Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации
В работе хроматографическим методом исследовали молекулярно-массовое распределение белков и пептидов из супернатантов, полученных из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации. Наибольшее количество пептидных фракций имеют супернатанты из неакклимированных к холоду личинок T. molitor. Пок...
Збережено в:
| Дата: | 2016 |
|---|---|
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2016
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138181 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации / А.К. Гулевский, Д.В. Третьяк // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 4. — С. 322–330. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138181 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1381812025-02-23T20:23:07Z Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации Features of protein-peptide and carbohydrate composition of supernatants from Tenebrio molitor larvae after cold acclimation Гулевский, А.К. Третьяк, Д.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология В работе хроматографическим методом исследовали молекулярно-массовое распределение белков и пептидов из супернатантов, полученных из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации. Наибольшее количество пептидных фракций имеют супернатанты из неакклимированных к холоду личинок T. molitor. Показано, что холодоакклимированные личинки T. molitor содержат низкомолекулярные пептидные фракции с м. м. (540 ± 20) – (2255 ± 85) Да, а неакклимированные – значительное количество высокомолекулярных пептидов с м. м. (4675 ± 225) – (6595 ± 550) Да. Определено содержание сахаров и сахароспиртов в супернатантах акклимированных к холоду и неакклимированных личинок T. molitor. Установлено, что концентрация глюкозы у неакклимированных особей T. molitor в 1,34 раза выше, чем у холодоакклимированных. Акклимированные личинки T. molitor содержали большее количество гидрофильных и меньшее количество гидрофобных белков по сравнению с неакклимированными. Также обнаружено, что неакклимированные личинки T. molitor содержали низкие концентрации сахароспиртов (сорбитола и маннитола), которые отсутствовали у акклимированных. У роботі хроматографічним методом досліджували молекулярно-масовий розподіл білків і пептидів із супернатантів, отриманих із личинок Tenebrio molitor після холодової аклімації. Найбільшу кількість пептидних фракцій мають супернатанти із неаклімованих до холоду личинок T. molitor. Показано, що холодоаклімовані личинки T. molitor містять низькомолекулярні пептидні фракції з м. м. (540 ± 20) – (2255 ± 85) Да, а неаклімовані – значну кількість високомолекулярних пептидів з м. м. (4675 ± 225) – (6595 ± 550) Да. Визначено вміст цукру та цукроспиртів у супернатантах аклімованих до холоду та неаклімованих личинок T. molitor. Встановлено, що концентрація глюкози у неаклімованих личинок T. molitor була в 1,34 рази вище, ніж у холодоаклімованих. Аклімовані личинки T. molitor мали більшу кількість гідрофільних і меншу кількість гідрофобних білків у порівнянні з неаклімованими. Також виявлено, що неаклімовані личинки T. molitor мали низькі концентрації цукроспиртів (сорбітолу та манітолу), які були відсутні у аклімованих. The paper describes the chromatographic studies on the molecular-mass distribution of proteins and peptides of supernatants, derived from Tenebrio molitor larvae during cold acclimation. Supernatants of non-acclimated larvae of T. molitor had the highest amount of peptide fractions. It has been shown that cold-acclimated T. molitor larvae comprised the low-molecular peptide fractions with MW of (540 ± 20) – (2.255 ± 85) Da, and high-molecular peptides with MW of (4.675 ± 225) – (6.595 ± 550) Da were characteristic for non-acclimated larvae. The content of sugars and polyols in supernatants of cold-acclimated and non-acclimated T. molitor larvae was determined. It has been found that glucose concentration in non-acclimated T. molitor larvae was in 1.34 times higher than in cold-acclimated ones. Аcclimated T. molitor larvae had more hydrophilic and less hydrophobic proteins as compared to non-acclimated ones. As well it has been established that non-acclimated T. molitor larvae had low concentrations of polyols (sorbitol and mannite), which were absent in acclimated insects. 2016 Article Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации / А.К. Гулевский, Д.В. Третьяк // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 4. — С. 322–330. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138181 612.44.014.086.3:616.127-002:612.649.011.87.014.3 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Гулевский, А.К. Третьяк, Д.В. Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
В работе хроматографическим методом исследовали молекулярно-массовое распределение белков и пептидов
из супернатантов, полученных из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации. Наибольшее количество пептидных
фракций имеют супернатанты из неакклимированных к холоду личинок T. molitor. Показано, что холодоакклимированные
личинки T. molitor содержат низкомолекулярные пептидные фракции с м. м. (540 ± 20) – (2255 ± 85) Да, а неакклимированные –
значительное количество высокомолекулярных пептидов с м. м. (4675 ± 225) – (6595 ± 550) Да. Определено содержание
сахаров и сахароспиртов в супернатантах акклимированных к холоду и неакклимированных личинок T. molitor. Установлено,
что концентрация глюкозы у неакклимированных особей T. molitor в 1,34 раза выше, чем у холодоакклимированных.
