ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ
The method of preservation of potato aucuba mosaic virus and potato virus Y purified preparations immobilized in polyacrylamide gels is provided. The method may be used for preservation of viral antigens for 6 months at room temperature for obtaining a specific antiserums.
Збережено в:
| Дата: | 2010 |
|---|---|
| Автори та афіліації: |
|
| Ключові слова: | keywords |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/303 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Agriciltural microbiology |
| Завантажити файл: |  |
Репозитарії
Agriciltural microbiology| _version_ | 1871465930647666688 |
|---|---|
| author | Мамчур , О.Є. Дмитрук , О.О. Коломієць , Л.П. Зарицький , М.М. |
| author_facet | Мамчур , О.Є. Дмитрук , О.О. Коломієць , Л.П. Зарицький , М.М. |
| author_institution_txt_mv | [
{
"author": "О.Є. Мамчур ",
"institution": "Інститут сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН"
},
{
"author": "О.О. Дмитрук ",
"institution": "Інститут сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН"
},
{
"author": "Л.П. Коломієць ",
"institution": "Інститут сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН"
},
{
"author": "М.М. Зарицький ",
"institution": "Інститут сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН"
}
] |
| author_sort | Мамчур , О.Є. |
| baseUrl_str | https://smic.in.ua/index.php/journal/oai |
| collection | OJS |
| datestamp_date | 2026-07-22T10:10:47Z |
| description | The method of preservation of potato aucuba mosaic virus and potato virus Y purified preparations immobilized in polyacrylamide gels is provided. The method may be used for preservation of viral antigens for 6 months at room temperature for obtaining a specific antiserums. |
| doi_str_mv | 10.35868/1997-3004.11.159-165 |
| first_indexed | 2025-07-17T12:25:13Z |
| format | Article |
| fulltext |
159
УДК 578.85/.86
ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ
ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК
ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ
Мамчур О.Є., Дмитрук О.О., Коломієць Л.П.,
Зарицький М.М.
Інститут сiльськогосподарської мiкробiологiї УААН,
вул. Шевченка, 97, м. Чернігів, 14027, Україна
E-mail: omam8@mail.ru
Пропонується метод зберігання очищених препаратів вірусу
аукуба мозаїки картоплі і Y-вірусу картоплі, іммобілізованих в
поліакриламідний гель. Метод може використовуватися для
зберігання вірусних антигенів протягом 6-ти місяців при кімнатній
температурі для отримання специфiчних антисироваток.
Ключові слова: вірус аукуба мозаїки картоплі, Y-вiрус
картоплі, чисті препарати вірусу, іммобілізація в ПААГ.
Сьогодні при проведенні первинного фітосанітарного
контролю агроценозів майже в усіх країнах найбільше
використовуються методи серології у поєднанні з електронно-
мікроскопічними. Дослідження зразків рослинних тканин
за допомогою серологічних методів (крапельна аглютинація
і преципітація, імуноферментний аналіз, імуноелектронна
мікроскопія) дозволяють отримати інформацію про наявність
вірусних антигенів та їх таксономічну належність. Перевагами
серологічних методів є висока чутливість і специфічність детекції
та ідентифікації вірусних антигенів [1]. Створення методів і за-
собів імунодіагностики вимагає отримання вірусоспецифічних
діагностичних антисироваток на основі сконцентрованих вірусних
антигенів, які характеризуються високим ступенем чистоти [2, 3].
Імуногенні властивості вірусів найкраще виявляються,
якщо для імунізації тварин використовують свіжовиготовлені
вірусні препарати, отримані з молодих інфікованих рослин за
максимальної концентрації вірусу. Але період інтенсивного
росту рослин-індикаторів і строки накопичення вірусів в умовах
вегетаційної кімнати не завжди співпадають з оптимальними
строками імунізації кролів (влітку кролі линяють, що призводить
до неспецифічних реакцій при проведенні імунологічних аналізів)
160
[3]. Тому, виготовлені очищені препарати вірусів потребують таких
способів зберігання, які забезпечують підтримання антигенних та
імуногенних властивостей вірусів протягом певного часу.
