Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха
Запропоновано схему i вiдпрацьовано методичний пiдхiд щодо отримання стабiлiзованої культури пухлинних клiтин аденокарциноми Ерлiха (АКЕ) in vivo пiсля крiоконсервування з певними структурними та функцiональними характеристиками. На пiдставi оцiнки репертуару мембранних структур та потенцiалу самоп...
Збережено в:
| Дата: | 2012 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2012
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/84367 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха / А.М. Гольцев, О.В. Сафранчук, М.О. Бондарович, М.В. Останков, Н.М. Бабенко, Ю.О. Гаєвська, О.В. Челомбiтько // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2012. — № 8. — С. 115-122. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-84367 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-843672015-07-07T03:02:27Z Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха Гольцев, А.М. Сафранчук, О.В. Бондарович, М.О. Останков, М.В. Бабенко, Н.М. Гаєвська, Ю.О. Челомбітько, О.В. Біологія Запропоновано схему i вiдпрацьовано методичний пiдхiд щодо отримання стабiлiзованої культури пухлинних клiтин аденокарциноми Ерлiха (АКЕ) in vivo пiсля крiоконсервування з певними структурними та функцiональними характеристиками. На пiдставi оцiнки репертуару мембранних структур та потенцiалу самопiдтримки доведено, що процедура стабiлiзацiї клiтин АКЕ повинна складатися як мiнiмум з трьох етапiв їх культивування по 7 дiб. Збiльшення кiлькостi етапiв культивування АКЕ не змiнює нi фенотипiчних, нi структурних характеристик стовбурових пухлинних клiтин рiзного ступеня диференцiювання. Предложена схема и отработан методический подход получения стабилизированной культуры опухолевых клеток аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) in vivo после криоконсервирования с определенными структурными и функциональными характеристиками. На основании оценки репертуара мембранных структур и потенциала самоподдержания доказано, что процедура стабилизации клеток АКЭ должна складываться как минимум из трех этапов их культивирования по 7 суток. Увеличение числа этапов культивирования АКЭ не изменяет ни фенотипических, ни структурных характеристик стволовых опухолевых клеток разной степени дифференцировки. The scheme is proposed, and a methodological approach to the production of a stabilized culture of Ehrlich adenocarcinoma (EAC) tumor cells in vivo having certain structural and functional characteristics after cryopreservation is worked out. By assessment of the membrane structure repertoire and the self-supporting potential, it is demonstrated that the EAC cell stabilization procedure should consist of at least three stages of their cultivation each of 7 days. An increase in the number of EAC cultivation stages doesn’t change phenotypic or structural characteristics of stem tumor cells of different differentiation degrees. 2012 Article Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха / А.М. Гольцев, О.В. Сафранчук, М.О. Бондарович, М.В. Останков, Н.М. Бабенко, Ю.О. Гаєвська, О.В. Челомбiтько // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2012. — № 8. — С. 115-122. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/84367 616-006.68:615.014.41:57.085.1 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Гольцев, А.М. Сафранчук, О.В. Бондарович, М.О. Останков, М.В. Бабенко, Н.М. Гаєвська, Ю.О. Челомбітько, О.В. Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха Доповіді НАН України |
| description |
Запропоновано схему i вiдпрацьовано методичний пiдхiд щодо отримання стабiлiзованої
культури пухлинних клiтин аденокарциноми Ерлiха (АКЕ) in vivo пiсля крiоконсервування з певними структурними та функцiональними характеристиками. На пiдставi оцiнки репертуару мембранних структур та потенцiалу самопiдтримки доведено, що
процедура стабiлiзацiї клiтин АКЕ повинна складатися як мiнiмум з трьох етапiв їх
культивування по 7 дiб. Збiльшення кiлькостi етапiв культивування АКЕ не змiнює нi
фенотипiчних, нi структурних характеристик стовбурових пухлинних клiтин рiзного ступеня диференцiювання. |
| format |
Article |
| author |
Гольцев, А.М. Сафранчук, О.В. Бондарович, М.О. Останков, М.В. Бабенко, Н.М. Гаєвська, Ю.О. Челомбітько, О.В. |
| author_facet |