Акклимированные личинки T. molitor содержали большее количество гидрофильных и меньшее количество гидрофобных
белков по сравнению с неакклимированными. Также обнаружено, что неакклимированные личинки T. molitor содержали
низкие концентрации сахароспиртов (сорбитола и маннитола), которые отсутствовали у акклимированных. |
| format |
Article |
| author |
Гулевский, А.К. Третьяк, Д.В. |
| author_facet |
Гулевский, А.К. Третьяк, Д.В. |
| author_sort |
Гулевский, А.К. |
| title |
Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации |
| title_short |
Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации |
| title_full |
Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации |
| title_fullStr |
Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации |
| title_full_unstemmed |
Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации |
| title_sort |
особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок tenebrio molitor после холодовой акклимации |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2016 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138181 |
| citation_txt |
Особенности белково-пептидного и углеводного состава супернатантов из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации / А.К. Гулевский, Д.В. Третьяк // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 4. — С. 322–330. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT gulevskijak osobennostibelkovopeptidnogoiuglevodnogosostavasupernatantovizličinoktenebriomolitorposleholodovojakklimacii AT tretʹâkdv osobennostibelkovopeptidnogoiuglevodnogosostavasupernatantovizličinoktenebriomolitorposleholodovojakklimacii AT gulevskijak featuresofproteinpeptideandcarbohydratecompositionofsupernatantsfromtenebriomolitorlarvaeaftercoldacclimation AT tretʹâkdv featuresofproteinpeptideandcarbohydratecompositionofsupernatantsfromtenebriomolitorlarvaeaftercoldacclimation |
| first_indexed |
2025-11-25T04:38:39Z |
| last_indexed |
2025-11-25T04:38:39Z |
| _version_ |
1849735799449321472 |
| fulltext |
УДК 612.44.014.086.3:616.127-002:612.649.011.87.014.3
А.К. Гулевский*, Д.В. Третьяк
Особенности белково-пептидного и углеводного состава
супернатантов из личинок Tenebrio molitor
после холодовой акклимации
UDC 612.44.014.086.3:616.127-002:612.649.011.87.014.3
A.K. Gulevsky*, D.V. Tretiak
Features of Protein-Peptide and Carbohydrate Composition
of Supernatants From Tenebrio Molitor Larvae After Cold Acclimation
Реферат: В работе хроматографическим методом исследовали молекулярно-массовое распределение белков и пептидов
из супернатантов, полученных из личинок Tenebrio molitor после холодовой акклимации. Наибольшее количество пептидных
фракций имеют супернатанты из неакклимированных к холоду личинок T. molitor. Показано, что холодоакклимированные
личинки T. molitor содержат низкомолекулярные пептидные фракции с м. м. (540 ± 20) – (2255 ± 85) Да, а неакклимированные –
значительное количество высокомолекулярных пептидов с м. м. (4675 ± 225) – (6595 ± 550) Да. Определено содержание
сахаров и сахароспиртов в супернатантах акклимированных к холоду и неакклимированных личинок T. molitor. Установлено,
что концентрация глюкозы у неакклимированных особей T. molitor в 1,34 раза выше, чем у холодоакклимированных.
Акклимированные личинки T. molitor содержали большее количество гидрофильных и меньшее количество гидрофобных
белков по сравнению с неакклимированными. Также обнаружено, что неакклимированные личинки T. molitor содержали
низкие концентрации сахароспиртов (сорбитола и маннитола), которые отсутствовали у акклимированных.
Ключевые слова: Tenebrio molitor, холодовая акклимация, хроматография, пептиды, сахара, сахароспирты.
