Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?

В огляді йдеться про історію відкриття, бурхливий розвиток і подальші перспективи застосування нового потужного інструменту для редагування геному — CRISPR/Cas9. Взявши за основу один з елементів захисної системи бактерій, вчені-біологи створили досить простий, дешевий і швидкий метод внесення змі...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2020
Hauptverfasser:	Комісаренко, С.В., Романюк, С.І.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2020
Schriftenreihe:	Вісник НАН України
Schlagworte:	Статті та огляди
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/169912
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису? / С.В. Комісаренко, С.І. Романюк // Вісник Національної академії наук України. — 2020. — № 3. — С. 50-77. — Бібліогр.: 138 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-169912
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1699122020-07-03T01:27:57Z Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису? Комісаренко, С.В. Романюк, С.І. Статті та огляди В огляді йдеться про історію відкриття, бурхливий розвиток і подальші перспективи застосування нового потужного інструменту для редагування геному — CRISPR/Cas9. Взявши за основу один з елементів захисної системи бактерій, вчені-біологи створили досить простий, дешевий і швидкий метод внесення змін у ДНК рослин, тварин і людини. Ніколи раніше людство не мало настільки точного знаряддя для маніпуляції генами, і це відкриває широкі можливості для профілактики та лікування багатьох захворювань. Водночас у суспільстві точаться гострі дискусії: благо чи зло несе людству CRISPR/Cas9? Як і будь-яка нова технологія, генне редагування викликає побоювання і піднімає низку серйозних етичних проблем, особливо щодо можливості його використання на клітинах зародкової лінії і геномі ембріонів людини. Проте вже зараз очевидно, що CRISPR/Cas9 — це не чергова модна «іграшка» для вчених, а революційна технологія, яка змінить наше майбутнє. The review discusses the history of discovery, rapid development and further prospects for the use of a new powerful genome editing tool, CRISPR/Cas9. Taking one of the elements of the bacterial protective system, biologists have created a simple, inexpensive and fast method of altering the DNA of plants, animals and humans. Never before has humanity had such an accurate tool for gene manipulation, and this opens up great opportunities for the prevention and treatment of many diseases. At the same time, there is a heated debate in society: will CRISPR/Cas9 bring good or evil to humanity? Like any new technology, gene editing raises concerns and raises a number of serious ethical issues, especially regarding its use on germline cells and the genome of human embryos. However, it is already clear that CRISPR/Cas9 is not another fancy “toy” for scientists, but a revolutionary technology that will change our future. 2020 Article Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису? / С.В. Комісаренко, С.І. Романюк // Вісник Національної академії наук України. — 2020. — № 3. — С. 50-77. — Бібліогр.: 138 назв. — укр. 0372-6436 DOI: doi.org/10.15407/visn2020.03.050 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/169912 uk Вісник НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Статті та огляди Статті та огляди
spellingShingle	Статті та огляди Статті та огляди Комісаренко, С.В. Романюк, С.І. Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису? Вісник НАН України
description	В огляді йдеться про історію відкриття, бурхливий розвиток і подальші перспективи застосування нового потужного інструменту для редагування геному — CRISPR/Cas9. Взявши за основу один з елементів захисної системи бактерій, вчені-біологи створили досить простий, дешевий і швидкий метод внесення змін у ДНК рослин, тварин і людини. Ніколи раніше людство не мало настільки точного знаряддя для маніпуляції генами, і це відкриває широкі можливості для профілактики та лікування багатьох захворювань. Водночас у суспільстві точаться гострі дискусії: благо чи зло несе людству CRISPR/Cas9? Як і будь-яка нова технологія, генне редагування викликає побоювання і піднімає низку серйозних етичних проблем, особливо щодо можливості його використання на клітинах зародкової лінії і геномі ембріонів людини. Проте вже зараз очевидно, що CRISPR/Cas9 — це не чергова модна «іграшка» для вчених, а революційна технологія, яка змінить наше майбутнє.
format	Article
author	Комісаренко, С.В. Романюк, С.І.
author_facet	Комісаренко, С.В. Романюк, С.І.
author_sort	Комісаренко, С.В.
title	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?
title_short	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?
title_full	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?
title_fullStr	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?
title_full_unstemmed	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?
title_sort	редагування геному, або crispr/cas9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2020
topic_facet	Статті та огляди
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/169912
citation_txt	Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису? / С.В. Комісаренко, С.І. Романюк // Вісник Національної академії наук України. — 2020. — № 3. — С. 50-77. — Бібліогр.: 138 назв. — укр.
series	Вісник НАН України
work_keys_str_mv	AT komísarenkosv redaguvannâgenomuabocrisprcas9panaceâvídbagatʹohnevilíkovnihhvorobčiperšijkrokdogennogoapokalípsisu AT romanûksí redaguvannâgenomuabocrisprcas9panaceâvídbagatʹohnevilíkovnihhvorobčiperšijkrokdogennogoapokalípsisu
first_indexed	2025-07-15T04:51:37Z
last_indexed	2025-07-15T04:51:37Z
_version_	1837687224218419200
fulltext	50 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ СТАТТІ ТА ОГЛЯДИТА ОГЛЯДИ РЕДАГУВАННЯ ГЕНОМУ, АБО CRISPR/CAS9 — ПАНАЦЕЯ ВІД БАГАТЬОХ НЕВИЛІКОВНИХ ХВОРОБ ЧИ ПЕРШИЙ КРОК ДО ГЕННОГО АПОКАЛІПСИСУ? В огляді йдеться про історію відкриття, бурхливий розвиток і подальші перспективи застосування нового потужного інструменту для редагуван- ня геному — CRISPR/Cas9. Взявши за основу один з елементів захисної сис- теми бактерій, вчені-біологи створили досить простий, дешевий і швидкий метод внесення змін у ДНК рослин, тварин і людини. Ніколи раніше люд- ство не мало настільки точного знаряддя для маніпуляції генами, і це від- криває широкі можливості для профілактики та лікування багатьох за- хворювань. Водночас у суспільстві точаться гострі дискусії: благо чи зло несе людству CRISPR/Cas9? Як і будь-яка нова технологія, генне редагу- вання викликає побоювання і піднімає низку серйозних етичних проблем, особливо щодо можливості його використання на клітинах зародкової лінії і геномі ембріонів людини. Проте вже зараз очевидно, що CRISPR/Cas9 — це не чергова модна «іграшка» для вчених, а революційна технологія, яка змінить наше майбутнє. Ключові слова: CRISPR/Cas9, редагування геномної ДНК, генна тера- пія, генетично модифіковані організми. Історія науки знає багато прикладів, коли випадкове відкрит- тя в непопулярній галузі науки приводило до наукового про- риву, який уможливлював здійснення найзаповітніших мрій людства. Так було відкрито антибіотики, рентгенівське випро- мінювання тощо. Ось і зараз ми є свідками розгортання подіб- ної наукової революції в генетиці. Здається, у розпорядженні генетиків з’явився інструмент, здатний у короткий термін зро- бити наукову фантастику реальністю. Наукове співтовариство активно обговорює перспективи лікування раку та невиліков- них спадкових захворювань шляхом видалення з організму дефектних генів. У геометричній прогресії зростає кількість наукових статей з цієї тематики, у пресі постійно з’являються повідомлення, інтерв’ю, точаться дискусії. Винуватцями тако- го «переполоху» є автори несподіваного відкриття, які у 2012 р. КОМІСАРЕНКО Сергій Васильович — академік НАН України, директор Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України doi: https://doi.org/10.15407/visn2020.03.050 РОМАНЮК Світлана Іванівна — кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 51 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ розробили метод CRISPR/Cas9 для точного редагування геному живих організмів. Відкриття CRISPR/Cas9 вже відзначено безліччю наукових нагород і, безсумнівно, за- слуговує на найпрестижнішу наукову відзна- ку — Нобелівську премію. Основна частина цієї статтібула написана кілька років тому як передвісниця цієї події. Однак Нобелівський комітет з різних причин поки що не поспішає приймати позитивне рішення, зокрема, ймо- вірно, через судову тяганину щодо патенту- вання цієї методики, яка триває останні роки. Незважаючи на це, практичне застосування технології CRISPR/Cas9 з кожним роком стає все більш широким і має численні здобутки в галузі біотехнології та медицини, значення яких для людства складно переоцінити. Тому, на нашу думку, є важливим і цікавим розгля- нути основні напрями та перспективи розви- тку цієї технології, а також окреслити наявні проблеми. З чого ж почалася історія відкриття CRISPR/Cas9? Як не дивно, з досліджень про- тивірусного імунітету бактерій. У 50-х роках XX ст. вчені звернули увагу на те, що деякі штами бактерій легко заражаються вірусами, а інші штами того самого виду — стійкі до за- раження. Двадцять років досліджень дали свої результати: виявилося, що стійкість певних бактеріальних штамів до вірусів пояснюється наявністю у бактерій спеціальних ензимів — рестриктаз (від лат. restrictio — обмеження), що розрізають вірусну ДНК. Цікавою особли- вістю цих ензимів є їх чітка специфічність до певної невеликої послідовності ДНК. Власну ДНК бактерія захищає від рестриктаз за до- помогою метилювання нуклеотидних залиш- ків аденіну та цитозину. Першу рестриктазу (EcoK) у 1968 р. виділили Метью Мезельсон (Matthew Meselson) і Роберт Юань (Robert Yuan) [1]. Здатність цих ензимів «різати» ДНК у чітко визначеній точці було використано вченими для одержання потрібних фрагментів геномної ДНК. У 1978 р. за відкриття рестрик- таз та їх застосування в молекулярній генети- ці Вернера Арбера (Werner Arber), Гамілтона Сміта (Hamilton O. Smith) і Даніела Натанса (Daniel Nathans) було удостоєно Нобелівської премії. А в 1967 р. Бернард Вейсс (Веrnhard Weiss) і Чарльз Річардсон (Charles Richardson) уперше виявили спеціальні «зшиваючі» ензи- ми — ДНК-лігази [2]. Використання лігаз і рестриктаз дало можливість створювати штуч- ні конструкції з ДНК живих організмів. Так з’явилася нова галузь науки — генна інженерія, яка дала можливість створювати генно-моди- фіковані організми (ГМО), рекомбінантні протеїни, індуковані стовбурові клітини тощо. Що ж таке CRISPR/Cas9? І до чого тут про- тивірусний імунітет бактерій? Виявилося, що бактерії захищаються від ві- русів не тільки за допомогою рестриктаз, адже вірус може не мати у своїй ДНК послідовності, необхідної для розщеплення цими ензимами. Є й інший, більш дієвий механізм, який надає бактеріям специфічний захист після зустрічі з певним вірусом. Цей механізм реалізує систе- ма з досить громіздкою назвою CRISPR/Cas9, або «криспер». Коли ДНК вірусу проникає в бактерію, від- бувається копіювання фрагмента цієї ДНК і перенесення його в спеціальне «сховище» інформації про віруси у власному геномі — CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — короткі паліндромні по- втори, регулярно розташовані групами). Тут зразки ДНК різних вірусів (спейсери) накопи- чуються між однаковими короткими повтора- ми бактеріальної ДНК і використовуються для виготовлення CRISPR РНК — сrРНК (їх ще називають РНК-зондами або РНК-гідами), що специфічно розпізнають гени певних вірусів і зв’язуються з ними у разі повторного заражен- ня. Завдяки сrРНК вірусну ДНК знаходять спеціальні ензими — протеїни Cas (CRISPR- асоційовані протеїни), гени яких знаходяться поруч з масивом CRISPR. Ці ензими, як і ре- стриктази, є ендонуклеазами, тобто вони здат- ні розрізати ДНК вірусу, знешкоджуючи її. Розглянемо докладніше, як саме працює система CRISPR/Cas9. Лідерна послідовність CRISPR відіграє роль промотора, з якого по- чинається транскрипція всього масиву. Мож- ливо, вона також розпізнається протеїнами, 52 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ які вставляють у CRISPR нові спейсери. Піс- ля транскрипції масиву CRISPR утворюєть- ся довга молекула РНК, до якої приєднуєть- ся невелика РНК, комплементарна повторам (tracrРНК); до tracrРНК приєднується протеїн Cas9, який активується при взаємодії, а до Cas9, у свою чергу, приєднується ензим РНКаза III, що розрізає довгу РНК на фрагменти — сrРНК та від’єднується. У Streptococcus pyogenes, на- приклад, сrРНК, що утворилися, складаються з 42 нуклеотидів: 22 кінцевих нуклеотиди — це половина паліндромного повтору, а решта 20— унікальний спейсерний фрагмент. Фактично в результаті розрізання довгої РНК утворюється комплекс crРНК, tracrРНК і активованого про- теїну Cas9. Спейсерна частина crРНК розпізнає комплементарну ділянку вірусної ДНК, а про- теїн Cas9 замикається на двох нитках ДНК і «розрізає» їх, спричинюючи подальшу деграда- цію чужорідної ДНК [3]. Для успішного розпізнавання ДНК-«мі ше- ні» та її пошкодження необхідно, щоб протеїн Cas9 розпізнав певну коротку (3–9 нуклеоти- дів) послідовність PAM (Protospacer Adjacent Motif — мотив, що примикає до протоспей- сера), яка знаходиться поруч з розпізнаною crРНК ділянкою ДНК. У різних видів бактерій ця послідовність різна; наприклад, для Strepto- coccus pyogenes послідовність PAM — 5’-NRG- 3’ (де N — будь-який нуклеотид, а R — A або G). Для чого потрібне розпізнавання PAM? Є припущення, що відсутність послідовностей PAM у складі власних генів бактерії захищає їх від розрізання системою CRISPR/Cas9, адже CRISPR містить 20 % спейсерів, націлених на власну ДНК [4]. Для чого ці спейсери зберіга- ються, невідомо. Можливо, у бактерій є якийсь механізм регуляції транскрипції власних ге- нів, до якого залучений CRISPR та спеціальні протеїни. Хто ж відкрив систему CRISPR/Cas9? Су- перечки щодо цього питання тривають і досі. Адже в сучасній науці вже неможливо від- крити щось одноосібно. Історія відкриття, що спричинило революцію в генній інженерії, тривала протягом 25 років, і багато вчених зро- били в неї свій внесок. У 1987 р. японські вчені на чолі з Йосідзу- мі Ісіно (Yoshizumi Ishino) разом з геном iap, який вони досліджували, випадково клонува- ли досить великий фрагмент геному кишко- вої палички Escherichia coli, який не кодував жодного протеїну [5]. Це було дуже дивно, оскільки бактерії, як правило, не мають зайвих послідовностей. Ділянка складалася з повто- рюваних послідовностей ДНК та варіабельних фрагментів ДНК між ними — спейсерів [6]. У 1993 р. науковці з Нідерландів під керівни- цтвом Яна ван Ембдена (Jan D.A. van Embden) дослідили різноманітність перериваних пря- мих повторів серед різних штамів збудника ту- беркульозу (Mycobacterium tuberculosis) і роз- робили новий метод диференціювання штамів, який використовується і сьогодні [7]. Пізніше іспанець Франсиско Хуан Мартінес Мохіка (Francisco Juan Martínez Mоjica) знайшов по- дібні ділянки в інших видів бактерій та архей і в 2000 р. запропонував об’єднати їх у роди- ну під назвою SRSRs (Short Regularly Spaced Repeats — короткі регулярно розташовані по- втори) [8], яку через два роки перейменували на CRISPR. Тоді ж, у 2002 р., група вчених з Нідерландів на чолі з Рууд Янсеном (Ruud Jansen) відкрили гени протеїнів Cas, розташо- вані поруч з ділянкою CRISPR [9]. А в 2005 р. відразу три дослідницькі групи незалежно одна від одної з’ясували, що між повторами CRISPR часто знаходяться послідовності, ідентичні послідовностям