Гольцев, А.М. Сафранчук, О.В. Бондарович, М.О. Останков, М.В. Бабенко, Н.М. Гаєвська, Ю.О. Челомбітько, О.В. |
| author_sort |
Гольцев, А.М. |
| title |
Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха |
| title_short |
Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха |
| title_full |
Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха |
| title_fullStr |
Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха |
| title_full_unstemmed |
Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха |
| title_sort |
методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми ерліха |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2012 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/84367 |
| citation_txt |
Методичні підходи до стабілізації структурного і функціонального станів кріоконсервованих клітин аденокарциноми Ерліха / А.М. Гольцев, О.В. Сафранчук, М.О. Бондарович, М.В. Останков, Н.М. Бабенко, Ю.О. Гаєвська, О.В. Челомбiтько // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — 2012. — № 8. — С. 115-122. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT golʹcevam metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha AT safrančukov metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha AT bondarovičmo metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha AT ostankovmv metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha AT babenkonm metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha AT gaêvsʹkaûo metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha AT čelombítʹkoov metodičnípídhodidostabílízacíístrukturnogoífunkcíonalʹnogostanívkríokonservovanihklítinadenokarcinomierlíha |
| first_indexed |
2025-07-06T11:21:32Z |
| last_indexed |
2025-07-06T11:21:32Z |
| _version_ |
1836896373356625920 |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
8 • 2012
БIОЛОГIЯ
УДК 616-006.68:615.014.41:57.085.1
© 2012
Академiк НАН України А.М. Гольцев, О. В. Сафранчук,
М. О. Бондарович, М. В. Останков, Н.М. Бабенко,
Ю.О. Гаєвська, О. В. Челомбiтько
Методичнi пiдходи до стабiлiзацiї структурного
i функцiонального станiв крiоконсервованих клiтин
аденокарциноми Ерлiха
Запропоновано схему i вiдпрацьовано методичний пiдхiд щодо отримання стабiлiзованої
культури пухлинних клiтин аденокарциноми Ерлiха (АКЕ) in vivo пiсля крiоконсерву-
вання з певними структурними та функцiональними характеристиками. На пiдставi
оцiнки репертуару мембранних структур та потенцiалу самопiдтримки доведено, що
процедура стабiлiзацiї клiтин АКЕ повинна складатися як мiнiмум з трьох етапiв їх
культивування по 7 дiб. Збiльшення кiлькостi етапiв культивування АКЕ не змiнює нi
фенотипiчних, нi структурних характеристик стовбурових пухлинних клiтин рiзного
ступеня диференцiювання.
На сьогоднi онкологiчнi захворювання посiдають друге мiсце пiсля серцево-судинних зi
смертностi населення у свiтi. Класичними i найпоширенiшими в клiнiчнiй практицi мето-
дами лiкування злоякiсних новоутворень є хiмiо- i променева терапiя як самостiйнi пiдходи
або в комплексi з хiрургiчними втручаннями [1]. Залежно вiд ряду умов (стадiя захворюван-
ня, локалiзацiя пухлини та iн.) кожний з обраних методiв має рiзний ступiнь ефективностi.
Значними проблемами при проведеннi протипухлинної терапiї є дифузний, а не “локалiзо-
ваний” розподiл протипухлинних агентiв та неадекватнi концентрацiї лiкарських засобiв,
якi досягають пухлини.
Розробка рiзних терапевтичних заходiв лiкування онкопатологiї вимагає апробацiї їхньої
дiї в адекватних експериментальних умовах. У випадку онкозахворювань такою моделлю
є аденокарцинома Ерлiха (АКЕ) — лiнiя недиференцiйованих клiтин раку молочної зало-
зи мишей, що перевивається in vivo [2]. Розвиток асцитної форми АКЕ носить стадiйний
характер, що включає фази високої та низької пролiферативної активностi клiтин iз нако-
пиченням їх у перитонеальнiй порожнинi (ПП) експериментальних тварин.
Для пiдтримки клiтин АКЕ як постiйної лiнiї можна використовувати перiодичне пе-
ревивання культури in vivo. Однак у цьому випадку не виключене порушення генетичного
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2012, №8 115
профiлю лiнiї клiтин, що перевивається. Так, на мезенхiмальних стовбурових клiтинах по-
казано, що iнтенсивне (екстенсивне) культивування пошкоджує їхню функцiональну актив-
нiсть i надає їм вираженi ознаки старiння i/або апоптозу [3].
