Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры

Приведены новые данные, характеризующие морфометрические, физиолого-биохимические и продукционные характеристики зелёной почвенной микроводоросли Вracteacoccus minor (Сhodat) Petrová в условиях двухстадийной накопительной культуры. Показаны специфические особенности адаптивного ответа водоросли на э...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2015
Hauptverfasser:	Минюк, Г.С., Челебиева, Э.С., Чубчикова, И.Н.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України 2015
Schriftenreihe:	Альгология
Schlagworte:	Физиология, биохимия, биофизика
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/109932
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры / Г.С. Минюк, Э.С. Челебиева, И.Н. Чубчикова // Альгология. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 21-34. — Бібліогр.: 35 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-109932
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1099322025-02-23T18:34:37Z Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры Secondary carotenogenesis of the green microalga Bracteacoccus minor (Chlorophyta) in a two-stage culture Минюк, Г.С. Челебиева, Э.С. Чубчикова, И.Н. Физиология, биохимия, биофизика Приведены новые данные, характеризующие морфометрические, физиолого-биохимические и продукционные характеристики зелёной почвенной микроводоросли Вracteacoccus minor (Сhodat) Petrová в условиях двухстадийной накопительной культуры. Показаны специфические особенности адаптивного ответа водоросли на экспериментальную индукцию вторичного каротиногенеза — высокая устойчивость клеток к ацетату натрия, накопление многокомпонентной смеси вторичных кетокаротиноидов с доминированием в их составе фракции диацильных эфиров астаксантина (37— 42 % суммы) и высокое содержание липидов в биомассе (53—63 % сухой биомассы). Morphometric and physiologic-biochemical characteristics as well as the productivity of the green terrestrial microalga Вracteacoccus minor (Chodat) Petrová were investigated in a twostage batch culture. The specific adaptive responses, which the microalga developed under the experimentally induced secondary carotenogenesis were: high cellular resistance to sodium acetate, the accumulation of a multicomponent mixture of secondary ketocarotenoids with the dominance of astaxanthin diesters (37—42% of the total carotenoids) and a large lipid content in algal biomass (53—63% of dry matter). 2015 Article Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры / Г.С. Минюк, Э.С. Челебиева, И.Н. Чубчикова // Альгология. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 21-34. — Бібліогр.: 35 назв. — рос. 0868-8540 DOI: http://doi.org/10.15407/alg25.01.021 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/109932 579:582.26/.27:576.31:577.1 ru Альгология application/pdf Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Физиология, биохимия, биофизика Физиология, биохимия, биофизика
spellingShingle	Физиология, биохимия, биофизика Физиология, биохимия, биофизика Минюк, Г.С. Челебиева, Э.С. Чубчикова, И.Н. Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры Альгология
description	Приведены новые данные, характеризующие морфометрические, физиолого-биохимические и продукционные характеристики зелёной почвенной микроводоросли Вracteacoccus minor (Сhodat) Petrová в условиях двухстадийной накопительной культуры. Показаны специфические особенности адаптивного ответа водоросли на экспериментальную индукцию вторичного каротиногенеза — высокая устойчивость клеток к ацетату натрия, накопление многокомпонентной смеси вторичных кетокаротиноидов с доминированием в их составе фракции диацильных эфиров астаксантина (37— 42 % суммы) и высокое содержание липидов в биомассе (53—63 % сухой биомассы).
format	Article
author	Минюк, Г.С. Челебиева, Э.С. Чубчикова, И.Н.
author_facet	Минюк, Г.С. Челебиева, Э.С. Чубчикова, И.Н.
author_sort	Минюк, Г.С.
title	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры
title_short	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры
title_full	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры
title_fullStr	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры
title_full_unstemmed	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры
title_sort	особенности вторичного каротиногенеза у bracteacoccus minor (chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры
publisher	Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
publishDate	2015
topic_facet	Физиология, биохимия, биофизика
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/109932
citation_txt	Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры / Г.С. Минюк, Э.С. Челебиева, И.Н. Чубчикова // Альгология. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 21-34. — Бібліогр.: 35 назв. — рос.
