. та ін.] //XII з’їзд Товариства мікробіологів України (Ужгород, 25-30 травня 2009 р.): тез. доп. – Ужгород, 2009. – С. 376. РОСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ГЕЛЬНОЙ СРЕДЕ Каменева И.А. Южная опытная станция Института сельскохозяйственной микробиологии НААН Украины, пгт. Гвардейское Исследовано влияние экзополисахаридакриламида (ЭПАА) в жидкой среде на рост, сохранение жизнеспособности и вирулентности ризобий сои в условиях периодического культи-  вирования. Отмечено, что при сгущении среды титр B. japonicum М-8 и B. japonicum 36 увеличивается на 31,4 и 79,4 %, соответственно. В фазе экспоненциального роста отмечена тенденция повышения ростовой активности ризобий в гельной среде. Установлено, что B. japonicum 36 более чувствителен, чем B. japonicum М-8 к изменениям в составе среды и условий культивирования. Абсолютная скорость роста B. japonicum 36 в   5 раз увеличилась, а время генерации уменьшилось почти в 3 раза по сравнению с жидкой средой. Жизнеспособность обоих штаммов ризобий и их вирулентность сохраняется на протяжении пяти месяцев. Установлено, что ЭПАА является технологической добавкой для сгущения среды и стабилизации полученного гельного препарата на основе клубеньковых бактерий сои. Ключевые слова: ризобии, Bradyrhizobium japonicum, титр, жизнеспособность, вирулентность, гельний препарат. 116 THE GROWTH OF BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM AT CULTIVATION IN THE GEL MEDIUM Kameneva I.O. South Experimental Station of Institute of Agricultural Microbiology, NAAS of Ukraine, Gvardeyskoe The influence of exopolysaccharideacrylamide (EPAA) in a liquid medium on the growth, retaining of viability and virulence of soybean rhizobia under the periodic cultivation conditions was investigated. It was observed that maximum titer of B. japonicum M-8 (B-7198) and B. japonicum 36 (B-1798) at thickening of medium has increased by 31.4% and 79.4% respectively. In the phase of exponential growth the upward trend in growth activity of rhizobia in the gel medium was observed. It was shown that the B. japonicum 36 is more sensitive than B. japonicum M-8 to the changes in the medium composition and the cultivation conditions. Absolute speed of B.  japonicum 36 growth has increased in 5 times while the generation time has decreased in almost 3 times in comparison to the liquid medium. The viability and virulence of both rhizobium strains have remained over five months. It was established that the EPAA is a technological agent for the medium thickening and stabilization of the created on the basis of the soybean nodule bacteria gel preparation. Key words: rhizobium, Bradyrhizobium japonicum, titre, viability, virulence, gel preparation.
id oai:ojs2.smic.in.ua:article-261
institution Agriciltural microbiology
keywords_txt_mv keywords
language Ukrainian
last_indexed 2026-07-23T01:08:25Z
publishDate 2011
publisher Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine
record_format ojs
resource_txt_mv smicinua/10/2c5d528dffc02c2f006444f563e14510.pdf
spelling oai:ojs2.smic.in.ua:article-2612026-07-22T10:10:46Z THE GROWTH OF BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM AT CULTIVATION IN THE GEL MEDIUM РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ Каменєва , І.О. rhizobium, Bradyrhizobium japonicum, titre, viability, virulence, gel preparation ризобії, Bradyrhizobium japonicum, титр, життєздатність, вірулентність, гельний препарат The influence of exopolysaccharideacrylamide (EPAA) in a liquid medium on the growth, retaining of viability and virulence of soybean rhizobia under the periodic cultivation conditions was investigated. It was observed that maximum titer of B. japonicum M-8 (B-7198) and B. japonicum 36 (B-1798) at thickening of medium has increased by 31.4% and 79.4% respectively. In the phase of exponential growth the upward trend in growth activity of rhizobia in the gel medium was observed. It was shown that the B. japonicum 36 is more sensitive than B. japonicum M-8 to the changes in the medium composition and the cultivation conditions. Absolute speed of B. japonicum 36 growth has increased in 5 times while the generation time has decreased in almost 3 times in comparison to the liquid medium. The viability and virulence of both rhizobium strains have remained over five months. It was established that the EPAA is a technological agent for the medium thickening and stabilization of the created on the basis of the soybean nodule bacteria gel preparation. Досліджено вплив екзополісахаридакриламіду (ЕПАА) у рідкому середовищі на ріст, зберігання життєздатності і вірулентності ризобій сої за умов періодичного культивування. Відмічено, що при загущуванні середовища титр Bradyrhizobium japonicum М-8 та B. japonicum 36 збільшується на 31,4 та 79,4 %, відповідно. У фазу експоненційного росту відмічено тенденцію підвищення ростової активності ризобій за умов культивування в гельному середовищі. Встановлено, що B. japonicum 36 чутливіший, ніж B. japonicum М-8 до змін у складі середовища та умов культивування. Абсолютна швидкість росту B. japonicum 36 у 5 разів збільшилася, а час генерації зменшився майже у 3 рази в порівнянні з рідким середовищем. Життєздатність обох штамів ризобій і їх вірулентність зберігаються впродовж п’яти місяців. Встановлено, що ЕПАА є технологічною добавкою для загущення середовища і стабілізації отриманого гельного препарату на основі бульбочкових бактерій сої. Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine 2011-08-19 Article Article Рецензована Стаття application/pdf https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/261 10.35868/1997-3004.13.108-116 Agricultural microbiology; Vol. 13 (2011): Agriciltural microbiology; 108-116 Сільськогосподарська мікробіологія; Том 13 (2011): Сільськогосподарська мікробіологія; 108-116 1997-3004 10.35868/1997-3004.13 uk https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/261/353 Авторське право (c) 2011 I.O. Kameneva https://creativecommons.org/licenses/by/4.0
spellingShingle ризобії
Bradyrhizobium japonicum
титр
життєздатність
вірулентність
гельний препарат
Каменєва , І.О.
РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ
title РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ
title_alt THE GROWTH OF BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM AT CULTIVATION IN THE GEL MEDIUM
title_full РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ
title_fullStr РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ
title_full_unstemmed РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ
title_short РІСТ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ У ГЕЛЬНОМУ СЕРЕДОВИЩІ
title_sort ріст bradyrhizobium japonicum при культивуванні у гельному середовищі
topic ризобії
Bradyrhizobium japonicum
титр
життєздатність
вірулентність
гельний препарат
topic_facet rhizobium
Bradyrhizobium japonicum
titre
viability
virulence
gel preparation
ризобії
Bradyrhizobium japonicum
титр
життєздатність
вірулентність
гельний препарат
url https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/261
work_keys_str_mv AT kamenêvaío thegrowthofbradyrhizobiumjaponicumatcultivationinthegelmedium
AT kamenêvaío rístbradyrhizobiumjaponicumprikulʹtivuvanníugelʹnomuseredoviŝí
AT kamenêvaío growthofbradyrhizobiumjaponicumatcultivationinthegelmedium