Ефективним методом зберiгання клiтин АКЕ є крiоконсервування [4]. Проте на бага-
тьох бiологiчних об’єктах показано, що пiсля крiоконсервування в клiтинах розвиваються
нелетальнi ушкодження, що викликає тимчасове порушення їхнього функцiонального ста-
ну. Це супроводжується змiною мембранного рецепторного репертуару клiтин, спрямова-
ностi їхнього диференцiювання, iнгiбiцiєю пролiферацiї, зниженням здатностi розпiзнавати
мiкрооточення i розселятися в ньому тощо [5].
Особливої уваги заслуговує вплив факторiв крiоконсервування на стовбуровi пухлиннi
клiтини (СПК), якi є нечисленною популяцiєю малодиференцiйованих клiтин з потенцiалом
необмеженої самопiдтримки [6]. СПК є головними структурними одиницями онкопроцесу
та здатнi не тiльки формувати первиннi злоякiснi сайти, але й вiдповiдати за пiдтримку
росту та метастазування пухлини при злоякiсних новоутвореннях мозку, молочної залози,
простати, пiдшлункової залози, гемопоетичної системи тощо [7, 8]. Агресивнiсть цих клiтин
обумовлена їхньою здатнiстю продукувати ауто- i паракриннi цитокiни, хемокiни й ангiо-
геннi фактори. Саме СПК є стiйкими до хiмiо- i променевої терапiї, що i викликає рецидиви
захворювання пiсля їхнього проведення [9, 10].
Враховуючи успiхи з iдентифiкацiї СПК за фенотиповими i деякими iншими характе-
ристиками, робляться спроби керування станом СПК до i пiсля проведення тих або iнших
видiв терапiї. СПК як пухлиноiндукуючим попередникам притаманна експресiя широко-
го спектра iмунофенотипiчних маркерiв. Для СПК солiдних пухлин характерними є, на-
приклад, маркери CD44, CD133, CD24, ESA (epithelial surface antigen) та iн., що дають
можливiсть виявляти їх у загальнiй популяцiї клiтин [11]. Крiм суто маркерної феноти-
пiчної одиницi, кожна з цих структур реалiзує важливе навантаження як рецептор кому-
нiкацiйного i метаболiчного потенцiалу СПК, а також дозволяє оцiнити ступiнь їхнього
диференцiювання [10]. Оцiнка рiвня кiлькiсної експресiї молекули додає клiтинi визначе-
ний функцiональний статус [12]. Наприклад, тiльки клiтини з високою щiльнiстю СD44
молекул iдентифiкуються як CD44hi, мають усi ознаки СПК [11, 13]. Висока канцероген-
нiсть CD44hi клiтин пiдтверджується формуванням нової пухлини усього десятьма такими
клiтинами, що в 10–50 разiв перевищує канцерогеннiсть пухлинних попередникiв iншого
рiвня диференцiювання [14].
Використання технологiй фенотипiчного маркування пухлинних клiтин-попередникiв,
їхнього потенцiалу самопiдтримки i диференцiювання, дає змогу не тiльки iдентифiкувати
стадiї, динамiку розвитку та iнвазивнiсть процесу, але й оцiнити ступiнь ревертацiї струк-
турно-функцiональних показникiв цих клiтин пiсля крiоконсервування [15].
Метою дослiдження було стабiлiзувати в системi in vivo культуру клiтин АКЕ пiсля
зберiгання в низькотемпературному банку при −196 ◦С, тобто довести їхнi структурнi
i функцiональнi показники до рiвня, який притаманний пухлинним клiтинам цiєї форми
до крiоконсервування.
Матерiали i методи. Експерименти проводили на 8-мiсячних самках мишей лiнiї
BALB/c масою 16–18 г, що утримувалися в стандартних умовах вiварiю Iнституту проблем
крiобiологiї i крiомедицини НАН України (Харкiв). Принципи проведення експериментiв
вiдповiдали схваленим Нацiональним конгресом з бiоетики (Київ, 2001) та положенням
“Європейської конвенцiї про захист хребетних тварин, що використовуються для експери-
ментальних i iнших наукових цiлей ” (Страсбург, 1986).