series	Альгология
work_keys_str_mv	AT minûkgs osobennostivtoričnogokarotinogenezaubracteacoccusminorchlorophytavusloviâhdvuhstadijnojkulʹtury AT čelebievaés osobennostivtoričnogokarotinogenezaubracteacoccusminorchlorophytavusloviâhdvuhstadijnojkulʹtury AT čubčikovain osobennostivtoričnogokarotinogenezaubracteacoccusminorchlorophytavusloviâhdvuhstadijnojkulʹtury AT minûkgs secondarycarotenogenesisofthegreenmicroalgabracteacoccusminorchlorophytainatwostageculture AT čelebievaés secondarycarotenogenesisofthegreenmicroalgabracteacoccusminorchlorophytainatwostageculture AT čubčikovain secondarycarotenogenesisofthegreenmicroalgabracteacoccusminorchlorophytainatwostageculture
first_indexed	2025-11-24T10:56:23Z
last_indexed	2025-11-24T10:56:23Z
_version_	1849668962477932544
fulltext	Особенности вторичного каротиногенеза 21 ISSN 0868-8540. Аlgologia. 2015, 25(1): 21—34 http://dx.doi.org/10.15407/alg25.01.021 УДК 579:582.26/.27:576.31:577.1 Г.С. МИНЮК, Э.С. ЧЕЛЕБИЕВА, И.Н. ЧУБЧИКОВА Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского, пр. Нахимова, 2, Севастополь 99011, Крым ОСОБЕННОСТИ ВТОРИЧНОГО КАРОТИНОГЕНЕЗА У BRACTEACOCCUS MINOR (CHLOROPHYTA) В УСЛОВИЯХ ДВУХСТАДИЙНОЙ КУЛЬТУРЫ Приведены новые данные, характеризующие морфометрические, физиолого-био- химические и продукционные характеристики зелёной почвенной микроводоросли Вracteacoccus minor (Сhodat) Petrová в условиях двухстадийной накопительной культу- ры. Показаны специфические особенности адаптивного ответа водоросли на экспе- риментальную индукцию вторичного каротиногенеза — высокая устойчивость клеток к ацетату натрия, накопление многокомпонентной смеси вторичных кетокаротинои- дов с доминированием в их составе фракции диацильных эфиров астаксантина (37— 42 % суммы) и высокое содержание липидов в биомассе (53—63 % сухой биомассы). К л ю ч е в ы е с л о в а : вторичный каротиногенез, кетокаротиноиды, астаксантин, Вracteacoccus minor, Chlorophyta. Введение В последнее время возникла необходимость в скрининге зелёных микро- водорослей для выявления новых коммерчески перспективных проду- центов природных кетокаротиноидов (ККР) астаксантина (АСТ) и кан- таксантина (КАН) (Минюк и др., 2010). Актуальность нового направле- ния определяется высокой биологической ценностью ККР (Krinsky, John- son, 2005; Hussein et al., 2006), широким спектром областей их примене- ния (Carlsson et al., 2007; Dufossé, 2009) и растущим рыночным спросом на природные пигменты (März, 2009). Модельным объектом в исследова- ниях различных аспектов вторичного каротиногенеза (ВКРГ) и пока единственным среди микроводорослей промышленным источником АСТ является планктонная микроводоросль Haematococcus pluvialis Flot. (http:// www.scholar.google.com). Большинство работ посвящено оптимизации технологии выращивания этого не совсем пригодного для промышлен- ных целей вида. Низкая скорость роста, узкий диапазон физико- химических параметров культивирования и высокий риск контаминации культур требуют применения дорогостоящих закрытых систем культиви- рования, определяющих неприемлемую для большинства потенциальных потребителей цену на АСТ из H. pluvialis (≈ US$ 7000), и, как следствие, стагнацию мирового объёма производства его биомассы на уровне 300 т·год-1 (März, 2009). В то же время, десятки эдафофильных и аэрофиль- ных видов Chlorophyceae с выраженной способностью к ВКРГ (Костіков та ін., 2001), более технологичных, чем планктонные водоросли, в силу бóльшей экологической валентности (Андреева, 1998), долгое время © Г.С. Минюк, Э.С. Челебиева, И.Н. Чубчикова, 2015 Г.С. Минюк и др. 22 оставались вне поля зрения специалистов. Лишь недавно стали появ- ляться сведения об особенностях роста и составе вторичных каротинои- дов (ВКР) у отдельных наземных коккоидных видов, таких, например, как:Chlorococcum sp., Scenedesmus spp., Chlorella zofingiensis Dönz., Protosiphon botryoides (Kütz.) Klebs, Scotiellopsis oocystiformis (J.W.G. Lund) Puncochárová и др. (Hanagata, Dubinsky, 1999; Liu, Lee, 2000; Ma, Chen, 2001; Orosa et al., 2001; Del Campo et al., 2004; Qin et al., 2008; и др.), подтверждающие целесообразность поисков новых источников ККР сре- ди наземных Chlorophyceae. Данная работа является продолжением исследования особенностей ВКРГ у эдафофильной микроводоросли Bracteacoccus minor в условиях двухстадийной накопительной культуры (Чубчикова и др., 2011). Цель работы — определение динамики численности, морфометрических и фи- зиолого-биохимических характеристик на «зелёной» и «красной» стадиях культивирования; оценка целесообразности использования ацетата на- трия (NaAc) для увеличения выхода ККР; уточнение фракционного со- става ВКР; анализ содержания основных компонентов сухой биомассы. Материалы и методы В исследовании использовали штамм ACKU 506-06 (= SAG 221-1) B. minor, полученный из коллекции Киевского национального универси- тета им. Т. Шевченко. Водоросль выращивали по двухстадийной схеме скрининга продуцентов АСТ (Минюк и др., 2010). Условия культивиро- вания на I («зелёной») стадии продолжительностью 16 сут были следую- щими: питательная среда ВВМ 3N, освещённость 7000 лк (лампы Feron DL 20W T4 6400K), фотопериод 15 ч свет : 9 ч темнота, температура сре- ды 25—26 °С, скорость продувки газо-воздушной смесью 0,44 л·мин-1·л-1 (0,7 % СО2 (v/v), объём культур в стеклянных литровых колбах 0,6 л, на- чальная численность клеток (2,3—2,4)·106 кл.