МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН
Objective. To determine the possibilities of using the RT-PCR method for monitoring viral infectious processes in plants. Methods. Extraction of nucleic acids from tobacco and wheat plants using the STAV protocol and real-time polymerase chain reaction with reverse transcription stage (RT-PCR). Resu...
Saved in:
| Date: | 2025 |
|---|---|
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine
2025
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/551 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Agriciltural microbiology |
| Download file: |  |
Institution
Agriciltural microbiology| _version_ | 1871466351613181952 |
|---|---|
| author | Щукін, Ю. С. Коваленко, О. Г. |
| author_facet | Щукін, Ю. С. Коваленко, О. Г. |
| author_institution_txt_mv | [
{
"author": "Ю. С. Щукін",
"institution": "Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України"
},
{
"author": "О. Г. Коваленко",
"institution": "Інститут біохімії і біофізики ПАН, Польща"
}
] |
| author_sort | Щукін, Ю. С. |
| baseUrl_str | https://smic.in.ua/index.php/journal/oai |
| collection | OJS |
| datestamp_date | 2026-07-22T10:10:52Z |
| description | Objective. To determine the possibilities of using the RT-PCR method for monitoring viral infectious processes in plants. Methods. Extraction of nucleic acids from tobacco and wheat plants using the STAV protocol and real-time polymerase chain reaction with reverse transcription stage (RT-PCR). Results. A real-time PCR method for monitoring viral processes in plants has been created and tested. The study presents optimized protocols for isolation, primers, and fluorescent probes, as well as buffer composition and a selected amplification protocol. The data obtained indicate the sensitivity, specificity, and linearity of the real-time PCR test systems, which allows them to be optimized for quantitative determination for further use in monitoring the viral infection process in plants. Conclusions. The example of TMV and WSMV viruses demonstrates the fundamental possibility of using RT-PCR systems for quantitative assessment of the viral infection course in plants. The results obtained can be used to study other DNA- and RNA-containing viruses. The proposed method has obvious advantages over the methods of detection and monitoring of viral infections in plants (sensitivity, specificity, the possibility of quantitative determination of virus-specific products) that are currently used. However, the peculiarity of its practical implementation is the need for expensive equipment and reagents, as well as the availability of trained, qualified personnel. The practical value of the method will increase after its adaptation to the monitoring of economically important viruses of agricultural crops that reproduce vegetatively (potatoes, strawberries, fruit crops). |
| doi_str_mv | 10.35868/1997-3004.42.110-116 |
| first_indexed | 2026-03-18T02:00:08Z |
| format | Article |
| fulltext |
110
МЕТОДИ
Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42. С. 110–116.
ISSN 1997-3004
https://doi.org/10.35868/1997-3004.42.110-116
УДК 578.865.1
МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР
ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО
ПРОЦЕСУ У РОСЛИН
Ю. С. Щукін1, https://orcid.org/0009-0003-5455-2564,
О. Г. Коваленко1,2, https://orcid.org/0000-0002-1342-1045
1Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України
вул. Академіка Заболотного, 154; м. Київ, 03680, Україна
2Інститут біохімії і біофізики ПАН
вул. Павінського, 5а; м. Варшава, 02-106, Польща
e-mail: udajko@ukr.net
Мета. З’ясувати можливості використання методу ЗТ-ПЛР для моніторингу вірусного
інфекційного процесу у рослин. Методи. Екстракція нуклеїнових кислот із рослин тютюну
та пшениці за CTAB-протоколом і метод полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі зі
стадією зворотної транскрипції (ЗТ-ПЛР). Результати. Створено й відпрацьовано мето-
дику ПЛР у реальному часі для моніторингу вірусного процесу у рослин. У роботі наведені
оптимізовані протоколи виділення, праймера та флуоресцентні проби, а також склад бу-
феру й підібраний протокол ампліфікації. Отримані дані свідчать про чутливість, специ-
фічність та лінійність отриманих ПЛР-тест-систем у реальному часі, що дає змогу опти-
мізувати їх для кількісного визначення для подальшого використання в моніторингу вірусно-
го інфекційного процесу у рослин. Висновки. На прикладі вірусів TMV та WSMV показана
принципова можливість використання ЗТ-ПЛР-систем для кількісної оцінки перебігу вірус-
ного інфекційного процесу у рослин. Отримані результати можуть бути використані для
вивчення інших як ДНК-, так і РНК-вмісних вірусів. Пропонований метод має очевидні пере-
ваги перед методами виявлення й моніторингу вірусних інфекцій у рослин (чутливість, спе-
цифічність, можливість кількісного визначення віpусоспецифічниx продуктів), які викорис-
товуються на сьогодні. Проте особливість його практичної реалізації полягає в необхідно-
сті вартісного обладнання й реактивів, а також в наявності підготовленого, кваліфікова-
ного персоналу. Практична цінність методу зросте після його адаптації до моніторингу
економічно важливих вірусів сільськогосподарських культур, які розмножуються вегета-
тивно (картопля, полуниця, плодові культури).