ДНК вірусів-бак- теріофагів і плазмід [10–12]. Ці результати та припущення про виконання CRISPR функції противірусного захисту не викликали тоді осо- бливого інтересу. Усе змінила наукова стаття, яка вийшла в журналі Science в 2007 р. [13]. Її авторами була група вчених на чолі з Філіпом Хорва- том (Philippe Horvath) з компанії Danisco (США) — виробника відомих йогуртів Danone (у 2011 р. Danisco придбала компанія DuPont за $6,3 млрд). Справа в тому, що при вироб- ництві кисломолочних продуктів є небезпека зараження молочнокислих бактерій віруса- ми-бактеріофагами, що може призвести до величезних збитків. Тому в компанії Danisco ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 53 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ вирішили відібрати для виробництва клони молочнокислих бактерій, стійких до вірусу. А оскільки компанія використовувала CRISPR для класифікації своїх комерційних штамів, учені одразу помітили, що в ділянках CRISPR відібраних клонів з’являлися нові спейсери, які були тотожні ділянкам вірусного геному. Дослідники штучно вставили спейсер з послі- довністю ДНК вірусу в ділянку CRISPR бак- терії, що одразу ж зробило її стійкою до вірусу. У 2007–2008 рр. було відкрито важливі де- талі механізму роботи CRISPR. Група під ке- рівництвом Джона ван дер Ооста (John van der Oost), наприклад, показала, що захист CRISPR реалізується через малі РНК [14]. Лучіано Марраффіні (Luciano A. Marraffini) та Ерік Сонтгеймер (Erik J. Sontheimer) з Північ- но-Західного університету в Еванстоні (штат Іллінойс, США) довели, що система CRISPR спрямована на розрізання ДНК [15]. Вони першими висловили думку про можливість використання CRISPR для редагування гено- му в гетерологічних системах і навіть подали заявку на патент, але через недостатність екс- периментального підтвердження врешті-решт відмовилися від нього [16]. Згодом стало відомо, що для виконан- ня захисної функції CRISPR необхідна вза- ємодія з багатьма протеїнами Cas, одні з яких зв’язуються з малими РНК, інші — розпізна- ють ДНК вірусу, а треті — розрізають її. Од- нак французька дослідниця Еммануель Шар- пентьє (Emmanuelle Charpentier), яка працює зараз переважно в Німеччині та Швеції, ви- явила різновид системи CRISPR, який для повноцінного захисту потребував лише одно- го дуже великого протеїну Cas — його назвали Cas9. У 2012 р. Мартін Джінек (Martin Jinek) з групи Дженніфер Дудни (Jennifer Doudna) з Каліфорнійського університету в Берклі (University of California, Berkeley) об’єднав tracrРНК і crРНК в одну єдину молекулу ѕgРНК (single-guide RNA — єдина РНК-гід) і створив вектор для клонування цієї РНК. Ви- явилося, що така синтетична ѕgРНК коректно працює в клітині у комплексі з протеїном Cas9. Тоді ж наукові групи Е. Шарпентьє і Дж. Дуд- ни опублікували статтю в Science [17], в якій запропонували спосіб використання системи CRISPR/Cas9 для розрізання обраних дослід- ником ДНК-«мішеней» у клітині та продемон- стрували можливість такого підходу в експе- риментах in vitro. Майже одночасно з ними по- дібну статтю опублікувала група литовського біохіміка Віргініюса Шикшніса (Virginijus Sik- snys) з Інституту біотехнології Вільнюського університету [18]. Цікаво, що роботу Шикшні- са було виконано раніше, але її публікація за- трималася на пів року через безпідставне від- хилення в журналом Cell. На початку 2013 р. групи Джорджа Черча (George Church) [19] і його колишнього ас- піранта Фена Чжана (Feng Zhang) [20] з Ін- ституту Броуд (Broad Institute of MIT and Harvard) у Кембриджі показали, що штучна crРНК і протеїн Cas9 повноцінно функціону- ють у клітинах вищих організмів. Практично водночас ефективність такого підходу підтвер- дили вчені з Південної Кореї в експериментах з культурою клітин людини [21]. Одразу піс- ля цього всі забули про проблеми бактерій в їх непростій боротьбі з вірусами. Здавалося, що наукові та громадські видання «вибухну- ли» публікаціями виключно на одну тему: про CRISPR/Cas9 як фантастичний інструмент для редагування геномів вищих організмів. Чому ж відкриття технології CRISPR/Cas9 спричинило такий ажіотаж? Річ у тім, що ця технологія виявилася набагато кращою за по- передні методи генної інженерії. Раніше при створенні ГМО вчені не мали можливості контролювати, куди саме в геномі та в якій кількості вбудується вірусний вектор з ге- ном-вставкою. Щоб отримати необхідний ре- зультат, потрібно було провести дуже копітку і тривалу роботу, відкидаючи значну кількість невдалих варіантів. Технологія CRISPR/Cas9 запропонувала простий спосіб вбудовувати ген-вставку в певну послідовність ДНК. Крім того, ця технологія дає можливість працюва- ти в клітинах усіх організмів — від бактерій до ссавців. Систему CRISPR/Cas9 можна вико- ристовувати не лише в пробірці, як рестрикта- зи, а й безпосередньо в живій клітині. Можна 54 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ одночасно редагувати необмежену кількості генів у геномі, а також вводити компоненти системи не тільки в окремі клітини, а й у цілі тканини чи весь організм. Беззаперечні пере- ваги CRISPR/Cas9 значно скорочують трива- лість генно-інженерних робіт і дозволяють уже зараз розглядати реальну можливість застосу- вання цієї системи для модифікації ембріонів людини, лікування раку чи спадкових захво- рювань. Звичайно, є й інші інструменти для реда- гування геному, а саме: мегануклеази, TALEN і нуклеази з «цинковими пальцями» (ZFN — Zinc-Finger Nucleases). Мегануклеази — це природні ДНК-нуклеази, які є у фагів, бакте- рій, грибів, водоростей і деяких рослин. Вони кодуються мобільними генетичними елемен- тами та розпізнають великі ділянки ДНК (12– 40 пар основ), завдяки чому їх вважають най- більш специфічними природними рестрикта- зами. З моменту відкриття в 1990-х роках най- відомішими стали мегануклеази I-SceI, I-CreI і I-DmoI родини LAGLIDADG (назва походить від характерної для цих протеїнів послідов- ності). Ці невеликі протеїни трапляються в мітохондріях та хлоропластах еукаріотичних одноклітинних організмів і відомі своїми тісно упакованими тривимірними структурами. Од- нак широкого застосування в генній інженерії мегануклеази не отримали, оскільки досить складно підібрати серед них ензим, який роз- різав би ДНК у потрібному місці. Зараз вчені намагаються створити більш досконалі генно- інженерні мегануклеази та їх гібриди з іншими протеїнами [22]. Системи редагування геному TALEN і ZFN — це генно-інженерні протеїни, які містять домен ДНК-нуклеази, що розще- плює ДНК, і домени інших протеїнів, що після модифікації набувають здатності зв’язуватися з певною послідовністю ДНК. До складу про- теїнів TALEN входить домен протеїну TALE (Transcription Activator-Like Effector — ефек- тор, подібний до активатора транскрипції) фітопатогенної бактерії Xanthomonas, а проте- їни ZFN містять домен еукаріотичного факто- ра транскрипції, в структурі якого є від 3 до 6 структур так званих «цинкових пальців». Проте застосування систем TALEN і ZFN для редагування геному вимагає створення окремого штучного протеїну для кожної нової ДНК-«мішені». На відміну від них, система CRISPR використовує універсальний протеїн Cas9, а змінювати необхідно лише ѕgРНК. Це набагато простіше і дешевше, оскільки будь- які РНК можна легко синтезувати. Ще одні- єю перевагою системи CRISPR/Cas9 перед іншими інструментами редагування геному є можливість застосування її до РНК, що надає більш гнучкі можливості для впливу на біохі- мічні процеси в клітині. Для редагування од- ноланцюгової РНК необхідно додати crРНК, протеїн Cas9 і ДНК-олігонуклеотид, що міс- тить послідовність PAM, — PAMmer [23]. Так, у 2016 р. було запропоновано за допомогою системи CRISPR/Cas9 відстежувати частку певних РНК у живій клітині без застосування генетичних міток — тегів [24]. Біотехнологічні фірми вже давно продають вектори для зручної доставки в клітину ком- понентів системи CRISPR/Cas9 з метою реда- гування геному. Компанія відкритого обміну Addgene (Кембридж, США) восени 2018 р. зробила великий крок, безкоштовно передав- ши понад 1 млн плазмід ученим усього світу, а нещодавно в неї з’явилася нова послуга — по- ширення вірусних векторів, передусім ленти- вірусів та адено-асоційованого вірусу (AAV) [25]. Вектори для CRISPR/Cas9 являють со- бою кільцеву молекулу ДНК, яка кодує ѕgРНК і матричну РНК протеїну Cas9. Отже, дослід- ник може розрізати будь-яку послідовність ДНК у клітині, включивши в ѕgРНК відповід- ний комплементарний фрагмент. Звичайно, необхідно вибрати таку послідовність, яка не повторюється в інших ділянках геному. Далі вектор розмножують у клітинах спеціально- го лабораторного штаму кишкової палички (де він не зчитується через невідповідність командних сигналів), виділяють з бактерій і трансформують ним клітини, геном яких хо- чуть змінити. Вчені всього світу кинулися використову- вати технологію CRISPR/Cas9 для редагуван- ня геномів вірусів, бактерій, тварин і рослин. ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 55 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ Застосування цієї технології до бактерій до- зволило зі змішаної культури виділяти окре- мі види і штами. Успішно було модифіковано дріжджі, плодових мушок, рибок даніо, шов- копрядів, жаб. Ін’єкції матричної РНК Cas9 і ѕgРНК у клітини зародка дозволили швидко отримати генно-модифікованих мишей, щурів, свиней, тхорів, коропів і навіть слонів. Отже, відкрилися практично безмежні перспективи створення ГМО для боротьби з хворобами, поліпшення порід сільськогосподарських тва- рин і сортів рослин, створення моделей для вивчення генетичних захворювань людини та тварин, тестування нових методів лікування і навіть створення домашніх улюбленців. У багатьох країнах, зокрема у США, орга- нізми, модифіковані за допомогою CRISPR, не відносять до ГМО, оскільки вони не міс- тять чужорідної ДНК, а тому можна відносно легко отримати дозвіл на вирощування моди- фікованих CRISPR-рослин і виготовлення з них продуктів харчування. Першими в квітні 2016 р. такий дозвіл від Міністерства сіль- ського господарства США отримали печериці садові (Agaricus bisporus), яких за допомогою CRISPR позбавили здатності темнішати за ме- ханічних ушкоджень і втрачати товарний ви- гляд. Модифіковані гриби одержав американ- ський вчений Їнонг Янг (Yinong Yang) з Уні- верситету штату Пенсильванія. Відтоді дозвіл на вирощування було надано ще для 5 організ- мів, модифікованих CRISPR, зокрема рижію посівного (Camelina sativa) — олійної культу- ри, що містить більше омега-3 жирних кислот, а також сорту сої, стійкого до посухи. Невдовзі планується вихід цих продуктів на ринок [26]. Технологія редагування генів здатна підви- щити ефективність сільського господарства та допомогти прогодувати зростаюче населення планети, зменшивши при цьому негативний вплив людини на навколишнє середовище. Дослідники планують вирощувати курей, що не викликають алергії у людини, відновити чи- сельність медоносних бджіл, які потерпають у всьому світі від хвороб і паразитів. Також про- понують застосувати CRISPR для контролю статі сільськогосподарських тварин: велика рогата худоба має народжувати тільки бичків, що дають більше м’яса; включення гена зеле- ного флуоресцентного протеїну (GFP) у стате- ві хромосоми курей дозволить відбраковувати за світінням в ультрафіолеті яйця, з яких вилу- пляться півники, і використовувати їх у вироб- ництві вакцин. Однак оскільки при редагуван- ні геному CRISPR може змінювати нецільові гени, висловлюється припущення, що це може вплинути на здоров’я тварин, на склад м’яса та молока. Тому поки що споживачі вимагають обережності у застосуванні нових технологій для тварин, яких використовують у виробни- цтві продуктів харчування [27]. Можливість модифікації геномів екзо- тичних і маловивчених тварин спричинила «хвилю» масового створення нових модель- них організмів. Розроблення моделей тварин потребує величезних витрат часу й коштів. У 2016 р. Національний науковий фонд США запустив програму вартістю $24 млн для ство- рення нових модельних організмів. Програма підтримує дослідження геномів видів, вивчен- ня життєвих циклів організмів та розроблення протоколів для утримання цих видів у лабо- раторії. В рамках програми у березні 2019 р. за допомогою CRISPR було створено першу генетично модифіковану рептилію — коричне- вого аноліса (Anolis sagrei) [28]. Технологія CRISPR стала цінним інстру- ментом фундаментальних досліджень, який дає змогу «вимикати» певні гени та встанов- лювати їх біологічну функцію в організмі. Роз- криття генетичних і молекулярних механізмів, які зумовлюють складні ознаки та поведінку, є особливо важливим для маловивчених видів тварин. Так, за допомогою CRISPR було іден- тифіковано гени, які контролюють візерунок і колір крил метелика [29], створено модифі- кованих рейдерських мурах (Ooceraea biroi), які не мають запаху феромонів і не можуть підтримувати складну ієрархію колонії. Тех- нологія CRISPR допомогла вивчити мозкову діяльність головоногих молюсків (гавайського кальмара бобтейла Euprymna scolopes та карли- кової каракатиці Sepia bandensis) під час зміни візерунків на шкірі залежно від зовнішнього 56 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ середовища. Раніше подібні дослідження не проводилися через відсутність у молюсків кіс- ток і неможливість закріплення електродів на голові тварини [28]. Інактивувати ген без його пошкодження можна за допомогою CRISPR-інтерференції (CRISPRi). При цьому мутантний протеїн dCas9, у якого не функціонують обидва нукле- азних центри, зв’язується з ДНК-«мішенню» і заважає просуванню РНК-полімерази, що при- зводить до зупинення транскрипції [30]. Якщо до протеїну dCas9 «прив’язати» домен фактора транскрипції, який збільшує або пригнічує ак- тивність генів, то можна безпосередньо впли- вати на функціонування генів і роботу всього організму. Регулювати активність експресії генів можна також, впливаючи на епігеномні процеси (наприклад, на метилювання ДНК чи ацетилювання гістонів). Для цього можна ви- користати штучні протеїни, що складаються з dCas9 та каталітичного домену відповідного ензиму (ДНК-метилтрансферази чи ацетил- трансферази гістонів) [31]. «Мішенню» сис- теми CRISPR/Cas9 можуть бути також дов- гі некодуючі РНК (lncRNA) або енхансерні РНК (eRNA), які регулюють експресію генів і епігенетичні процеси [32]. Це дуже важливо для дослідження функцій регуляторних РНК і встановлення їх ролі в патогенезі захворювань, оскільки понад 90 % захворювань, пов’язаних з одиничною нуклеотидною заміною, містять цю заміну в некодуючих ділянках ДНК [33]. За допомогою CRISPR/Cas9 можна достав- ляти до мутантних генів протеїни, здатні за- мінити дефектний ген на його здорову копію з іншої хромосоми, що може стати основою нових методів лікування деяких захворювань, наприклад діабету. А приєднавши до протеїну dCas9 флуоресцентний протеїн GFP, можна позначити певну ділянку в хромосомі живої клітини і спостерігати за нею під мікроско- пом протягом клітинного циклу або візуально визначати довжину теломер [34]. У 2019 р. у Каліфорнійському університеті в Берклі було створено біосенсор CRISPR-Chip на основі ультрачутливого графену та системи CRISPR/ Cas9, який дозволяє протягом 15 хв виявляти певні послідовності ДНК без її ампліфікації з чутливістю 1,7 fM (1,7·10–15 Моль) [35]. Ні- мецькі вчені з Університету Фрайбурга роз- робили електрохімічний мікрофлюїдний біо- сенсор, який виявляє до восьми мікроРНК в одному зразку за допомогою CRISPR/Cas13a. Цей біосенсор має універсальний чип і легко налаштовується на виявлення будь-якої мі- кроРНК. Він може бути використаний для ранньої діагностики захворювань людини, оскільки кластери з 5–6 мікроРНК, як прави- ло, є хорошим біомаркером, зокрема при хво- робі Альцгеймера або різних типах раку. Поді- бні біосенсори, що використовують різні типи ензиму Cas, можуть спрямовуватися на вияв- лення специфічних послідовностей в одно- або дволанцюговій ДНК і РНК збудників інфек- ційних захворювань. Така система, наприклад, здатна визначати кількість РНК коронавірусу, його тип (SARS або Covid19) і навіть диферен- ціювати поодинокі невідповідності нуклеїно- вої кислоти [36]. Отже, як бачимо, можливості системи CRISPR/Cas9 не обмежуються лише розрізанням певних послідовностей ДНК. Ця система є універсальним механізмом доставки будь-яких молекул у будь-яку «точку» геному, що відкриває фантастичні можливості для ме- дицини та фундаментальної науки. Ученим, що зробили найбільший внесок у відкриття технології CRISPR/Cas9, щороку пророкують Нобелівську премію, а в її очіку- ванні — відзначають іншими численними на- городами. Найбільшу кількість відзнак зібрала Дж. Дудна (29 за останні 6 років), серед яких: премія Мілдред Кон з біологічної хімії від Американського товариства біохіміків і моле- кулярних біологів (2013), премія Лур’є в галу- зі біомедичних наук від Фонду Національного інституту здоров’я, премія «Прорив» у галузі наук про життя, премія доктора Поля Янссе- на з біомедичних досліджень, премія Якоба Хескеля Габбая (2014), нагорода принцеси Астурійської, премія Грубера в галузі генети- ки (2015), премія фонду Уоррена Альперта, премія Пауля Ерліха та Людвіга Дармстедте- ра, премія Л’Ореаль–ЮНЕСКО для жінок у науці, премія доктора Г.