Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания
Изучали влияние замораживания-оттаивания на структурно-функциональное состояние гемоглобинов A и F. Отмечено увеличение содержания метформы в растворах белков, свидетельствующее об ускорении их аутоокисления. Конформационные изменения, сопровождающие этот процесс, происходят преимущественно в полярн...
Збережено в:
| Дата: | 2002 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2002
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/136802 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания / Н.Н. Тимченко, Е.Д. Розанова, Ю.В. Кучеренко, Б.Н. Леонов // Проблемы криобиологии. — 2002. — № 4. — С. 68–71. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-136802 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1368022025-02-09T10:15:46Z Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания Autooxidation of Hemoglobins A and F after Freeze-Thawing Тимченко, Н.Н. Розанова, Е.Д. Кучеренко, Ю.В. Леонов, Б.Н. Теоретическая и экспериментальная криобиология Изучали влияние замораживания-оттаивания на структурно-функциональное состояние гемоглобинов A и F. Отмечено увеличение содержания метформы в растворах белков, свидетельствующее об ускорении их аутоокисления. Конформационные изменения, сопровождающие этот процесс, происходят преимущественно в полярных областях молекул. Вивчали вплив заморожування-відтавання на структурно-функціональний стан гемоглобінів A і F. Визначено підвищення вмісту метформи в розчинах білків, яке свідчить про прискорення їх аутоокислення. Конформаційні зміни, що супроводжують цей процес, відбуваються переважно в полярних зонах молекул. The authors studied the effect of freeze-thawing on structural and functional state of hemoglobins A and F. An increase in content of metforms in protein solutions is noted, which testifies to an acceleration of hemoglobins’ auto-oxidation. Conformation changes, accompanying this process, affect mainly the polar zones of molecules. 2002 Article Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания / Н.Н. Тимченко, Е.Д. Розанова, Ю.В. Кучеренко, Б.Н. Леонов // Проблемы криобиологии. — 2002. — № 4. — С. 68–71. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/136802 612.111.11:615.832.9 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Тимченко, Н.Н. Розанова, Е.Д. Кучеренко, Ю.В. Леонов, Б.Н. Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Изучали влияние замораживания-оттаивания на структурно-функциональное состояние гемоглобинов A и F. Отмечено увеличение содержания метформы в растворах белков, свидетельствующее об ускорении их аутоокисления. Конформационные изменения, сопровождающие этот процесс, происходят преимущественно в полярных областях молекул. |
| format |
Article |
| author |
Тимченко, Н.Н. Розанова, Е.Д. Кучеренко, Ю.В. Леонов, Б.Н. |
| author_facet |
Тимченко, Н.Н. Розанова, Е.Д. Кучеренко, Ю.В. Леонов, Б.Н. |
| author_sort |
Тимченко, Н.Н. |
| title |
Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания |
| title_short |
Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания |
| title_full |
Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания |
| title_fullStr |
Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания |
| title_full_unstemmed |
Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания |
| title_sort |
аутоокисление гемоглобинов a и f после замораживания-оттаивания |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2002 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/136802 |
| citation_txt |
Аутоокисление гемоглобинов A и F после замораживания-оттаивания / Н.Н. Тимченко, Е.Д. Розанова, Ю.В. Кучеренко, Б.Н. Леонов // Проблемы криобиологии. — 2002. — № 4. — С. 68–71. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT timčenkonn autookisleniegemoglobinovaifposlezamoraživaniâottaivaniâ AT rozanovaed autookisleniegemoglobinovaifposlezamoraživaniâottaivaniâ AT kučerenkoûv autookisleniegemoglobinovaifposlezamoraživaniâottaivaniâ AT leonovbn autookisleniegemoglobinovaifposlezamoraživaniâottaivaniâ AT timčenkonn autooxidationofhemoglobinsaandfafterfreezethawing AT rozanovaed autooxidationofhemoglobinsaandfafterfreezethawing AT kučerenkoûv autooxidationofhemoglobinsaandfafterfreezethawing AT leonovbn autooxidationofhemoglobinsaandfafterfreezethawing |
| first_indexed |
2025-11-25T18:43:46Z |
| last_indexed |
2025-11-25T18:43:46Z |
| _version_ |
1849788967540490240 |
| fulltext |
68
Àóòîîêèñëåíèå ãåìîãëîáèíîâ A è F ïîñëå çàìîðàæèâàíèÿ-îòòàèâàíèÿ
Í.Í. ÒÈÌ×ÅÍÊÎ, Å.Ä. ÐÎÇÀÍÎÂÀ, Þ.Â. ÊÓ×ÅÐÅÍÊÎ, Á.Í. ËÅÎÍÎÂ
Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ
Autooxidation of Hemoglobins A and F after Freeze-Thawing
TIMCHENKO N.N., ROZANOVA E.D., KUCHERENKO YU.V., LEONOV B.N.