116 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2012, №8
Зберiгання суспензiї клiтин АКЕ. Як первинну культуру використовували крiокон-
сервованi клiтини АКЕ, що зберiгалися в низькотемпературному банку Iнституту проб-
лем крiобiологiї i крiомедицини НАН України при −196 ◦C. Крiоконсервування сус-
пензiї клiтин АКЕ здiйснювали в пластикових ампулах (“Nunc”, СШA) без застосу-
вання класичних крiопротекторiв у асцитичнiй рiдинi [4] в концентрацiї 1 · 107 клi-
тин/мл об’ємом 1,8 мл на заморожувачi УОП-06 (СКТБ з ОВ IПКiК НАН Украї-
ни). Умови крiоконсервування: швидкiсть охолодження 1 ◦С/хв до −80 ◦C, вiд −80
до −196 ◦C зi швидкiстю 300–400 ◦С/хв. Зразки вiдiгрiвали на водянiй банi при 40–
41 ◦С протягом 45–50 с при постiйному шутелюваннi ампул до зникнення твердої фа-
зи [2].
Стабiлiзацiя АКЕ. Вiдiгрiтi клiтини АКЕ “стабiлiзували” шляхом перевивання in vi-
vo по 7 дiб декiлька разiв, доки вони не набували структурно-функцiональних ознак на-
тивної культури [15]. Перед кожним перевиванням проводили атестацiю клiтин, що були
культивованi: визначали об’єм накопиченої в ПП рiдини (мл), пiдраховували абсолютну
кiлькiсть ядровмiсних клiтин АКЕ у нiй, оцiнювали їхнi iмунофенотипiчнi характеристики
та аналiзували функцiональний стан, тобто потенцiал самопiдтримки СПК рiзного рiвня
диференцiювання.
Культивування клiтин АКЕ в системi in vivo. Суспензiю клiтин АКЕ вводили внутрi-
шньоочеревинно в дозi 3 · 106/мишу в об’ємi 0,3 мл i культивували протягом 7 дiб в ПП.
До необхiдної концентрацiї асцитичну рiдину доводили фiзiологiчним розчином (“Черка-
си-фарма”, Україна). Асцит iз ПП одержували шприцом через голку № 10, попередньо
вводячи мишей у легкий ефiрний наркоз.
Оцiнка iмунофенотипiчних характеристик клiтин АКЕ. Для проведення такої атес-
тацiї були використанi моноклональнi антитiла (“BD Pharmingen”, СШA) до CD44 (кон’ю-
гованi з FITC, № 553 133 за каталогом), а також CD24 (кон’югованi з PE, за каталогом
№ 553 262). За допомогою цих моноклональних антитiл були iдентифiкованi: загальна фрак-
цiя клiтин з фенотипом CD44+/CD24−, а також CD44hi — клiтини, якi входять до її складу
i характеризуються найбiльшою флуоресценцiєю за логарифмiчною шкалою, з iнтенсивнiс-
тю сигналу 104.
Iмуноглобулiни тих самих iзотипiв (за каталогом № 553988 i № 553989, “BD Pharmingen”,
СШA) були використанi як контроль. Концентрацiю дослiджуваних субпопуляцiй клiтин
у зразках АКЕ визначали на проточному цитофлуориметрi FACS Calibur (“Becton Dickin-
son”, СШA). Для мiнiмiзацiї помилок у пробах аналiзували 10000 подiй. Облiк i аналiз
результатiв здiйснювали за допомогою програми WinMDI 2.9.
Оцiнка середньої iнтенсивностi флуоресценцiї (СIФ) є важливим компонентом аналiзу
стану трансформованих клiтин при дiагностицi онкозахворювань [12]. СIФ вимiряли за
логарифмiчною шкалою iнтенсивностi сигналу в дiапазонi вiд 64 до 1024 каналу i виражали
в умовних одиницях, що вiдповiдали середньому каналу максимального випромiнювання
маркера. Ступiнь експресiї CD44hi маркера за СIФ визначали на вказаному проточному
цитофлуориметрi.