Існують традиційні способи зберігання вірусних препаратів
за температури нижче –20 оС, у рідкому азоті при –196 оС [4] або у
ліофілізованому стані [5], які забезпечують збереженість віріонів
протягом року і більше. Але деякі віруси при заморожуванні
піддаються деструкції і тому не можуть зберігатися цими способами.
Консервування очищених вірусних препаратів сахарозою або
гліцерином дозволяє зберігати їх імуногенні властивості протягом
кількох тижнів за температури 8-10 оС. Застосування 33 %-ного
сульфату амонію є ефективним при тривалому збереженні ряду
очищених вірусних препаратів (ХВК, YВК, МВК, ВАМК), але
перед використанням препарати необхідно звільнити від солі, що
супроводжується зниженням концентрації антигену.
Застосування іммобілізованих ферментів, цілих клітин та їх
органоїдів, антитіл, антигенів широко використовується у сучасній
біотехнології. Метод іммобілізації в масу полімерного носія
(альгінат, желатин, колаген, целюлоза, поліакриламід та ін.) полягає
у внесенні суспензії клітин мікроорганізмів у розчин мономерів,
створенні умов для полімеризації суспензії, коли відбувається
механічне включення клітин мікроорганізмів у структуру
носія. Для мікроорганізмів частіше як носій використовується
поліакриламідний гель (ПААГ), який має пористу структуру,
механічну міцність, однорідний за складом, хімічно інертний,
нетоксичний, а також забезпечує стабільність іммобілізованих
препаратів [6]. Крім того, ПААГ має властивості ад’юванту, що
сприяє посиленню імуностимуляції при імунізації тварин [3].
Метою нашої роботи було дослідження можливості вико-
ристання методу іммобілізації в ПААГ для зберігання очищених
препаратів вірусів картоплі при виробництві діагностичної
антисироватки.
Матеріали і методи. У роботі використовували вірус аукуба
мозаїки картоплі (Potato aucuba mosaic virus, штам ВАМК-об) та
Y-вiрус картоплi (Potato virus Y, штам YВК-к), які зберігаються в
колекції фітопатогенних вірусів Інституту сільськогосподарської
мікробіології.
Накопичення Y-вірусу картоплі проводили на рослинах тютюну
справжнього (Nicotiana tabacum L.), ВAMК – на рослинах махорки
161
(Nicotiana rustica L.), які вирощували в посудинах, заповнених
сумішшю торфу, ґрунту, піску та перегною (співвідношення 3:2:1:1)
у вегетаційній кімнаті за 20-22 оС i фотоперіоді 16 год. Інфекцій-
ний матеріал відбирали у період максимального накопичення
вірусу: листки рослин махорки, уражених ВАМК – на 18-21 день;
листки тютюну, інфікованого Y-вірусом картоплі – на 21-25 день
після інокуляції.
При очищенні та концентруванні препаратів YВК і ВАМК
використовували відомі методики [7, 8].
ПААГ отримували шляхом полімеризації акриламіду і
N,N-метилен-біс-акриламіду, ініціатор реакції – персульфат
амонію, промотор ініціатора – N,N,N,N-тетраметілетилендіамін
(ТЕМЕД). Використовували 30 %-й розчин мономерів з концен-
трацією метилен-біс-акриламіду 2,7 % та 2,5 % розчин персуль-
фату амонію [9].
Контроль етапів отримання чистих препаратів вірусів і
препаратів, іммобілізованих у ПААГ, проводили методом електрон-
ної мікроскопії нативних препаратів, контрастованих 2 %-ним
розчином фосфорно-вольфрамової кислоти. Досліджували
препарати в електронних мікроскопах Tesla-540 та ЕМ-125 при
інструментальному збільшенні 20 тис.
Результати та їх обговорення. За тривалого зберігання
очищених вірусних препаратів однією з основних причин втрати
антигенних властивостей вірусів є денатурація капсидних білків
[2]. При іммобілізації в ПААГ завдяки наявності гідрофобного
полімерного ланцюга макромолекули і гідрофільних карбонільних
груп у структурі полімерів можливе фізичне зв’язування вірусних
часток з полімерною матрицею, що дає змогу зберігати вірусні
частки протягом певного часу. Даний метод базується на взаємодії
розчину мономерів з очищеною суспензією вірусних часток.