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Изучали влияние замораживания-оттаивания на структурно-функциональное состояние гемоглобинов A и F. Отмечено
увеличение содержания метформы в растворах белков, свидетельствующее об ускорении их аутоокисления. Конформационные
изменения, сопровождающие этот процесс, происходят преимущественно в полярных областях молекул.
Вивчали вплив заморожування-відтавання на структурно-функціональний стан гемоглобінів A і F. Визначено підвищення
вмісту метформи в розчинах білків, яке свідчить про прискорення їх аутоокислення. Конформаційні зміни, що супроводжують
цей процес, відбуваються переважно в полярних зонах молекул.
The authors studied the effect of freeze-thawing on structural and functional state of hemoglobins A and F. An increase in
content of metforms in protein solutions is noted, which testifies to an acceleration of hemoglobins’ auto-oxidation. Conformation
changes, accompanying this process, affect mainly the polar zones of molecules.
УДК 612.111.11:615.832.9 UDC 612.111.11:615.832.9
Окисление железа в гемоглобине приводит к
образованию метгемоглобина, содержащего
трехвалентное железо, и потере способности
связывать молекулярный кислород. Спонтанное
формирование метгемоглобина (аутоокисление)
идет медленно как in vivo, так и in vitro. Однако
этот процесс может ускоряться при действии
различных физико-химических факторов [8]. Такое
влияние на молекулу гемоглобина является
неблагоприятным, так как снижает ее устой-
чивость к окислению и приводит к потере
способности выполнять основную функцию –
связывать молекулы кислорода. Сохранение этой
функции – одна из главных задач при низко-
температурном консервировании эритроцитов и
гемоглобина.
Ранее [2] были изучены некоторые закономер-
ности реакций обратимой оксигенации гемоглоби-
на человека. Отмечено, что константа скорости
реакции аутоокисления существенно возрастает с
понижением рН среды и алифатические спирты
повышают эффективность процесса аутоокис-
ления. Несмотря на то, что низкотемпературное
консервирование широко используется для
хранения эритроцитов и гемоглобина, как влияет
замораживание-оттаивание на способность
молекулы гемоглобина к аутоокислению не
изучалось. Целью настоящей работы было изучить,
каким образом влияет замораживание-оттаивание
на аутоокисление гемоглобинов А и F (HbA и HbF)
и какими изменениями конформации белка этот
процесс может сопровождаться.
В работе использовали растворы HbА и HbF в
физиологическом растворе на 0,05 М натрий-фос-
фатном буфере, рН 7,2. Раствор HbA выделяли из
донорской, а HbF – из пуповинной крови [4].
Iron oxidation in hemoglobin results in the
formation of methemoglobin, containing three-valent
iron, and the loss of the capability to bind molecular
oxygen. Spontaneous formation of methemoglobin
(autooxidation) proceeds slowly both in vivo and in
vitro. However this process can be accelerated under
the effect of various physical and chemical factors
[8]. Such an effect on hemoglobin molecule is
unfavourable, because it reduces its resistance to
oxidation and leads to the loss of the capability to
perform the main function: to bind the oxygen
molecules. Keeping of this function is one of the main
aims of low temperature preservation of erythrocytes
and hemoglobin.