Оцiнка функцiонального стану (пролiферативного потенцiалу) клiтин АКЕ. Для оцiнки
пролiферативного потенцiалу загальної популяцiї АКЕ, а також реплiкативної активностi
рiзного рiвня диференцiювання СПК обчислювали час подвоєння кiлькостi цих клiтин Td
(вiд англ. Time doubling) за формулою Td = T (logNf − logN0) · 3,3219, де T — час культи-
вування клiтин (год); 3,3219 — коефiцiєнт переведення log в ln; N0 — початкова кiлькiсть
клiтин; Nf — кiнцева кiлькiсть клiтин.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2012, №8 117
Статистичний аналiз. Отриманi результати статистично обробляли за методом Стью-
дента в модифiкацiї Фiшера iз застосуванням комп’ютерної програми МS Exсel.
Результати та їх обговорення. Вiдомо, що пiсля повернення клiтин АКЕ в умови
нормотермiї зi стану глибокого i помiрного холодового анабiозу в них розвиваються неле-
тальнi ушкодження у виглядi зворотної iнгiбiцiї пролiферативної активностi пухлинних клi-
тин i їхнього метаболiзму [4]. Однак характер впливу факторiв крiоконсервування на стан
СПК у складi гетерогенної популяцiї клiтин пухлини залишається маловивченим. Показни-
ки структурно-функцiонального стану СПК мають низку притаманних їм характеристик,
незважаючи на те, що вони варiюють у пухлинах рiзної локалiзацiї та рiзного генезу [8].
Основнi бiомаркери СПК представленi як фенотипiчнi поверхневi (мембраннi) молеку-
ли. Найбiльшої уваги заслуговує CD44 молекула (CD-44 — насамперед рецептор до гiалу-
ронової кислоти), яку експресують клiтини багатьох типiв пухлин, зокрема раку товстого
кишечнику, молочної залози, простати [6, 10]. При цьому тiльки частина цих клiтин, поряд
з вiдсутнiстю експресiї молекули CD24, гiперекспресує CD44-маркер i iдентифiкується як
CD44hi, виявляючи всi ознаки СПК: здатнiсть до самопiдтримки, швидкого формування
пухлин [6]. Проте в СD44+/24− клiтинах визначено високий рiвень експресiї проiнвазивних
генiв Sox-2, Oct-4, Nanog, Bmi-1. Саме цi клiтини також здатнi формувати в органiзмi ре-
ципiєнтiв пухлини, але якщо CD44hi — при введеннi в дозi 1 ·102, то CD44+/24− — у значно
бiльшiй дозi. Iншими словами, для кожної з цих популяцiй пухлинних попередникiв iснує
рiзна “критична” маса щодо iндукцiї пухлинного росту.
Встановлено (табл. 1), що нативнi клiтини АКЕ (контроль) формують в ПП об’єм асци-
тичної рiдини не менш 3 мл iз загальним вмiстом клiтин 3,5 · 108. При аналiзi в загальному
пулi АКЕ клiтин з фенотипiчними маркерами СПК показано, що концентрацiя СD44+/24−
клiтин становить (4,80 ± 0,33)%, CD44hi — (0,38 ± 0,017)%. При цьому час подвоєння за-
значених клiтинних популяцiй повинен досягати таких значень: для СD44+/24− клiтин —
(2,8 ± 0,16) год, а для CD44hi — (2,9 ± 0,17) год [15].
Як видно з табл. 1, динамiка показникiв, що вивчалися протягом усього строку культи-
вування АКЕ, мала свої особливостi. Якщо об’єм асцитичної рiдини в ПП та вмiст найбiльш
iнвазивної популяцiї CD44hi серед клiтин АКЕ мав тенденцiю збiльшуватися протягом усьо-
го строку спостереження, то загальний вмiст клiтин АКЕ в ПП досягав максимальних
значень, iстотно перевищуючи контрольнi показники, пiсля других 7 дiб культивування зi
значним зменшенням та стабiлiзацiєю їхньої кiлькостi до рiвня нативної культури на третi
7 дiб культивування. Дуже важливо, що подiбна динамiка була вiдзначена i для популяцiї
бiльш диференцiйованих CD44+/24− клiтин.