П. Хайнекена з біохі- ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 57 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ мії та біофізики від Нідерландської королів- ської академії мистецтв і наук, Міжнародна премія канадського фонду Gairdner, премія Тан Тайванської академії Sinica (2016), премія Японії, медаль Ф. Альберта Коттона за доско- налі хімічні дослідження (2017), премія Кав- лі з нанонауки, Круніанська медаль і лекція від Лондонського королівського товариства, премія Перла Майстра Грінгарда від Універ- ситету Рокфеллера, медаль пошани від Аме- риканського товариства раку (2018), премія Ніренберга (2019), премія Вольфа з медицини (2020) та ін. Дженніфер Дудна та Еммануель Шарпентьє в 2015 р. увійшли до сотні най- впливовіших людей світу за версією журналу Time, в 2016 р. Дж. Дудна стала іноземним чле- ном престижного Лондонського королівського товариства, а в 2018 р. увійшла до американ- ського списку 50 найвидатніших жінок у галу- зі техніки за версією журналу Forbes [37]. У січні 2014 р. за допомогою системи CRISPR/Cas9 китайські вчені модифікували геном макак. Від однієї матері народилися дві мавпочки, яким успішно ввели мутації в ген Ppar-γ, відповідальний за відкладення жиру, а також у ген Rag1, пов’язаний з роботою імун- ної системи, а саме з процесом утворення різ- номаніття антитіл [38]. Після успіху з мавпами всі зрозуміли, що настала черга людини. І дійсно, дуже заманливо, виправивши всьо- го одну нуклеотидну основу в ДНК, звільнити людину від важкої спадкової хвороби, напри- клад гемофілії. Послідовність ДНК довжиною в 20 нуклеотидів, яка є «мішенню» для системи CRISPR/Cas9, як правило, не повторюється в геномі людини. Після розрізання протеїном Cas9 ДНК відновлюється завдяки репарації за зразком правильної копії гена з парної хро- мосоми. Якщо парної хромосоми немає (на- приклад, при гемофілії помилка знаходиться в Х-хромосомі, яка у чоловіків лише одна), то можна ввести в клітину разом з crРНК і про- теїном Cas9 фрагмент з правильною послідов- ністю ДНК потрібного гена. Крім того, за допо- могою CRISPR/Cas9 можна вимикати окремі гени та ідентифікувати ті, що відповідають за виживання клітин при раку [39]. А виявивши в окремих клітинах організму мутації, які ве- дуть до розвитку раку, можна за допомогою CRISPR/Cas9 усувати їх [40]. Для швидкого редагування будь-яких генів людини створено величезну бібліотеку, що містить 73 000 різних ѕgРНК і охоплює 80–90 % всіх послідовностей геному [41]. Однак невідомо, як відреагує організм люди- ни на втручання в геном. Тому можливість реда- гування генів людини одразу поставила низку етичних проблем, особливо гострих у разі реда- гування генів ембріона людини. Чи мають пра- во вчені або батьки майбутньої дитини прийма- ти рішення про зміну генів ембріона, про зміну сутності людини, яка має народитися? Адже у цієї людини ніхто не питає згоди, оскільки вона ще не існує. Де гарантія, що прий няті зараз рі- шення згодом виявляться такими розумними, якими вони видаються зараз? Чи готові вчені взяти на себе відповідальність за непередбаче- ні наслідки таких експериментів? І що взагалі стане з людиною, якщо вона почне змінювати свої гени як заманеться? Ці питання зараз є предметом палких дискусій, і поки що вони не мають однозначних відповідей. Однак через надзвичайно спокусливі пер- спективи редагування геному людини за до- помогою CRISPR/Cas9 виникли побоювання, що його можуть розпочати раніше, ніж переко- наються в безпеці. Тому 24 січня 2015 р. Джен- ніфер Дудна зібрала в долині Напа в Каліфор- нії 18 авторитетних генетиків для обговорення цієї проблеми. В конференції взяв участь нобе- лівський лауреат Пол Берг (Paul N. Berg), який організував у 1975 р. на території Державного парку-пляжу Асиломар у місті Пасифік Гроув у Каліфорнії знамениту Асиломарську конфе- ренцію, на якій було прийнято правила роботи в генній інженерії та запроваджено мораторій на використання технологій рекомбінантних ДНК. Після цього мораторії вводили ще двічі: у 1997 р. — на репродуктивне клонування лю- дини і в 2012 р. — на роботи з мутагенезу ві- русу пташиного грипу. Підсумки конференції у долині Напа опубліковано 3 квітня 2015 р. в журналі Science у вигляді меморандуму, який закликає заборонити клінічні експерименти 58 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ з генетичної модифікації людини доти, доки не будуть зрозумілі наслідки і введені прави- ла [42]. Коментуючи висновки конференції в Напі, Джордж Черч влучно зауважив, що на ній скромно замовчувалося головне питання: «Який же сценарій нас хвилює насправді: що методики редагування геному будуть працю- вати не досить добре або ж що вони, навпаки, будуть працювати дуже добре?» [43]. Редагування геному людини відкрило теоре- тичну можливість не лише лікувати генетичні захворювання, а й створювати людей з бажа- ними ознаками. Одразу воскресли забуті після Другої світової війни ідеї створення «надлю- дини» та ідеї євгеніки — вчення про поліпшен- ня людської породи, яке було запропоноване Френсісом Гальтоном (Francis Galton), дво- юрідним братом Чарльза Дарвіна. А й справді, чому б не створити більш досконалих людей: розумніших, красивіших, сильніших? Хоча при цьому неодмінно з’являються й ідеї ство- рення людей з певним призначенням, напри- клад ідеальних солдатів: сильних, витривалих, без відчуття болю і страху. Страшно подумати, які можуть бути наслідки таких фантастич- них можливостей науки. Тому, звичайно, люди ставляться до успіхів генетики з пересторогою. На жаль, а може і на щастя, ми не маємо до- статньо знань щодо генетики складних люд- ських ознак. Можливо, генетика взагалі не відіграє вирішальної ролі у формуванні таких ознак. Однак багато хто вбачає в технології CRISPR/Cas9 перший крок до створення но- вої раси людей — генних мутантів, передрікає появу зомбі, змішання видів і всезагальний генний апокаліпсис. У звіті з оцінки світових загроз для США від 9 лютого 2016 р. директор національної розвід- ки Джеймс Р. Клаппер (James R. Clapper) на- звав редагування геному потенційною зброєю масового знищення, оскільки біологічні агенти або продукти, створені в країнах з норматив- ними або етичними стандартами, «відмінними від західних», можуть виявитися шкідливими. В документі стверджується, що поширення, низька вартість та прискорені темпи розвитку технології CRISPR/Cas9, навмисне або нена- вмисне зловживання нею можуть призвести до далекосяжних наслідків для економічної та національної безпеки США [44]. Водночас простота технології CRISPR/Cas9 і доступність у США реактивів для її реаліза- ції дали можливість біохакерам втручатися в геном живих організмів у домашніх умовах, не маючи особливих навичок і обладнання. Так, колишній вчений NASA Джозая Зайнер (Josiah Zayner), який має кандидатський ступінь з біо- хімії Чиказького університету, заявив, що він є першою людиною, яка намагалася модифіку- вати свій власний геном за допомогою іннова- ційної технології редагування генів CRISPR. За словами Зайнера, він почав експериментувати з CRISPR у своєму гаражі влітку 2016 р., вво- дячи собі ген GFP, який спричиняє світіння ме- дуз. Сам він світитися не почав, але біопсія по- казала, що новий ген присутній у його клітинах. Компанія Зайнера The Odin займається прода- жем комплектів «Зміни свої гени сам» вартістю у $20, однак FDA заборонило поширення цього продукту, назвавши його шахрайським. Тепер біохакер пропонує клієнтам купувати інстру- менти для генного редагування рослин і тварин. Таких випадків досить багато: підлітки, сту- денти, генетики-аматори намагалися застосу- вати технологію CRISPR для того, щоб збіль- шити власні м’язи, позбавитися герпесу або вилікувати СНІД, однак ці спроби були без- успішними. Неконтрольоване поширення тех- нології CRISPR становить неабияку небезпеку через можливість створення біологічної зброї та загрозу біотероризму. Дослідники з Універ- ситету Альберти в Едмонтоні (Канада) відтво- рили з нуля вимерлий вірус чорної віспи. Вони придбали у комерційної компанії фрагменти ДНК, що перекриваються, зшили їх разом і ввели в клітини, заражені іншим типом поксві- русу. Робота тривала пів року і коштувала при- близно $100 тис. Цей експеримент звів нані- вець десятиліття дебатів щодо того, чи знищу- вати два зразки чорної віспи у світі: в Центрі контролю та профілактики хвороб в Атланті (США) та в Державному науковому центрі ві- русології та біотехнології «Вектор» у Кольцові під Новосибірськом (РФ), адже він довів, що ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 59 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ вчені, які хочуть експериментувати з вірусом віспи, можуть створити його самостійно. По- дібні роботи повинні проводитися під суво- рим контролем з боку держави, але це складно зробити, оскільки значна частина наукових досліджень здійснюється за гроші комерцій- них організацій, а фінансування легко можна залучити через вебсайти краудфандингу. Кло- новані фрагменти ДНК можна замовити через спеціальні інтернет-сайти (наприклад, Science Exchange), однак невдовзі і в цьому не буде по- треби, оскільки на столі у кожного біохакера буде стояти принтер для синтезу ДНК BioXp 3200, який продається приблизно за $65 тис. і нагадує струменевий принтер, у якому замість кольорової палітри CMYK використовують букви генетичного коду — AGTC. А свої до- машні експерименти біохікери можуть по- чати з ДНК-платформи від Amino Labs, гене- тичної духовки Easy Bake, яка коштує менше, ніж iPad, або з набору для редагування генів CRISPR від The Odin за $159 [45]. Незважаючи на заклики про заборону екс- периментів із генетичної модифікації люди- ни, 14 квітня 2015 р. в журналі Protein&Cell з’явилася стаття групи китайських генетиків під керівництвом Цзюньцзю Хуана (Junjiu Huang) з Університету Сунь Ятсена в Гуанч- жоу, в якій описувався експеримент з вико- ристання системи CRISPR/Cas9 для редагу- вання геному людського ембріона [46]. Метою роботи було виправлення мутації в одному з генів гемоглобіну, яка призводить до хвороби крові — бета-таласемії. Це була перша в істо- рії спроба генетично модифікувати людину. Журнали Science і Nature відмовилися від пу- блікації цієї статті з етичних міркувань, хоча в експерименті було використано людські яйце- клітини, штучно запліднені двома сперматозо- їдами для того, щоб експериментальні зародки були завідомо нежиттєздатними та загинули через певну кількість поділів. Експеримент тривав 48 годин, його перервали на стадії вось- миклітинних ембріонів. У результаті з 86 запліднених яйцеклітин мутацію вдалося виправити лише в 4 ембріо- нах (приблизно 5 %). Можливо, такий низь- кий відсоток успішних генних модифікацій по в’я заний з триплоїдністю клітин. Однак була ще одна неприємна новина: в усіх кліти- нах ембріонів з’явилася значна кількість нових мутацій в інших генах унаслідок неспецифіч- ної взаємодії crРНК з іншими подібними по- слідовностями ДНК, а також через помилки ензимів репарації. Такі результати викликали небезпідставні побоювання, що систему CRISPR/Cas9 взага- лі ніколи не можна буде використовувати для експериментів на людині. Чи можна якось по- ліпшити її точність? Адже при створенні ГМО або навіть стовбурових клітин людини з вели- кої кількості невдалих варіантів можна обрати найбільш придатний, а ембріон людини є уні- кальним, і в цьому разі необхідно використо- вувати максимально точний і абсолютно без- печний інструмент. Для підвищення точності системи CRISPR/ Cas9 пропонували різні ідеї. Наприклад, було отримано Cas9-ніказу — модифікований про- теїн Cas9, у якого працює тільки один нуклеаз- ний центр, і тому він робить лише одноланцю- гові розриви ДНК. Використовуючи дві такі нікази з різними ѕgРНК, можна значно підви- щити точність розрізання ДНК у потрібному місці [47]. Інша ідея полягала у використанні crРНК з вкороченою спейсерною частиною. Ймовірно, що з ДНК-«мішенню» спочатку зв’язується лише невелика ділянка спейсера, для якої комплементарність строго дотриму- ється, а лише потім — інша частина спейсера, для якої можливі відхилення до 3–5 пар ну- клеотидів. Завдяки такій неточності бактерія може розпізнавати і знешкоджувати мутовані фаги [48]. Одним з напрямів роботи з вдоско- налення CRISPR/Cas9 стала зміна специфіч- ності протеїнів Cas9 різних видів бактерій від- носно послідовностей PAM [49]. Ще один під- хід, який дозволив підвищити специфічність системи CRISPR/Cas9 у 140 разів, полягав у використанні замість Cas9 гібридного проте- їну fCas9, який складається з інактивованого мутантного протеїну dCas9 і каталітичного до- мена неспецифічної ДНК-нуклеази FokI бак- терії Flavobacterium okeanokoites [50]. 