Recently some regularities in reactions of
reversible oxygenation of human haemoglobin have
been studied [2]. It is noted that the constant of
autooxidation reaction rate increases with the
decrease in medium’s pH and aliphatic alcohols
increase the efficiency of autooxidation process.
Despite the low temperature preservation is widely
used for the storage of erythrocytes and hemoglobin,
the way, by which freeze-thawing affects the
capability of hemoglobin molecule to oxidation has
not been studied. The aim of this work was to
investigate how freeze-thawing affects autooxidation
of hemoglobins A and F (HbA and HbF) and what
changes in protein conformation can accompany this
process.
In the work we used the solutions of HbA and
HbF in physiological solution on 0.05 M sodium-
sulphate buffer, pH 7.2. Methemoglobin (metHb)
content in the solutions was spectrophotometrically
determined [9, 10]. To characterise the protein
conformation we used the first derivative of
absorption spectra (DAS) in UV area and the
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
2002, ¹4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2002, ¹4
69
Содержание метгемоглобина
(метHb) в растворах определяли
спектрофотометрически [9, 10].
Для характеристики конформа-
ции белков использовали первые
производные спектров поглоще-
ния (ПСП) в УФ области и ис-
следование гидрофобной по-
верхности молекул методом свя-
зывания белка с органическим
красителем бромтимоловым
синим (БТС) [7]. Растворы БТС
концентрацией 5×10-4М готовили
на 0,05 М натрий-фосфатном
буфере, рН 7,2.
Время контакта белков с БТС
корС
ч,яиненарх
,mretegarotS
srh
AbHтеМ
AbHteM
FbHтеМ
FbHteM
К ьлортно
lortnoC
елсоП
�яинавижаромаз
яинавиатто
�ezeerfretfA
gniwaht
К ьлортно
lortnoC
елсоП
�яинавижаромаз
яинавиатто
�ezeerfretfA
gniwaht
0 7,0±0,3 8,0±0,4 0,1±0,5 8,0±0,6
6 7,0±0,3 8,0±0,5 0,1±0,5 0,1±0,8
21 7,0±0,3 8,0±0,7 0,1±0,5 0,1±0,01
42 7,0±0,3 8,0±0,8 0,1±0,5 9,0±0,21
Рис. 1. Первые ПСП раствора HbA : • – до; × – после
замораживания-оттаивания.
Fig. 1. The first DAS of the HbA solution: • – before; × –
after freeze-thawing
∆A
/∆
λ
260 270 280 290 300 310
-0,04
-0,03
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02
λ, нм/nm
Содержание метформы в растворах HbA и HbF после замораживания-
оттаивания, %
Content of metform in the solutions of HbA and HbF after freeze-thawing, %
составило 20 мин. Концентрации HbА и HbF
находились в пределах 0,8 ÷ 1,4×10-5М и 1,2 ÷
1,5×10-5М соответственно; концентрации БТС –
5 ÷ 30×10-6М. Параметры связывания красителя с
белком (количество участков n на молекуле белка,
сорбирующих краситель и константу диссоциации
комплекса белок-краситель kd) рассчитывали по
методу, предложенному С.В.Левиным [3]. Раст-
воры HbA и HbF замораживали со средней
скоростью 20°С/мин до температуры жидкого
азота. Оттаивание осуществляли на водяной бане
при 20°С. Спектры поглощения записывали на
спектрофотометре “PYE UNICAM SP 8000”
(Велико-британия).
Содержание метгемоглобина в растворах после
замораживания-оттаивания заметно увеличивается
после хранения растворов в течение 1-2-х суток
при 4°С, в то время как в исходных растворах
изменения в содержании метгемоглобина не
наблюдается (таблица).
Изучение первых ПСП в УФ области показало,
что изменения в структуре спектров наблюдаются
в области 272 нм, свидетельствующие о смещении
максимума спектра поглощения в коротковолновую
область и небольших изменениях в области
тирозиновых аминокислотных остатков [1],
которые обычно располагаются в полярных
областях (рис.1,2).
