Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus

Отримано рекомбінантний фрагмент протеїну А Staphylococcus aureus з унікальною послідовністю, який складається з чотирьох доменів: D–E–A–A* і експресується в клітинах Escherichia coli. З метою перевірки його функціональної активності проведено тести на здатність взаємодіяти з імуноглобулінами, в яки...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2009
Hauptverfasser:	Олійник, О.С., Колибо, Д.В., Кабернюк, А.А., Лабинцев, А.Ю., Короткевич, Н.В., Романюк, С.І., Комісаренко, С.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Ukrainian
Veröffentlicht:	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2009
Schriftenreihe:	Біотехнологія
Schlagworte:	Експериментальні статті
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28174
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus / О.С. Олійник, Д.В. Колибо, А.А. Кабернюк, А.Ю. Лабинцев, Н.В. Короткевич, С.І. Романюк, С.В. Комісаренко // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 59-68. — Бібліогр.: 35 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-28174
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-281742011-11-01T12:13:53Z Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus Олійник, О.С. Колибо, Д.В. Кабернюк, А.А. Лабинцев, А.Ю. Короткевич, Н.В. Романюк, С.І. Комісаренко, С.В. Експериментальні статті Отримано рекомбінантний фрагмент протеїну А Staphylococcus aureus з унікальною послідовністю, який складається з чотирьох доменів: D–E–A–A* і експресується в клітинах Escherichia coli. З метою перевірки його функціональної активності проведено тести на здатність взаємодіяти з імуноглобулінами, в яких використано кон’югати цього рекомбінантного фрагмента з пероксидазою хрону та наночастками колоїдного золота.Встановлено, що рекомбінантний фрагмент протеїну А, мічений пероксидазою хрону або колоїдним золотом, має таку саму специфічність стосовно імуноглобулінів ссавців, як і природний протеїн А. Одержаний аналог протеїну А можна використовувати не лише при створенні хроматографічних сорбентів для виділення імуноглобулінів та імунохімічних кон’югатів з метою виявлення антитіл, але й у подальших фундаментальнихдослідженнях імунобіологічних властивостей протеїну А. Получен рекомбинантный фрагмент протеина А Staphylococcus aureus с уникальной последовательностью, состоящий из четырех доменов: D–E–A–A* и экспрессирующийся в клетках Escherichia coli. С целью проверки функциональной активности были протестированы его иммуноглобулинсвязывающие свойства с использованием конъюгат этого рекомбинантного фрагмента с пероксидазой хрена и наночастицами коллоидного золота. Показано, что рекомбинантный фрагмент протеина А, меченный пероксидазой хрена или коллоидным золотом, обладает такой же специфичностью по отношению к иммуноглобулинам млекопитающих, как и природный протеин А. Таким образом, полученный аналог протеина А можно использовать при создании хроматографических сорбентов для выделения иммуноглобулинов и иммунохимических конъюгат для выявления антител, а также в дальнейших фундаментальных исследованиях иммунобиологических свойств протеина А. Recombinant fragment of protein A from Staphylococcus aureus with unique sequence, which has four domains D-E-A-A* and is expressed in Escherichia coli have been obtained. Conjugates of recombinant fragment with horse radish peroxidase and colloidal gold nanoparticles were used for testing its functional activity and immunoglobulin-binding properties. It was shown, that recombinant fragment of protein A marked by horseradish peroxidase or colloidal gold nanoparticles, has the same specificity to mammal immunoglobulines as nativeprotein A. Therefore an obtained analog of protein A can be used not only in development of chromatography sorbents for immunoglobulins purification and immunochemical conjugates for immunoglobulins detection, but also in fundamental investigations of immunobiological properties of protein A. 2009 Article Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus / О.С. Олійник, Д.В. Колибо, А.А. Кабернюк, А.Ю. Лабинцев, Н.В. Короткевич, С.І. Романюк, С.В. Комісаренко // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 59-68. — Бібліогр.: 35 назв. — укр. 1995-5537 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28174 577(с87.1+112.4) uk Біотехнологія Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Експериментальні статті Експериментальні статті
spellingShingle	Експериментальні статті Експериментальні статті Олійник, О.С. Колибо, Д.В. Кабернюк, А.А. Лабинцев, А.Ю. Короткевич, Н.В. Романюк, С.І. Комісаренко, С.В. Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus Біотехнологія
description	Отримано рекомбінантний фрагмент протеїну А Staphylococcus aureus з унікальною послідовністю, який складається з чотирьох доменів: D–E–A–A* і експресується в клітинах Escherichia coli. З метою перевірки його функціональної активності проведено тести на здатність взаємодіяти з імуноглобулінами, в яких використано кон’югати цього рекомбінантного фрагмента з пероксидазою хрону та наночастками колоїдного золота.Встановлено, що рекомбінантний фрагмент протеїну А, мічений пероксидазою хрону або колоїдним золотом, має таку саму специфічність стосовно імуноглобулінів ссавців, як і природний протеїн А. Одержаний аналог протеїну А можна використовувати не лише при створенні хроматографічних сорбентів для виділення імуноглобулінів та імунохімічних кон’югатів з метою виявлення антитіл, але й у подальших фундаментальнихдослідженнях імунобіологічних властивостей протеїну А.
format	Article
author	Олійник, О.С. Колибо, Д.В. Кабернюк, А.А. Лабинцев, А.Ю. Короткевич, Н.В. Романюк, С.І. Комісаренко, С.В.
author_facet	Олійник, О.С. Колибо, Д.В. Кабернюк, А.А. Лабинцев, А.Ю. Короткевич, Н.В. Романюк, С.І. Комісаренко, С.В.
author_sort	Олійник, О.С.
title	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus
title_short	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus
title_full	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus
title_fullStr	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus
title_full_unstemmed	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus
title_sort	клонування та експресія функціонально активного фрагмента d-e-a-a* протеїну а staphylococcus aureus
publisher	Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
publishDate	2009
topic_facet	Експериментальні статті
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/28174
citation_txt	Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus / О.С. Олійник, Д.В. Колибо, А.А. Кабернюк, А.Ю. Лабинцев, Н.В. Короткевич, С.І. Романюк, С.В. Комісаренко // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 1. — С. 59-68. — Бібліогр.: 35 назв. — укр.