Для дослідження отримували препарати вірусів з високим
ступенем чистоти (для Y-вірусу картоплі співвідношення D260/280
складало 1,2; для ВАМК – 1,1) та концентрацією вірусу (для YВК
– 2 мг/мл, для ВАМК – 4 мг/мл).
Дані електронної мікроскопії підтвердили присутність в
очищених препаратах ВАМК ниткоподібних часток вірусу, мода-
льна довжина яких становила 590±2 нм. В очищених препаратах Y-
вірусу картоплі виявлено характерні за морфологічними ознаками
частки з модальною довжиною 740±5 нм (рис. 1).
162
Рис. 1. Очищені вірусні препарати ВAMК (ліворуч) і Y-вірусу
картоплі (праворуч), інструментальне збільшення × 20 000
Для іммобілізації вірусних часток використовували 10 %
ПААГ, який має оптимальні механічні та адсорбційні властивості
[9]. У 30 %-й водний розчин мономерів об’ємом 4 мл додавали
при інтенсивному перемішуванні за допомогою магнітної мішалки
8 мл очищеного вірусного антигену (концентрація 2 мг/мл), 0,3 мл
2,5 % персульфату амонію та 3 краплі ТЕМЕД. Реакційну суміш
розливали у скляні флакони по 2 мл і витримували протягом 15-
20 хв. для завершення процесу іммобілізації. Після полімеризації
гелю флакони закупорювали і зберігали протягом 6-ти місяців за
кімнатної температури.
Дослідження збереженості іммобілізованих в ПААГ вірусних
препаратів проводили за допомогою електронної мікроскопії
та методу біотестування. Монолітний гель з іммобілізованим
антигеном після 6-ти місяців зберігання ретельно розтирали у
фарфоровій ступці, суспендували 0,1 М фосфатним буфером, рН 7,4
і центрифугували при 1000 g протягом 15 хв. Отримані супернатанти
використовували для визначення збереженості морфологічних
ознак вірусу та інфекційних властивостей препаратів.
З рис. 2 видно ефективну адсорбцію вірусних часток ВАМК
всередині полімерної матриці 10 %-ного ПААГ. Віріони щільно
упаковані у товщі гелю, що дозволяє зберігати морфологію вірус-
них часток, іммобілізованих в ПААГ, протягом 6-ти місяців.
Виявлено також вірусні частки, характерні для досліджуваних
вірусів за морфологією та розмірами.
Инфекційність іммобілізованих препаратів перевіряли
методом біотестування: для Y-вірусу картоплі використовували
рослини тютюну справжнього і махорки; для ВАМК – рослини
перцю і тютюну. На всіх уражених рослинах ознак інфікування
163
не спостерігали, що підтвердили дані серології та електронної
мікроскопії. Тобто, вірусні препарати втрачають свою інфекційність
після іммобілізації в ПААГ.
Рис. 2. Вірусні частки, іммобілізовані в ПААГ
(ВАМК та YВК), після 6-ти місяців зберігання,
інструментальне збільшення × 20 000
Вивчення імуногенної активності, на прикладі ВАМК,
показало, що іммобілізовані в ПААГ вірусні препарати здатні
викликати в організмі імунізованих тварин утворення антитіл. Для
приготування антигену гель розтирали, додавали фізіологічний
розчин (1:1, об’єм/об’єм) і центрифугували за 1000 g протягом
15 хв. Отриманий надосад використовували як антиген, де ПААГ
виконував функцію ад’юванту. Специфічну антисироватку
отримували за схемою, яка передбачала три ін’єкції по 0,5 мл
антигену з чергуванням підшкірних та внутрішньошкірних
уведень. Через тиждень після останньої імунізації тричі відбирали
кров з крайової вушної вени та визначали титр антисироватки.
Діагностична сироватка давала реакцію крапельної аглютинації
з інфікованим ВАМК рослинним матеріалом при максимальному
розведенні 1:2048. Отримана антисироватка специфічна і не
вступає в реакцію з екстрактами зі здорових рослин-накопичувачів
(Nicotiana rustica L.), картоплі і тест-рослин, інфікованих Х, S, М,
Y-вірусами картоплі.