·мл-1. Перевод культур на II («красную») стадию продолжительностью 11 сут осуществляли путём 10- кратного разбавления «зелёной» культуры редуцированной по N и P сре- дой ВВМ (4,12 мг·л-1 N и 5,32 мг·л-1 P) и изменения режима освещения с одностороннего периодического на двухстороннее круглосуточное (по 7000 лк с каждой из сторон). Скорость продувки увеличивали до 1 л·мин-1·л-1 во избежание оседания на дно колб красных апланоспор, более тяжелых, чем зёленые клетки. Температуру питательной среды (26 оС) поддерживали при помощи бытового кондиционера и охлажде- ния колб встречными потоками воздуха от двух вентиляторов. В одном из вариантов эксперимента для интенсификации биосинтеза ККР в сре- ду вносили NaAc до концентрации 0,05 М. Вариант без добавления NaAc служил контролем. Число повторностей во всех случаях равнялось трём. Динамику роста и состояния культуры контролировали при помо- щи проточного цитометра CytomicsTM FC 500, снабженного однофаз- ным 488 нм аргоновым лазером (Beckman Coulter, США). Общую чис- ленность клеток (N) и активность внутриклеточных эстераз как инте- Особенности вторичного каротиногенеза 23 гральный показатель метаболической активности клеток (МАК) (Franklin, 2001) оценивали на двухпараметрических цитограммах: по прямому светорассеянию в системе координат FS Log — FL4 Log и интенсивности флуоресценции флуоресцеина на канале FL1 в системе координат FL1 Log — FL4 Log после обработки клеток диацетатом флуо- ресцеина (ФДА) (Franklin et al., 2001; Marie et al., 2005). Линейные раз- меры клеток устанавливали по микрофотографиям с применением микроскопа Leica DM-1000, цифровой камеры Leica Microsystem AG и компьютерной программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Объём кле- ток (V) рассчитывали по формуле шара. Содержание сухой биомассы (СБ) анализировали весовым методом на мембранных фильтрах «Sartorius» (3; 5 и 8 мкм). Пигменты экстрагировали 100 % ацетоном (о.с.ч.) с соблюдением всех предосторожностей, необходимых при работе с пигментами (Britton, 2008). Содержание хлорофилла а (хл. а) и сум- марных каротиноидов (ΣКР) в экстрактах определяли спектрофотомет- рическим методом на СФ 46 (ЛОМО, Россия) по уравнениям Лихтента- лера (Lichtenthaler, 1987). Фракционный состав КР исследовали при по- мощи тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах «Silica gel 60» Merck (Германия) в двух системах растворителей: I — гексан-ацетон 9 : 1; II — гексан-бензол-ацетон 5 : 3,75 : 0,8 (Дробецкая и др., 2010). Иден- тификацию каротиноидных фракций проводили по химическим, спек- тральным и хроматографическим тестам на наличие и количество гидро- кси- и кетогрупп; положение максимумов поглощения в УФ-ВИД спек- трах в трёх растворителях (гексане, бензоле и ацетоне); совпадение Rf идентифицируемых фракций и стандартов при совместной ТСХ (Rodriguez-Amaya, 2001; Britton et al., 2004; Britton, 2008; Egeland et al., 2011). Стандарты ККР получали путём экстракции пигментов из свежего материала и выделения отдельных компонентов методом адсорбционной ТСХ (Britton, 2008). Моно- и диэфиры АСТ выделяли из красных апла- носпор Haematococcus pluvialis, свободный АСТ — из мышц Salmon salar, КАН — из цист Artemia salina. Для расчёта концентрации отдельных фракций использовали инди- видуальные коэффициенты удельного поглощения, приведенные в лите- ратуре (Britton et al., 2004; Дробецкая и др., 2010, Egeland et al., 2011). Содержание белка в биомассе анализировали по Лоури (Lowry et al., 1951), углеводов — при помощи фенольного и сернокислотного реаген- тов (Strickland, Parsons, 1968), липидов — фосфованилиновым методом (Ahlgren, Merino, 1991). Концентрацию нитратов в среде контролировали с помощью нитрат-селективного электрода 9307BNWP (Thermo Orion) (www.aurumlab.com.ua). Все аналитические измерения для каждой биоло- гической повторности проводили трижды. Данные, приведенные на ри- сунках и в тексте, являются средними ( x ). Их вариабельность характе- ризуется выборочным стандартным отклонением (s) или ошибкой сред- ней арифметической (m). Г.С. Минюк и др. 24 Результаты и обсуждение Одним из важных факторов, определяющих конечный результат выра- щивания продуцентов ККР методом двухстадийной накопительной куль- туры, является выживаемость клеток в результате стресс-воздействия, индуцирующего биосинтез ККР. В зависимости от его интенсивности и времени применения (фазы роста культуры) потери биомассы, получен- ной в конце «зелёной» стадии, могут достигать 40—50 %. Такой высокий процент гибели характерен, например, для H. pluvialis при совместном использовании NaAc и NaCl для активации биосинтеза АСТ (Минюк и др., 2007). В то же время, у ряда исследованных нами почвенных микро- водорослей (Scotiellopsis rubescens Vinatz., Chlorococcum granatum Beij., Pseu- dospongiococcum protococcoides Gromov, Chlorella zofingiensis, Scenedesmus rubescens (P.J.L. Dang.) E. Kessler) при сходном способе индукции ВКРГ численность клеток на II стадии не снижалась (Чубчикова и др., 2009), а у Ettlia carotinosa Komárek, наоборот, даже существенно увеличивалась (Челебиева и др., 2013). Из ряда устойчивых к модельному стрессу видов выпали два представителя рода Bracteacoccus Tereg (B. minor и B. giganteus Bisch. et Bold.), у которых при попытке сокращения «зелёной» стадии до 6 сут гибель клеток составила 32—33 % (Чубчикова и др., 2011). Это об- стоятельство послужило поводом для пролонгирования I стадии до 16 сут и проведения более детальных наблюдений за динамикой роста и морфофизиологическими показателями вегетативных клеток B. minor. 