Ключові слова: віруси рослин, моніторинг вірусного інфекційного процесу у рослин, вірус
тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus, TMV), вірус смугастої мозаїки пшениці (Wheat
Streak Mosaic Virus, WSMV), полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі зі стадією зво-
ротної транскрипції (ЗТ-ПЛР), екстракція нуклеїнових кислот з рослинного матеріалу.
Вступ. Одними з основних патогенів, що
вражають рослини, зокрема сільськогоспо-
дарські, є віруси. Боротьба з ними вимагає
комплексного підходу, одним із елементів
якого є швидка діагностика хвороби та іден-
тифікація її збудника [1]. Основними мето-
дами визначення вірусної інфекції сьогодні
є візуальне спостереження за рослинами,
використання рослин-індикаторів (біотест)
та імуноферментний аналіз (ІФА) [2]. Також
впроваджуються нові молекулярно-генетич-
ні методи, зокрема метод ЗТ-ПЛР [2]. Цей
© Ю. С. Щукін, О. Г. Коваленко, 2025
111
метод дозволяє виявляти вірусні нуклеїнові
кислоти з великою чутливістю (сотні копій
геномів на мг біомаси), точністю та специ-
фічністю.
Вищезазначені методи відрізняються за
чутливістю, точністю, специфічністю, трива-
лістю проведення аналізу, а також фінансо-
вими затратами. Хоча візуальне спостере-
ження і є найбільш простим і дешевим засо-
бом, за наявністю видимих симптомів можна
судити лише про присутність у рослині пато-
гена. Метод рослин-індикаторів має такий са-
мий недолік. Імуноферментний аналіз, орієн-
тований на визначення білків вірусу, дозво-
ляє виявляти його на більш ранніх стадіях,
але у порівнянні з методами, що базуються
на полімеразній ланцюговій реакції, значно
програє в чутливості. Крім того, синтез біл-
ків вірусу проходить на пізніх стадіях пато-
генезу і не дає змоги виявляти вірус на ран-
ніх стадіях [3]. Побудова кількісної системи
виявлення вірусів рослин методом ІФА є
складним завданням. Наявність вірусних бі-
лків не перебуває у чіткій стехіометричній
залежності від кількості вірусної нуклеїнової
кислоти, тоді як присутність у рослині нук-
леїнових кислот вірусу є 100 %-им маркером
зараження рослини, що дає змогу виявляти
інфекцію на найбільш ранніх стадіях патоге-
незу й завчасно вживати заходів для уник-
нення поширення вірусної інфекції.
Метою роботи було з’ясування можли-
востей використання методу ЗТ-ПЛР для
моніторингу вірусного інфекційного процесу
у рослин.
Матеріали та методи.
Об’єкти досліджень. Для відпрацюван-
ня методики діагностики вірусної інфекції
рослин методом ПЛР у реальному часі ми
вибрали вірус тютюнової мозаїки (Tobacco
mosaic virus, TMV) як найбільш досліджений
модельний вірус і вірус смугастої мозаїки
пшениці (Wheat Streak Mosaic Virus, WSMV).
У роботі використано рослини Nicotiana
tabacum L. сорту Трапезунд та Triticum aes-
tivum L. сорту Зимоярка, здорові й інфікова-
ні вірусами TMV(штам U1) і WSMV відпо-
відно. В окремих варіантах зразки тканин
для дослідження були отримані з ТMV-ін-
фікованого калюсу тютюну, оздоровлювано-
го в присутності ліпосомальниx біонаноком-
позитів (БНК) [4], або з інтактниx рослин
пшениці, вирощеної за передпосівної оброб-
ки насіння БНК та/або мікробними препара-
тами [5].
Використані реактиви та обладнання.
У дослідженняx використовували ампліфіка-
тор Biorad (C1000/CFX96), термостат BIO-
SAN TDB-120, мініцентрифугу BIOSAN MI-
CROSPIN 12, BIOBASE Benchtop pH-meter
pH-210, дозатори змінного об’єму одноразові
RNAse/DNAse free пластик та інше загаль-
нолабораторне обладнання.