series	Біотехнологія
work_keys_str_mv	AT olíjnikos klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus AT kolibodv klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus AT kabernûkaa klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus AT labincevaû klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus AT korotkevičnv klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus AT romanûksí klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus AT komísarenkosv klonuvannâtaekspresíâfunkcíonalʹnoaktivnogofragmentadeaaproteínuastaphylococcusaureus
first_indexed	2025-07-03T08:11:10Z
last_indexed	2025-07-03T08:11:10Z
_version_	1836612606064852992
fulltext	59 Протеїн А Staphylococcus aureus та його рекомбінантні аналоги завдяки здатності зв’язуватися з імуноглобулінами різних видів тварин широко використовують при створенні афінних сорбентів та біоспе� цифічних міток в імунохімії та біотехно� логії. Генно�інженерні похідні протеїну А мають ширшу сферу застосування, ніж сам протеїн А: їх, наприклад, використовують як мітки для афінного очищення інших ре� комбінантних протеїнів, а також як рандо� мізовані афінні ліганди — афібоді з широ� ким спектром специфічностей. Протеїн А S. aureus (SPA — від англ. Staphylococcal protein A) має молекулярну масу 42 кДа, входить до складу клітинної стінки стафілокока і, як вважають, бере ак� тивну участь у патогенезі стафілококової інфекції. Протеїн А містить сигнальну С� кінцеву амінокислотну послідовність LPXTG, що є характерною для багатьох ін� ших адгезинів грампозитивних бактерій [1, 2]. SPA, що розташований на поверхні ста� філокока, здатен зв’язувати імуноглобуліни переважно за їхні Fc�фрагменти, тобто в зво� ротній орієнтації, що дозволяє стафілококу уникати опсонізації, фагоцитозу та компле� ментзалежного лізису [3]. Також SPA при� таманна здатність взаємодіяти з іншими протеїнами хазяїна, наприклад, з рецепто� ром до фактора некрозу пухлин (TNFR1) [4] та фактором фон Віллібранта [5], що дає змо� гу стафілококу взаємодіяти з поверхнею клітин хазяїна та спричинювати запалення. Завдяки здатності зв’язуватися з Fab�фраг� ментами імуноглобулінових рецепторів наївних В�клітин, протеїн А стафілокока ви� являє властивості суперантигена, тобто субстанції, яка може призвести до полікло� нальної активації імунної відповіді. Така ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ УДК 577(с87.1+112.4) КЛОНУВАННЯ ТА ЕКСПРЕСІЯ КЛОНУВАННЯ ТА ЕКСПРЕСІЯ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТАФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТА D>E>A>A* ПРОТЕЇНУ А D>E>A>A* ПРОТЕЇНУ А SStaphylococcus aureustaphylococcus aureus Ключові слова: протеїн А, Staphylococcus aureus, рекомбінантний аналог, імуноглобулінзв’язувальна активність, імуноензимний аналіз, імунохроматографічні тести. О. С. Олійник Д. В. Колибо А. А. Кабернюк А. Ю. Лабинцев Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ Н. В. Короткевич С. І. Романюк С. В. Комісаренко E:mail: kolibo@biochem.kiev.ua Отримано рекомбінантний фрагмент протеїну А Staphylococcus aureus з унікальною послідовністю, який складається з чотирьох доменів: D–E–A–A* і експресується в клітинах Escherichia coli. З метою перевірки його функціональної активності проведено тести на здатність взаємодіяти з імуноглобулінами, в яких використано кон’югати цього рекомбінантного фрагмента з пероксидазою хрону та наночастками колоїдного золота. Встановлено, що рекомбінантний фрагмент протеїну А, мічений пероксидазою хрону або колоїдним золо� том, має таку саму специфічність стосовно імуноглобулінів ссавців, як і природний протеїн А. Одержаний ана� лог протеїну А можна використовувати не лише при створенні хроматографічних сорбентів для виділення іму� ноглобулінів та імунохімічних кон’югатів з метою виявлення антитіл, але й у подальших фундаментальних дослідженнях імунобіологічних властивостей протеїну А. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 60 активація здебільшого закінчується заги� беллю активованих клонів В�лімфоцитів, що зумовлює розвиток стану неспецифічної імуносупресії [6, 7]. Наявність у протеїну А таких властивостей відкриває можливість створення на його основі препарату для лікування ряду системних автоімунних по� рушень. Однак найширшою сферою прак� тичного застосування протеїну А є викорис� тання його імуноглобулінзв’язувальної активності в біотехнологічній індустрії, зок� рема у синтезі на основі цього протеїну афінних сорбентів для виділення імуногло� булінів, а також у створенні реагентів, здат� них виявляти антитіла та їх комплекси з ан� тигеном в імунохімічному аналізі [8]. Протеїн А є універсальним реагентом для візуалізації імунохімічних реакцій за участю антитіл багатьох видів ссавців. Це дає можливість, змінюючи лише антиген, використовувати принципи та підходи, що їх розроблено у процесі створення однієї тест�системи, для інших тест�систем, спря� мованих на визначення антитіл до антигенів широкого кола збудників людини і тварин. Для застосування в імунохімії протеїн А кон’югують з різними мітками, такими як флуоресцентні барвники, ензими, колоїдні наночастки, радіоізотопи або залишки біотину. Така кон’югація майже не призво� дить до втрати здатності зв’язувати імуно� глобуліни. Біотехнологічна промисловість випускає сорбенти з протеїном А на основі латексних, магнітних і агарозних кульок. Такі сорбен� ти дозволяють вилучати антитіла із суміші, наприклад з асцитної рідини або із сироват� ки крові. Також за допомогою цих сорбентів можна проводити реакцію імунопре� ципітації для вилучення із суміші окремих протеїнів у складі імунних комплексів. Цікавий підхід було запропоновано для іммобілізації протеїну А на целюлозі: для цього використовували генетично�злитий протеїн, що складався з протеїну