60 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ У 2016 р. пролунало кілька гучних заяв про досягнення мети — зниження кількості поми- лок системи CRISPR/Cas9 практично до нуля. Одні дослідники отримали протеїн eSpCas9 заміною трьох позитивно заряджених аміно- кислотних залишків на нейтральні в ділянці протеїну Cas9 бактерії Streptococcus pyogenes, яка взаємодіє завдяки своїй позитивно за- рядженій борозенці з негативно зарядженою ДНК. Ослаблення сили взаємодії протеїну Cas9 з ДНК призвело до зменшення кількості неспецифічних взаємодій [51]. Інші дослідни- ки отримали високоточний ензим SpCas9-HF1 і протестували його з вісьмома різними crРНК. Він зробив лише одну помилку, тоді як вихід- ний ензим Cas9 зробив сім помилок [52]. Вчені з Пітсбургського університету (штат Пенсиль- ванія, США) розробили підходи до умовної активації функції протеїну Cas9 за допомогою малих молекул і світла. Ці методи привели до підвищення специфічності системи CRISPR/ Cas9 і дозволили активувати її в певному місці і на певний проміжок часу [53]. У серпні 2017 р. було опубліковано обна- дійливі результати досліджень, проведених ве- ликим колективом вчених (31 дослідник з 10 наукових установ США, Китаю та Південної Кореї, половина — з Центру ембріональної клі- тини та генної інженерії Університету здоров’я та науки Орегону у Портленді, США) під ке- рівництвом Шухрата Міталіпова (Shoukhrat Mitalipov) — уйгура за національністю родом з Казахстану, відомого своїми успішними екс- периментами з клонування приматів і люди- ни, а також заміни мітохондріального геному в клітинах їх ембріонів [54–57]. Дослідники винайшли спосіб цілеспрямованої корекції мутацій генів у ембріонах людини за допомо- гою CRISPR/Cas9 і продемонстрували його ефективність на прикладі редагування гете- розиготної мутації MYBPC3, що викликає гі- пертрофічну кардіоміопатію — спадкове захво- рювання серця, яке неминуче призводить до смерті людини. Введення компонентів систе- ми CRISPR/Cas9 в ооцит разом зі сперматозо- їдом, що несе мутацію MYBPC3, під час мета- фази II клітинного циклу дозволило уникнути утворення мозаїчних ембріонів, частина клі- тин яких має мутації в генах. Крім того, такий підхід дав змогу збільшити до 72,4 % вихід емб- ріонів, що несуть ген MYBPC3 дикого типу без ознак будь-яких мутацій, завдяки вчасній де- градації компонентів системи CRISPR/Cas9, а також завдяки зростанню частоти репарації дволанцюгових розривів ДНК за механізмом гомологічно спрямованої репарації (HDR), яка відновлює ДНК точно за зразком гомоло- гічного гена матері дикого типу, на відміну від механізму негомологічного з’єднання кінців (NHEJ), який вносить помилки в послідов- ність ДНК у місці розриву і зазвичай є менш ефективним [58]. У листопаді 2018 р. китайський дослідник Хе Цзянькуй (He Jiankui) з Південного уні- верситету науки і техніки у Шеньчжені неспо- дівано заявив, що він створив перших у світі генетично відредагованих дітей — дівчат-близ- нюків Лулу і Нану, які не здатні заразитися вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) через модифікацію гена CCR5. У 2019 р. народилася ще одна модифікована дитина в рамках цього проєкту. Ці заяви спровокували скандал і по- ліцейське розслідування в Китаї та обурення світової наукової громадськості. Вченого зви- нуватили у підробці документів з етичного на- гляду, порушенні низки китайських законів, в тому, що він задля особистої слави на само- тужки зібрані кошти організував проєктну групу з іноземців і залучив 8 пар добровольців (з ВІЛ-позитивним батьком і ВІЛ-негативною матір’ю) для проведення сумнівних експери- ментів. Звинувачення вчених ґрунтуються на відсутності медичної доцільності такої мо- дифікації, адже діти були здорові, а для пере- вірки успішності експерименту їх тепер треба заразити ВІЛ [59]. На закритому для громад- ськості суді Хе Цзянькуя було засуджено до трьох років ув’язнення та оштрафовано на 3 млн юанів ($430 тис) за проведення «неза- конної медичної практики», його колеги Чжан Ренлі (Zhang Renli) та Цінь Цзіньчжоу (Qin Jinzhou) отримали відповідно 24 та 18 міся- ців ув’язнення умовно. Всі троє визнали свою провину, їм довічно заборонили брати участь у ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 61 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ дослідженнях, пов’язаних з репродуктивною медициною [60]. Однак справа Хе Цзянькуя продовжує жити. В червні 2019 р. російський дослідник Денис Ребриков з Російського національного дослід- ного медичного університету ім. М.І. Пирогова заявив, що також планує створити немовлят з редагованим геном, що запобігатиме заражен- ню дітей ВІЛ від інфікованих матерів. Пізніше він змінив свої наміри, обравши «мішенню» ген GJB2, пов’язаний зі спадковою втратою слуху. В серпні 2019 р. репродуктивний біолог з Нью-Йорка Джанпієро Палермо (Gianpiero D. Palermo) оприлюднив свої плани щодо ви- користання технології CRISPR для редагу- вання в клітинах людської сперми гена, який збільшує ризик виникнення раку. Невідомо, наскільки ці плани є близькими до втілення, однак такі заяви є попередженням про те, що найближчим часом знайдуться й інші люди, які намагатимуться ввести в геном людини зміни, здатні успадковуватися майбутніми по- коліннями [61, 62]. Вчені, які готові створювати дітей з редаго- ваними генами, мріють покращити світ, позба- вити людство від небезпечних захворювань. Однак внесені мутації, захищаючи від однієї небезпеки, можуть наражати організм на інші. Так, з’ясувалося, що мутації гена CCR5, який кодує рецептор для ВІЛ, скорочують життя людей у середньому на 1,9 року. Причиною цього є багатофункціональність більшості ге- нів, яка в разі мутації гена призводить до зміни цілого комплексу ознак, не завжди бажаних і корисних. Є припущення, що мутація гена CCR5 виникла на півночі Європи для захисту від бубонної чуми (вона майже не трапляється в Азії, а у Великій Британії її мають 10 % насе- лення). Яку б перевагу не отримував організм з мутованим CCR5 раніше, це не означає, що мутація є корисною сьогодні. Дані інших до- слідників свідчать, що люди з мутантною вер- сією CCR5 мають більшу ймовірність смерті від грипу [63]. На зібранні провідних учених з семи країн світу з проблем CRISPR, яке відбулося у бе- резні 2019 р. під керівництвом американсько- го математика і генетика Еріка Лендера (Eric Lander), відомого як один з керівників проєкту «Геном людини», було вирішено закликати до п’ятирічного міжнародного мораторію на ви- користання редагування генів у клітинах люд- ської зародкової лінії з терапевтичною метою. В серпні 2019 р. низка дослідницьких груп, що працювали в цій галузі, заявили про під- тримку ідеї мораторію, а група міжнародних дослідницьких товариств розпочала роботу зі складання рекомендацій щодо відповідних до- сліджень, яку планується завершити навесні 2020 р. Проте новий експертний консульта- тивний комітет ВООЗ на своєму засіданні в серпні 2019 р. оминув питання про мораторій, але створив глобальний реєстр для відстежен- ня всіх видів досліджень з редагування генів людини та запропонував консультації щодо керування такими технологіями [62]. Впровадження будь-яких технологічних ін- новацій, в тому числі генетичної терапії, вима- гає широкого колективного обговорення щодо припустимості його використання, передба- чуваних наслідків та регулювання. Понад 40 країн прийняли законодавство, що забороняє репродуктивне використання генетичних мо- дифікацій людини. Це таке саме глобальне пи- тання, як і зміна клімату та багато інших про- блем, що потребують узгоджених дій різних держав та зміцнення як міжнародного права, так і можливостей глобального керування [64]. Серйозною проблемою залишається від- сутність узгодженого законодавства, яке б регулювало питання генної модифікації орга- нізмів. У багатьох країнах генетичні роботи з ембріонами людини заборонені або не заохо- чуються. В США заборонено давати державні гранти на такі роботи, але ними можна займа- тися приватним компаніям. Перспективними напрямами застосування технології CRISPR/Cas9 є редагування ге- ному бактерій або дріжджів з метою синтезу абсолютно нових речовин, а також створення тваринних моделей захворювань людини, які дають можливість вивчати патогенез захво- рювань та розробляти нові підходи до їх лі- кування. Вчені намагаються застосувати тех- 62 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ нологію CRISPR/Cas9 для вирішення найак- туальніших проблем сьогодення, зокрема для боротьби з антибіотикорезистентністю мікро- організмів, знешкодження комах-шкідників і переносників інфекцій (наприклад, малярій- них комарів), вирішення проблеми нестачі до- норських органів для трансплантації, захисту від небезпечних вірусів (у тому числі ВІЛ), лі- кування онкологічних захворювань та ін. Зростання кількості штамів бактерій, стій- ких до антибіотиків, загрожує прогресу меди- цини, що спостерігався протягом останніх де- сятиліть. Особливо гостро ця проблема стоїть при лікуванні туберкульозу. Експерименталь- но підтверджено, що систему CRISPR/Cas9 можна успішно застосовувати для руйнування генів ензимів, які забезпечують стійкість бак- терій до дії антибіотиків [65]. Наприклад, за допомогою CRISPR/Cas9 в клітинах вірулент- ного золотистого стафілокока було зруйновано плазміди, що містять гени стійкості до антибіо- тиків, а в клітинах невірулентних стафілоко- ків створено імунітет проти таких плазмід. На моделі колонізації стафілококами шкіри миші продемонстровано підвищення ефективнос- ті дії протимікробних препаратів [66]. Навіть отримано бактеріофаги, які вибірково знешко- джують бактерії, стійкі до антибіотиків [67]. Одним з важливих завдань зараз є створення універсальних бактеріофагів, здатних інфіку- вати широкий спектр видів бактерій-хазяїв. Генно-модифіковані комахи можуть стати новою зброєю проти переносників інфекцій і шкідників сільськогосподарських культур. Так, людство давно і безуспішно бореться з малярією — небезпечним захворюванням, яке викликає одноклітинний паразит — малярій- ний плазмодій і яке передається людині від комарів. Щороку від малярії помирає 670 тис. осіб, більшість з яких діти віком до п’яти ро- ків. В 2015 р. китайській дослідниці Юю Ту (Youyou Tu) присудили Нобелівську премію за ефективний протималярійний препарат артемізинін. Однак хворобу подолати так і не вдалося через недостатній рівень розвитку системи охорони здоров’я в регіоні, де поши- рена малярія. Ентоні Джеймс (Anthony James) з Каліфорнійського університету в Ірвайні за- пропонував спосіб знешкодження малярійних комарів за допомогою CRISPR/Cas9. У геном комара вбудовують активну систему CRISPR/ Cas9, яка може вставляти себе та ген антитіла, що блокує розвиток малярійного плазмодія. В першому поколінні комарів модифікована хромосома запускає CRISPR/Cas9 і робить другу хромосому такою самою. В наступному поколінні майже всі потомки (а не половина) отримують модифіковану хромосому, і процес повторюється. Таким чином здатність виро- бляти антитіла проти плазмодія швидко по- ширюється серед популяції комарів [68]. Хоча висловлюються побоювання, що застосування методів з використанням системи CRISPR/ Cas9 на кшталт методу мутагенної ланцюгової реакції (MCR), який дає можливість генеру- вати в автокаталітичному режимі мутації, пе- ретворюючи гетерозиготний стан на гомози- готний, може мати непередбачувані наслідки, наприклад може повністю змінити види і по- рушити екологічну рівновагу [69]. Біотехнологічна компанія Oxitec (Оксфорд, Велика Британія) використовує CRISPR/ Cas9 для створення генно-модифікованих ко- мах, які після спарювання зі своїми дикими родичами спричиняють загибель частини їхніх нащадків. У жовтні 2019 р. у місті Індаятуба (Бразилія) було успішно проведено випро- бування модифікованих комарів, створених для боротьби з лихоманкою денге та іншими захворюваннями, а також проведено випро- бування модифікованих діамантових молей, які є шкідниками різних видів капусти. Вче- ні вбудували в геном комах-самців ген tTAV (транскрипційний активатор, що контролю- ється тетрацикліном), створений злиттям ге- нів тетрациклін-зв’язувального домену (tetR) бактерії Escherichia coli та активатора тран- скрипції вірусу простого герпесу (VP16). За відсутності тетрацикліну продукт гена tTAV підсилює власну експресію і призводить до загибелі комахи. Після спарювання модифіко- ваних самців з дикими самками цей ген пере- дається їхнім нащадкам, серед яких всі самки гинуть на стадії личинки, а половина самців ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 63 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ стають носіями гена. У такий спосіб популя- ція знищується за три покоління. Недоліками цього підходу є більша складність і вартість порівняно з обприскуванням інсектицидами, а також заборона використання генетично модифікованих комах на органічних фермах. Незважаючи на це, зараз триває розроблення аналогічних методів боротьби з двома метели- ками-шкідниками, стійкими до інсектицидів: соєвою совкою і кукурудзяною листовою со- вкою, які становлять велику проблему в Бра- зилії та Африці [70]. Люди давно шукають можливість викорис- товувати тварин як донорів органів для тран- сплантації. По-перше, людей, що можуть бути донорами, набагато менше, ніж тих, хто потре- бує трансплантації. Близько 22 людей на день гинуть в очікуванні трансплантації. По-друге, з етичної точки зору не дуже добре, коли лю- дина вимушена довго чекати в черзі, сподіва- ючись на смерть іншої людини. За анатомічни- ми особливостями найбільш придатними для трансплантації людині могли б бути органи свиней. Однак вчені відмовилися від цієї ідеї через наявність у клітинах свиней ендогенних ретровірусів PERV, які можуть інфікувати людину. Іншою проблемою стала наявність на клітинах свиней молекул вуглеводів, які є міт- ками для негайного знищення антитілами лю- дини. Про цю проблему ще на початку 1980-х років дізналися хірурги, пересадивши свиняче серце бабуїну; вони були шоковані, коли бабу- їн помер за лічені хвилини. Наприкінці 2015 р. китайські та американ- ські вчені під керівництвом Джорджа Черча з Гарвардського університету (Кембридж) про- демонстрували можливість видалення за до- помогою CRISPR/Cas9 з геному клітин епіте- лію нирок свині 62 копій вірусу PERV [71], а в серпні 2017 р. опублікували приголомшливі результати досліджень з клонування генно-мо- дифікованих свиней, у яких повністю інакти- вовано віруси PERV [72]. Доктор Черч засну- вав компанію eGenesis, сподіваючись продава- ти генетично змінені органи свиней. Дослідники з Університету Алабами в Бір- мінгемі (США) використали редагування ге- нів та клонування для створення свиней без специфічних вуглеводів на поверхні їхніх ор- ганів. Бабуїни, яким було пересаджено сер- ця та нирки від цих свиней, прожили більше року [73]. В 2018 р. ця група вчених замінила ген свинячого тромбомодуліну на людський з метою розширення можливостей ксенотран- сплантації аорти [74]. Можливо, поєднання кількох підходів у недалекому майбутньому дозволить широко використовувати органи свиней для пересадки людям. Система CRISPR/Cas9 може бути вико- ристана також для боротьби з небезпечними вірусними інфекціями. В експериментах на мишах показано, що система CRISPR/Cas9 здатна пригнічувати реплікацію вірусу гепа- титу В [75]. Звичайно, робилися неодноразові спроби застосувати технологію CRISPR/Cas9 для боротьби з ВІЛ. У результаті отримано по- зитивні результати: геном ВІЛ-1 успішно було видалено з ДНК латентно інфікованих люд- ських CD4+Т-клітин, причому, Т-клітини лю- дини не тільки позбавилися ВІЛ, а й виявили- ся стійкими до нового зараження цим вірусом [76]. Однак деякі дослідники повідомляли, що через два тижні після подібних експериментів у клітинах починали розмножуватися мутова- ні віруси, які уникали розпізнавання системою CRISPR/Cas9. Навіть висловлювалося при- пущення, що це відбувається не тільки через підвищену схильність ВІЛ до мутагенезу, а й тому, що сама система CRISPR/Cas9 при роз- різанні вірусної ДНК провокує виникнення додаткових мутацій внаслідок подальшої по- милкової репарації ДНК [77]. Пропонують різні способи усунення цієї проблеми: застосу- вання CRISPR/Cas9 для одночасного знешко- дження кількох генів вірусу, для зміни генів Т-клітин з метою запобігання проникненню вірусу або використання CRISPR/Cas9 у ком- бінації з противірусними ліками. Результати досліджень з редагування в клітинах ембрі- она людини гена ССR5, що кодує рецептор для проникнення ВІЛ-1 в Т-клітини, були успішними лише частково, і вони підтверди- ли необхідність удосконалення застосованої технології [78]. В серпні 2017 р. опубліковано 64 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ результати досліджень китайських вчених, які успішно ввели систему редагування CRISPR/ Cas9 у стовбурові клітини людини, що є по- передниками клітин крові, з метою редагуван- ня гена CCR5. На моделі трансгенних мишей було продемонстровано довготривалий (понад рік) ефект стійкості до ВІЛ-1 in vivo, що вияв- лявся у значному зменшенні титру вірусу та збагаченні популяції CD4+Т-клітин людини [79]. А в липні 2019 р. опубліковано результати досліджень