Таблиця 1. Змiна структурно-функцiональних характеристик АКЕ протягом стабiлiзацiї (M ±m, n = 5)
Показник
Строки стабiлiзацiї культури Нативна культура
(контроль)першi 7 дiб другi 7 дiб третi 7 дiб
Об’єм асцитичної рiдини, мл 1,5± 0,11∗ 3,1± 0,22 3,5± 0,25 3,5± 0,24
Загальний вмiст клiтин в ПП, n · 10
8
1,2± 0,08∗ 7,65 ± 0,05∗ 3,5± 0,65 3,5± 0,71
Вмiст CD44+/24− клiтин, % 5,02 ± 0,35∗ 7,07 ± 0,4∗ 4,10 ± 0,33 4,80 ± 0,33
Вмiст CD44hi клiтин, % 0,03 ± 0,002∗ 0,07 ± 0,005∗ 0,36 ± 0,02 0,38 ± 0,017
СIФ CD44hi клiтин, у. о. 7465 ± 525
∗
8036 ± 562
∗
9096 ± 637 9110 ± 637
Час подвоєння CD44+/24−клiтин, год 7,0± 0,98∗ 3,9± 0,27∗ 3,1± 0,23 2,8± 0,16
Час подвоєння CD44hi клiтин, год 10,8 ± 0,76∗ 6,1± 0,43∗ 3,2± 0,22 2,9± 0,17
∗ Результати мають достовiрнi вiдмiнностi зi стабiлiзованою культурою, p < 0,05.
118 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2012, №8
Рис. 1. Результати цитофлуориметричної оцiнки вмiсту СD44+/24− клiтин: а — нативної культури; б —
пiсля перших 7 дiб; в — пiсля других 7 дiб; г — пiсля третiх 7 дiб стабiлiзацiї АКЕ
Пiсля перших 7 дiб стабiлiзацiї АКЕ загальний вмiст клiтин у ПП тварин становив
тiльки (1,2±0,08) ·108 клiтин в об’ємi 1,5 мл (див. табл. 1). При цьому в загальнiй популяцiї
АКЕ концентрацiя бiльш диференцiйованих клiтин-попередникiв з фенотипом CD44+/24−
становила (5,02± 0,35)% (рис. 1, б ), а менш диференцiйованих — CD44hi — (0,03± 0,002)%
(рис. 2, б ). Протягом перших 7 дiб культивування АКЕ показник Td був досить подовженим
вiдносно показникiв нативної культури, а саме для CD44+/24− клiтин вiн становив (7,0 ±
± 0,98) год (див. табл. 1), а для CD44hi — (10,8± 0,76) год. Саме рiзниця в цих показниках
є важливою для подальшого культивування протягом других 7 дiб.
Пiсля других 7 дiб культивування практично всi показники АКЕ значно змiнювали-
ся i мали такi характеристики: загальний вмiст клiтин у ПП — (7,65 ± 0,05) · 108 клiтин
в об’ємi 3,1 мл, концентрацiя клiтин з фенотипом CD44+/24− — (7,07±0,4)% (див. рис. 1, в),
CD44hi — (0,07 ± 0,005)% (див. рис. 2, в). Час подвоєння для обох популяцiй скоротився
до (3,9 ± 0,27) i (6,1± 0,43) год вiдповiдно (табл. 2). Треба зауважити, що рiзниця значень
Td мiж субпопуляцiями СПК не змiнюється i становить 3 год, як на першi, так i на другi
7 дiб культивування.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2012, №8 119
Рис. 2. Результати цитофлуориметричної оцiнки вмiсту СD44hi клiтин: а — нативної культури; б — пiсля
перших 7 дiб; в — пiсля других 7 дiб; г — пiсля третiх 7 дiб стабiлiзацiї АКЕ. М1 — зона високого рiвня
експресiї маркера
Пiсля третiх 7 дiб стабiлiзацiї показники вже iстотно наближалися до контрольних зна-
чень [15]. Загальний вмiст клiтин у ПП (3,5 · 108 клiтин) i об’єм асцитичної рiдини (3,5 мл)
зовсiм не вiдрiзнялися вiд контролю. Те саме можна сказати i про клiтини з СD44+/24−
((4,10±0,33)%) (див. рис. 1, г) i CD44hi ((0,36±0,02)%) маркерами (див. рис. 2, г). Найбiльш
важливим є той факт, що час подвоєння СD44+/24− та CD44hi клiтин практично збiгався
не тiльки з контрольними значеннями, а i мiж собою.