0 400 800 1200 1600 0 10 20 30 0 80 160 240 320 400 0 10 20 30 40 0 200 400 600 800 1000 0 10 20 30 40 50 Ч ис ло к ле то к инокулят 8-е сутки 12-е сутки 16-е сутки 0 200 400 600 8001000 0 20 40 60 Ч ис ло к ле то к 0 200 400 600 8001000 Объём клеток, мкм3 0 20 40 60 4-е сутки 0 2 4 6 8 10 1214 16 Время, сутки 0 200 400 600 800 N ·1 04 к л· м л- 1 (x ± s ) а б в г д е Рис. 1. Динамика численности (а) и объёма (б-е) клеток Bracteacoccus minor на I («зелёной») стадии культивирования Особенности вторичного каротиногенеза 25 Несмотря на длительный дефицит питания (уже на 8-е сут концентра- ция N(NO3) — в среде была ниже предела чувствительности ионо- селективного электрода), численность клеток в культуре продолжала уве- личиваться до конца «зелёной» стадии (рис. 1, а). При этом размножение зооспорами, превалирующее в начальный пе- риод, постепенно уступало место делению с образованием апланос- пор/автоспор, что, в свою очередь, приводило к заметному изменению размерной структуры популяции. Так, на 4-е сут в культуре преобладали недавно осевшие зооспоры (V = 7—40 мкм3) и молодые вегетативные клет- ки (V = 50—160 мкм3), образовавшиеся преимущественно в многочислен- ных (35 % общего числа) крупных зооспорангиях (V = 450—1600 мкм3) в результате деления материнских клеток с образованием зооспор или не- подвижных шаровидных клеток (см. рис. 1, в; 2, а, б). Относительное содержание апланоспорангиев (V = 200—400 мкм3), дававших по 2—4, реже 6 апланоспор, составляло в это время 15 % обще- го числа клеток. Углубление дефицита питания сопровождалось неук- лонным снижением числа крупных зооспорангиев (см. рис. 1, г, д) вплоть до их полного исчезновения на 16-е сут (см. рис. 1, е; 2, б). При этом размеры апланоспорангиев уменьшались в 2—3 раза и на 16-е сут основу культуры (62 %) составляли мелкие (V < 80 мкм3), частично агре- гированные клетки (рис. 3, г). На этом фоне содержание СВ, хл. а и ∑КР в культуре увеличивалось до конца I стадии (см. рис. 1, а; 3, а, д, и). Средняя продуктивность по СБ составила 143,05±7,63 мг·л-1·сут-1; по хл. а — 2,46±0,08 мг·л-1·сут-1; по ∑КР — 0,91±0,03 мг·л-1·сут-1. Рис. 2. Культура Bracteacoccus minor на 4-е (а, б) и 16-е (в, г) сут «зелёной» стадии (увеличение 1040). Масштаб 10 мкм Г.С. Минюк и др. 26 Положительная динамика численности клеток маскировала противо- положно направленные изменения их физиологического состояния, про- являвшиеся в устойчивом снижении внутриклеточного содержания СБ и фотосинтетических пигментов (рис. 3). Уже через сутки после полного поглощения азота из питательной сре- ды содержание СБ клетках снизилось ≈ на 20 % по отношению к периоду адекватной обеспеченности питанием (4-е сут), а к концу «зелёной» ста- дии уменьшилось на 70 % (в 3,2 раза) (см. рис. 3, б). Отмеченная тенден- ция, по всей вероятности, была обусловлена как прогрессирующим из- мельчанием культуры, так и активизацией использования внутриклеточ- ных резервов на размножение в условиях голодания, на что косвенно ука- зывает снижение (в 1,7 раза) содержания СБ в расчёте на единицу объёма клеток (мкм3) (см. рис. 3, в). 0.2 0.3 0.4 К Р/ х л. а ( х ± s ) 0 4 8 12 16 0 0.3 0.6 0.9 1.2  К Р , % С Б ( x ± s ) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 С Б , г . л -1 (x ± s ) a 0 10 20 30 40 50 хл . а , м г· л- 1 ( x ± s ) д 0 4 8 12 16 0 4 8 12 16 20  К Р , м г· л- 1 ( x ± s) и 0 4 8 12 16 2 4 6 8 10  К Р , ф г· м км -3 ( х ± s ) 0 4 8 12 16 Время, сутки 0 0.4 0.8 1.2  К Р, п г· кл -1 ( х ± s ) ж б 0 4 8 12 16 20 хл . а , ф г· м км -3 ( х ± s ) к л 0 50 100 150 С Б , п г. кл -1 (x ± s ) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 С Б , п кг ·м км -3 ( x ± s) в е 0 1 2 3 хл . а , п г· кл -1 ( x ± s ) 0 1 2 3 хл . а , % С Б ( x ± s) г з м Рис. 3. Динамика содержания сухой биомассы (а — в), хлорофилла а (д — з), суммар- ных каротиноидов (и — м) и коэффициента ∑КР/хл. а (г) на «зелёной» стадии культи- вирования Четко выраженные отрицательные тренды содержания хл. а (рис. 3, е, ж) и ∑КР (рис. 3, к, л) в клетках Bracteacoccus minor на «зелёной» ста- дии культивирования в наших исследованиях продуцентов АСТ отмече- ны впервые и рассматриваются на данном этапе как дискуссионная ви- доспецифическая характеристика, нуждающаяся в дополнительной экс- периментальной проверке и аргументации. Литературные сведения, под- тверждающие или опровергающие вероятность такой динамики при ла- бораторном культивировании почвенных видов Chlorophyceae, найти не удалось, за исключением работы испанских исследователей, показавших Особенности вторичного каротиногенеза 27 аналогичное