Для приготування буферів для екстракції
нуклеїнових кислот використано такі реаген-
ти: Цетілтріметиламоніум бромід (CTAB), Mo-
lecular Biology Grade, Sigma (219374-100GM);
NaCl, ACS reagent, ≥ 99,0 %, Merck (S9888);
Тріс амінометан, ACS reagent, ≥ 99,0 %, Merck
(252859); Полівінілпіролідон-40 (PVP-40),
Merck (PVP40-100G); ЕДТА, ACS reagent,
Merck (E9884); 2-меркаптоетанол, ≥ 99,0 %,
Merck (M6250); Lithium chloride, Molecular
Biology, ≥ 99 %, Merck (L9650-100G).
Суміші для ампліфікації готували за ви-
користання таких реагентів: Hot Start Taq
DNA Polymerase, NEB (M0495); M-MuLV
Reverse Transcriptase NEB (M0253L); Stan-
dard Taq Reaction Buffer NEB (B9014S) with
MgCl2 and dNTP; олігонуклеотиди й плаз-
мідні вектори (pUC19) зі вставленими відпо-
відними для кожного вірусу послідовностя-
ми, замовлені в «Azenta life science».
Екстракція нуклеїнових кислот. У ро-
боті випробувано декілька варіантів екстрак-
ції нуклеїнових кислот з рослинного матері-
алу: СТАВ-протокол, СТАВ-протокол з озву-
чуванням зразків, виділення нуклеїнових ки-
слот із попередньо отриманих протопластів
[6] набором ТОВ «ІНЖЕНІКО» PrEx — пре-
ципітація ДНК/РНК за протоколом виробни-
ка. Серед цих протоколів для подальших
досліджень вибрано СТАВ-протокол [7] в на-
шій модифікації, що передбачало обробку от-
риманих ізолятів нуклеїнових кислот ДНК-
азою, eлюцією в 500 мкл ТЕ буферу і по-
дальшим зберіганням екстрагованих зразків
за температури –70 °С.
Підбір і дизайн праймерів. Для виявлен-
ня вірусів тютюнової мозаїки та смугастої
мозаїки пшениці підібрано специфічні та
унікальні праймери до регіонів TMVgp3 ге-
ному TMV та P3 геному WSMV. Вибірка
повногеномних сиксвенсів була взята з бази
даних NCBI virus. Вирівнювання й пошук
консервативних послідовностей проводили
ISSN 1997-3004 Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42.
112
в програмі Snapgene. Дизайн праймерів та
їхній аналіз на наявність димерів проводився
у веб-інтерфейсі (https://www.idtdna.com/calc/
analyzer). Підібрані праймери наведені в табл.
Ампліфікація нуклеїнових кислот. Ре-
акційна суміш для проведення ампліфікації
мала кінцевий об’єм 50 мкл і складалася з
M-MuLV ревертази, Hot Start Taq ДНК полі-
мерази, буфера для проведення реакції дода-
них згідно з рекомендаціями виробника. Та-
кож вона містила 3 мМ MgCl2, 0,2 uM dNTP,
0,3 uM TMV_F, 0,2 uM TMV_P, 0,3 uM
TMV_R і стерильну воду. Для приготування
буферу для ампліфікації WSMV використо-
вували ті самі параметри.
Ампліфікація нуклеїнових кислот про-
водилася за такою програмою: ревертазна
реакція (45 °С — 15 хв.); початкова денату-
рація (95 °С — 5 хв.); 5 циклів денатурації
(95 °С — 5 с) та відпалювання, без зчитуван-
ня (60 °С — 40 с); 45 циклів денатурації
(95 °С — 5 с) та відпалювання, зі зчитуван-
ням (60 °С — 40 с).
Для побудови стандартної кривої і ви-
значення лінійності реакції використовували
серійні розведення плазмідної ДНК, встано-
вленої виробником концентрації з вбудова-
ним ампліконом відповідного вірусу.
Результати та їх обговорення. Резуль-
тати ампліфікації інфікованих TMV рослин
наведені на рис. 1А. Для валідації тест-сис-
теми були відібрані 5 зразків інфікованого
матеріалу з різним інфекційним навантажен-
ням та 10 здорових. Як позитивний контроль
використовували розчин плазміди з вбудова-
ним ампліконом. Наведені дані свідчать про
специфічність і можливість використання цих
послідовностей. Для визначення лінійності
й чутливості був використаний метод серій-
них розведень плазміди (рис. 1Б) і побудова-
на стандартна крива для набору (рис. 1В).