Исследование параметров связывания БТС с
белками показало, что количество участков
сорбции БТС с HbF меньше по сравнению с HbA
(3,2 и 5,4 соответственно), но образующаяся связь
более прочная, так как константа диссоциации
меньше. Замораживание-оттаивание не влияет на
параметры взаимодействия гемоглобинов с БТС.
Таким образом, полученные результаты показа-
ли, что замораживание-оттаивание растворов HbA
и HbF приводит к увеличению содержания в них
метформы, свидетельствующее об ускорении
аутоокисления белков, причем для HbF этот
investigation of hydrophobic surface of molecules
by the method of protein binding with organic dye,
bromthymol blue (BTB) [7]. BTB solutions under
the concentration of 5×10-4M were prepared with
0.05M sodium-phosphate buffer, pH 7.2.
The contact time of proteins with BTB made 20
min. The concentrations of HbA and HbF were
within the limits of 0.8 ÷ 1.4×10-5M and 1.2 ÷
1.5×10-5M, correspondingly; BTB concentrations did
5 ÷ 30×10-6M. The parameters of dye binding with
protein (the number of sites on protein molecule,
absorbing the dye and the constant of dissociation
for the “protein-dye” complex, kd) were calculated
according to the method proposed by S.V. Levin [3].
The solutions of HbA and HbF were frozen with an
average rate of 20°C/min down to the temperature
of liquid nitrogen. Thawing was carried out on water
bath at 20°C. Absorption spectra were recorded with
the spectrometer “PYE UNICAM SP 8000” (UK).
The content of methemoglobin in the solutions
after freeze-thawing considerably increases after
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
2002, ¹4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2002, ¹4
70
процесс более выражен. Изученные структурные
параметры показали, что замораживание-оттаива-
ние приводит к конформационным изменениям,
затрагивающим преимущественно полярные
области белковой глобулы. Более выраженное
действие замораживания-оттаивания на HbF по
сравнению с HbA, по-видимому, обусловлено тем,
что в его состав входит большее количество
полярных аминокиcлот [5], и, как показали наши
эксперименты, меньшее количество гидрофобных
областей, которые вносят наибольший вклад в
стабилизацию белковых молекул [6]. Для под-
тверждения высказанных предложений необхо-
димо исследовать структурно-функциональное
состояние белков другими методами, определить,
какие факторы (состав растворителя, скорость
охлаждения) вносят наиболее существенный вклад
в наблюдаемые изменения. Результаты таких
исследований позволят предложить пути стаби-
лизации белков в процессе замораживания-
оттаивания.
∆A
/∆
λ
Рис. 2. Первые ПСП раствора HbF: • – до; × – после
замо-раживания-оттаивания.
Fig. 2. The first DAS of the HbF solution: • – before; × –
after freeze-thawing
λ, нм/nm
storage of the solutions during 1-2 days at 4°C,
meanwhile in initial solutions the changes in the
methemoglobin content were not observed (Table).
The investigation of the first DAS in UV area
has shown that the changes in the spectra structure
are observed in the area of 242 nm, testifying to a
shift of the absorption spectrum maximum to a short
wave region and slight changes in the area of tyrosine
amino acids residua [7], which usually are located
in polar areas (Fig. 1,2).
The studying of the parameters of BTB binding
with proteins has demonstrated that the number of
BTB absorption sites with HbF is less in comparison
with HbA (3.2 and 5.4, correspondingly), but the
forming binding is more tight, because the disso-
ciation constant is lower (0.2 for HbF and 0.7 for
HbA). Freeze-thawing does not affect the parameters
of interaction of hemoglobins with BTB.
Thus obtained results have shown that freeze-
thawing of the HbA and HbF solutions results in the
increase of the content in them of metform, testifying
to an acceleration of protein autooxidation, moreover
for HbF this process is more manifested. Studied
structural parameters have demonstrated that freeze-
thawing results in conformational changes, affecting
predominantly the polar areas of protein globule.
More manifested effect of freeze-thawing on HbF in
comparison with HbA, probably, is stipulated by the
fact that it comprises a big number of polar amino
acids [5] and as our experiments showed less number
of hydrophobic areas, which contributed most of all
to stabilisation of protein molecules [6]. To confirm
these statements it is necessary to continue the
investigation of structural and functional state of
protein by other methods, and to determine the
factors (solvent composition, cooling rate), which
essentially contribute to the observed changes.