Таким чином, іммобілізація очищених вірусних препаратів
ВАМК і Y-вірусу картоплі в ПААГ дозволяє зберігати їх протягом
6 місяців при кімнатній температурі і використовувати як антиген
для імунізації кролів. Інфекційні властивості іммобілізованих
в ПААГ очищених препаратів ВАМК і Y-вірусу картоплі не
зберігаються.
164
1. Мельничук М.Д. Фітовірусологія: навчальний посібник
/М.Д. Мельничук. – К.: Поліграф Консалтинг, 2005. – 200 с.
2. Мэтьюз Р. Вирусы растений: пер. с англ. /Р. Мэтьюз. – М.: Мир,
1973. – 592 с.
3. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовиру-
сологии /Р.В.Гнутова. – М.: Наука, 1985. – С. 147-153.
4. Wiys J.J. De. The long-term preservation of potato virus Y and
watermelon mosaic virus in liquid nitrogen in comparison to other preservation
methods /De Wiys J.J., Suda-Bachmann F. //Nethrl. J. Plant Pathol. – 1979.
– Vol. 85, N 1. – P. 23-29.
5. Purcifull D.E. Preservation of plant virus antigens by freeze-drying
/Purcifull D.E., Christie S.R., Batchelor D.L. //Phytopathol. – 1975. – Vol. 65,
N 11. – P. 1202-1205.
6. Волова Т.Г. Введение в биотехнологию. Версия 1.0 [Электрон-
ный ресурс]: электрон. учеб. пособие /Т.Г. Волова. – Красноярск: ИПК
СФУ, 2008.
7. Новиков В.К. Метод получения препарата Y-вируса картофеля
и приготовление диагностических антисывороток /В.К. Новиков,
И.Г. Атабеков, М.О. Агур [и др.] //С.-х. биол. – 1982. – T. 17, № 5. – С. 706-
711.
8. Мамчур О.Є. Метод отримання очищених препаратів вірусів
рослин /Мамчур О.Є., Дмитрук О.О., Коломiєць Л.П., Зарицкий М.М.
//С.-г. мікробіол.: міжвід. темат. наук. зб. – Чернігів, ЦНТЕІ, 2005. – С. 165-
170.
9. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых
кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование /Л.А. Остерман. – М.:
Наука, 1981. – 274 с.
165
ХРАНЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ АНТИГЕНА
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА АНТИСЫВОРОТОК
К ФИТОПАТОГЕННЫМ ВИРУСАМ
Мамчур О.Е., Дмитрук О.А., Коломиец Л.П.,
Зарицький М.М.
Институт сельскохозяйственной микробиологии УААН,
г. Чернигов
Предлагается метод хранения очищенных препаратов
вируса аукуба мозаики картофеля и Y-вируса картофеля,
иммобилизованных в полиакриламидном гель. Метод может
использоваться для хранения вирусных антигенов в течение 6-ти
месяцев при комнатной температуре для получения специфических
антисироваток.
Ключевые слова: вирус аукуба мозаики картофеля, Y-вирус
картофеля, чистые препараты вируса, иммобилизация в ПААГ.
PRESERVATION OF ANTIGEN PREPARATIONS
FOR PRODUCTION OF ANTISERUMS TO
PHYTOPATHOGENIC VIRUSES
Mamchur А.E., Dmitruk O.A., Kolomiets L.P.,
Zaritzky M.M.
Institut of Agricultural Microbiology UAAS, Chernihiv
The method of preservation of potato aucuba mosaic virus and
potato virus Y purified preparations immobilized in polyacrylamide gels
is provided. The method may be used for preservation of viral antigens
for 6 months at room temperature for obtaining a specific antiserums.