Результати ампліфікації інфікованих
WSMV рослин наведені на рис. 2А. Для ва-
лідації тест-системи відібрано 4 інфіковані
рослини на різних стадіях розвитку інфекції
та 10 здорових. Як позитивний контроль ви-
користовували розчин плазміди з вбудова-
ним ампліконом. Для визначення лінійності
й чутливості був використаний метод серій-
них розведень плазміди (рис. 2Б) і побудова-
на стандартна крива для набору (рис. 2В).
Отже, наведені дані для обох наборів
свідчать про їхню специфічність, чутливість
і лінійність. Ці характеристики дозволяють
надалі оптимізувати їх для використання як
кількісних наборів для визначення нуклеїно-
вих кислот.
На сьогодні використання ПЛР для діаг-
ностики інфекційних хвороб є досить роз-
повсюдженим і широко використовується у
діагностичній практиці. Незважаючи на на-
явність у науковій літературі статей з вияв-
лення вірусів TMV [8–10] та WSMV [11; 12],
зокрема у реальному часі, ми не знайшли да-
них про використання ЗТ-ПЛР-наборів для
кількісного визначення. Наша робота ство-
рює підґрунтя для розробки кількісного ви-
значення параметрів вірусного інфекційного
процесу у рослин, яке може бути широко ви-
користано як у наукових, так і в прикладних
дослідженнях із фітовірусології та фітопа-
тології.
Висновки. Показана принципова мож-
ливість використання ЗТ-ПЛР систем для кі-
лькісної оцінки перебігу вірусного інфекцій-
ного процесу у рослин, наразі ця можливість
підтверджена нами для TMV та WSMV.
Отримані результати можуть бути викорис-
Таблиця. Праймери для виявлення вірусів тютюнової мозаїки та смугастої мозаїки
пшениці
Назва Флуорофор Послідовність (5’-3’) Гасник Розмір
амплікону
TMV_F GGTCTCTTTGTGATGTTGCTG
185 пар основ TMV_P Cy5 GCGTCGTCCAACTGTGTGTAATAС BHQ-3
TMV_R CCTTTAACAACTAGAGCCATCT
WSMV_F ATGAAAGCTGAGATGATGCAATA
318 пар основ WSMV_P ROX TCCTCGGAGATAGCGTGTCAACC BHQ-2
WSMV_R CCTCAAGGAACTCCCTTTGT
ISSN 1997-3004 Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42.
113
Рис. 1. А — криві ампліфікації зразків TMV; Б — ампліфікація двократних розведень пла-
зміди із вбудованим ампліконом TMV; В — стандартна крива, побудована на розведен-
нях плазміди з вбудованим ампліконом TMV.
тані для вивчення інших як ДНК-, так і РНК-
вмісних вірусів. Зокрема, практична цінність
методу зросте після його адаптації до моні-
торингу економічно важливих вірусів сільсь-
когосподарських культур, які розмножують-
ся вегетативно (картопля, полуниця, плодові
культури).
Метод має очевидні переваги перед ме-
тодами моніторингу вірусних інфекцій у ро-
слин (чутливість, специфічність, можливість
кількісного визначення віpусоспецифічниx
продуктів), які використовуються на сьо-
годні. Особливість його практичної реалі-
зації, однак, полягає в необхідності вартіс-
ного обладнання й реактивів, а також в наяв-
ності підготовленого, кваліфікованого пер-
соналу.
Подяки: Ця робота виконана за фінан-
сової підтримки НАН України в рамках
науково-дослідних проектів (0125U000536,
0125U000535) і Польською академією наук
через «Довгострокову програму підтримки
українських дослідницьких колективів»
(PAN.BFB.S.BWZ.407.022.2024).
-100
100
300
500
700
900
1100
1300
1500
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Ф
лу
ор
ес
це
нц
ія
Цикл
А
1
2
3
4
5
Neg
Pos
Поріг
-100
100
300
500
700
900
1100
1300
1500
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ф
лу
ор
ес
це
нц
ія
Цикл
Б
10
15
20
25
30
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Ц
ик
л
Логарифм від початкової
кількості копій на мкл
В
ISSN 1997-3004 Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42.
114
Рис. 2. А — криві ампліфікації зразків WSMV; Б — ампліфікація двократних розведень
плазміди із вбудованим ампліконом WSMV; В — стандартна крива, побудована на розве-
деннях плазміди з вбудованим ампліконом WSMV.
ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Anikina I., Kamarova A., Issayeva K., Issa-
khanova S., Mustafayeva N., Insebayeva M. … Ra-
poso A. Plant protection from virus: a review of dif-
ferent approaches. Frontiers in Plant Science. 2023.