А та целю� лозозв’язувального домену (CBD — cellu� lose�binding domain) Clostridium cellulovo: rans [9]. Окрім нативного протеїну А, дедалі частіше використовують його різні ре� комбінантні аналоги. Наприклад, шляхом сайтспрямованого мутагенезу було отрима� но рекомбінантний аналог протеїну А, який містив заміну Asn на Ala в 28 положенні В� домену, що призвело до втрати здатності взаємодіяти з Fab�фрагментами імуногло� булінів без зміни афінності взаємодії з Fc� фрагментами. Водночас цей домен виявився більш стійким до протеолізу і розщеплення гідроксиламіном, оскільки чутлива до роз� щеплення ділянка Asn�Gly була замінена на Ala�Gly. Такий змінений В�домен отримав назву Z�домену [10], а конструкції, що містять його тандемний повтор (ZZ�фраг� мент), мають найширше практичне вико� ристання серед усіх рекомбінантних ана� логів протеїну А [11] завдяки здатності цього фрагмента зв’язувати імуноглобуліни в такому ж самому молярному співвідношен� ні, що й природний протеїн А [12]. Послідов� ність, що кодує ZZ�фрагмент, використову� ють також у деяких комерційних векторах для експресії, що дозволяє спростити виді� лення та детекцію отриманих злитих протеї� нів [11]. У низці робіт було показано, що ви� користання протеїну А стафілокока чи його фрагментів як маркерних послідовностей у рекомбінантних протеїнах поліпшує фол� динг та підсилює вихід злитого протеїну в розчинній формі [13]. Для «м’якших» умов елюції антитіл штучно розробляють низько� афінні рекомбінантні аналоги протеїну А. Наприклад, збільшенням петлі між першою і другою альфа�спіралями вдалося отримати похідне Z�домену, комплекс якого з IgG ди� соціює при pH 4,5 (комплекс не модифікова� ного Z�домену з IgG дисоціює при pH 3,3) [14]. Крім протеїну А стафілокока відомі й ін� ші протеїни мікроорганізмів, що зв’язують імуноглобуліни. Це — протеїн G стрепто� коків та протеїн L Peptostreptococcus magnus [15]. Кожен із цих протеїнів зв’язує свій власний профіль імуноглобулінів, що дозво� ляє використовувати їх з різною метою. Та� кож відомий штучно створений химерний протеїн A/G з молекулярною масою 50,46 кДа, що складається з чотирьох доменів протеїну А і двох доменів протеїну G. Цей протеїн поєднує імуноглобулін�зв’язувальні власти� вості протеїнів А та G, що розширює спектр його специфічності до різних класів імуно� глобулінів [16]. Принципово новим напрямом у біотехно� логії є створення афінних конструкцій (афі� боді) на основі протеїну А сайтспрямованим мутагенезом та відбором найбільш афінних варіантів за допомогою фагового дисплея [17]. Наприклад, на основі Z�домену було створено афібоді шляхом замін 13 поверхне� вих амінокислот цього домену [18]. Застосу� вання технології комбінаторної протеїнової інженерії для отримання реагентів з певною специфічністю розглядають як потужну альтернативу технології одержання реком� бінантних антитіл. З огляду на вищезазначене можна зроби� ти висновок, що отримання нових рекомбі� Експериментальні статті 61 нантних аналогів протеїну А S. aureus є перспективним напрямом сучасної біотех� нології, який активно розвивається, відкри� ваючи нові можливості застосування по� дібних аналогів як у прикладній, так і в фундаментальній сфері. Тому метою да� ної роботи було одержати фрагмент стафіло� кокового протеїну А з унікальною послідов� ністю, перевірити його функціональну активність і специфічність до імуноглобулі� нів різних видів ссавців порівняно з природ� ним протеїном А, а також можливість вико� ристовувати отриманий рекомбінантний протеїн у складі кон’югатів в імуноензимно� му та імунохроматографічному тестуванні. Матеріали і методи Одержання рекомбінантного фрагмента протеїну А S. aureus. Нуклеотидну послі� довність, що кодує необхідний фрагмент протеїну А, було ампліфіковано з геномної ДНК ізоляту золотистого стафілокока (ізо� лят не ідентифікували на належність до штаму). Для виділення стафілококів ма� теріал із мазків горла, взятих в авторів статті, висівали на селективно�дифе� ренційне середовище — жовтково�сольовий агар Г. Н. Чистовича (поживний агар, що містить 10% NaCl, до якого додавали 20% жовткової суспензії). Для відбору бактерій� носіїв гена протеїну А колонії, що виросли, тестували в ПЛР�аналізі на наявність про� дуктів відповідного розміру. Для ампліфікації нуклеотидної послі� довності, що кодує фрагмент протеїну А, ви� користовували пару олігонуклеотидних праймерів з роботи Gomez et al. [4], у послі� довність яких додали сайти для ендонуклеаз рестрикції BamHI та XhoI. ПЛР�ампліфіка� цію проводили на термоциклері 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, США) з використанням реактивів виробництва Fermentas (Литва) за режиму 95 0С 3 хв, 30 циклів (95 0С 1 хв, 51,5 0С 1 хв, 72 0С 2 хв) 72 0С 7 хв. Одержаний ПЛР�продукт гідролізували ендонуклеазами рестрикції BamHI та XhoI та клонували у векторі рЕТ�28с(+) (Novagen, США). Такою рекомбінантною конструк� цією трансформували клітини E. coli DH10B. Із отриманих після трансформації клонів методом лужного лізису виділяли плазміду [19] і проводили рестрикційний аналіз. Для цього зразки плазмід гідролізу� вали ендонуклеазами рестрикції BamHI і XhoI та аналізували отримані фрагменти в 1,0%�му агарозному гелі у трис�ацетатно� му буфері, рН 7,6 (40 мМ трис�оксимети� ламінометан, 1 мМ ЕДТА). Із клону, що міс� тив фрагмент, який відповідає цільовій послі� довності, виділяли плазміду і трансформували клітини E.coli Rosetta (ДЕЗ) (Novagen, США) методом електропорації, використо� вуючи близько 25 нг ДНК, за напруги 1800 V, на приладі Electroporator 2510 (Eppendorf, ФРН). Потім клітини переносили в 1 мл се� редовища SOС (без селективного антибіоти� ка) та інкубували протягом 1 год при 37 0С, перемішуючи зі швидкістю 225 об/хв. Після цього їх висівали на чашки Петрі