Не виключено, що саме розходження в ступенi експресiї зазначених маркерiв СПК на
рiзних стадiях розвитку пухлини i обумовлює їхню резистентнiсть до проведених терапев-
тичних заходiв [12]. Вiдомо, що пiсля крiоконсервування рецепторний репертуар багатьох
клiтин змiнюється за рахунок “шедингу” мембранних структур у вiдповiдь на дiю фiзи-
ко-хiмiчних факторiв крiовпливу [5]. Як наслiдок, може змiнюватися здатнiсть клiтин до
комунiкацiї з мiкрооточенням як у системi in vivo, так i in vitro [5, 15], тобто їхня функцiо-
нальна активнiсть. На цiй пiдставi обов’язковим компонентом оцiнки стану клiтин АКЕ,
а саме клiтин з CD44hi маркером на етапах стабiлiзацiї, були вибранi саме показники СIФ
120 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2012, №8
(див. табл. 1). Як видно, вже пiсля перших 7 дiб стабiлiзацiї, незважаючи на низький вiд-
соток вмiсту CD44hi клiтин (у 10 разiв менший, нiж у контролi), у загальнiй популяцiї
ступiнь експресiї маркера CD44 був досить високим, але достовiрно нижчим, нiж у контро-
лi (7465 ± 525 i 9110 ± 637 вiдповiдно, p < 0,05). Пiсля других 7 дiб цей показник iстотно
наближався до показникiв контролю (8036 ± 562 i 9110 ± 637, p < 0,05), продовжуючи
зростати до третiх 7 дiб стабiлiзацiї.
Таким чином, отриманi данi свiдчать про те, що пiсля крiоконсервування клiтини АКЕ
за своїми структурно-функцiональними характеристиками значно вiдрiзняються вiд натив-
них клiтин. Для повернення крiоконсервованих клiтин АКЕ до стану нативних (за обра-
ними параметрами) необхiдно провести процедуру їхньої стабiлiзацiї, яка складається як
мiнiмум з трьох етапiв культивування по 7 дiб. У стабiлiзованiй таким чином культурi АКЕ
кiлькiсть клiтин з маркерами, якi притаманнi СПК (СD44+/24− i CD44hi), не вiдрiзнялась
вiд вiдповiдних значень нативних АКЕ [15]. З метою пiдтвердження подальшої незмiннос-
тi показникiв протягом наступних двох тижнiв культивування була проведена додаткова
їхня атестацiя, яка встановила, що увесь спектр показникiв АКЕ залишався стабiльним
(данi не наведено). Тiльки у цьому випадку можна вважати що пiсля трикратного 7-добо-
вого послiдовного культивування культура АКЕ є стабiлiзованою пiсля крiоконсервування
i придатною для подальшого використання, в тому числi атестацiї впливу рiзних форм
протипухлинних агентiв.
Отже, на пiдставi результатiв дослiдження розроблено схему i вiдпрацьовано методич-
ний пiдхiд отримання стабiлiзованої культури клiтин АКЕ пiсля крiоконсервування з пев-
ними структурно-функцiональними характеристиками з урахуванням гетерогенного складу
популяцiї пухлинних клiтин.
1. Новик А.В., Моисеенко В.М. Теоретические предпосылки адъювантной терапии злокачественных
опухолей // Практ. онкология. – 2007. – 8, № 3. – С. 109–117.
2. Эммануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. – Москва: Наука, 1977. – 419 с.
3. Cognet P. A., Minguell J. J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal
progenitor cells // J. Cell Physiol. – 1999. – 181. – P. 67–73.
4. Федец О.И. Биоэнергетика и пролиферативная активность криоконсервированных клеток аденокар-
циномы Эрлиха: Автореф. дис. . . . канд. биол. наук. – Харьков, 1987. – 36 с.
5. Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G. et al. Modification of the state of bone marrow hematopoietic
cells after cryopreservation // Intern. J. Refrigeration. – 2006. – 29, No 3. – P. 358–367.