№ 14. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1163270
2. Burgess S. Plant cell protoplast isolation.
Vol. 1. 2016. https://doi.org/10.17504/protocols.io.
ftnbnme
3. Deb M., Anderson J. M. Development of a
multiplexed PCR detection method for Barley and
Cereal yellow dwarf viruses, Wheat spindle streak
virus, Wheat streak mosaic virus and Soil-borne
wheat mosaic virus. Journal of Virological Methods.
2008. Vol. 148, № 1–2. P. 17–24. https://doi.org/10.
1016/j.jviromet.2007.10.015
4. Han S., Zhou T., Zhang F., Feng J., Han C.,
Maimaiti Y. One-Step Multiplex RT-PCR Method
for Detection of Melon Viruses. Microorganisms.
2024. Vol. 12, № 11. 2337. https://doi.org/10.3390/
microorganisms12112337
5. Kanapiya A., Amanbayeva U., Tulegenova Z.,
Abash A., Zhangazin S., Dyussembayev K., Muki-
yanova, G. Recent advances and challenges in plant
viral diagnostics. Frontiers in Plant Science. 2024.
№ 15. https://doi.org/10.3389/fpls.2024.1451790
-100
400
900
1400
1900
2400
2900
3400
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ф
лу
ор
ес
це
нц
ія
Цикл
А
1
2
3
4
POS
NEG
Поріг
-100
400
900
1400
1900
2400
2900
3400
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ф
лу
ор
ес
це
нц
ія
Цикл
Б
10
15
20
25
30
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Ц
ик
л
Логарифм від початкової кількості
копій на мікролітр
В
ISSN 1997-3004 Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42.
115
6. Kiss T., Karácsony Z., Gomba-Tóth A., Sza-
badi K. L., Spitzmüller Z., Hegyi-Kaló J. … Vá-
czy K. Z. A modified CTAB method for the extrac-
tion of high-quality RNA from mono-and dicotyle-
donous plants rich in secondary metabolites. Plant
Methods. 2024. Vol. 20, № 1. 62. https://doi.org/10.
1186/s13007-024-01198-z
7. Kovalenko O. Liposomal strategy in gro-
wing, recovering and protecting plants against viral
infections. X International Conference “Bioresour-
ces and Viruses”: Book of abstracts (Kyiv, the 11–
13 of September). Kyiv, 2023. P. 50.
8. Kovalenko O., Kyrychenko А., Shchukin Y.
Liposomal Ganoderma adspersum [Schulzer] Donk
promotes elimination of tobacco mosaic virus from
Nicotiana tabacum callus tissue in vitro. XVI з’їзд
товариства мікробіологів України ім. С. М. Ви-
ноградського: тези доповідей (м. Тернопіль, 2–
6 червня). Тернопіль, 2025. С. 297.
9. Kumar S., Udaya Shankar A. C., Nayaka S. C.,
Lund O. S., Prakash, H. S. Detection of Tobacco
mosaic virus and Tomato mosaic virus in pepper and
tomato by multiplex RT-PCR. Letters in Applied
Microbiology. 2011. Vol. 53, № 3. P. 359–363.
https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2011.03117.x
10. Liu H., Wu K., Wu W., Mi W., Hao X.,
Wu, Y. A multiplex reverse transcription PCR assay
for simultaneous detection of six main RNA viruses
in tomato plants. Journal of Virological Methods,
2019. Vol. 265. P. 53–58. https://doi.org/10.1016/j.
jviromet.2018.12.011
11. Mekuria G., Ramesh, S. A., Alberts E., Ber-
tozzi T., Wirthensohn M., Collins G., Sedgley M.
Comparison of ELISA and RT-PCR for the detec-
tion of Prunus necrotic ring spot virus and prune
dwarf virus in almond (Prunus dulcis). Journal of
Virological Methods. 2003. Vol. 114, № 1. P. 65–69.
https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2003.08.014
12. Price J. A., Smith J., Simmons A., Fellers J.,
Rush C. M. Multiplex real-time RT-PCR for detec-
tion of Wheat streak mosaic virus and Tritcum mo-
saic virus. Journal of Virological Methods. 2010.