з твердим живильним середовищем 2YT, що містило селективний антибіотик канаміцин (середовища SOС та 2YT готували згідно з [19]). Секвенування нуклеотидної послі� довності отриманого фрагмента проводили в Українській лабораторії якості і безпеки продукції агропромислового комплексу. Отримані клони аналізували на наяв� ність продукту в клітинних лізатах методом електрофорезу в 10%�му ПААГ у присут� ності SDS [20] та методом імуноблотингу. Клітини штаму�продуцента нарощували при 37 0С на живильному середовищі 2YT з до� даванням селективного антибіотика (канамі� цину) до А600 = 0,5–1,0, після чого вносили індуктор експресії — IPTG (ізопропіл�β�D�тіо� галактопіранозид) до концентрації 1 мМ та ще 4 год при 30 0С. Після цього клітинну біомасу осаджували центрифугуванням (3 000 об/хв), осад ресуспендували в буфері, що містив 10 мМ Tris�HCl (pH 7,5), 2,5 мM MgCl2, 0,1 мM CaCl2, 100 мкг/мл лізоциму, 10 од/мл ДНК� ази й інкубували протягом 30 хв при 0 0С. Після цього зразки обробляли ультразвуковим дезінтегратором Labsonic (Sartorius, ФРН). Фракцію розчинних протеїнів, що містила цільовий продукт, відокремлювали від нероз� чинної центрифугуванням (7 500–8 500 g). Імуноблотинг проводили шляхом елект� роперенесення протеїнів із гелю на нітро� целюлозну мембрану на приладі Hoefer™ ТЕ77. Потім мембрану вміщували в 5%�й розчин знежиреного молока в ЗФР (0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,144% Na2HPO4, 0,024% KH2PO4, pH 7,4) та інкубували при 4 0С упро� довж ночі. Після цього мембрану промивали і занурювали у розчин кон’югованих з пе� роксидазою антитіл проти полігістидинової маркерної послідовності. Антитіла (Sigma, США) вносили в ЗФР, що містив 0,04% Твін�20, та інкубували 1 год при 37 0C, після чого промивали. Для візуалізації резуль� татів нітроцеллюлозну мембрану переноси� ли в 0,06%�й розчин діамінобензидину, який містив 0,003% пероксиду водню. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 62 Рекомбінантний фрагмент протеїну А виділяли методом металоафінної хромато� графії на сорбенті Ni�NTA агароза (Sigma, США) у нативних умовах. Сорбент врівнова� жували, відмиваючи двічі дистильованою водою та один раз буфером для відмивання (50 мМ Na2HPO4, 0,5 M NaCl, pH 8,0 ) з роз� рахунку 1,5 мл на 50 мкл сорбенту. Клітини штаму�продуцента нарощували, індукували експресію, після чого осаджували центри� фугуванням 15 хв зі швидкістю 3 000 об/хв. До осаду додавали буфер для лізису (50 мМ Na2HPO4, 0,3 M NaCl, 100 мкг/мл лізоциму, 10 од/мл ДНК�ази, pH 8,0) з розрахунку 1 мл буфера на 20 мл клітинної суспензії та інкубували 30 хв при 0 0С. Після цього суміш обробляли ультразвуковим дезінте� гратором і видаляли нерозчинні залишки осадженням 15 хв, 8 500 g. Надосадову ріди� ну додавали до врівноваженого сорбенту (з розрахунку 1 мл на 50 мкл сорбенту) і за� лишали на 1 год при 30 0С, періодично пе� ремішуючи. Потім сорбент зі зв’язаним про� теїном тричі промивали буфером для відмивання, двічі буфером для відмивання з 10 мМ імідазолом та елюювали протеїн бу� фером для елюції (20 мМ Тris�НCl (рН 7,5), 100 мМ NaCl, 350 мМ імідазол). Для визначення концентрації протеїну використовували метод Бредфорда [21], про� би аналізували електрофорезом у 10% ПААГ. Синтез кон’югатів рекомбінантного та природного протеїнів А з пероксидазою хро: ну проводили за допомогою перйодатного методу за методикою Nakane [22]. Разом з рекомбінантним фрагментом для синтезу кон’югата було використано препарат при� родного протеїну А («Предприятие по произ� водству бакпрепаратов НИИЭМ им. Пасте� ра», Росія). До 1 мл розчину пероксидази хрону в дис� тильованій воді (4 мг/мл) додавали 200 мкл розчину перйодату натрію (21,4 мг/мл) та інкубували при кімнатній температурі про� тягом 20 хв за постійного перемішування. Після цього реакційну суміш ставили на діаліз на 12 год при 4 0С проти ацетатного бу� фера, 1 л якого містив 136 мг тригідрату аце� тату натрію та 39,7 мкл 99,6% оцтової кислоти (рН 4,4). До 0,5 мл активованої пе� роксидази в ацетатному буфері за постійного перемішування додавали 20 мкл натрійкар� бонатного буфера, 1 л якого містив 6,48 г Na2CO3 і 11,76 г NaHCO3 (рН 9,5), потім до� давали 250 мкл розчину протеїну А в натрій� карбонатному буфері (4 мг/мл) і перемішу� вали при кімнатній температурі упродовж 2 год. Після цього в реакційну суміш дода� вали 50 мкл розчину NaBH4 в дистильованій воді (4 мг/мл) і перемішували протягом 2 год при 4 0С. Отримані кон’югати очищува� ли шляхом висолювання насиченим розчи� ном сульфату амонію [22]. Дослідження імуноглобулінзв’язуваль: них властивостей кон’югатів протеїнів А з пероксидазою хрону проводили за допомо� гою імуноензимного аналізу [23]. Як антиге� ни використовували препарати, що містили імуноглобуліни 10 різних видів ссавців (лю� дини, миші, кроля, мурчака, свині, корови, вівці, кози, віслюка та коня). Синтез кон’югата рекомбінантного фрагмента протеїну А S. aureus з колоїд: ним золотом. До 50 мкл 1%�го водного роз� чину золотохлорводневої кислоти додавали 737,5 мкл дистильованої води, нагрівали до 60 0С та змішували з нагрітим до 60 0С буфе� ром, що містив 200 мкл 1%�го розчину цит� рату натрію, 7,5 мкл 0,03%�го водного роз� чину танінової кислоти та 5 мкл 1%�го розчину К2СО3. Суміш інкубувати 20 хв при 60 0С, після чого швидко охолоджували до 0 0С та додавали 25 мкг рекомбінантного фрагмента протеїну А. Через 40 хв додавали сироватковий альбумін бика (БСА) до кінце� вої концентрації 5% та інкубували ще 40 хв. Після інкубації суміш центрифугували 1 год (8 500 g, 0 0С), видаляли надосадову рідину, а осад ресуспендували у 0,2%�му розчині цитрату натрію, що містив 50 мг/мл БСА. У такому вигляді кон’югат зберігали при 4 0С. Оптичне поглинання отриманого кон’ю� гата вимірювали на спектрофотометрі