американських вчених з Медичної школи Льюїса Катца при Університеті Темпл у Філадельфії (штат Пенсильванія) і Медич- ного центру Університету Небраски, які по- вністю видалили ВІЛ з Т-клітин 30 % «гумані- зованих» трансгенних мишей, яких було інфі- ковано ВІЛ, поєднавши технологію CRISPR/ Cas9 і антиретровірусну терапію тривалої дії. Після випробування нової методики на мавпах у 2020 р. заплановано перші випробування за участі людей [80]. Система CRISPR/Cas9 є також цінним ін- струментом для створення вірусів з певними властивостями, наприклад ослаблених вірусів для вакцин або онколітичних вірусів для лі- кування раку [81]. Інактивація за допомогою CRISPR/Cas9 генів Е6 або Е7 вірусу папіломи викликає загибель клітин цервікальної кар- циноми шляхом апоптозу [82]. Також за до- помогою цієї системи можуть бути вдоскона- лені імунотерапевтичні підходи до лікування раку. Одна зі стратегій передбачає створення генно-модифікованих Т-клітин з химерними антигенними рецепторами (CAR-T), до скла- ду яких входить scFv-антитіло проти певного антигена ракових клітин. Особливо успіш- ним виявився спосіб лікування В-клітинної лімфоми за допомогою Т-клітин з химерни- ми рецепторами проти антигена CD19: відпо- відний препарат Kymriah (Tisagenlecleucel) виробництва Novartis (Швейцарія) схвалено FDA у 2017 р. [83]. На основі CRISPR/Cas9 у 2018 р. було розроблено систему, яка без використання вірусних векторів дозволила швидко та ефективно вставляти великі послі- довності ДНК (більше 1 кілобази) в певні ді- лянки геному Т-клітин людини, зберігаючи їх життєздатність та функції [84]. Завдяки цьому зараз досліджуються та проходять клінічні ви- пробування понад 300 різних варіантів терапії CAR-T, зокрема терапія TanCAR з біспецифіч- ними химерними антигенними рецепторами, які запобігають так званій «втечі» пухлинного антигена внаслідок мутацій; системи універ- сальних антигенних рецепторів (наприклад, SUPRA CAR), в яких можна легко змінити специфічність scFv-антитіла, а також терапія nanoCAR на основі однодоменних наноанти- тіл, які завдяки малому розміру вирішують проблеми агрегації та імуногенності scFv [85]. Крім Т-клітин розроблено також генно-моди- фіковані макрофаги (CARMA), природні кіле- ри (CAR-NK) та інші типи клітин, у тому чис- лі синтетичні клітини, що імітують Т-клітини і походять з клітин нирок, виділених із сечі, або стовбурових клітин, одержаних при ліпо- сакції [86]. У промислових масштабах клітини CAR-Т також отримують з генетично модифі- кованих індукованих плюрипотентних стовбу- рових клітин (iPSCs), які можна нескінченно довго розмножувати, а перед лікуванням пере- творювати на зрілі клітини CAR-Т за допомо- гою штучного тимуса — органа, в якому зазви- чай Т-клітини розвиваються зі стовбурових клітин крові [87]. Онкологічні захворювання, як правило, ви- никають через мутації у різноманітних генах, які призводять до стимулювання клітинної проліферації, втрати функції пухлинних супре- сорів, що регулюють клітинний ріст, індукції метаболічних ензимів, які надають стійкість до хіміотерапевтичних агентів тощо. Технологія CRISPR/Cas9 відкриває реальні можливості усунення таких мутацій, що є дуже важливим при лікуванні раку [88]. В жовтні 2016 р. гру- па китайських учених під керівництвом онко- лога Лу Ю (Lu You) з Університету Сичуань в Ченду в рамках клінічного випробування вперше ввела CRISPR/Cas9 Т-клітини, моди- фіковані за геном PD-1, що гальмує клітинну імунну відповідь, пацієнту з агресивним раком легенів. Результати цих досліджень спонука- ли США розпочати проведення подібних ви- пробувань [89]. У 2019 р. технологію CRISPR ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 65 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ було використано для визначення генів, які є критичними для виживання раку. Під час до- слідження було почергово пошкоджено майже 20 000 генів у клітинах 300 моделей раку, що належать до 30 типів раку. В результаті дослід- ники відібрали 600 найперспективніших «мі- шеней» для розроблення нових протиракових препаратів. Головною «мішенню» для кількох різних типів раку виявився синдром RecQ хелікази Вернера (WRN), який є необхідним для виживання ракових клітин з порушення- ми шляхів репарації ДНК, що називають ще раком з мікросателітною нестабільністю. До нього належить багато типів раку, зокрема 15 % типів раку товстої кишки та 28 % типів раку шлунка [90]. Для того, щоб використовувати систему CRISPR/Cas9 у практичній медицині для лі- кування спадкових захворювань, викликаних одиничною мутацією в певному гені (таких як гемофілія, муковісцидоз, хвороба Гантінгтона, серпоподібноклітинна анемія, лейкемія тощо), необхідно вдосконалювати технологію, зроби- ти її цілком безпечною для людини, виріши- ти проблему доставки компонентів CRISPR/ Cas9 до окремих клітин в організмі. Ймовір- но, найпростішим варіантом для застосуван- ня CRISPR/Cas9 в медицині є захворювання крові, для яких технології клітинної терапії вже добре відпрацьовані. Генну терапію гемо- поетичних стовбурових клітин успішно засто- совують для лікування спадкових імунодефі- цитів протягом останніх 20 років. Спочатку для введення ДНК у клітини використовували гамма-ретровірусні вектори, які іноді виклика- ли лейкемію. Згодом розробили більш безпеч- ні вектори, які проходять зараз клінічні випро- бування [91]. В експериментах на мишах вже отримано позитивні результати з використан- ня CRISPR/Cas9 для генної терапії гемофілії [92] та міодистрофії Дюшена [93]. А наприкін- ці минулого року група вчених з Каліфорній- ського університету в Берклі повідомила про успішне використання CRISPR/Cas9 для ви- правлення генетичної мутації в стовбурових клітинах пацієнтів з серпоподібно-клітинною анемією [94]. Тому не дивно, що біотехноло- гічні компанії вкладають усе більше й більше грошей у розроблення технології CRISPR/ Cas9 і реалізацію ідей щодо її медичного засто- сування. Вчені, які зробили найбільший внесок у винахід технології CRISPR/Cas9, стали спів- засновниками перших чотирьох компаній, що розвивають застосування цієї техноло- гії у медичній практиці. По-перше, це Intellia Therapeutics (США), яку очолює Дженніфер Дудна; по-друге, Caribou Biosciences (США), яку очолює Рудольф Баррангоу, а співзаснов- никами є Дженніфер Дудна та Мартін Джі- нек; по-третє, CRISPR Therapeutics зі штаб- квартирами в Швейцарії, Великій Британії та США на чолі з Еммануель Шарпентьє; по-четверте, Editas Medicine (США), яку за- снували Фен Чжан і Джордж Черч — автори перших результатів редагування клітин еука- ріотів та людини. Спочатку Дж. Дудна також була співзасновником Editas Medicine, але змушена була розірвати відносини з компані- єю, оскільки Фен Чжан несподівано оформив на себе та свій інститут патент на застосування технології CRISPR/Cas9 у клітинах еукаріотів (у тому числі людей). Судова тяганина за прі- оритет, яка коштувала десятки мільйонів до- ларів, тривала кілька років і у лютому 2017 р. завершилася рішенням патентного відомства США на користь Фена Чжана з Інституту Бро- уд у Кембриджі. Однак Європейське патентне відомство видало патент на застосування тех- нології CRISPR/Cas9 у клітинах усіх типів, в тому числі еукаріотичних, Дж. Дудні та Ка- ліфорнійському університету в Берклі. Після численних апеляцій рішення американського суду тривалий час залишилося незмінним. І лише після останньої скандальної апеляційної заяви Дудни, зробленої у червні 2019 р., з об- винуваченнями у брехні та підтасовці фактів на адресу співробітників Інституту Броуд [95] було прийнято рішення про надання команді Дудна–Шарпентьє наприкінці 2019 р. патенту США на спосіб отримання генетично модифі- кованих клітин за допомогою редагування ге- нів CRISPR-Cas9 і про подальше розширення патентного портфеля навесні 2020 р. [96]. Чи 66 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ закінчиться на цьому протистояння, невідомо, адже фармацевтичні компанії вже вклали у ви- щезгадані стартап-компанії понад $300 млн. Гроші надали Білл Гейтс, Google Ventures і ще кілька провідних венчурних фондів. І це не межа. У разі отримання обнадійливих резуль- татів, інвестиції зростуть, а застосування в ме- дичній практиці обіцяє мільярдні прибутки. З огляду на таку перспективу домогтися гло- бальної заборони експериментів з генетичної модифікації людини скоріш за все не вдасться. З іншого боку, навряд чи варто їх забороняти, оскільки завжди знайдуться люди, готові по- рушити будь-які заборони заради власних ін- тересів. Навіть якщо подібні експерименти за- боронити в США чи Європі, то вони все одно реалізовуватимуться в Китаї, оскільки через місцеві культурно-релігійні особливості там не бачать великої проблеми в експериментах з людськими ембріонами, адже за вченням Кон- фуція людина стає людиною (тобто отримує душу) лише після народження. У Великій Британії генетичні маніпуляції з ембріонами офіційно дозволено. 29 жовтня 2015 р. у цій країні прийнято закон, який дозво- ляє при штучному заплідненні пересаджувати в запліднену яйцеклітину мітохондрії від тре- тьої особи — донора [97]. А з 1 лютого 2016 р. дозволили проведення досліджень з викорис- танням технології CRISPR/Cas9 та життєздат- них ембріонів людини [98]. У своєму звіті від 2018 р. Наффілдська рада з біоетики (Велика Британія) зазначила, що використання спад- кового редагування геному «може бути етично прийнятним за деяких обставин». Соціальні опитування показали, що в США майже три чверті населення підтримують використання редагування геному для лікування серйозних спадкових захворювань у немовлят [99]. Генеральний директор Центру народжу- ваності New Hope у Нью-Йорку Джон Чжан (John Zhang) одним з перших вирішив комер- ціалізувати метод мітохондріальної замісної терапії (МЗТ), яку часто називають «зачаттям від трьох батьків». Вартість інноваційної про- цедури вчений оцінив приблизно у $100 тис. У 2016 р. він допоміг жінці зачати і виносити здорову дитину, використовуючи метод МЗТ. Після цього Чжан створив стартап Darwin Life, покликаний допомагати жінкам, старшим за 40 років, народити дитину. Чжан просив у FDA дозвіл на проведення клінічних випробу- вань, однак у 2017 р. отримав відмову у вигляді відкритого листа. Незважаючи на це, Чжан на сайті компанії Darwin Life продовжує рекла- мувати процедуру, яка може бути проведена у мексиканських відділеннях клініки [100], та закликає інших вчених розвивати цю галузь у Великій Британії, Україні та Китаї, де подібні дослідження дозволені [101]. Тривалий час FDA не дозволяло проведення за федеральні кошти клінічних випробувань системи CRISPR/Cas9, на відміну від іншого інструменту геномного редагування — ZFN. Компанія Sangamo BioSciences (Ричмонд, штат Вірджинія, США) використала ZFN у клінічних випробуваннях з метою лікування гемофілії типу В, мукополісахаридозу, бета- таласемії та вірусного імунодефіциту люди- ни [102]. Адміністрація президента Дональда Трампа внесла пропозиції до правил FDA, які висували більш жорсткі вимоги до контролю за організмами, модифікованими за допомо- гою CRISPR/Cas9, навіть за сільськогосподар- ськими тваринами та рослинами, не кажучи вже про людей. Вчені вважали ці пропозиції «божевільними» і побоювалися, що багато ор- ганізацій відмовляться від створення генно-ін- женерних тварин. Однак на початку 2019 р. на- решті було офіційно схвалено проведення пер- шого клінічного випробування. У цьому році фармацевтичні компанії CRISPR Therapeutics і Vertex розпочали випробування терапії CTX001, призначеної для лікування бета-та- ласемії та серпоподібної анемії, які зумовлені мутацією в одному гені. Ця терапія передба- чає модифікацію стовбурових клітин пацієнта шляхом внесення єдиної генетичної зміни, що приведе до підвищення рівня гемоглобіну в еритроцитах плоду. Щодо проведених випро- бувань на території Китаю слід зазначити, що жодних результатів цих досліджень не було опубліковано, а останні звіти свідчать про ви- явлення значних процедурних проблем [103]. ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 67 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ У США зараз проводять понад 20 клініч- них випробувань терапевтичних препаратів на основі CRISPR для низки захворювань, та- ких як рідкісні моногенні гематологічні та очні хвороби, а також полігенні онкологічні захво- рювання [104]. Серед спадкових захворювань, зумовлених точковою мутацією, увагу вчених привертають насамперед вроджений амавроз Лебера 10 (ураження сітківки ока), синдром Ушера (глухота з поступовою втратою зору), м’язова дистрофія Дюшена, муковісцидоз (кіс- тозний фіброз, що вражає дихальну та травну системи), дефіцит транстиретину (ураження периферичної нервової системи), амілоїдоз альфа-1 та первинна гіпероксалурія І типу (ураження нирок). Слід зазначити, що для лікування подібних захворювань розробляють також препарати на основі антисенс-олігонуклеотидів, що функціо- нують за принципом інтерферуючих РНК. На сьогодні дозвіл FDA одержали 7 таких препа- ратів: у 1998 р. — Вітравен (Vitravene, фомівір- сен) для терапії цитомегаловірусного ретиніту у ВІЛ-інфікованих (у 2006 р. виведений з ринку завдяки ефективій антиретровірусній терапії); у 2004 р. — Макуджен (Macugen, пегаптаніб) для лікування неоваскулярної вікової макуляр- ної дегенерації; у 2013 р. — Кінамро (Kynamro, міпомерсен) для лікування гомозиготної сімей- ної гіперхолістеринемії; у 2016 р. — Ексондис 51 (Exondys 51, етеплірсен) для лікування м’язової дистрофії Дюшена з підтвердженою мутаці- єю гена дистрофіну, яка може бути виправле- на пропуском екзона 51; у 2016 р. — Спінраза (Spinraza, нусинерсен) для лікування спіналь- ної м’язової атрофії; у 2018 р. — Тегседі (Tegsedi, інотерсен) та Онпатро (Onpattro, патисиран) для лікування спадкового транстиретичного амілоїдозу з полінейропатією [105]. Тривалий час суспільство з недовірою стави- лося до перспектив генної терапії, особливо піс- ля того, як в 1999 р. у США внаслідок лікування вперше померла людина — 18-річний хлопець Джессі Джелсінджер (Jesse Gelsinger), який мав генетичне захворювання печінки, пов’язане з Х-хромосомою, — дефіцит орнітин-транскарба- мілази, що проявлялося в нездатності знешко- джувати аміак. Він помер, ймовірно, через по- рушення деяких правил проведення клінічних випробувань і внаслідок генералізованої імун- ної реакції на пробне введення аденовірусного вектора зі здоровим геном [106]. Уперше генну терапію офіційно дозволили в Китаї 16 жовтня 2003 р. (препарат Gendicine компанії SiBiono GeneTech Co з Шеньчжень, провінція Гуандун), пізніше, у 2006 р., на рин- ку з’явився препарат Oncorine (Н101) компанії Sunway Biotech Co Ltd, Шанхай. Обидва пре- парати призначені для лікування раку голови та шиї. В 2011 р. в Росії дозволили викорис- тання препарату Neovasculogen для лікування атеросклерозу та ішемії [107]. Першим генно-терапевтичним препаратом на території Європи або США, який був ре- комендований в липні 2012 р. Європейським агентством з лікарських засобів і схвалений Єврокомісією в листопаді 2012 р., був пре- парат Glybera (аліпоген типарвовек), розро- блений біотехнологічною компанією uniQure (Нідерланди). Цей препарат призначено для лікування надзвичайно рідкісного (1–2 випад- ки на мільйон) спадкового захворювання — де- фіциту ліпопротеїнліпази (ЛПЛ), або сімейної хіломікронемії. Нестача ензиму ЛПЛ призво- дить до порушення обміну жирів в організмі: відкладенню жирів у шкірі, сітківці очей і пе- чінці, а також гострого запалення підшлунко- вої залози (панкреатиту). Glybera за допомо- гою вірусу AAV1 забезпечує доставку в м’язові клітини неушкодженої копії гена ЛПЛ, яка не вбудовується в геном, але компенсує вродже- ний дефект. Паралельно з ін’єкціями препара- ту проводиться імуносупресивна терапія для запобігання імунній реакції на вірус. Роздріб- на ціна цих ліків стала рекордною і становила в Німеччині 53 тис. за флакон, а курс терапії обходився у понад 1 млн. Препарат виготов- ляли за індивідуальним замовленням на заводі uniQure в Амстердамі. Продаж цих ліків роз- почато лише в 2014 р., коли було отримано ре- зультати шестирічного спостереження за паці- єнтами. Дані клінічних досліджень показали, що майже у всіх пацієнтів концентрація жиру в крові знижувалася після ін’єкції на період 68 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ від 3 до 12 тижнів. Виробник сподівався, що в 2018 р. Glybera вийде на американський ринок [108]. Однак у квітні 2017 р. компанія відкли- кала свою заявку і через високу вартість вилу- чила препарат з європейського ринку, продав- ши його лише один раз у Німеччині та оголо- сивши його комерційною помилкою [109]. Наприкінці 2015 р. у США, а потім і в Єв- ропі було затверджено препарат на основі он- колітичного вірусу герпесу Imlygic (T-Vec) транснаціональної компанії Amgen (зі штаб- квартирою в Каліфорнії, США) для лікування неоперабельної меланоми вартістю $65 тис. Однак статистично достовірних доказів ефек- тивності лікування ним досі не отримано [110], хоча відзначалося зростання в 2 рази кількос- ті пацієнтів з регресією пухлини при комбі- нованому застосуванні Imlygic та Yervoy — людського моноклонального антитіла проти CTLA-4, що стало першим лікарським засобом на основі інгібіторів імунних чекпоїнтів [111]. 