Vol. 165, № 2. P. 198–201. https://doi.org/10.1016/j.
jviromet.2010.01.019
Отримано: 18.08.2025
Прийнято до друку: 30.09.2025
Опубліковано онлайн: 29.12.2025
https://doi.org/10.35868/1997-3004.42.110-116
UDC 578.865.1
POSSIBILITIES OF USING THE RT-PCR METHOD FOR MONITORING
VIRAL INFECTION PROCESSES IN PLANTS
Yu. S. Shchukin1, https://orcid.org/0009-0003-5455-2564,
О. H. Kovalenko1,2, https://orcid.org/0000-0002-1342-1045
1D. K. Zabolotnyi Institute of Microbiology and Virology, NAS of Ukraine, Kyiv
2Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw
e-mail: udajko@ukr.net
Objective. To determine the possibilities of using the RT-PCR method for monitoring viral in-
fectious processes in plants. Methods. Extraction of nucleic acids from tobacco and wheat plants
using the STAV protocol and real-time polymerase chain reaction with reverse transcription stage
(RT-PCR). Results. A real-time PCR method for monitoring viral processes in plants has been cre-
ated and tested. The study presents optimized protocols for isolation, primers, and fluorescent
probes, as well as buffer composition and a selected amplification protocol. The data obtained in-
dicate the sensitivity, specificity, and linearity of the real-time PCR test systems, which allows them
to be optimized for quantitative determination for further use in monitoring the viral infection pro-
cess in plants. Conclusions. The example of TMV and WSMV viruses demonstrates the fundamental
possibility of using RT-PCR systems for quantitative assessment of the viral infection course in
plants. The results obtained can be used to study other DNA- and RNA-containing viruses. The pro-
posed method has obvious advantages over the methods of detection and monitoring of viral infec-
ISSN 1997-3004 Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42.
116
tions in plants (sensitivity, specificity, the possibility of quantitative determination of virus-specific
products) that are currently used. However, the peculiarity of its practical implementation is the
need for expensive equipment and reagents, as well as the availability of trained, qualified person-
nel. The practical value of the method will increase after its adaptation to the monitoring of eco-
nomically important viruses of agricultural crops that reproduce vegetatively (potatoes, strawber-
ries, fruit crops).
Key words: plant viruses, monitoring of viral infectious processes in plants, tobacco mosaic vi-
rus (Tobacco mosaic virus, TMV), wheat streak mosaic virus (Wheat Streak Mosaic Virus, WSMV),
real-time polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR), extraction of nucleic
acids from plant material.
REFERENCES
1. Anikina, I., Kamarova, A., Issayeva, K., Is-
sakhanova, S., Mustafayeva, N., Insebayeva, M. …
Raposo, A. (2023). Plant protection from virus: a re-
view of different approaches. Frontiers in Plant Sci-
ence, 14. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1163270
2. Burgess, S. (2016). Plant cell protoplast iso-
lation. https://doi.org/10.17504/protocols.io.ftnbnme
3. Deb, M., & Anderson, J. M. (2008). Deve-
lopment of a multiplexed PCR detection method for
Barley and Cereal yellow dwarf viruses, Wheat
spindle streak virus, Wheat streak mosaic virus and
Soil-borne wheat mosaic virus. Journal of Virologi-
cal Methods, 148(1–2), 17–24. https://doi.org/10.
1016/j.jviromet.2007.10.015
4. Han, S., Zhou, T., Zhang, F., Feng, J., Han, C.,
& Maimaiti, Y. (2024). One-Step Multiplex RT-PCR
Method for Detection of Melon Viruses. Microor-
ganisms, 12(11), 2337. https://doi.org/10.3390/micro
organisms12112337
5. Kanapiya, A., Amanbayeva, U., Tulegeno-
va, Z., Abash, A., Zhangazin, S., Dyussembayev, K.,
& Mukiyanova, G. (2024). Recent advances and
challenges in plant viral diagnostics. Frontiers in
Plant Science, 15. https://doi.org/10.3389/fpls.2024.
1451790
6. Kiss, T., Karácsony, Z., Gomba-Tóth, A.,
Szabadi, K. L., Spitzmüller, Z., Hegyi-Kaló, J. …
Váczy, K. Z. (2024). A modified CTAB method for
the extraction of high-quality RNA from mono-and
dicotyledonous plants rich in secondary metabolites.
Plant Methods, 20(1), 62. https://doi.org/10.1186/
s13007-024-01198-z
7. Kovalenko, O. (2023, September). Liposomal
strategy in growing, recovering and protecting plants
against viral infections. Book of abstracts of the
X International Conference «Bioresources and Vi-
ruses» (pp. 50–50), Kyiv.
8. Kovalenko, O., Kyrychenko, А., & Shchu-
kin, Y. (2025, June). Liposomal Ganoderma adsper-
sum [Schulzer] Donk promotes elimination of to-
bacco mosaic virus from Nicotiana tabacum callus
tissue in vitro. Abstracts of reports of the XVI Con-
gress of Vinogradskyi society of microbiologists of
Ukraine (pp. 297–297), Ternopil.