СФ� 2000 (ОКБ «Спектр», Росія). Проведення імунохроматографічного аналізу. Для імунохроматографічного аналі� зу було використано нітроцелюлозні мемб� рани Hi�Flow та набір для комплектації тест� систем Hi�Flow™ Plus Assembly Kit Plus (Millipore, США). До складу стрипу, окрім нітроцелюлозної мембрани з іммобілізова� ними імуноглобулінами, входила також смужка для кон’югата колоїдного золота з протеїном А, та смужка, що вбирає надли� шок вологи під час руху проби і кон’югата в товщі мембрани. Використовували нітроце� люлозну мембрану розміром 5х30 мм. На смужку для кон’югата наносили 5 мкл роз� чину кон’югата колоїдного золота та вису� шували. Сироватки (в розведенні 1:100 у ЗФР) чи контрольний антиген (в концент� рації 1 мг/мл) наносили тонкою смугою, 30 хв витримували мембрану при 37 0С, після цього протягом 30 хв — у 5%�му розчині знежире� ного молока в ЗФР, потім промивали та ви� сушували. До нітроцелюлозної мембрани Експериментальні статті 63 прикріплювали з одного боку смужку для кон’югата, з другого — адсорбуючу смужку таким чином, щоб вони на кілька міліметрів покривали нітроцелюлозну мембрану, після цього смужку для кон’югата покривали фільтрувальним папером. Для проведення аналізу стрип занурювали у фізрозчин так, щоб у рідині знаходився лише фільтруваль� ний папір, і за 10 хв реєстрували наявність червоної смуги, що з’являється внаслідок взаємодії між Fc�фрагментами антитіл, іммобілізованих на мембрані, та кон’югова� ними з наночастками золота рекомбінантни� ми фрагментами протеїну А, які рухаються в товщі мембрани. Так само проводили аналіз для перевірки можливості візуалізувати отриманим кон’ю� гатом комплекси антиген–антитіло. На нітроцелюлозну мембрану наносили смугу антигену (рекомбінантну субодиницю В дифтерійного токсину) у концентрації 1 мг/мл, а імунну мишачу сироватку (5 мкл) — безпосередньо на смужку фільтрувального паперу і занурювали стрип у фізрозчин. Під час проведення аналізу антитіла мишачої сироватки зв’язуються із фрагментом про� теїну А, кон’югованим з наночастинками зо� лота, і, рухаючись у товщі мембрани, взає� модіють з антигеном, внаслідок чого на нітроцелюлозі проявляється червона смуга. Додатково на нітроцелюлозну мембрану бу� ло нанесено контрольну смугу (сироватки в розведенні 1:100) як контроль роботи кон’югата. Результати та обговорення Протеїн А S. aureus складається з п’яти доменів: D, E, A, B і C, кожен з яких має здатність зв’язуватись із Fc�фрагментом ан� титіл (як правило, IgM та IgG) багатьох видів тварин і людини [24]. Також кожен до� мен SРA здатен взаємодіяти з Fab�фрагмен� тами антитіл (IgM, IgA, IgG і IgE), що містять V+ H3 домен важкого ланцюга [25, 26]. Кожен з п’яти доменів SPA має послідов� ність приблизно з 56–61 амінокислотних залишків, які утворюють структуру, що складається з трьох антипаралельних аль� фа�спіралей. За допомогою рентгенострук� турного аналізу було показано, що в струк� турі В�домену 11 амінокислотних залишків першої та другої альфа�спіралі беруть участь у зв’язуванні з Fc�фрагментом IgG [27]. Вод� ночас за зв’язування з Fab�фрагментом ан� титіл відповідають інші 11 залишків, що на� лежать другій та третій альфа�спіралям [28]. Зв’язок між антитілом та кожним до� меном протеїну А досить міцний: за фізіоло� гічних умов константа афінності становить близько 108 М–1 [29, 30]. Протеїн А з висо� кою афінністю зв’язує IgG1 та IgG2 людини і IgG2a та IgG2b миші; із середньою афін� ністю — IgM, IgA та IgE людини й IgG3 та IgG1 миші і майже не реагує з IgG3 та IgD людини і IgM, IgA та IgE миші [31]. З метою отримання рекомбінантного фрагмента протеїну А, який би максималь� но відповідав імуноглобулінзв’язувальним властивостям природного SPA, ми клонува� ли послідовність, що кодує чотири спе� цифічні до Fc�фрагмента антитіл домени протеїну А: E�, D�, A� та В�домени. Ці доме� ни є гомологічними, і тому праймер, специ� фічний до нуклеотидної послідовності одного домену, може взаємодіяти з послідовностя� ми, які кодують інші домени, що ускладнює процедуру їх ампліфікації. Так у роботі Gomez і співавт. [4] для ампліфікації окре� мих доменів матричну ДНК перед ампліфі� кацією обробляли ендонуклеазами рестрикції для запобігання перехресному реагуванню праймерів. Для отримання необхідного фрагмента ДНК продукти полімеразної лан� цюгової реакції ми розділяли за допомогою електрофорезу в 1%�му агарозному гелі та виділяли фрагмент необхідного розміру. Не всі виділені колонії, що їх використо� вували для отримання ДНК�матриці, несли ген протеїну А (на рис. 1 показано лише час� тину проб). Довжина очікуваного фрагмента становила 718 п. н., відповідно для подаль� шої роботи було виділено фрагмент близько 700 п. н. Подальше секвенування клонова� ної ДНК�послідовності показало, що вона відповідає передбачуваній (рис. 2, А). Макси� мальна ідентичність, порівняно з окремими ізолятами золотистого стафілокока дорівню� вала 96%. Було проведено порівняння клонованого фрагмента протеїну А та відомих з літерату� ри амінокислотних послідовностей протеїну А, виділених зі S. aureus, з використанням пошукової системи амінокислотних послі� довностей NIH Protein BLAST. Виявлено, що клонована послідовність доменів E–D–A–A* протеїну А відповідає описаним раніше [24] його фрагментам його (рис. 2, А), окрім домену A, послідовність якого не ма� ла повної гомології ні з В� (різниця 4 аміно� кислоти), ні з А�доменом (різниця 2 аміно� кислоти) описаної послідовності. Під час додаткового BLAST�аналізу встановили, що отриманий A�домен є найбільш гомологіч� ним до А�домена (різниця 1 амінокислота) протеїну А S. aureus штаму V8 (рис. 2, В) БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 64 [32]. Таким чином, клонований фрагмент протеїну А має унікальну доменну послі� довність