27 травня 2016 р. в Європі було схвалено перший генно-терапевтичний препарат для лікування дітей — Strimvelis, розроблений італійськими вченими та біотехнологічною фірмою GlaxoSmithKline (Велика Британія), зараз переданий Orchard Therapeutics Limited (Велика Британія). Цей препарат створено для лікування рідкісного комбінованого іму- нодефіциту ADA-SCID, який спричинюється дефіцитом аденозиндеамінази — ензиму, що утилізує пурини. У хворих дітей перестають формуватися лейкоцити, тому вони повинні перебувати у стерильних умовах і рідко живуть більше двох років. Щороку в Європі народжу- ється близько 15 дітей з цим захворюванням. У березні 2017 р. перша дитина з європейської країни (дані про яку не розголошуються) про- йшла лікування Strimvelis. Вартість лікування становила 594 тис. ($648 тис.), на сьогодні вже понад $700 тис., тоді як замісна терапія ензи- мом протягом 10 років потребує щотижневих ін’єкцій і коштує близько $4,25 млн. Поки що лікування можливе лише в Мілані (Італія), оскільки генно-модифіковані стовбурові клі- тини залишаються придатними до трансплан- тації протягом 6 год [112]. Компанія Orchard Therapeutics Limited під час дослідження можливості кріогенного заморожування та транспортування клітин пацієнтів розробила новий препарат OTL-101, який є вдосконале- ним варіантом Strimvelis, що в 2019 р. успішно завершив дворічні випробування на 20 немов- лятах і в 2020 р. буде заявлений для розповсю- дження на ринку США [113]. Однак висока вартість подібних препаратів може стати пе- решкодою для їх широкого використання: ані державні бюджети, ані страхові компанії не го- тові до таких витрат. Ймовірно, завдяки успіш- ному впровадженню CRISPR/Cas9 у клінічну практику спадкові захворювання не зникнуть, а стануть ознакою бідності. На сьогодні вже багато відомо про систему CRISPR/Cas9, хоча ці знання є недостатніми. Деякі фундаментальні питання залишають- ся поки що без відповіді. Невідомо, звідки бе- реться більшість спейсерів у CRISPR, адже лише декілька відсотків з них мають вірусне походження, і для чого вони потрібні бактерії. Є відомості, що система CRISPR/Cas може брати активну участь у регуляції ендогенних бактеріальних генів, зокрема при взаємодії бактерій з еукаріотичним організмом, у якому вони паразитують. Наприклад, протеїн Cas9 з Francisella novicida використовує CRISPR/ Cas-асоційовану малу РНК (scaRNA) для при- гнічення ендогенного транскрипту мРНК, що кодує бактеріальний ліпопротеїн. Це дозволяє послабити імунну відповідь хазяїна й підвищи- ти вірулентність бактерії [114]. Незрозуміло, як виникла система CRISPR/Cas в ході еволюції (є припущення, що вона походить від так зва- них стрибаючих генів — транспозонів — діля- нок ДНК, які кодують протеїни, необхідні для переміщення цих ділянок у геномі) [115]. Зараз відомо 6 різних типів CRISPR/Cas (CRISPR/ Cas9 належить до ІІ типу). Не виключено, що є й інші, поки що невідомі, системи CRISPR/Cas. Важливим є вивчення на біохімічному та струк- турному рівнях різних природних форм голов- ного компоненту системи — протеїну Cas9, серед яких можуть виявитися протеїни, більш перспективні для практичного використання. Вже з’ясовано деякі невідомі деталі молекуляр- ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 69 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ ного механізму розпізнавання ДНК-«мішені» та її розрізання завдяки одержанню кристаліч- них структур комплексів Cas1-Cas2 або R-петлі Cas9 з фрагментами чужорідної ДНК в локу- сі CRISPR [116, 117]. Очевидно, що завдяки пильній увазі вчених всього світу до CRISPR/ Cas9 всі нез’ясовані фундаментальні питання буде докладно досліджено в найближчому май- бутньому. Недоліками CRISPR/Cas9 є не тільки зна- чна кількість помилок редагування, а й не- ефективність редагування ДНК поза межами клітини, а також значний розмір ензиму Cas9, що ускладнює його доставку в клітину та зу- мовлює сильні імуногенні властивості. Тому вчені активно шукають і досліджують інші протеїни Cas, які можуть виявитися ефектив- нішими. Останнім часом їх увагу все більше привертають представники родини Cas12a (Cpf1), особливо протеїни LbCpf1 та AsCpf1, що трапляються відповідно у бактерій родини Lachnospiraceae і роду Acidaminococcus. Ці ен- зими, на відміну від Cas9, розрізають ДНК з утворенням «липких» кінців, а не «тупих», що дозволяє легко вирізати і вставляти цілі гени [118]. Така можливість є дуже цінною для ген- ної терапії захворювань, пов’язаних з багатора- зовим пошкодженням гена, наприклад хворо- би Альцгеймера, коли ген легше замінити, ніж відредагувати [119]. На основі Cpf1 вперше було створено систему для редагування ДНК у безклітинному екстракті, яка може стати діа- гностичним інструментом для виявлення ге- нетичних мутацій у пухлинних клітинах хво- рих на рак [120]. Перспективними для генної інженерії можуть виявитися й інші нещодавно відкриті компоненти систем захисту бактерій, наприклад невеликі за розміром протеїни-ар- гонавти CasX і CasY [121], здатні розрізати чужорідну ДНК (їх було виявлено у глибо- ководних прокаріот Кришталевого гейзеру (США) [122]), ще менші (40–70 кДа) протеї- ни Cas14(a, b, c), здатні до розщеплення одно- ланцюгової ДНК без необхідності взаємодії з PAM, які було відкрито в архей [123], протеї- ни Cas13a (С2с2) [124], Cas13b [125], Cas13c і Cas13d [126], що знешкоджують РНК вірусів, або протеїн ScCas9 Streptococcus canis, що має спорідненість до мінімальних 5’-NNG-3’ по- слідовностей PAM і ширші можливості реда- гування геному [127]. Нещодавно розроблена система CRISPR/Cas3 типу I, яка може вирі- зати довгі ділянки ДНК, поповнила арсенал інструментів для редагування геному [128]. А у 2018 р. вчені з Каліфорнійського університе- ту в Лос-Анджелесі розробили вдосконалену технологію CRISPR/Cas9 з використанням CRISPR-бібліотек, що дозволило одночасно редагувати геном тисячами різних способів, спостерігаючи при цьому, як будь-які можливі мутації зумовлюють позитивний чи негатив- ний вплив на клітини [129]. Поєднання системи CRISPR/Cas з іншими технологіями також дає цікаві результати. Зо- крема, компанія Eurofins DiscoverX нещодавно запропонувала поєднати CRISPR/Cas9 з ме- тодом аналізу комплементарності фрагментів ферменту (EFC) [130], що дозволило створи- ти біосенсор для кількісної оцінки зміни рівня певного ендогенного протеїну під впливом те- рапевтичних засобів [131]. Цей біосенсор може бути використаний для проведення масового скринінгу нових засобів для лікування того чи іншого захворювання, що є особливо акту- альним для нового класу терапевтичних пре- паратів, відомих як цільові деградатори про- теїнів, наприклад PROTAC — біфункціональ- них молекул, які націлені на специфічні для захворювання протеїни та здатні руйнувати їх за допомогою клітинної системи убіквітин- протеасоми. Останнім часом значний інтерес викликають PROTAC для знешкодження бро- модомену Brd4, який розпізнає ацетильовані залишки лізину на хроматині та регулює екс- пресію багатьох онкогенів [132]. З’являються все нові способи вдосконалення технології CRISPR/Cas9: компанія GenScript (США) пропонує використовувати як шаблон одноланцюгову ДНК (ssDNA або ssODN), що підвищує ефективність редагування та знижує ймовірність інтеграції поза межами цільової ділянки [133]. Нещодавно група під керівни- цтвом Фена Чжана відкрила нову техніку ре- дагування генів, яка дає змогу вставляти гени у 70 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ ДНК без її розрізання за допомогою CRISPR- асоційованої транспозази із ціанобактерій Scytonema hofmannii (ShCAST), що складається з Tn7-подібних субодиниць транспозази та ен- зиму Cas12k [134]. У 2019 р. неабияку цікавість (понад 400 наукових публікацій) викликав метод, розроблений ще у 2012 р. німецькими вченими Торстеном Стаффорстом (Thorsten Stafforst) і Маріусом Шнайдером (Marius F. Schneider) з Тюбінгенського університету [135], який тоді залишився без уваги, оскільки був за- тьмарений сенсаційним відкриттям CRISPR/ Cas9. Цей метод дозволяє змінювати протеїни шляхом редагування РНК, а не ДНК, що вирі- шує проблему ризиків, пов’язаних з внесенням постійних змін у ДНК людини та ймовірністю обтяження її помилками редагування. Зміни у мРНК вносять за допомогою аденозинових деаміназ ADAR (adenosine deaminases acting on RNA), які перебувають у комплексі з РНК- гідами (adRNAs — ADAR guide RNAs) і здатні в утвореній дволанцюговій РНК змінювати аденозин на інозин, який при синтезі протеїну зчитується як гуанозин. Важливою перевагою використання людських ензимів ADAR по- рівняно з протеїном Cas9, що має бактеріальне походження, є відсутність небажаних реакцій з боку імунної системи. Зараз уже відомі й інші засоби редагування РНК: цитидинові деаміна- зи APOBEC змінюють цитозин на уридин; пев- ні ензими винограду змінюють цитидин на ури- дин, а деякі ензими пухлин можуть змінювати гуанозин на аденозин тощо. Незважаючи на обмеженість способів зміни послідовності РНК та проблеми з доставкою РНК до клітин, кілька стартап-компаній вже почали використовува- ти системи редагування РНК для розроблен- ня засобів лікування раку, м’язової дистрофії та інших захворювань (не лише генетичних), а також для корекції різних патологічних станів, таких як гострий біль або високий рівень холес- терину [136]. Зараз ми переживаємо бум захоплення тех- нологією CRISPR/Cas9. Протягом останніх 7 років опубліковано близько 17 тис. наукових статей на цю тему, виділено мільйони доларів на дослідження, а кількість стартап-компаній невпинно зростає. Не дивно, що авторитетний науковий журнал Science випустив огляд до- сягнень у цій галузі під назвою «The CRISPR Craze» (Криспер-божевілля) [137]. Очікуєть- ся, що до 2025 р. у світі на розвиток технології CRISPR/Cas9 та редагування геномів за її до- помогою буде витрачено понад $5,3 млрд [138]. Сьогодні складно давати будь-які прогнози щодо того, якими будуть результати практич- ного використання системи CRISPR/Cas9 че- рез кілька десятиліть. Однак уже зараз зрозу- міло, що CRISPR/Cas9 — це не чергова модна «іграшка», якою вчені побавляться і невдовзі про неї забудуть. Немає сумнівів, що ця техно- логія є революційною, і на неї чекає велике май- бутнє. Технологія CRISPR/Cas9 суттєво спрос- тила і здешевила техніку редагування геномної ДНК, що в перспективі може значно приско- рити темпи розвитку генної терапії та експе- риментальної біології. З відкриттям CRISPR/ Cas9 водночас з’явилося безліч можливостей для вирішення наболілих проблем людства, з якими наука досі не могла впоратися. Ця тех- нологія дала шанс позбавитися від генетичних захворювань, створити «розумні» антибіотики, цінні ГМО для сільського господарства, про- мисловості та медицини, нейтралізувати пере- носників інфекційних хвороб тощо. Однак щоб реалізувати всі ці можливості по- вною мірою, необхідно зробити технологію без- печною: виключити всі побічні ефекти, а також вдосконалити системи доставки компонентів CRISPR/Cas9 до клітин. Коли це буде зробле- но, редагування геномів тварин стане звичною справою, а ідея застосування CRISPR/Cas9 до ембріонів людини для позбавлення від тяжких захворювань, ймовірно, вже не буде видавати- ся такою сумнівною. Якщо замислитися над тим, що зміни, внесені в ДНК ембріонів, мо- жуть бути передані майбутнім поколінням, то приходить усвідомлення факту, що технологія CRISPR/Cas9 може змінити напрям еволюції людини, надати нам безпрецедентну можли- вість переписати власний код життя. Багато хто зараз каже: «Це добром не скінчиться…». Чомусь здається, що те ж саме казали первісні люди, вперше побачивши колесо. ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 71 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ REFERENCES [СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ] 1. Meselson M., Yuan R. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature. 1968. 217(5134): 1110–1114. DOI: https://doi. org/10.1038/2171110a0 2. Weiss B., Richardson C.C. Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, I. Repair of single-strand breaks in DNA by an enzyme system from Escherichia coli infected with T4 bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. 57(4): 1021–1028. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.57.4.1021 3. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011. 471(7340): 602– 607. DOI: https://doi.org/10.1038/nature09886 4. Westra E.R., Semenova E., Datsenko K.A., Jackson R.N., Wiedenheft B., Severinov K., Brouns S.J. Type I-E CRIS- PR-cas systems discriminate target from non-target DNA through base pairing-independent PAM recognition. PLoS Genet. 2013. 9(9): e1003742. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003742 5. Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 1987. 169(12): 5429–5433. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.169.12.5429-5433.1987 6. Nakata A., Amemura M., Makino K. Unusual nucleotide arrangement with repeated sequences in the Escherichia coli K-12 chromosome. J. Bacteriol. 1989. 171(6): 3553–3556. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.171.6.3553-3556.1989 7. Groenen P.M., Bunschoten A.E., van Soolingen D., van Embden J.D. Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method. Mol. Microbiol. 1993. 10(5): 1057–1065. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x 8. Mojica F.J., Díez-Villaseñor C., Soria E., Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of archaea, bacteria and mitochondria. Mol. Microbiol. 2000. 36(1): 244–246. DOI: https://doi.org/10.1046/ j.1365-2958.2000.01838.x 9. Jansen R., Embden J.D., Gaastra W., Schouls L.M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 2002. 43(6): 1565–1575. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x 10. Mojica F.J., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of Molecular Evolution. 2005. 60(2): 174–182. DOI: https://doi. org/10.1007/s00239-004-0046-3 11. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 2005. 151(3): 653–663. DOI: https://doi.org/10.1099/mic.0.27437-0 12. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology. 2005. 151(8): 2551–2561. DOI: https://doi. org/10.1099/mic.0.28048-0 13. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A., Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007. 315(5819): 1709–1712. DOI: https://doi. org/10.1126/science.1138140 14. Brouns S.J., Jore M.M., Lundgren M., Westra E.R., Slijkhuis R.J., Snijders A.P., Dickman M.J., Makarova K.S., Koo- nin E.V., van der Oost J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 2008. 321(5891): 960–964. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1159689 15. Marraffini L.A., Sontheimer E.J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 2008. 322(5909): 1843–1845. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1165771 16. Sontheimer E., Marraffini L. Target DNA interference with crRNA. U.S. Provisional Patent Application 61/009, 317, filed September 23, 2008; later published as US2010/0076057 (abandoned). 17. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012. 337(6096): 816–821. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.1225829 18. Gasiunas G., Barrangou R., Horvath P., Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. 109: E2579–E2586. DOI: https://doi. org/10.1073/pnas.1208507109 19. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. RNA-guided human ge- nome engineering via Cas9. Science. 2013. 339(6121): 823–826. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1232033 72 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ 20. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013. 339(6121): 819–823. DOI: https://doi. org/10.1126/science.1231143 21. Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endo- nuclease. Nat. Biotechnol. 2013. 31(3): 230–232. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.2507 22. Meganuclease. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Meganuclease 23. O’Connell M.R., Oakes B.L., Sternberg S.H., East-Seletsky A., Kaplan M., Doudna J.A. Programmable RNA recogni- tion and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 2014. 516(7530): 263–266. DOI: https://doi.org/10.1038/nature13769 24. Nelles D.A., Fang M.Y., O’Connell M.R., Xu J.L., Markmiller S.J., Doudna J.A., Yeo G.W. Programmable RNA track- ing in live cells with CRISPR/Cas9. Cell. 2016. 165(2): 488–496. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.02.054 25. Vandenberghe L.H. Addgene: molecular therapy interview with Melina Fan and Karen Guerin. https://www. cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(18)30582-3 DOI: https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2018.12.001 26. Brown K.V. Why CRISPR-edited food may be in supermarkets sooner than you think. https://gizmodo.com/why- crispr-edited-food-may-be-in-supermarkets-sooner-th-1822025033 27. Lee J., Wang F. Gene-edited baby by Chinese scientist: the opener of the pandora’s box. Science Insights. 2018. 2018:e000178. DOI: https://doi.org/10.15354/si.18.co015 28. Reardon S. CRISPR gene-editing creates wave of exotic model organisms. Nature. 2019. 568(7753): 441–442. DOI: https://doi.org/10.1038/d41586-019-01300-9 29. Wade N. Genes color a butterfly’s wings. Now scientists want to do it themselves. https://www.nytimes. com/2017/09/18/science/butterfly-wing-color-patterns-gene-editing.html 30. Qi L.S., Larson M.H., Gilbert L.A., Doudna J.A., Weissman J.S., Arkin A.P., Lim W.A. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013. 152(5): 1173–1183. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.cell.2013.02.022 31. Kungulovski G., Jeltsch A. Epigenome editing: state of the art, concepts, and perspectives. Trends Genet. 2016. 32(2): 101–113. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tig.2015.12.001 32. Pefanis E., Wang J.G., Rothschild G., Lim J., Kazadi D., Sun J.B., Federation A., Chao J., Elliott O., Liu Z.P., Econo- mides A.N., Bradner J.E., Rabadan R., Basu U. RNA exosome-regulated long non-coding RNA transcription controls super-enhancer activity. Cell. 2015. 161(4): 774–789. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.034 33. Elling R., Chan J., Fitzgerald K.A. Emerging role of long noncoding RNAs as regulators of innate immune cell devel- opment and inflammatory gene expression. Eur. J. Immunol. 2016. 46(3): 504–512. DOI: https://doi.org/10.1002/ eji.201444558 34. Chen B., Gilbert L.A., Cimini B.A., Schnitzbauer J., Zhang W., Li G.W., Park J., Blackburn E.H., Weissman J.S., Qi L.S., Huang B. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 2013. 155(7): 1479–1491. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12.001 35. Hajian R., Balderston S., Tran T., deBoer T., Etienne J., Sandhu M., Wauford N.A., Chung J.Y., Nokes J., Athai- ya M., Paredes J., Peytavi R., Goldsmith B., Murthy N., Conboy I.M., Aran K. Detection of unamplified target genes via CRISPR-Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor. Nat. Biomed. Eng. 2019. 3(6): 427–437. DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-019-0371-x 36. CRISPR’s future for point-of-care diagnostics. https://www.diagnosticsworldnews.com/news/2020/02/18/ crispr%27s-future-for-point-of-care-diagnostics 37. List of awards and honors received by Jennifer Doudna. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_awards_ and_honors_received_by_Jennifer_Doudna 38. Niu Y., Shen B., Cui Y., Chen Y., Wang J., Wang L., Kang Y., Zhao X., Si W., Li W., Xiang A.P., Zhou J., Guo X., Bi Y., Si C., Hu B., Dong G., Wang H., Zhou Z., Li T., Tan T., Pu X., Wang F., Ji S., Zhou Q., Huang X., Ji W., Sha J. Genera- tion of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014. 156(4): 836–843. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.027 39. Shalem O., Sanjana N.E., Hartenian E., Shi X., Scott D.A., Mikkelsen T.S., Heckl D., Ebert B.L., Root D.E., Doench J.G., Zhang F. Genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014. 343(6166): 84–87. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1247005 40. Raphael B.J., Dobson J.R., Oesper L., Vandin F. Identifying driver mutations in sequenced cancer genomes: compu- tational approaches to enable precision medicine. Genome Med. 2014. 6(1): 5. DOI: https://doi.org/10.1186/gm524 41. Wang T., Wei J.J., Sabatini D.M., Lander E.S. Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system. Sci- ence. 2014. 343(6166): 80–84. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1246981 ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 73 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ 42. Baltimore D., Berg P., Botchan M., Carroll D., Charo R.A., Church G., Corn J.E., Daley G.Q., Doudna J.A., Fenner M., Greely H.T., Jinek M., Martin G.S., Penhoet E., Puck J., Sternberg S.H., Weissman J.S., Yamamoto K.R. Biotechnol- ogy. A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science. 2015. 348(6230): 36–38. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aab1028 43. Vogel G. Bioethics. Embryo engineering alarm. Science. 2015. 347(6228): 1301. DOI: https://doi.org/10.1126/sci- ence.347.6228.1301 44. Clapper J.R. Worldwide threat assessment of the US intelligence community. https://www.dni.gov/files/docu- ments/SASC_Unclassified_2016_ATA_SFR_FINAL.pdf 45. Baumgaertner E. As D.I.Y. gene editing gains popularity, ‘Someone is going to get hurt’. https://www.nytimes. com/2018/05/14/science/biohackers-gene-editing-virus.html 46. Liang P., Xu Y., Zhang X., Ding C., Huang R., Zhang Z., Lv J., Xie X., Chen Y., Li Y., Sun Y., Bai Y., Songyang Z., Ma W., Zhou C., Huang J. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015. 6(5): 363–372. DOI: https://doi.org/10.1007/s13238-015-0153-5 47. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y., Gootenberg J.S., Konermann S., Trevino A.E., Scott D.A., Inoue A., Matoba S., Zhang Y., Zhang F. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 2013. 154(6): 1380–1389. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.08.021 48. Fu Y., Sander J.D., Reyon D., Cascio V.M., Joung J.K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. 2014. 32(3): 279–284. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.2808 49. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., Topkar V.V., Nguyen N.T., Zheng Z., Gonzales A.P., Li Z., Peterson R.T., Yeh J.R., Aryee M.J., Joung J.K. Engineered CRISPR/Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015. 523(7561): 481–485. DOI: https://doi.org/10.1038/nature14592 50. Guilinger J.P., Thompson D.B., Liu D.R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specific- ity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014. 32(6): 577–582. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.2909 51. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B., Scott D.A., Yan W.X., Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with im- proved specificity. Science. 2016. 351(6268): 84–88. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aad5227 52. Kleinstiver B.P., Pattanayak V., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T., Zheng Z., Joung J.K. High-fidelity CRISPR/Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 2016. 529(7587): 490–495. DOI: https://doi. org/10.1038/nature16526 53. Zhou W., Deiters A. Conditional Control of CRISPR/Cas9 Function. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016. 55(18): 5394–5399. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201511441 54. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L., Nelson M., Sanger W.G., Gokhale S., Wolf D.P., Mitalipov S.M. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature. 2007. 450(7169): 497–502. DOI: https://doi. org/10.1038/nature06357 55. Tachibana M., Sparman M., Sritanaudomchai H., Ma H., Clepper L., Woodward J., Li Y., Ramsey C., Kolotush- kina O., Mitalipov S. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 2009. 461(7262): 367–372. DOI: https://doi.org/10.1038/nature08368 56. Tachibana M., Amato P., Sparman M., Gutierrez N.M., Tippner-Hedges R., Ma H., Kang E., Fulati A., Lee H.S., Srita- naudomchai H., Masterson K., Larson J., Eaton D., Sadler-Fredd K., Battaglia D., Lee D., Wu D., Jensen J., Patton P., Gokhale S., Stouffer R.L., Wolf D., Mitalipov S. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell. 2013. 153(6): 1228–1238. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.06.042 57. Kang E., Wu J., Gutierrez N.M., Koski A., Tippner-Hedges R., Agaronyan K., Platero-Luengo A., Martinez-Redondo P., Ma H., Lee Y., Hayama T., Van Dyken C., Wang X., Luo S., Ahmed R., Li Y., Ji D., Kayali R., Cinnioglu C., Olson S., Jensen J., Battaglia D., Lee D., Wu D., Huang T., Wolf D.P., Temiakov D., Belmonte J.C., Amato P., Mitalipov S. Mitochondrial replacement in human oocytes carrying pathogenic mitochondrial DNA mutations. Nature. 2016. 540(7632): 270–275. DOI: https://doi.org/10.1038/nature20592 58. Ma H., Marti-Gutierrez N., Park S.W., Wu J., Lee Y., Suzuki K., Koski A., Ji D., Hayama T., Ahmed R., Darby H., Van Dyken C., Li Y., Kang E., Park A.R., Kim D., Kim S.T., Gong J., Gu Y., Xu X., Battaglia D., Krieg S.A., Lee D.M., Wu D.H., Wolf D.P., Heitner S.B., Belmonte J.C.I., Amato P., Kim J.S., Kaul S., Mitalipov S. Correction of a pathogen- ic gene mutation in human embryos. Nature. 2017. 548(7668): 413–419. DOI: https://doi.org/10.1038/nature23305 59. Second woman carrying gene-edited baby, Chinese authorities confirm. https://www.theguardian.com/sci- ence/2019/jan/22/second-woman-carrying-gene-edited-baby-chinese-authorities-confirm 60. CRISPR scientist gets three years of jail time for creating gene-edited babies. https://gizmodo.com/crispr-scientist- gets-three-years-of-jail-time-for-crea-1840724277 61. Act now on CRISPR babies. Nature. 2019. 570(137). DOI: https://doi.org/10.1038/d41586-019-01786-3 74 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ 62. Collins F.S. NIH Director on Human Gene Editing: ‘We Must Never Allow our Technology to Eclipse our Human- ity’. https://www.discovermagazine.com/health/nih-director-on-human-gene-editing-we-must-never-allow-our- technology-to 63. Gene mutation meant to protect from HIV ‘raises risk of early death’. https://www.theguardian.com/science/2019/ jun/03/gene-mutation-protect-hiv-raises-risk-early-death 64. Andorno R., Yamin A.E. The right to design babies? Human rights and bioethics. https://www.openglobalrights.org/ the-right-to-design-babies-human-rights-and-bioethics/ 65. Citorik R.J., Mimee M., Lu T.K. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat. Biotechnol. 2014. 32(11): 1141–1145. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.3011 66. Bikard D., Euler C.W., Jiang W., Nussenzweig P.M., Goldberg G.W., Duportet X., Fischetti V.A., Marraffini L.A. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat. Biotechnol. 2014. 32(11): 1146– 1150. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.3043 67. Yosef I., Manor M., Kiro R., Qimron U. Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill an- tibiotic-resistant bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. 112(23): 7267–7272. DOI: https://doi.org/10.1073/ pnas.1500107112 68. Gantz V.M., Jasinskiene N., Tatarenkova O., Fazekas A., Macias V.M., Bier E., James A.A. Highly efficient Cas9-me- diated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. 112(49): E6736–E6743. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1521077112 69. Gantz V.M., Bier E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 2015. 348(6233): 442–444. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaa5945 70. Stokstad E. Genetically engineered moths can knock down crop pests, but will they take off? https://www.sci- encemag.org/news/2020/01/genetically-engineered-moths-can-knock-down-crop-pests-will-they-take DOI: https://doi.org/10.1126/science.abb1078 71. Yang L., Güell M., Niu D., George H., Lesha E., Grishin D., Aach J., Shrock E., Xu W., Poci J., Cortazio R., Wilkin- son R.A., Fishman J.A., Church G. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science. 2015. 350(6264): 1101–1104. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aad1191 72. Niu D., Wei H.J., Lin L., George H., Wang T., Lee I.H., Zhao H.Y., Wang Y., Kan Y., Shrock E., Lesha E., Wang G., Luo Y., Qing Y., Jiao D., Zhao H., Zhou X., Wang S., Wei H., G ell M., Church G.M., Yang L. Inactivation of por- cine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science. 2017. 357(6357): 1303–1307. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aan4187 73. Gene editing spurs hope for transplanting pig organs into humans. https://www.nytimes.com/2017/08/10/health/ gene-editing-pigs-organ-transplants.html 74. Nunes Dos Santos R.M., Carneiro D’Albuquerque L.A., Reyes L.M., Estrada J.L., Wang Z.Y., Tector M., Tector A.J. CRISPR/Cas and recombinase-based human-to-pig orthotopic gene exchange for xenotransplantation. J. Surg. Res. 2018. 229: 28–40. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jss.2018.03.051 75. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nu- clease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res. 2015. 118: 110–117. DOI: https://doi.org/10.1016/j. antiviral.2015.03.015 76. Kaminski R., Chen Y., Fischer T., Tedaldi E., Napoli A., Zhang Y., Karn J., Hu W., Khalili K. Elimination of HIV-1 genomes from human T-lymphoid cells by CRISPR/Cas9 gene editing. Sci. Rep. 2016. 6: 22555. DOI: https://doi. org/10.1038/srep22555 77. Wang Z., Pan Q., Gendron P., Zhu W., Guo F., Cen S., Wainberg M.A., Liang C. CRISPR/Cas9-derived muta- tions both inhibit HIV-1 replication and accelerate viral escape. Cell Rep. 2016. 15(3): 481–489. DOI: https://doi. org/10.1016/j.celrep.2016.03.042 78. Kang X., He W., Huang Y., Yu Q., Chen Y., Gao X., Sun X., Fan Y. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J. Assist. Reprod. Genet. 2016. 33(298): 1–8. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-016-0710-8 79. Xu L., Yang H., Gao Y., Chen Z., Xie L., Liu Y., Liu Y., Wang X., Li H., Lai W., He Y., Yao A., Ma L., Shao Y., Zhang B., Wang C., Chen H., Deng H. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progeni- tor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. 2017. 25(8): 1782–1789. DOI: https://doi.org/10.1016/j. ymthe.2017.04.027 80. Dash P.K., Kaminski R., Bella R., Su H., Mathews S., Ahooyi T.M., Chen C., Mancuso P., Sariyer R., Ferrante P., Donadoni M., Robinson J.A., Sillman B., Lin Z., Hilaire J.R., Banoub M., Elango M., Gautam N., Mosley R.L., Pol- uektova L.Y., McMillan J., Bade A.N., Gorantla S., Sariyer I.K., Burdo T.H., Young W.B., Amini S., Gordon J., Jacob- ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 75 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ son J.M., Edagwa B., Khalili K., Gendelman H.E. Sequential LASER ART and CRISPR treatments eliminate HIV-1 in a subset of infected humanized mice. Nat. Commun. 2019. 10(1): 2753. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019- 10366-y 81. Yuan M., Webb E., Lemoine N.R., Wang Y. CRISPR-Cas9 as a powerful tool for efficient creation of oncolytic viruses. Viruses. 2016. 8(3): E72. DOI: https://doi.org/10.3390/v8030072 82. Kennedy E.M., Kornepati A.V., Goldstein M., Bogerd H.P., Poling B.C., Whisnant A.W., Kastan M.B., Cullen B.R. Inactivation of the human papillomavirus E6 or E7 gene in cervical carcinoma cells by using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided endonuclease. J. Virol. 2014. 88(20): 11965–11972. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.01879-14 83. Miller J.F., Sadelain M. The journey from discoveries in fundamental immunology to cancer immunotherapy. Cancer Cell. 2015. 27(4): 439–449. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2015.03.007 84. Roth T.L., Puig-Saus C., Yu R., Shifrut E., Carnevale J., Li P.J., Hiatt J., Saco J., Krystofinski P., Li H., Tobin V., Nguyen D.N., Lee M.R., Putnam A.L., Ferris A.L., Chen J.W., Schickel J.N., Pellerin L., Carmody D., Alkorta-Aran- buru G., Del Gaudio D., Matsumoto H., Morell M., Mao Y., Cho M., Quadros R.M., Gurumurthy C.B., Smith B., Haugwitz M., Hughes S.H., Weissman J.S., Schumann K., Esensten J.H., May A.P., Ashworth A., Kupfer G.M., Gree- ley S.A.W., Bacchetta R., Meffre E., Roncarolo M.G., Romberg N., Herold K.C., Ribas A., Leonetti M.D., Marson A. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature. 2018. 559(7714): 405–409. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-018-0326-5 85. Zaroff S. CAR T-Cell therapies with a bispecific twist. Genet. Eng. Biotech. N. 2018. 38(13). https://www.geneng- news.com/magazine/car-t-cell-therapies-with-a-bispecific-twist/ DOI: https://doi.org/10.1089/gen.38.13.09 86. Kojima R., Scheller L., Fussenegger M. Nonimmune cells equipped with T-cell-receptor-like signaling for cancer cell ablation. Nature Chemical Biology. 2018. 14: 42–49. DOI: https://doi.org/10.1038/nchembio.2498 87. Montel-Hagen A., Seet C.S., Li S., Chick B., Zhu Y., Chang P., Tsai S., Sun V., Lopez S., Chen H.C., He C., Chin C.J., Casero D., Crooks G.M. Organoid-induced differentiation of conventional T cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2019. 24(3): 376–389.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.12.011 88. White M.K., Khalili K. CRISPR/Cas9 and cancer targets: future possibilities and present challenges. Oncotarget. 2016. 7(11): 12305–12317. DOI: https://doi.org/10.18632/oncotarget.7104 89. Cyranoski D. CRISPR gene-editing tested in a person for the first time. Nature News. 2016. 539(7630): 479. DOI: https://doi.org/10.1038/nature.2016.20988 90. New cancer drug targets accelerate path to precision medicine. https://www.drugtargetreview.com/news/42672/ new-cancer-drug-targets-accelerate-path-to-precision-medicine/ 91. Booth C., Gaspar H.B., Thrasher A.J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends Mol. Med. 2016. 22(4): 317–327. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molmed.2016.02.002 92. Guan Y., Ma Y., Li Q., Sun Z., Ma L., Wu L., Wang L., Zeng L., Shao Y., Chen Y., Ma N., Lu W., Hu K., Han H., Yu Y., Huang Y., Liu M., Li D. CRISPR/Cas9-mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse. EMBO Mol. Med. 2016. 8(5): 477–488. DOI: https://doi.org/10.15252/ emmm.201506039 93. Nelson C.E., Hakim C.H., Ousterout D.G., Thakore P.I., Moreb E.A., Castellanos Rivera R.M., Madhavan S., Pan X., Ran F.A., Yan W.X., Asokan A., Zhang F., Duan D., Gersbach C.A. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016. 351(6271): 403–407. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.aad5143 94. DeWitt M.A., Magis W., Bray N.L., Wang T., Berman J.R., Urbinati F., Heo S.J., Mitros T., Mu oz D.P., Boffelli D., Kohn D.B., Walters M.C., Carroll D., Martin D.I., Corn J.E. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci. Transl. Med. 2016. 8(360): 360ra134. DOI: https://doi. org/10.1126/scitranslmed.aaf9336 95. CRISPR patent fight turns ugly as UC accuses Broad researchers of lying about claims. https://www.genomeweb. com/business-news/crispr-patent-fight-turns-ugly-uc-accuses-broad-researchers-lying-about-claims 96. Sanders R. UC rings out 2019 with its 20th CRISPR patent. https://news.berkeley.edu/2019/12/31/uc-rings-out- 2019-with-its-20th-crispr-patent/ 97. Craven L., Herbert M., Murdoch A., Murphy J., Lawford Davies J., Turnbull D.M. Research into policy: a brief his- tory of mitochondrial donation. Stem Cells. 2016. 34(2): 265–267. DOI: https://doi.org/10.1002/stem.2221 98. Callaway E. UK scientists gain license to edit genes in human embryos. Nature News. 2016. 530(7588): 18. DOI: https://doi.org/10.1038/nature.2016.19270 99. Mills P. Genome editing and human reproduction: The Nuffield Council on Bioethics’ report. https://www.bionews. org.uk/page_137343 76 ISSN 1027-3239. Visn. Nac. Acad. Nauk Ukr. 2020. (3) СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ 100. Becker R. The ‘three-parent baby’ fertility doctor needs to stop marketing the procedure, FDA says. https://www. theverge.com/2017/8/5/16100680/three-parent-baby-fertility-doctor-fda-letter-violations 101. This fertility doctor is pushing the boundaries of human reproduction, with little regulation. https://www.wash- ingtonpost.com/national/health-science/this-fertility-doctor-is-pushing-the-boundaries-of-human-reproduction- with-little-regulation/2018/05/11/ea9105dc-1831-11e8-8b08-027a6ccb38eb_story.html 102. Sangamo ZFN Technology Platform. 2018. https://www.sangamo.com/application/files/6915/3002/3307/IR- Technology_v06.12.18_1.pdf 103. Haridy R. First CRISPR therapy administered in landmark human trial. https://newatlas.com/crispr-trial-under- way-vertex-gene-therapy/58643/ 104. The Future of CRISPR. http://www.fwreports.com/dossier/the-future-of-crispr/#.XmgL-kFR2Uk 105. «Tegsedi»: an oligonucleotide drug against familial amyloid polyneuropathy. (in Russian). https://mosmedprepara- ty.ru/news/16897 [«Тегседи»: олигонуклеотидное лекарство против семейной амилоидной полинейропатии.] 106. Stolberg S.G. The biotech death of Jesse Gelsinger. http://www.nytimes.com/1999/11/28/magazine/the-biotech- death-of-jesse-gelsinger.html 107. Bersenev A. The history of gene therapy drugs approval on the market. http://stemcellassays.com/2011/12/histo- ry-gene-therapy-drugs-approval-market/ 108. Morrison C. 1-million price tag set for Glybera gene therapy. Nature Biotechnology. 2015. 33: 217–218. DOI: https:// doi.org/10.1038/nbt0315-217 109. Kozubek J. Who will pay for CRISPR? https://www.statnews.com/2017/06/26/crispr-insurance-companies-pay/ 110. Talimogene laherparepvec. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Talimogene_laherparepvec 111. Kegel M. Imlygic-Yervoy combo twice as effective as Yervoy in fighting melanoma, study finds. https://immuno- oncologynews.com/2017/10/12/melanoma-investigational-therapy-combo-imlygic-yervoy-twice-as-effective-yer- voy-alone-study-finds/ 112. Mullin E. A gene therapy that cures a rare genetic disease just got its first customer, a year after it was approved. http://www.businessinsider.com/gsks-strimvelis-gene-therapy-used-for-the-first-time-after-approval-2017-5 113. Al Idrus A. Orchard Therapeutics’ 2019: Pipeline progress, breaking ground on its $90M manufacturing site. https://www.fiercebiotech.com/biotech/orchard-therapeutics-2019-pipeline-progress-breaking-ground-its-90m- manufacturing-site 114. Sampson T.R., Saroj S.D., Llewellyn A.C., Tzeng Y.L., Weiss D.S. A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature. 2013. 497(7448): 254–257. DOI: https://doi.org/10.1038/nature12048 115. Koonin E.V., Krupovic M. Evolution of adaptive immunity from transposable elements combined with innate im- mune systems. Nat. Rev. Genet. 2015. 16(3): 184–192. DOI: https://doi.org/10.1038/nrg3859 116. Wright A.V., Liu J.J., Knott G.J., Doxzen K.W., Nogales E., Doudna J.A. Structures of the CRISPR genome integra- tion complex. Science. 2017. 357(6356): 1113–1118. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aao0679 117. Jiang F., Taylor D.W., Chen J.S., Kornfeld J.E., Zhou K., Thompson A.J., Nogales E., Doudna J.A. Structures of a CRISPR/Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science. 2016. 351(6275): 867–871. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aad8282 118. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P., Volz S.E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E.V., Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015. 163(3): 759–771. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038 119. Gleeson A., Sawyer A. CRISPR/Cas9: the gold standard of genome editing? Biotechniques. 2018. 64(6): 239–243. DOI: https://doi.org/10.2144/btn-2018-0066 120. Sansbury B.M., Wagner A.M., Nitzan E., Gabi T., Kmeic E.B. CRISPR-directed in vitro gene editing of plasmid DNA catalyzed by Cpf1 (Cas12a) nuclease and a mammalian cell-free extract. CRISPR J. 2018. 1(2): 191–202. DOI: https://doi.org/10.1089/crispr.2018.0006 121. Burstein D., Harrington L.B., Strutt S.C., Probst A.J., Anantharaman K., Thomas B.C., Doudna J.A., Banfield J.F. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. Nature. 2017. 542(7640): 237–241. DOI: https://doi. org/10.1038/nature21059 122. Hegge J.W., Swarts D.C., van der Oost J. Prokaryotic Argonaute proteins: novel genome-editing tools? Nat. Rev. Microbiol. 2017. 16(1): 5–11. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.73 123. Harrington L.B., Burstein D., Chen J.S., Paez-Espino D., Ma E., Witte I.P., Cofsky J.C., Kyrpides N.C., Banfield J.F., Doudna J.A. Programmed DNA Destruction by Miniature CRISPR-Cas14 Enzymes. Science. 2018. 362(6416): 839–842. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aav4294 ISSN 1027-3239. Вісн. НАН України, 2020, № 3 77 СТАТТІ ТА ОГЛЯДИ 124. Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I.M., Cox D.B., Shmakov S., Makarova K.S., Semenova E., Minakhin L., Severinov K., Regev A., Lander E.S., Koonin E.V., Zhang F. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016. 353(6299): aaf5573. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aaf5573 125. Smargon A.A., Cox D.B., Pyzocha N.K., Zheng K., Slaymaker I.M., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.A., Essletz- bichler P., Shmakov S., Makarova K.S., Koonin E.V., Zhang F. Cas13b is a type VI-B CRISPR-associated RNA- guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28. Mol. Cell. 2017. 65(4): 618–630.e7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023 126. Yan W.X., Chong S., Zhang H., Makarova K.S., Koonin E.V., Cheng D.R., Scott D.A. Cas13d is a compact RNA- targeting type VI CRISPR effector positively modulated by a WYL-domain-containing accessory protein. Mol Cell. 2018. 70(2): 327–339. DOI: https://doi.org/10.1016 / j.molcel.2018.02.028 127. Chatterjee P., Jakimo N., Jacobson J.M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Sci. Adv. 2018. 4(10): eaau0766. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.aau0766 128. New DNA ‘shredder’ technique goes beyond CRISPR’s scissors. https://www.drugtargetreview.com/news/42518/ new-dna-shredder-technique-goes-beyond-crisprs-scissors/ 129. Sadhu M.J., Bloom J.S., Day L., Siegel J.J., Kosuri S., Kruglyak L. Highly parallel genome variant engineering with CRISPR-Cas9. Nat. Genet. 2018. 50(4): 510–514. DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-018-0087-y 130. Enzyme fragment complementation assay technology. https://www.discoverx.com/technologies-platforms/en- zyme-fragment-complementation-technology 131. Biosensor development using CRISPR to quantify endogenous protein modulated by targeted protein degraders. http://www.healthtech.com/eurofins-biosensor-Development-using-crispr/ 132. Zengerle M., Chan K.-H., Ciulli A. Selective small molecule induced degradation of the BET bromodomain protein BRD4. ACS Chem. Biol. 2015. 10(8): 1770. DOI: https://doi.org/10.1021/acschembio.5b00216 133. Single-stranded DNA synthesis service. https://www.genscript.com/new-single-stranded-dna-synthesis-service. html 134. Strecker J., Ladha A., Gardner Z., Schmid-Burgk J.L., Makarova K.S., Koonin E.V., Zhang F. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 2019. 365(6448): 48–53. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.aax9181 135. Stafforst T., Schneider M.F. An RNA-deaminase conjugate selectively repairs point mutations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2012. 51(44): 11166–11169. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201206489 136. Reardon S. Step aside CRISPR, RNA editing is taking off. Nature. 2020. 578(7793): 24–27. DOI: https://doi. org/10.1038/d41586-020-00272-5 137. Pennisi E. The CRISPR craze. Science. 2013. 341(6148): 833–836. DOI: https://doi.org/10.1126/science.341. 6148.833 138. Gene editing like CRISPR is too important to be left to scientists alone. https://www.theguardian.com/comment- isfree/2019/oct/22/gene-editing-crispr-scientists S.V. Komisarenko, S.I. Romanyuk Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv GENOME EDITING, OR CRISPR/CAS9 — A PANACEA FOR MANY INCURABLE DISEASES OR THE FIRST STEP TO A GENE APOCALYPSE? The review discusses the history of discovery, rapid development and further prospects for the use of a new powerful genome editing tool, CRISPR/Cas9. Taking one of the elements of the bacterial protective system, biologists have cre- ated a simple, inexpensive and fast method of altering the DNA of plants, animals and humans. Never before has human- ity had such an accurate tool for gene manipulation, and this opens up great opportunities for the prevention and treat- ment of many diseases. At the same time, there is a heated debate in society: will CRISPR/Cas9 bring good or evil to humanity? Like any new technology, gene editing raises concerns and raises a number of serious ethical issues, especially regarding its use on germline cells and the genome of human embryos. However, it is already clear that CRISPR/Cas9 is not another fancy “toy” for scientists, but a revolutionary technology that will change our future. Keywords: CRISPR/Cas9, genomic DNA editing, gene therapy, genetically modified organisms.

Редагування геному, або CRISPR/CAS9 — панацея від багатьох невиліковних хвороб чи перший крок до генного апокаліпсису?

Institution

Ähnliche Einträge