снижение содержания ∑КР в клетках Chlorella zofingiensis (≈ в 2 раза) на фоне их массивного накопления в растущей культуре (Del Campo et al., 2004). Авторы выращивали водоросль на модифицирован- ной среде Арнона, в которой концентрация азота (N) и фосфора (P) бы- ла выше в 2,3 раза, чем в среде ВВМ 3N. Тем не менее, падение уровня ∑КР в клетках началось уже на 4-е сут, что, как и в нашем случае, не позволяет интерпретировать эти данные в связи с дефицитом питания. У Ch. zofingiensis перманентное снижение уровня ∑КР в клетках сопровож- далось одновременным накоплением АСТ. У B. minor массовая доля хл. а и ∑КР в СБ на протяжении «зелёной» стадии практически не менялась (см. рис. 3, з, м), что было следствием однонаправленности векторов всех трёх показателей. Индукцию ВКРГ в ослабленных голоданием клетках B. minor (пере- ход на «красную» стадию) проводили путём резкого изменения комплек- са физико-химических параметров культивирования (Минюк и др., 2010). Роль ключевого стресс-фактора играл более чем 20-кратный по- ложительный градиент облучённости клеток, достигнутый при одновре- менном 10-кратном разбавлении плотной «зелёной» культуры, увеличе- ния интенсивности (в 2 раза) и продолжительности (в 2,6 раза) внешне- го освещения. Для разведения вместо воды использовали 10-кратно ре- дуцированную по N и P среду ВВМ для подкормки истощённой культу- ры биогенами и микроэлементами, необходимыми для синтеза de novo ферментов, контролирующих разветвленный метаболический путь обра- зования АСТ из β-каротина (Liu, Lee, 2000; Lemoine, Schoefs, 2010). Особенно интересно было определить отношение В. minor к NaAc как популярному и в то же время неоднозначному химическому активатору ВКРГ у Chlorophyceae (Kobayashi et al., 1993; Данцюк, 2010). Ранее нами бы- ло показано, что ацетат (0,05 М) в сочетании с NaCl (0,17 М) вызывает массовое отмирание молодых клеток В. minor (Чубчикова и др., 2011). Исключение NaCl из стресс-комплекса и перенесение сроков индукции ВКРГ на более позднюю стадию развития культуры в данном эксперименте частично ослабило стресс-воздействие, но полностью не устранило нежела- тельный побочный эффект ацетата, проявившийся уже на 3-и сут в склеи- вании клеток в плотные хлопьевидные скопления. Диспергировать клеточ- ные агрегаты в пробах, отобранных для анализа, не удавалось даже при по- мощи продувки аквариумным воздушным компрессором (Sera 550R с про- изводительностью 9 л·мин-1), что, к сожалению, не позволило осуществить цитофлуорометрический анализ численности и состояния клеток в присут- ствии NaAc. Поэтому на рисунках, характеризующих постстрессорные из- менения физиолого-биохимических показателей в расчёте на клетку и мкм3, данные представлены фрагментарно. В контроле ни агрегирования, ни массовой гибели клеток на «красной» стадии не наблюдалось. Посте- пенно краснеющие клетки продолжали делиться, и к окончанию периода наблюдений их численность выросла в 2 раза (рис. 4, а). Доля метаболически активных клеток (МАК) (флуоресцирующих на канале FL1 после обработки ФДА) была стабильно высокой (> 97 % обще- Г.С. Минюк и др. 28 го числа) (рис. 4, в). В то же время относительная интенсивность флуорес- ценции на канале FL1, характеризующая активность внутриклеточных эс- тераз (Franklin et al., 2001), снизилась в 2,4 раза (рис. 4, г). 0 2 4 6 8 10 12 Время, сутки 6 8 10 12 14 16 N ·1 06 ·к л· м л- 1 ( x ± s ) Контроль NaAc 0 2 4 6 8 10 12 Время, сутки 96 97 98 99 100 Д ол я М А К , % ( x ± s ) а в 0 2 4 6 8 10 12 Время, сутки 40 80 120 160 200 240 V ср ., м км 3 , ( x ± m ) б 0 2 4 6 8 10 12 Время, сутки 100 200 300 400 500 А кт ив но ст ь эс те ра з, о тн . е д · к л- 1 ( x ± s ) г Рис. 4. Динамика численности (а), средних объёмов клеток (б), относительного содержа- ния метаболически активных клеток в культурах (в) и активности внутриклеточных эсте- раз (г) на «красной» стадии культивирования 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6  К Р , м г· л- 1 0 1 2 3 4 5 хл . а , м г· л- 1 0 0.5 1 1.5 С Б , г . л -1 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 С Б , п кг ·м км -3 а 0 0.2 0.4 0.6 хл . а , п г· кл -1 0 2 4 6 8 10 12 Время, сутки 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5  К Р , п г· кл -1 0 20 40 60 80 100 C Б , п г. кл -1 NaAc контроль б 0 2 4 6 8 хл . а , ф г· м км -3 0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5  К Р , ф г· м км -3 д и е к в ж л 0 2 4 6 8 10 12 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1  К Р , % С Б 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 хл . а , % С Б 0 1 2 3 4 5  К Р / х л. а г з м Рис. 5. Динамика содержания сухой биомассы (а—в), хлорофилла а (д—з), суммарных каротиноидов (и—м) и коэффициента ∑КР/хл. а (г) на «красной» стадии культивиро- вания К характерным последствиям экспериментально индуцированного ВКРГ у почвенных Сhlorophyceae следует отнести увеличение объёма клеток B. minor (в 1,8 раза в контроле и в 2,5 раза в варианте с NaAc) (рис. 4, б), а также противоположную направленность динамики содер- жания хл. а и ∑КР в культурах и клетках водоросли (рис. 5). За 11 сут содержание хл. а в расчёте на литр культуры в обоих вариантах снизи- Особенности