9. Kumar, S., Udaya Shankar, A. C., Nayaka, S. C.,
Lund, O. S., & Prakash, H. S. (2011). Detection of
Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus in
pepper and tomato by multiplex RT-PCR. Letters in
Applied Microbiology, 53(3), 359–363. https://doi.
org/10.1111/j.1472-765X.2011.03117.x
10. Liu, H., Wu, K., Wu, W., Mi, W., Hao, X.,
& Wu, Y. (2019). A multiplex reverse transcription
PCR assay for simultaneous detection of six main
RNA viruses in tomato plants. Journal of Viro-
logical Methods, 265, 53–58. https://doi.org/10.1016/
j.jviromet.2018.12.011
11. Mekuria, G., Ramesh, S. A., Alberts, E.,
Bertozzi, T., Wirthensohn, M., Collins, G., &
Sedgley, M. (2003). Comparison of ELISA and
RT-PCR for the detection of Prunus necrotic ring
spot virus and prune dwarf virus in almond (Prunus
dulcis). Journal of Virological Methods, 114(1), 65–
69. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2003.08.014
12. Price, J. A., Smith, J., Simmons, A., Fellers, J.,
& Rush, C. M. (2010). Multiplex real-time RT-PCR
for detection of Wheat streak mosaic virus and
Tritcum mosaic virus. Journal of Virological Me-
thods, 165(2), 198–201. https://doi.org/10.1016/j.
jviromet.2010.01.019
Received: 18.08.2025
Accepted: 30.09.2025
Published online: 29.12.2025
ISSN 1997-3004 Сільськогосподарська мікробіологія. 2025. Вип. 42.
|
| id | oai:ojs2.smic.in.ua:article-551 |
| institution | Agriciltural microbiology |
| keywords_txt_mv | keywords |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2026-07-23T01:16:33Z |
| publishDate | 2025 |
| publisher | Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine |
| record_format | ojs |
| resource_txt_mv | smicinua/a7/e511a0a92bedcc0269de9eafdc3bc9a7.pdf |
| spelling | oai:ojs2.smic.in.ua:article-5512026-07-22T10:10:52Z POSSIBILITIES OF USING THE RT-PCR METHOD FOR MONITORING VIRAL INFECTION PROCESSES IN PLANTS МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН Щукін, Ю. С. Коваленко, О. Г. plant viruses, monitoring of viral infectious processes in plants, tobacco mosaic virus (Tobacco mosaic virus, TMV), wheat streak mosaic virus (Wheat Streak Mosaic Virus, WSMV), real-time polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR), extraction of nucleic acids from plant material віруси рослин, моніторинг вірусного інфекційного процесу у рослин, вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus, TMV), вірус смугастої мозаїки пшениці (Wheat Streak Mosaic Virus, WSMV), полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі зі стадією зворотної транскрипції (ЗТ-ПЛР), екстракція нуклеїнових кислот з рослинного матеріалу Objective. To determine the possibilities of using the RT-PCR method for monitoring viral infectious processes in plants. Methods. Extraction of nucleic acids from tobacco and wheat plants using the STAV protocol and real-time polymerase chain reaction with reverse transcription stage (RT-PCR). Results. A real-time PCR method for monitoring viral processes in plants has been created and tested. The study presents optimized protocols for isolation, primers, and fluorescent probes, as well as buffer composition and a selected amplification protocol. The data obtained indicate the sensitivity, specificity, and linearity of the real-time PCR test systems, which allows them to be optimized for quantitative determination for further use in monitoring the viral infection process in plants. Conclusions. The example of TMV and WSMV viruses demonstrates the fundamental possibility of using RT-PCR systems for quantitative assessment of the viral infection course in plants. The results obtained can be used to study other DNA- and RNA-containing viruses. The proposed method has obvious advantages over the methods of detection and monitoring of viral infections in plants (sensitivity, specificity, the possibility of quantitative determination of virus-specific products) that are currently used. However, the peculiarity of its practical implementation is the need for expensive equipment and reagents, as well as the availability of trained, qualified personnel. The practical value of the method will increase after its adaptation to the monitoring of economically important viruses of agricultural crops that reproduce vegetatively (potatoes, strawberries, fruit crops). Мета. З’ясувати можливості використання методу ЗТ-ПЛР для моніторингу вірусного інфекційного процесу у рослин. Методи. Екстракція нуклеїнових кислот із рослин тютюну та пшениці за CTAB-протоколом і метод полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі зі стадією зворотної транскрипції (ЗТ-ПЛР). Результати. Створено й відпрацьовано методику ПЛР у реальному часі для моніторингу вірусного процесу у рослин. У роботі наведені оптимізовані протоколи виділення, праймера та флуоресцентні проби, а також склад буферу й підібраний протокол ампліфікації. Отримані дані свідчать про чутливість, специфічність та лінійність отриманих ПЛР-тест-систем у реальному часі, що дає змогу оптимізувати їх для кількісного визначення для подальшого використання в моніторингу вірусного інфекційного процесу у рослин. Висновки. На прикладі вірусів TMV та WSMV показана принципова можливість використання ЗТ-ПЛР-систем для кількісної оцінки перебігу вірусного інфекційного процесу у рослин. Отримані результати можуть бути використані для вивчення інших як ДНК-, так і РНК-вмісних вірусів. Пропонований метод має очевидні переваги перед методами виявлення й моніторингу вірусних інфекцій у рослин (чутливість, специфічність, можливість кількісного визначення віpусоспецифічниx продуктів), які використовуються на сьогодні. Проте особливість його практичної реалізації полягає в необхідності вартісного обладнання й реактивів, а також в наявності підготовленого, кваліфікованого персоналу. Практична цінність методу зросте після його адаптації до моніторингу економічно важливих вірусів сільськогосподарських культур, які розмножуються вегетативно (картопля, полуниця, плодові культури). Institute of Agrocultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture of NAAS of Ukraine 2025-12-29 Article Article Рецензована Стаття application/pdf https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/551 10.35868/1997-3004.42.110-116 Agricultural microbiology; Vol. 42 (2025): Agriciltural microbiology; 110-116 Сільськогосподарська мікробіологія; Том 42 (2025): Сільськогосподарська мікробіологія; 110-116 1997-3004 10.35868/1997-3004.42 uk https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/551/619 Авторське право (c) 2025 Yu. S. Shchukin, О. H. Kovalenko https://creativecommons.org/licenses/by/4.0 |
| spellingShingle | віруси рослин моніторинг вірусного інфекційного процесу у рослин вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus TMV) вірус смугастої мозаїки пшениці (Wheat Streak Mosaic Virus WSMV) полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі зі стадією зворотної транскрипції (ЗТ-ПЛР) екстракція нуклеїнових кислот з рослинного матеріалу Щукін, Ю. С. Коваленко, О. Г. МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН |
| title | МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН |
| title_alt | POSSIBILITIES OF USING THE RT-PCR METHOD FOR MONITORING VIRAL INFECTION PROCESSES IN PLANTS |
| title_full | МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН |
| title_fullStr | МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН |
| title_full_unstemmed | МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН |
| title_short | МОЖЛИВОСТІ ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДУ ЗТ-ПЛР ДЛЯ МОНІТОРИНГУ ВІРУСНОГО ІНФЕКЦІЙНОГО ПРОЦЕСУ У РОСЛИН |
| title_sort | можливості використання методу зт-плр для моніторингу вірусного інфекційного процесу у рослин |
| topic | віруси рослин моніторинг вірусного інфекційного процесу у рослин вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus TMV) вірус смугастої мозаїки пшениці (Wheat Streak Mosaic Virus WSMV) полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі зі стадією зворотної транскрипції (ЗТ-ПЛР) екстракція нуклеїнових кислот з рослинного матеріалу |
| topic_facet | plant viruses monitoring of viral infectious processes in plants tobacco mosaic virus (Tobacco mosaic virus TMV) wheat streak mosaic virus (Wheat Streak Mosaic Virus WSMV) real-time polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR) extraction of nucleic acids from plant material віруси рослин моніторинг вірусного інфекційного процесу у рослин вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus TMV) вірус смугастої мозаїки пшениці (Wheat Streak Mosaic Virus WSMV) полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі зі стадією зворотної транскрипції (ЗТ-ПЛР) екстракція нуклеїнових кислот з рослинного матеріалу |
| url | https://smic.in.ua/index.php/journal/article/view/551 |
| work_keys_str_mv | AT ŝukínûs possibilitiesofusingthertpcrmethodformonitoringviralinfectionprocessesinplants AT kovalenkoog possibilitiesofusingthertpcrmethodformonitoringviralinfectionprocessesinplants AT ŝukínûs možlivostívikoristannâmetoduztplrdlâmonítoringuvírusnogoínfekcíjnogoprocesuuroslin AT kovalenkoog možlivostívikoristannâmetoduztplrdlâmonítoringuvírusnogoínfekcíjnogoprocesuuroslin |