6. Al-Hajj M., Wicha M. S., Benito-Hernandez A. et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer
cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – 100, No 7. – P. 3983–3989.
7. Бондарович Н.А., Гольцев К.А. Определение содержания CD44+ CD24− клеток как дополнительный
критерий оценки эффективности превентивной терапии онкопатологии в эксперименте // Пробл.
криобиологии. – 2008. – 18, № 1. – С. 5–9.
8. Prince M.E., Sivanadan R., Kaczorowski A. et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer
stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. –
104, No 3. – P. 973–978.
9. Eramo A., Ricci-Vitiani L., Zeuner A. et al. Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells // Cell
Death Differ. – 2006. – 13, No 7. – P. 1238–1241.
10. Nakshatri H. Radiation resistance in breast cancer: are CD44+/CD24−/ proteosome low/PKH26+ cells to
blame? // Ibid. – 2010. – 12, No 2. – P. 105.
11. Fillmore C., Kuperwasser C. Human breast cancer stem cell markers CD44 and CD24: enriching for cells
with functional properties in mice or in man? // Breast Cancer Res. – 2007. – No 3. – P. 303–306.
12. Гольцев А.Н., Сафранчук О.В., Бондарович Н.А. и др. Влияние факторов криоконсервирования на
уровень экспрессии маркеров стволовых раковых клеток в аденокарциноме Эрлиха // Биол. вест-
ник. – 2009. – 13, № 1–2. – С. 13–16.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2012, №8 121
13. Abraham B.K., Fritz P., McClellan M. et al. Prevalence of CD44+/CD24−/low cells in breast cancer may
not be associated with clinical outcome but may favour distant metastasis // Clin. Cancer Res. – 2005. –
11, No 3. – P. 1154–1159.
14. Hermann P.C., Huber S. L., Herrler T. et al. Distinct populations of cancer stem cells determines tumor
growth and metastatic activity in human pancreatic cancer // Cell Stem Cell. – 2007. – 1, No 3. – P. 313–
323.
15. Гольцев А.М., Сафранчук О.В., Бондарович М.О. та iн. Змiна крiолабiльностi стовбурових пухлин-
них клiтин залежно вiд фази росту аденокарциноми // Фiзiол. журн. – 2011. – 57, № 4. – С. 68–76.
Надiйшло до редакцiї 21.02.2012Iнститут проблем крiобiологiї
i крiомедицини НАН України, Харкiв
Академик НАН Украины А.Н. Гольцев, О.В. Сафранчук, Н. А. Бондарович,
М.В. Останков, Н. Н. Бабенко, Ю.А. Гаевская, О. В. Челомбитько
Методические подходы стабилизации структурного
и функционального состояний криоконсервированных клеток
аденокарциномы Эрлиха
Предложена схема и отработан методический подход получения стабилизированной куль-
туры опухолевых клеток аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) in vivo после криоконсервирова-
ния с определенными структурными и функциональными характеристиками. На основании
оценки репертуара мембранных структур и потенциала самоподдержания доказано, что
процедура стабилизации клеток АКЭ должна складываться как минимум из трех этапов
их культивирования по 7 суток. Увеличение числа этапов культивирования АКЭ не изме-
няет ни фенотипических, ни структурных характеристик стволовых опухолевых клеток
разной степени дифференцировки.
Academician of the NAS of Ukraine A.N. Goltsev, O.V. Safranchuk,
N.A. Bondarovich, M. V. Ostankov, N.N. Babenko, Yu. A. Gaevskaya,
O.V. Chelombitko
Methodological approaches to the stabilization of structural and
functional states of Ehrlich adenocarcinoma cryopreserved cells
The scheme is proposed, and a methodological approach to the production of a stabilized culture
of Ehrlich adenocarcinoma (EAC) tumor cells in vivo having certain structural and functional
characteristics after cryopreservation is worked out. By assessment of the membrane structure
repertoire and the self-supporting potential, it is demonstrated that the EAC cell stabilization
procedure should consist of at least three stages of their cultivation each of 7 days. An increase
in the number of EAC cultivation stages doesn’t change phenotypic or structural characteristics of
stem tumor cells of different differentiation degrees.
122 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2012, №8
|