вторичного каротиногенеза 29 лось приблизительно в 3,5 раза (рис. 5, д), на клетку в 6,9 раза (рис. 5, е), на мкм3 — в 12,9 раза (рис. 5, ж). Массовая доля хл. а в сухой биомассе по окончании эксперимента составила 0,15 % СБ против 1,6 % в конце «зелёной» стадии (рис. 5, з). За это же время содержание ∑КР в 1 л культуры в обоих вариантах экс- перимента увеличилось в 3,2—3,4 раза (рис. 5, и), отношение ∑КР/хл. а увеличилось в контроле в 11 раз, а в варианте с NaAc — почти в 9 раз (рис. 5, г). В данном случае стремительный рост коэффициента ∑КР/хл. а, часто использующегося для характеристики ВКРГ у Haematococcus pluvialis (Boussiba, 2000), отражал не столько интенсивность накопления ∑КР в клетках B. minor, сколько глубину деградации хл. а в результате стресс-воздействия, индуцирующего ВКРГ. В контроле содержание ∑КР в расчёте на мкм3 на протяжении «красной» стадии практически не ме- нялось (рис. 5, л) и накопление ВКР в отдельных клетках (рис. 5, к) и в целом в культуре определялось увеличением размеров и числа апланос- пор. В варианте с NaAc проследить аналогичную динамику ∑КР не уда- лось из-за образования клеточных агрегатов. Можно лишь отметить, что и в скоплениях клетки водоросли активно накапливали ∑КР. Причем, судя по их содержанию в 1 л культуры (см. рис. 5, и) и массовой доле в СБ (рис. 5, м), NaAc не оказывал на этот процесс положительного влия- ния, характерного для некоторых других видов (H. pluvialis, Scotiellopsis rubescens, Ettlia carotinosa) (Данцюк, 2010; Чубчикова и др., 2010; Челе- биева и др., 2013). Выход ∑КР из 1 л исходной культуры с плотностью (2,3—2,4)·106 кл.·мл-1 в обоих вариантах эксперимента достоверно не раз- личался и с учётом 10-кратного разбавления культуры при переходе на II стадию составил 1,43±0,01 мг·л-1·сут-1 в контроле и·1,30±0,22 мг·л-1·сут-1 в варианте с NaAc. В конце «красной» стадии культура в обоих вариантах имела темно-апельсиновый цвет, обусловленный деградацией фотосин- тетических пигментов и накоплением С40-ККР (91—93% ∑КР) (см. таблицу, рис. 6). В качестве особенностей состава ВКР у B. minor следует отметить срав- нительно низкое относительное содержание всех форм АСТ (46—48 % ∑КР), запасание АСТ преимущественно в виде диэфиров и более вырази- тельный в количественном отношении спектр интермедиатов синтеза АСТ. Все они, за исключением свободных АСТ и АДК, присутствовали в количестве, достаточном для корректного определения методом ТСХ, причем доля моноэфиров АДК была необычно высокой — 16—18 % ∑КР. Досто- верного влияния NaAc на фракционный состав ВКР B. minor не выявле- но. Вместе с тем, у всех исследованных нами ранее продуцентов ККР (включая близкородственный В. giganteus), доминирующей формой АСТ были моноацильные эфиры, из двух прямых предшественников (АДК и АДР) количественно определялся, как правило, только один, а второй, как и ЭХ, отмечен только в виде следов. Г.С. Минюк и др. 30 Фракционный состав каротиноидов Bracteacoccus minor в конце «красной» стадии культивирования Содержание каротиноидов, % суммы Фракция Контроль Ацетат натрия β-каротин 3,98 ± 0,64 3,57 ± 0,58 Диэфиры астаксантина 42,34 ±2,81 38,74± 3,85 Эхиненон (ЭХ) 9,19 ± 1,06 5,38 ± 0,83 Эфиры адонирубина (АДР) 5,28 ± 1,53 6,70 ± 0,36 Кантаксантин 13,15 ± 0,66 11,51 ± 0,98 Моноэфиры астаксантина 5,17 ±1,38 9,16 ± 1,20 Моноэфиры адониксантина (АДК) 15,81 ± 1,17 17,51 ± 0,90 Свободный астаксантин и адониксантин Следы Следы Рис. 6. Схема хроматограммы каротиноидов Bracteacoccus minor в конце «красной» стадии: 1 — β-каротин; 2 — диэфиры АСТ; 3 — ЭХ; 4 — эфиры АДР; 5 — кантаксантин; 6 — моноэфиры АСТ; 7 — моноэфиры АДК; 8 — свободные АСТ и АДК; 9 — первичные ксантофиллы; 10 — хлорофиллы При этом NaAc стимулировал как накопление ∑КР, так и относи- тельное содержание эфиров АСТ (Минюк и др., 2007; Чубчикова и др., 2010; Челебиева и др., 2013). Увеличение содержания СБ в клетках B. minor (см. рис. 5, б, в) со- провождалось существенным изменением содержания его основных компонентов (рис. 7). В расчёте на мкм3 содержание белка снизилось в 1,4 раза (рис. 7, ж), а содержание липидов (рис. 7, в) и углеводов (рис. 7, л) увеличилось в 1,8 и 10,5 раза соответственно. Аналогичную трансформацию состава СБ мы отмечали и у других видов Chlorophyceae. Однако некоторые данные, приведенные на рис. 7, нуждаются в дополнительных комментариях. Так, 20 %-ное увеличение к концу «красной» стадии содержания белка в расчёте на клетку (рис. 7, е), представляющееся артефактом в условиях острого дефицита азота, объяс- фронт растворителя линия старта 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Особенности вторичного каротиногенеза 31 няется 2-кратным увеличением размеров клеток (рис. 4, б). А 10-крат- ный прирост уровня углеводов (рис. 7, к, л), по всей вероятности, связан с утолщением клеточной стенки и образованием вокруг клеток слизи- стых обёрток (Андреева, 1998). На правомерность такого предположения указывают результаты ультраструктурного исследования клеток Haemato- coccus pluvialis, показавшие сокращение числа крахмальных зерён в крас- ных апланоспорах по сравнению с зелёными пальмеллами (Wayama et al., 2013). Хотя, по нашим данным, содержание суммарных углеводов в созревающих апланоспорах увеличивается у этого вида в 10—12 раз (Минюк и др., 2007). Эти сопоставления свидетельствуют о необходимо- сти включения в дальнейшем в комплекс анализируемых показателей такой характеристики, как фракционный состав углеводов. 