Реферат: У роботі хроматографічним методом досліджували молекулярно-масовий розподіл білків і пептидів із супер-
натантів, отриманих із личинок Tenebrio molitor після холодової аклімації. Найбільшу кількість пептидних фракцій мають
супернатанти із неаклімованих до холоду личинок T. molitor. Показано, що холодоаклімовані личинки T. molitor містять
низькомолекулярні пептидні фракції з м. м. (540 ± 20) – (2255 ± 85) Да, а неаклімовані – значну кількість високомолекулярних
пептидів з м. м. (4675 ± 225) – (6595 ± 550) Да. Визначено вміст цукру та цукроспиртів у супернатантах аклімованих до холоду
та неаклімованих личинок T. molitor. Встановлено, що концентрація глюкози у неаклімованих личинок T. molitor була в 1,34 рази
вище, ніж у холодоаклімованих. Аклімовані личинки T. molitor мали більшу кількість гідрофільних і меншу кількість гідрофобних
білків у порівнянні з неаклімованими. Також виявлено, що неаклімовані личинки T. molitor мали низькі концентрації цукроспиртів
(сорбітолу та манітолу), які були відсутні у аклімованих.
Ключові слова: Tenebrio molitor, холодова аклімація, хроматографія, пептиди, цукри, цукроспирти.
Abstract: The paper describes the chromatographic studies on the molecular-mass distribution of proteins and peptides of
supernatants, derived from Tenebrio molitor larvae during cold acclimation. Supernatants of non-acclimated larvae of T. molitor had
the highest amount of peptide fractions. It has been shown that cold-acclimated T. molitor larvae comprised the low-molecular peptide
fractions with MW of (540 ± 20) – (2.255 ± 85) Da, and high-molecular peptides with MW of (4.675 ± 225) – (6.595 ± 550) Da were
characteristic for non-acclimated larvae. The content of sugars and polyols in supernatants of cold-acclimated and non-acclimated
T. molitor larvae was determined. It has been found that glucose concentration in non-acclimated T. molitor larvae was in 1.34 times
higher than in cold-acclimated ones. Аcclimated T. molitor larvae had more hydrophilic and less hydrophobic proteins as compared to
non-acclimated ones. As well it has been established that non-acclimated T. molitor larvae had low concentrations of polyols (sorbitol
and mannite), which were absent in acclimated insects.
Key words: Tenebrio molitor, cold acclimation, chromatography, peptides, sugars, sugar alcohols.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61016;
тел.: (+38 057) 373-74-35, факс: (+38 057) 373-59-52,
электронная почта: profgulevskyy@gmail.com
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkiv, Ukraine 61016;
tel.:+380 57 3737435, fax: +380 57 373 5952,
e-mail: profgulevskyy@gmail.com
Department of Cold Adaptation, Institute for Problems of Cryobiol-
ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkiv, Ukraine
Отдел холодовой адаптации, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
оригинальное исследование research article
Многие холодоустойчивые организмы (аркти-
ческая и антарктическая рыба [7, 11, 19, 21], насе-
комые [4, 5, 8, 9, 13, 14, 17, 18] и бактерии [12, 20])
способны адаптироваться к низким температурам
благодаря температурно-компенсаторным процес-
сам на разных уровнях биологической организации.
Так, на молекулярном уровне у холодоустойчивых
организмов синтезируются и аккумулируются
Many of cold-resistant organisms (Arctic and An-
tarctic fishes [5, 9, 18, 21], insects [1, 3, 6, 7, 11, 12,
16, 17] and bacteria [10, 20] are adaptable to low
temperatures due to the temperature-compensatory
processes at various levels of biological organization.
For example, at molecular level in cold-resistant orga-
nisms the specific proteins (antifreeze proteins and
glycoproteins, cold shock proteins), peptides, low mole-
© 2016 A.K. Gulevsky et al., Published by the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
Probl Cryobiol Cryomed 2016; 26(4): 322–330
http://dx.doi.org/10.15407/cryo26.04.322
Поступила 06.09.2016
Принята в печать 18.10.2016
Received September, 06, 2016
Accepted October, 18, 2016
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0),
which permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
323
специфические белки (антифризные белки и
гликопротеины, белки холодового шока), пептиды,
низкомолекулярные криозащитные вещества (са-
хара, полиолы), а также происходят структурные
перестройки некоторых протеинов, в результате
которых повышается гибкость [6] и стабильность
белковых молекул [10, 15], снижается их гидрофоб-
ность [16]. Именно биохимические модификации,
наблюдаемые вследствие изменения температур-
ных условий среды, способствуют сохранению и
оптимизации функций протеинов, что обеспечивает
выживание биологического вида. Процесс адап-
тации живых организмов к низким температурам
преимущественно связан со структурными изме-
нениями белков, а также с качественными модифи-
кациями спектра белков и углеводов, поэтому
представляло интерес установить особенности
адаптации холодоустойчивых личинок Tenebrio
molitor к низким температурам.