Key words: potato aucuba mosaic virus, potato virus Y, purified
virus preparations, immobilization in PAAG.
|
| id | oai:ojs2.smic.in.ua:article-303 |
| institution | Agriciltural microbiology |
| keywords_txt_mv | keywords |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2026-07-23T01:09:52Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine |
| record_format | ojs |
| resource_txt_mv | smicinua/a7/9a0a095ae0624e28dd375d81fd85bea7.pdf |
| spelling | oai:ojs2.smic.in.ua:article-3032026-07-22T10:10:47Z PRESERVATION OF ANTIGEN PREPARATIONS FOR PRODUCTION OF ANTISERUMS TO PHYTOPATHOGENIC VIRUSES ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ Мамчур , О.Є. Дмитрук , О.О. Коломієць , Л.П. Зарицький , М.М. potato aucuba mosaic virus, potato virus Y, purified virus preparations, immobilization in PAAG вірус аукуба мозаїки картоплі, Y-вiрус картоплі, чисті препарати вірусу, іммобілізація в ПААГ The method of preservation of potato aucuba mosaic virus and potato virus Y purified preparations immobilized in polyacrylamide gels is provided. The method may be used for preservation of viral antigens for 6 months at room temperature for obtaining a specific antiserums. Пропонується метод зберігання очищених препаратів вірусу аукуба мозаїки картоплі і Y-вірусу картоплі, іммобілізованих в поліакриламідний гель. Метод може використовуватися для зберігання вірусних антигенів протягом 6-ти місяців при кімнатній температурі для отримання специфiчних антисироваток. Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine 2010-07-05 Article Article Рецензована Стаття application/pdf https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/303 10.35868/1997-3004.11.159-165 Agricultural microbiology; Vol. 11 (2010): Agriciltural microbiology; 159-165 Сільськогосподарська мікробіологія; Том 11 (2010): Сільськогосподарська мікробіологія; 159-165 1997-3004 10.35868/1997-3004.11 uk https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/303/391 Авторське право (c) 2010 А.E. Mamchur , O.A. Dmitruk , L.P. Kolomiets , M.M. Zaritzky https://creativecommons.org/licenses/by/4.0 |
| spellingShingle | вірус аукуба мозаїки картоплі Y-вiрус картоплі чисті препарати вірусу іммобілізація в ПААГ Мамчур , О.Є. Дмитрук , О.О. Коломієць , Л.П. Зарицький , М.М. ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ |
| title | ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ |
| title_alt | PRESERVATION OF ANTIGEN PREPARATIONS FOR PRODUCTION OF ANTISERUMS TO PHYTOPATHOGENIC VIRUSES |
| title_full | ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ |
| title_fullStr | ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ |
| title_full_unstemmed | ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ |
| title_short | ЗБЕРІГАННЯ ПРЕПАРАТІВ АНТИГЕНУ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА ДІАГНОСТИЧНИХ СИРОВАТОК ДО ФІТОПАТОГЕННИХ ВІРУСІВ |
| title_sort | зберігання препаратів антигену для виробництва діагностичних сироваток до фітопатогенних вірусів |
| topic | вірус аукуба мозаїки картоплі Y-вiрус картоплі чисті препарати вірусу іммобілізація в ПААГ |
| topic_facet | potato aucuba mosaic virus potato virus Y purified virus preparations immobilization in PAAG вірус аукуба мозаїки картоплі Y-вiрус картоплі чисті препарати вірусу іммобілізація в ПААГ |
| url | https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/303 |
| work_keys_str_mv | AT mamčuroê preservationofantigenpreparationsforproductionofantiserumstophytopathogenicviruses AT dmitrukoo preservationofantigenpreparationsforproductionofantiserumstophytopathogenicviruses AT kolomíêcʹlp preservationofantigenpreparationsforproductionofantiserumstophytopathogenicviruses AT zaricʹkijmm preservationofantigenpreparationsforproductionofantiserumstophytopathogenicviruses AT mamčuroê zberígannâpreparatívantigenudlâvirobnictvadíagnostičnihsirovatokdofítopatogennihvírusív AT dmitrukoo zberígannâpreparatívantigenudlâvirobnictvadíagnostičnihsirovatokdofítopatogennihvírusív AT kolomíêcʹlp zberígannâpreparatívantigenudlâvirobnictvadíagnostičnihsirovatokdofítopatogennihvírusív AT zaricʹkijmm zberígannâpreparatívantigenudlâvirobnictvadíagnostičnihsirovatokdofítopatogennihvírusív |