0 200 400 600 800 Л ип ид ы , м г· л- 1 (x ± s ) 0 10 20 30 40 50 Л ип ид ы , п г· кл -1 ( x ± s) 0 70 140 210 280 350 Л ип ид ы , ф г· м км -3 ( x ± s) 0 10 20 30 40 50 60 70 Л ип ид ы , % C Б ( x ± s ) а б в г зд е ж 0 10 20 30 40 У гл ев од ы , м г· л- 1 ( x ± s) 0 10 20 30 40 У гл ев од ы , п г· кл -1 ( x ± s) 0 50 100 150 200 250 У гл ев од ы , ф г· м км -3 ( x ± s) 0 10 20 30 40 50 60 У гл ев од ы , % C Б ( x ± s ) 0 40 80 120 160 Б ел ок , м г· л- 1 ( x ± s) 0 4 8 12 Б ел ок , п г· кл -1 ( x ± s) 0 40 80 120 Б ел ок , ф г· м км -3 ( x ± s) 0 10 20 30 Б ел ок , % C Б ( x ± s) и к л м - 1-е сутки - 11-е сутки контроль - 11-е сутки NaAc Рис. 7. Содержание липидов, белка и углеводов ( х± s) в культуре, клетках и сухой биомассе в начале и в конце «красной» стадии культивирования Среди отмеченных изменений в составе СБ на «красной» стадии наибольший интерес представляет значительное увеличение содержания липидов (с 38 до 52 % СБ в контроле и до 63 % СБ в варианте с NaAc) (рис. 7, г), что указывает на возможность комплексного культивирования B. minor как источника ККР и технических масел. Г.С. Минюк и др. 32 Заключение Изменения в составе и содержании пигментов, а также основных ком- понентов сухой биомассы, наблюдаемые в клетках Bracteacoccus minor в условиях модельного абиотического стресса, согласуются с современны- ми представлениями о вторичном каротиногенезе как составной части комплексного физиологического ответа экстремобионтных видов Chlorophyceae на абиотический стресс, заключающегося в сохранении жиз- неспособности клеток путём снижения их метаболической активности и перехода в покоящееся состояние. К специфическим особенностям стресс-реакции вида на комплексное стресс-воздействие следует отнести отсутствие выраженной реакции (как положительной, так и отрицатель- ной) на внесение в среду ацетата натрия, более высокое, чем у других видов содержание интермедиатов биосинтеза астаксантина (около 50 % ∑КР), преимущественное запасание последнего в форме диацильных эфиров (39—42 % ∑КР) и высокое содержание липидов в биомассе (53— 63 % СV). Коммерчески значимые величины выхода кетокаротиноидов (1,3—1,4 мг·л-1·сут-1) и липидов (187-202 мг·л-1·сут-1) из 1 л исходной культуры позволяют сделать заключение о перспективности продолже- ния исследований данного вида с целью разработки технологии его культивирования для получения природных красителей и технических масел. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Андреева В.М. Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли. С.Пб.: Наука, 1998. — 351 с. Данцюк Н.В. Влияние ацетата натрия на интенсивность вторичного каротиногенеза у зелёной микроводоросли Haematococcus pluvialis // Экол. моря. — 2010. — Вып. 80. — С. 44—50. Дробецкая И.В., Чубчикова И.Н., Боровков А.Б., Минюк Г.С. Определение содержания аста- ксантина и кантаксантина у зелёных микроводорослей методом тонкослойной хроматографии // Там же. — 2010. — Вып. 79. — С. 50—56. Костіков І.Ю., Романенко П.О., Демченко Е.М. та ін. Водорості грунтів України. — К.: Фітосоціоцентр, 2001. — 300 с. Минюк Г.С., Дробецкая И.В., Чубчикова И.Н., Данцюк Н.В., Челебиева Э.С. Скрининг зелёных микроводорослей как потенциальных источников природных кетокаро- тиноидов. Актуальность, стратегия и тактика исследований // Экол. моря. — 2010. — Вып. 80. — С. 67—78. Минюк Г.С., Терентьева Н.В., Дробецкая И.В. Сравнительная характеристика морфо- логических и физиолого-биохимических признаков трёх штаммов Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyta, Chlamydomonadales) // Альгология. — 2007. — 17(2). — С. 148—159. Челебиева Э.С., Минюк Г.С., Дробецкая И.В., Чубчикова И.Н. Динамика химического состава Ettlia carotinosa Komárek 1989 (Chlorophyceae) при экспериментальной ин- дукции вторичного каротиногенеза // Мор. экол. журн. — 2013. — 12(2). — С. 78—87. Особенности вторичного каротиногенеза 33 Чубчикова И.Н., Дробецкая И.В., Минюк Г.С., Данцюк Н.В., Челебиева Э.С. Скрининг одноклеточных зелёных водорослей как потенциальных источников природных кетокаротиноидов. 2. Особенности роста и вторичного каротиногенеза у предста- вителей рода Bracteacoccus (Chlorophyсeae) // Мор. экол. журн.. — 2011. — 10(1). — С. 91—97. Чубчикова И.Н., Минюк Г.С., Дробецкая И.В. Данцюк Н.В. Хлорококковые микроводоросли как потенциальный источник природных кетокаротиноидов // Экол. моря — 2009. — Вып. 77. — С. 77—83. Чубчикова И.Н., Минюк Г.С., Дробецкая И.В. Вторичный каротиногенез у зелёной микроводоросли Scotiellopsis rubescens Vinatz. в условиях природной освещённости и температуры. — Там же. — 2010. — Вып. 81. — С. 77—81. Ahlgren G., Merino L. Lipid analysis of freshwater microalgae: A method study // Arch. Hy- drobiol. — 1991. — 121(3). — P. 295—306. Boussiba S. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: Cellular physiology and stress response // Physiol. Plant. — 2000. — 108. — P. 111—117. Britton G. TLC of carotenoids // Thin Layer Chromatography in Phytochemistry. Chap. 21. — New York: CRC Press, 2008. — P. 543—573. Britton G., Liaaen-Jensen S., Pfander H. Carotenoids Handbook. — Basel: Birkhäuser Verlag, 2004. — 647 p. Carlsson A. S., van Beilen J. B., Moller R. et al. Micro- and macro-algae: Utility for industrial applications. Outputs from EPOBIO project. — Chippenham: CPL Press, 2007. — 86 p. Del Campo A., Rodrigues H., Moreno J., Vargas M.Á., Rivas J., Guerrero M.G. Accumulation of astaxanthin and lutein in Chlorella zofingiensis (Chlorophyta) // Appl. Microbiol. Bio- technol. — 2004. — 64(6). —P. 848—854. Dufossé L. Microbial and Microalgal Carotenoids as Colourants and Supplements // Carote- noids. — Vol. 5: Nutrition and Health. — Basel: Birkhauser Verlag, 2009. — P. 67—82. Egeland E.S., Garrido J.L., Clementson L. et al. Data sheets aiding identification of phyto- plankton carotenoids and chlorophylls // Phytoplankton Pigments: Characterization, Chemotaxonomy and Applications in Oceanography. — Cambridge: Cambridge Univ. Press, 2011. — P. 718—823. Franklin N.M., Adams M.S., Stauber J.L., Lim R.P. Development of an improved rapid en- zyme inhibition bioassay with marine and freshwater microalgae using flow cytometry // Arch. Environ. Contam. Toxicol. — 2001. — 40. — P. 469—480. Hanagata N., Dubinsky Z. Secondary carotenoid accumulation in Scenedesmus komarekii (Chlorophyceae, Chlorophyta) // J. Phycol. — 1999. — 35. — Р. 960—966. Hussein G., Sankawa U., Goto H., Matsumoto K., Watanabe H. Astaxanthin, a carotenoid with potential human health and nutrition // J. Nat. Prod. — 2006. — 69(3). — P. 443—449. Kobayashi M., Kakizono T., Nagai S. Enhanced carotenoid biosynthesis by oxidative stress in ace- tate-induced cyst cells of green unicellular alga Haematococcus pluvialis // Appl. Environ. Microbiol. — 1993. — 59(3). — P. 867—873. Krinsky N.I., Johnson E.J. Carotenoid actions and their relation to health and disease // Mol. Aspects Med. — 2005. — 26. — Р. 459—516. Lemoine Y., Schoefs B. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunc- tional response to stress // Photosynt. Res. — 2010. — 106. — P. 155—177. Г.С. Минюк и др. 34 Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic membranes // Methods Enzym. — 1987. — 148. — P. 350—382. Liu B.H., Lee Y.K. Secondary carotenoids formation by the green alga Chlorococcum sp. // J Appl. Phycol. — 2000. — 12. — P. 301—307. Lowry O.H., Rosebrough N.J.,Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1951. — 193. — P. 265—275. Ma R., Chen F. Induction of astaxanthin formation by reactive oxygen species in mixotro- phic culture of Chlorococcum sp. // Biotechnol. Lett. — 2001. — 23(7). — P. 519—523. Marie D., Simon N., Vaulot D. Phytoplankton cell counting by flow cytometry // Algal Cul- turing Techniques. — Amsterdam: Elsevier Acad. Press, 2005. — P. 253 — 267. März U. The global market for carotenoids. — Business report FOD925C. — 2009. — www.bccresearch.com Orosa M., Valero J.F., Herrero C. et al. Comparison of the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis and other green microalgae under N-starvation and high light conditions // J. Biotechnol. Lett. — 2001. — 23(13). — P. 1079—1085. Qin S., Liu G.-X., Hu Z.-Y. The accumulation and metabolism of astaxanthin in Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) // J. Proc. Biochem. — 2008. — 43(8). — P. 795—802. Rodriguez-Amaya D.B. A guide to carotenoid analysis in foods. — Washington: ILSI Press, 2001. — 71 p. Strickland J.D.H., Parsons T.R. Determination of carbohydrate // A practical handbook of seawater analysis. — Ottava: Fish. Res. Board Can., 1968. — P. 173—174. Wayama M., Ota S., Matsuura H., Nango N., Hirata A., Kawano S. Three-dimensional ultra- structural study of oil and astaxanthin accumulation during encystment in the green alga Haematococcus pluvialis // PLoS ONE. — 2013. — 8(1): e53618. doi:10.1371/jour- nal.pone.0053618. Поступила 25 августа 2013 г. Подписала в печать Е.И. Шнюкова ISSN 0868-8540. Аlgologia. 2015, 25(1): 21—34 http://dx.doi.org/10.15407/alg25.01.021 G.S. Minyuk, E.S. Chelebieva, I.N. Chubchikova A.O. Kovalevsky Institute of Biology of Southern Seas, NAS of Ukraine, 2, Nakhimov Pr., Sevastopol 99011, Crimea SECONDARY CAROTENOGENESIS OF THE GREEN MICROALGA BRACTEACOCCUS MINOR (CHLOROPHYTA) IN A TWO-STAGE CULTURE Morphometric and physiologic-biochemical characteristics as well as the productivity of the green terrestrial microalga Вracteacoccus minor (Chodat) Petrová were investigated in a two- stage batch culture. The specific adaptive responses, which the microalga developed under the experimentally induced secondary carotenogenesis were: high cellular resistance to so- dium acetate, the accumulation of a multicomponent mixture of secondary ketocarotenoids with the dominance of astaxanthin diesters (37—42% of the total carotenoids) and a large lipid content in algal biomass (53—63% of dry matter). K e y w o r d s : secondary carotenogenesis, ketocarotenoids, astaxanthin, Bracteacoccus minor.

Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры

Institution

Ähnliche Einträge