Цель работы – изучить с помощью гель-прони-
кающей и прямофазной высокоэффективной жид-
костной хроматографии пептидный и углеводный
состав супернатантов, полученных из личинок
T. molitor, а также исследовать с помощью обра-
щенно-фазовой хроматографии распределение
белков по степени их гидрофобности после холо-
довой акклимации личинок T. molitor.
Материалы и методы
В работе использовали личинок (n = 6) большого
мучного хрущака T. molitor последних возрастов,
которых содержали при 25°С в прозрачных контей-
нерах, заполненных пшеничными и овсяными
отрубями. Перед началом эксперимента насекомых
акклимировали при 5...7°С в течение трех недель.
Для получения белков и пептидов личинок T. molitor
гомогенизировали в 0,6%-м растворе хлорида
натрия на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4) с
добавлением ингибитора протеаз фенилметил-
сульфонилфторида («Sigma», США) из расчета
шесть особей на 2 мл буфера. Гомогенат центрифу-
гировали 10 мин при 1800g, затем в течение 60 мин
надосадочную жидкость центрифугировали при
100 000g. В исследованиях использовали супер-
натант.
Количество белка в пробах определяли по
методу Бредфорда [3].
Количественную и качественную оценку пеп-
тидного состава супернатантов из личинок T. molitor
проводили с помощью гель-проникающей хромато-
графии [1] на колонке размером 400 × 16 мм, запол-
ненной поливиниловым гелем «TSK-Gel Toyopearl
HW-40 Fine» («Toyo Soda Manufacturing Co», Япо-
ния), применение которого позволяет разделять
полипептидные молекулы с м. м. 100–12 000 Да.
Через петлевой инжектор в колонку вводили пробы
cular weight cryoprotectants (sugars, polyols) are syn-
thesized and accumulated, as well there are structural
reorganization of some proteins, resulting in an increa-
sed flexibility [4] and stability of protein molecules [8,
14] and decrease in their hydrophobicity [15]. The very
biochemical modifications observed due to the changes
in environment temperature conditions, promote the
maintenance and optimization of protein functions, pro-
viding species survival. Adaptation of living organisms
to low temperatures is mostly associated with the struc-
tural changes in proteins as well as with qualitative mo-
difications of protein and carbohydrate spectrum, there-
fore it was of interest to establish the cold-adaptation
features of Tenebrio molitor larvae to low temperatures.
The research aim was to study peptide and carbo-
hydrate composition of supernatants derived from
T. molitor larvae by gel-permeation and high perfor-
mance liquid chromatography, as well as to investigate
the protein distribution on their hydrophobicity extent
after cold acclimation of T. molitor larvae by reverse
phase chromatography.
Materials and methods
The research was performed in the larvae (n = 6)
of T. molitor mealworm of last ages, kept at 25°C in
transparent containers filled with wheat and oat bran.
Before the experiment the insects were acclimated at
5...7°C for three weeks. To derive the proteins and
peptides, the larvae were homogenized in 0.6% NaCl
in 0.1 M Na-phosphate buffer (pH 7.4) supplemented
with protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride
(Sigma, USA) putting six insects per 2 ml of buffer.
The homogenate was centrifuged for 10 min at 1,800g
then the supernatant was centrifuged for 60 min at
100,000g. The supernatant was then used for studies.
Protein concentration in the samples was determi-
ned by the Bradford method [19].
Peptide composition of supernatants of T. molitor
larvae was quantitatively and qualitatively analyzed
using the gel-permeation chromatography in the
400×16 mm column filled with polyvinyl gel TSK-Gel
Toyopearl HW-40 Fine (Toyo Soda Manufacturing Co,
Japan), the use of which allows to separate polypeptide
molecules with MW 100–12,000 Da.