Results of these investigations will allow to propose
the ways of proteins’ stabilisation in process of
freeze-thawing.
References
1. Demchenko A.P. Ultraviolet spectrophotometry of proteins. –
Kiev: Naukova Dumka, 1981. – 201p.
2. Zavodnik I.B., Piletskaya T.P., Stepuro I.I. Autooxidation and
oxidation of human hemoglobin // Moleculyarnaya biologiya.–
1992.– Vol. 26, N2.- P. 321-327.
3. Levin S.V. Structural changes in cellular membranes. – Lenin-
grad: Nauka, 1976. – 224p.
4. Timchenko N.N., Rozanova E.D., Moiseyev V.A., Khromush-
kin K.N. Studying of the effect of concentrated solutions of sodium
chloride on the state of fetal hemoglobin and hemoglobin A //
Biophysical Bulletin.– 2001.– N2.– P. 62-66.
5. White A., Handler F., Smith E., Hill R. Grounds of Biochemistry.
Vol. 3. – Moscow: Mir, 1981.– 726 p.
6. Schultz G., Schirmer R. Principles of structural organization of
proteins. – Moscow: Mir, 1982. – 354 p.
Литература
1. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия
белков.– Киев: Наук. думка, 1981.– 208 с.
2. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П. Степуро И.И. Аутоокисление
и оксигенация гемоглобина человека // Молекулярная
биология.– 1992.– Т. 26, №2.– С. 321-327.
3. Левин С.В. Структурные изменения клеточных мембран.–
Л.: Наука, 1976.– 224 с.
4. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромуш-
кин К.Н. Изучение влияния концентрированных растворов
натрия хлорида на состояние фетального гемоглобина и
гемоглобина А // Біофіз. вісник.-2001.-№2.-С.62-66.
5. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р. Основы био-
химии.Т.3.– М.: Мир, 1981.– 726 с.
6. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации
белков.– М.: Мир, 1982.– 354 с.
260 270 280 290 300 310
-0,04
-0,03
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
2002, ¹4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2002, ¹4
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
2002, ¹4
71 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2002, ¹4
7. Antonini E., Wyman J., Moretti R. The interaction of bromthymol
blue with hemoglobin and its effect on the oxygen equilibrium //
Biochem. Biophys. Acta. – 1963. – Vol. 71. – P. 12-138.
8. Erust R., Joffe M. Methemoglobin pathophysiology. In: The
function of the red blood cells. Erythrocyte pathology. – N.Y,
1981.– P. 133-151.
9. Fogh-Andersen N., Siggard-Andersen O. Spectrophotometric
determination of hemoglobin pigments in neonatal blood // Clin.
Chim. Acta. – 1987.– Vol. 166. – P. 291-296.
10. Zwart A., Buursma A., Van Kampen E. A multi-wavelength
spectrophotometric method for the simultaneous determination
of five haemoglobin derivatives // J. Clin. Chem. Clin. Biochem.–
1981.– Vol. 19.– P. 457-463.
Accepted in 01.10.2002
7. Antonini E., Wyman J., Moretti R. The interaction of bromthymol
blue with hemoglobin and its effect on the oxygen equilibrium //
Biochem. Biophys. Acta. – 1963. – Vol. 71. – P. 12-138.
8. Erust R., Joffe M. Methemoglobin pathophysiology. In: The
function of the red blood cells. Erythrocyte pathology. – N.Y,
1981.– P. 133-151.
9. Fogh-Andersen N., Siggard-Andersen O. Spectrophotometric
determination of hemoglobin pigments in neonatal blood // Clin.
Chim. Acta. – 1987.– Vol. 166. – P. 291-296.
10. Zwart A., Buursma A., Van Kampen E. A multi-wavelength
spectrophotometric method for the simultaneous determination
of five haemoglobin derivatives // J. Clin. Chem. Clin. Biochem.–
1981.– Vol. 19.– P. 457-463.
Поступила 01.10.2002
|