E–D–A–A. Відсутність у структурі одержаного ре� комбінантного протеїну очікуваної послі� довності домену В свідчить про унікальність виділеного ізоляту стафілокока. Крім того, можна припустити наявність особливих іму� нобіологічних властивостей у синтезованого цим штамом відповідного фактора патоген� ності. У літературі поки що нема даних про існування стафілококів з аналогічною послі� довністю доменів протеїну А, а отже відсутні дані й про їх патогенний вплив, що вказує на необхідність подальшого вивчення цього пи� тання. З іншого боку, унікальність отрима� ної послідовності рекомбінантного фрагмен� та протеїну А стафілокока дає підстави прогнозувати можливість його використан� ня для створення імуноафінних сорбентів для виділення імуноглобулінів у «пом’як� шених» умовах, оскільки в структурі фраг� мента відсутній найбільш афінний стосовно Fc�фрагментів IgG домен В [33]. Імуноблотинг з антитілами проти гісти� динового тагу підтвердив наявність у клітин� ному лізаті рекомбінантного протеїну з роз� рахованою за допомогою програми Vector NTI 10 масою — близько 28 кДа (рис. 3, В). Аналіз розчинної та нерозчинної білкових фракцій клітин штаму�продуцента виявив, що цільовий протеїн синтезується переваж� но у розчинному вигляді. Відповідно, проце� дуру очищення проводили без додавання де� натуруючих агентів (з використанням металоафінної хроматографії). На рис. 3, А наведено електрофореграму зразків різних фракцій виділеного продукту. На наступному етапі здійснено порівня� льні дослідження імуноглобулінзв’язуваль� них властивостей природного та отриманого нами рекомбінантного протеїнів А. За допо� могою перйодатного методу синтезували два кон’югати цих протеїнів А з пероксидазою хрону та перевірили в імуноензимному аналізі їхню активність і специфічність до імуноглобулінів 10 видів ссавців: людини, миші, кроля, мурчака, свині, корови, вівці, кози, віслюка та коня. Результати цих досліджень (рис. 4) показали, що за своїми властивостями щодо розпізнавання імуно� глобулінів перерахованих вище видів тварин і людини отриманий нами рекомбінантний протеїн А є абсолютним аналогом природного протеїну А S. aureus (коефіцієнт кореляції R = 0,979), і його можна використовувати у складі імунохімічних кон’югатів та хрома� тографічних сорбентів для виявлення або виділення імуноглобулінів. Для перевірки здатності рекомбінантно� го фрагмента протеїну А виявляти імуногло� буліни в хроматографічному латеральному імуноаналізі проводили його кон’югацію з наночастками колоїдного золота. Синтез колоїдного золота здійснювали за стандартною методикою відновлення тет� рахлориду золота натрійцитратом [34], про� те дослідним шляхом було розроблено низку модифікацій для оптимізації цієї процеду� ри. Вносячи різну кількість протеїну А, виз� начили його оптимальну концентрацію, яка становила 25 мкг/мл суспензії колоїдного золота (протеїн вносили у 20мM Tris�HCl бу� фері, рН 7,5). Розмір колоїдних частинок зо� лота, що їх використовували для синтезу кон’югата, визначали вимірюванням оптич� ного поглинання. Як видно з рис. 5, на гра� фіку є максимум 524 нм, що відповідає по� глинанню колоїдного золота з розміром частинок близько 40 нм [35]. Функціональну активність отриманого рекомбінантного фрагмента протеїну А 1 2 3 4 Рис. 1. ПЛР>ампліфікація послідовності, що кодує фрагмент протеїну А: 1 — маркери; 2, 3, 4 — зразки, отримані з використанням матриці ДНК, виділеної з різних колоній золотистого стафілокока Експериментальні статті 65 перевіряли методом імунохроматографії. На нітроцелюлозну мембрану наносили ан� титіла різних видів ссавців та людини, а та� кож контрольний антиген (рекомбінантну субодиницю В дифтерійного токсину), з яким кон’югат не реагуватиме (рис. 6). Як видно з рис. 6, отриманий кон’югат прояв� ляє смугу антитіл і не реагує з контрольним антигеном. Ці результати підтверджують, що оптимізована нами методика синтезу ко� лоїдного золота та його кон’югації з фрагмен� том протеїну А є ефективною, а отриманий рекомбінантний аналог протеїну А — функціонально активний. Під час зберіган� ня кон’югат залишався функціонально ак� тивним принаймні упродовж 7 міс. Ми також перевірили, чи можна застосо� вувати цей кон’югат безпосередньо для візу� Рис. 2. Порівняння амінокислотних послідовностей протеїнів А різного походження з використанням пошукової системи амінокислотних послідовностей NIH Protein BLAST: A — порівняння послідовності отриманого фрагмента протеїну А (rSPA) з найбільш подібною послідовністю протеїну А штаму S. aureus MW2 (SPA MW2). Сірим кольором позначено залишки, що відрізняються у порівнюваних послідовностей; В — порівняння послідовностей доменів А SPA, отриманих з S. aureus штамів MW2 (SPA MW2) та V8 (SPA V8) з С�кінцевим доменом фрагмента рекомбінантного протеїну А (rSPA). Червоним кольором позначено за� лишки, що відрізняються порівняно з послідовністю С�кінцевого домену одержаного фрагмента протеїну А (rSPA) А В А В 1 98765432 Рис. 3. Виділення (А) та ідентифікація наявності (В) рекомбінантного фрагмента протеїну А: 1, 8 — маркери молекулярної маси, 2, 3, 4, 5 — різні фракції виділеного продукту, 6 — матеріал, що не зв'язався з сорбентом, 7 — клітинний лізат із цільовим протеїном, 9 — імуноблотинг клітинного лізату із цільовим протеїном Рис. 4. Результати порівняльного імуноензимного аналізу здатності рекомбінантного і природного протеїнів А до взаємодії з імуноглобулінами ряду видів ссавців у складі кон’югатів з пероксидазою хрону людина кіньвіслюккозавівцякоровасвинямурчаккроликмиша IgG1 миша БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 66 алізації комплексів антиген–антитіло в не� прямому імунохроматографічному аналізі. На рис. 6, В наведено результати експери� менту, в якому на нітроцелюлозну мембрану наносили антиген (субодиницю В дифтерій� ного токсину), а сироватку імунізованої цим антигеном тварини додавали під час прове� дення аналізу. Як видно з рисунка, на нітро� целюлозі проявилася смуга антигену та контрольна смуга (імуноглобуліни кроля). Це підтверджує, що одержаний нами кон’ю� гат можна використовувати для розроблен� ня імунохроматографічних тест�систем у форматі непрямого аналізу для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові, ко� ли на нітроцелюлозній мембрані іммобілізо� вано відповідний антиген. Таким чином, отримано новий рекомбі� нантний аналог протеїну А Staphylococcus aureus масою близько 28 кДа, що містить чо� тири імуноглобулінзв’язувальні домени. Аналіз секвенованої нуклеотидної послідов� ності цього аналога показав, що протеїн має унікальну послідовність доменів E–D–A–A. Створення на основі одержаного фрагмента протеїну А кон’югатів з пероксидазою хрону та колоїдним золотом уможливило пе� ревірку його функціональної активності сто� совно імуноглобулінів різних видів ссавців. Результати імуноензимного та імунохрома� тографічного аналізів показали повну відповідність властивостей рекомбінантного та природного протеїнів А, що підтвердило можливість використання рекомбінантного протеїну для виявлення антитіл в імуноен� зимних тест�системах, імунохроматографіч� них швидких тестах, а також у складі афінних сорбентів для виділення імуноглобулінів. Імовірно, відсутність у складі отриманого рекомбінантного аналога протеїну А високо� афінного В�домену дозволить у майбутньому використовувати його для створення афін� ного сорбенту з метою виділення імуногло� булінів у «м’яких» умовах. Рис. 5. Спектр оптичного поглинання колоїдного золота, що використовувалося для кон’югації з фрагментом протеїну А А В а b 654321 Рис. 6. Імунохроматографічний аналіз з використанням отриманого кон’югата. На нітроцелюлозі іммобілізовано: 1 — контрольний антиген (рекомбінантну субоди� ницю В дифтерійного токсину); 2 — сироватку крові корови; 3 — сироватку крові кроля; 4 — сироватку крові миші; 5 — сироватку крові людини; 6 — виявлення антитіл, специфічних до субодиниці В дифтерійного токсину в сироватці крові імунізо� ваної миші; a — контрольна смуга (імуноглобуліни кроля); b — смуга субодиниці В ЛІТЕРАТУРА 1. Schneewind O., Model P., Fischetti V. A. Sorting of protein A to the staphylococcal cell wall // Cell. — 1992. — V. 70, N2. — P. 267–281. 2. Schneewind O., Fowler A., Faull K. F. Struc� ture of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus // Science. — 1995. — V. 268, N5207. — P. 103–106. 3. Foster T. J. Immune evasion by staphylococci // Nat. Rev. Microbiol. — 2005. — V. 3, N12. — P. 948–958. 4. Gomez M. I., O’Seaghdha M., Magargee M. et al. Staphylococcus aureus protein A activates TNFR1 signaling through conserved IgG binding domains // J. Biol. Chem. — 2006. — V. 281, N29. — P. 20190–20196. 5. O’Seaghdha M., van Schooten C. J., Kerrigan S. W. et al. Staphylococcus aureus protein A binding to von Willebrand factor A1 domain is mediated by conserved IgG binding regions // FEBS J. — 2006. — V. 273, N21. — P. 4831–4841. 6. Silverman G. J., Goodyear C. S., Siegel D. L. On the mechanism of staphylococcal protein A Експериментальні статті 67 immunomodulation // Transfusion. — 2005. — V. 45, N2. — P. 274–280. 7. Palmqvist N., Silverman G. J., Josefsson E., Tarkowski A. Bacterial cell wall�expressed protein A triggers supraclonal B�cell responses upon in vivo infection with Staphylococcus aureus // Microb. Infect. — 2005. — V. 7, N15. — P. 1501–1511. 8. Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. — 2007. — V. 848, N1. — P. 40–47. 9. Shpigel E., Goldlust A., Eshel A. et al Expression, purification and applications of staphylococcal protein A fused to cellulose� binding domain // Biotechnol. Appl. Bio� chem — 2000. — V. 31, Pt. 3. — P. 197–203. 10. Nilsson B., Moks T., Jansson B. et al. Synthetic IgG�binding domain based on staphylococcal protein A // Prot. Eng. — 1987. — V. 1, N2. — P. 107–113. 11. Moks T., Abrahmsйn L., Holmgren E. et al. Expression of human insulin�like growth factor I in bacteria: use of optimized gene fusion vectors to facilitate protein purifica� tion // Biochemistry. — 1987. — V. 26, N17. — P. 5239–5244. 12. Ljungquist C., Jansson B., Moks T., Uhlen M. Thiol�directed immobilization of recombi� nant IgG�binding receptors // Eur. J. Bio� chem. — 1989. — V. 186, N3. — P. 557–561. 13. Inouye S., Sahara Y. Soluble protein expres� sion in E. coli cells using IgG�binding domain of protein A as a solubilizing partner in the cold induced system // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2008. — V. 376, N3. — P. 448–453. 14. Gulich S., Uhlen M., Hober S. Protein engi� neering of an IgG�binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatography // J. Biotechnol. — 2000. — V. 76, N2–3. — P. 233–244. 15. Housden N. G., Harrison S., Roberts S. E. et al. Immunoglobulin�binding domains: Pro� tein L from Peptostreptococcus magnus // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — V. 31, Pt. 3. — P. 716–718. 16. Eliasson M., Olsson A., Palmcrantz E. et al. Chimeric IgG�binding receptors engineered from staphylococcal protein A and strepto� coccal protein G // J. Biol. Chem. –1988. — V. 263, N9. — P. 4323–4327. 17. Kushwaha A., Chowdhury P. S., Arora K. et al. Construction and characterization of M13 bacteriophages displaying functional IgG� binding domains of staphylococcal protein A // Gene. — 1994. — V. 151, N1–2. — P. 45–51. 18. Nord K., Gunneriusson E., Ringdahl J., Stahl S. et al. Binding proteins selected from com� binatorial libraries of an alpha�helical bacte� rial receptor domain // Nat. Biotechnol. — 1997. — V. 15, N8. — P. 772–777. 19. Sambrook J., Fritsch E. F. Molecular cloning: A laboratory Manual, Second edition — NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. — 999 p. 20. Schagger H, von Jagow G. Tricine�sodium dodecyl sulfate�polyacrylamide gel elec� trophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem. — 1987. — V. 166. — P. 368–379. 21. Bradford, M. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein�dye binding // Ibid. — 1976. — V. 72. — P. 248–254. 22. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual — N.�Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. — 726 p. 23. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров А. М., Осипов А. П., Дзан� тиев Б. Б., Гаврилова Е. М. — М.: Высшая школа, 1991. — 288 с. 24. Uhlen M., Guss B., Nilsson B. et al. Complete sequence of the staphylococcal gene enco� ding protein A // J. Biol. Chem. — 1984. — V. 259, N3. — P. 1695–1702. 25. Sasso E. H., Silverman G. J., Mannik M. Human IgA and IgG F(ab’)2 that bind to staphylococcal protein A belong to the VHIII subgroup // J. Immunol. — 1991. — V. 147, N6. — P. 1877–1883. 26. Jansson B., Uhlen M., Nygren P. A. All indi� vidual domains of staphylococcal protein A show Fab binding // FEMS Immunol. Med. Microbiol. — 1998. — V. 20, N1. — P. 69–78. 27. Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9� and 2.8�A resolution // Biochemistry. — 1981. — V. 20, N9. — P. 2361–2370. 28. Graille M., Stura E. A., Corper A. L. et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: struc� tural basis for recognition of B�cell receptors and superantigen activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — V. 97, N10. — P. 5399–5404. 29. Handbook of Affinity Chromatography, Second Edition. Edited by D. S. Hage. Taylor & Francis, Inc., 2005. — 968 p. 30. Jendeberg L., Nilsson P., Larsson A. et al. Engineering of Fc(1) and Fc(3) from human immunoglobulin G to analyse subclass specifici� ty for staphylococcal protein A // J. Immunol. Methods. — 1997. — V. 201, N1. — P. 25–34. 31. Kabir S. Immunoglobulin purification by affinity chromatography using protein A mimetic ligands prepared by combinatorial chemical synthesis // Immunol Invest. — 2002. — V. 31, N3–4. — P. 263–278. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 2, №1, 2009 68 32. Finck:Barbancon V., Prevost G., Mazurier I., Piemont Y. A structurally novel staphylococ� cal protein A from the V8 strain // FEMS Microbiol. Lett. — 1992. — V. 70, N1. — P. 1–8. 33. Huang F., Lerner E., Sato S. et al. Time� resolved fluorescence resonance energy transfer study shows a compact denatured state of the B domain of protein A // Bioche� mistry. — 2009. — V. 48, N 15. — P. 3468–3476. 34. Frens G. Controlled nucleation for the regu� lation of the particle size in monodisperse gold suspension // Nat. Phys. Sci. — 1973. — V. 241. — P. 20–21. 35. Алимарин И. П., Фадеева В. И., Дорохо: ва Е. Н. Демонстрационный эксперимент по общему курсу аналитической химии. — M: Химия, 1974. — 286 c. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНОГО ФРАГМЕНТА D>E>A>A* ПРОТЕИНА А Staphylococcus aureus Е. С. Олейник Д. В. Колибо А. А. Кабернюк А. Ю. Лабинцев Н. В. Короткевич С. И. Романюк С. В. Комисаренко Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев E:mail: kolibo@biochem.kiev.ua Получен рекомбинантный фрагмент проте� ина А Staphylococcus aureus с уникальной пос� ледовательностью, состоящий из четырех до� менов: D–E–A–A* и экспрессирующийся в клетках Escherichia coli. С целью проверки функциональной активности были протести� рованы его иммуноглобулинсвязывающие свойства с использованием конъюгат этого ре� комбинантного фрагмента с пероксидазой хре� на и наночастицами коллоидного золота. Показано, что рекомбинантный фрагмент протеина А, меченный пероксидазой хрена или коллоидным золотом, обладает такой же специфичностью по отношению к иммуногло� булинам млекопитающих, как и природный протеин А. Таким образом, полученный аналог протеина А можно использовать при создании хроматографических сорбентов для выделе� ния иммуноглобулинов и иммунохимических конъюгат для выявления антител, а также в дальнейших фундаментальных исследованиях иммунобиологических свойств протеина А. Ключевые слова: протеин А, Staphylococcus aureus, рекомбинантный аналог, иммуногло� булинсвязывающая активность, иммуноэн� зимный анализ, иммунохроматографические тесты. CLONNING AND EXPRESSION OF FUNCTIONAL FRAGMENT D>E>A>A* OF PROTEIN А FROM Staphylococcus aureus O. S. Oliynyk D. V. Kolibo А. А. Kaberniuk A. Yu. Labyntsev N. V. Korotkevich S. I. Romanyuk S. V. Komisarenko Palladin Institute of Biochemmistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv E:mail: kolibo@biochem.kiev.ua Recombinant fragment of protein A from Staphylococcus aureus with unique sequence, which has four domains D�E�A�A* and is expressed in Escherichia coli have been obtained. Conjugates of recombinant fragment with horse radish peroxidase and colloidal gold nanoparti� cles were used for testing its functional activity and immunoglobulin�binding properties. It was shown, that recombinant fragment of protein A marked by horseradish peroxidase or colloidal gold nanoparticles, has the same speci� ficity to mammal immunoglobulines as native protein A. Therefore an obtained analog of pro� tein A can be used not only in development of chromatography sorbents for immunoglobulins purification and immunochemical conjugates for immunoglobulins detection, but also in funda� mental investigations of immunobiological pro� perties of protein A. Key words: protein A, Staphylococcus aureus, recombinant analog, immunoglobulin�binding activity, immunoenzyme assay, immunochro� matography tests.

Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus

Institution

Ähnliche Einträge