The samples of 0.2 ml were injected through a loop
injector into the column and eluting phosphate buffered
saline (18 mM Na2HPO4, 12 mM NaH2PO4, 100 mM
NaCl (pH 7,4)) was delivered using a Microperpex
LKB 2132 peristaltic pump (LKB, Sweden). Eluent
flow rate was 1.63 ml/min. The obtained fractions of
low molecular weight peptide compounds were recorded
with UV/optical monitor Uvicord SII LKB 2238 (LKB)
at 280 nm wavelength. Monitor signal was collected
by Recorder LKB 2210 two-channel potentiometer
(LKB) in terms of chromatograms and was supplied
to an integrator Waters 746 Data Module (Waters
объемом 0,2 мл и с помощью перистальтического
насоса «Microperpex LKB 2132» («LKB», Швеция)
подавали элюирующий фосфатно-солевой буфер-
ный раствор (18 мМ Na2HPO4, 12 мМ NaH2PO4,
100 мМ NaCl (рН 7,4)). Скорость потока элюента
составляла 1,63 мл/мин. Полученные фракции
низкомолекулярных веществ пептидной природы
регистрировали с помощью ультрафиолетового
оптического монитора «Uvicord SII LKB 2238»
(«LKB») при длине волны 280 нм. Сигнал монитора
регистрировался двухканальным самопишущим
потенциометром «Recorder LKB 2210» («LKB»)
в виде хроматограмм и подавался на интегратор
«Waters 746 Data Module» («Waters Millipore»,
США) для определения времени удерживания
фракции и площади под пиком. В качестве мар-
керов молекулярных масс использовали рибофла-
вин с м. м. 376,40 Да, ангиотензин ІІ с м. м. 1046,18 Да,
цианокобаламин с м. м. 1355,37 Да, мелитин с
м. м. 2846,46 Да, инсулин человека с м. м. 5807,57 Да
(все вещества производства «Sigma»).
Аликвоты, взятые из супернатантов, пропускали
через мембранные фильтры «Chromafil GF/PET-
45/25 ZF-S» («Macherey-Nagel», Германия), затем
идентифицировали и определяли при 75°С содержа-
ние сахаров и сахароспиртов методом высокоэф-
фективной прямофазной жидкостной хроматографии
с использованием хроматографа «Smartline» («Knauer»,
Германия) на колонке «Erokat H» («Knauer») раз-
мером 300 × 8 мм, заполненной поперечно сшитыми
сополимерами полистирола с размером пор 10 мкм.
В колонку вводили пробу объемом 0,015 мл.
В качестве подвижной фазы использовали воду пер-
вой степени очистки со скоростью потока 0,5 мл/мин.
Содержание сахаров в супернатантах определяли
с помощью рефрактометрического детектора «RI
Detector 2300» («Knauer»). Для обработки и вычис-
ления результатов применяли программное обес-
печение «Clarity Chrom» («Knauer»). В качестве
стандартов использовали глюкозу, сахарозу, фруктозу,
лактозу, сорбитол, маннитол (все вещества произ-
водства «Sigma»).
Для исследования гидрофобности белков из
личинок T. molitor методом обращенно-фазовой
высокоэффективной жидкостной хроматографии
использовали жидкостный хроматограф «Shimadzu
LC-2010» («Shimadzu», Япония) и колонку размером
250 × 4,6 мм «Vydac C4» («The Separations Group»,
США), заполненную сферическим силикагелем с
размером пор 300 D.
Белки градиентно элюировали из колонки двумя
подвижными фазами (ПФ) реактивов фирмы «Fluka
Chemie» (Швейцария) (ПФ А – 90% буферного
раствора с рН 4,2, 10% ацетонитрила и ПФ Б –
10% буферного раствора с рН 4,2, 90% ацетонит-
рила) по следующей программе: первые 8 мин
Millipore, USA) to determine the retention time of
fraction and the area under the peak. Riboflavin with
MW 376.40 Da, angiotensin II with MW 1046.18 Da,
cyanocobalamin with MW 1,355.37 Da, melittin with
MW 2,846.46 Da, human insulin with MW 5,807.57
Da (all the substances were of Sigma production) were
used as the molecular weight markers.
Aliquots derived from the supernatants were passed
through membrane filters Chromafil GF/PET-45/25
ZF-S (Macherey-Nagel, Germany), and then the con-
tent of sugars and sugar alcohols were examined and
revealed at 75°C by high performance liquid chroma-
tography using Smartline chromatograph (Knauer,
Germany) in the 300 × 8 mm column Erokat H (Knauer)
filled with cross-linked polystyrene copolymers with a
pore size of 10 µm.
The sample of 0.015 ml was introduced into the
column. Water of the first purification degree with
0.5 ml/min flow rate was used as mobile phase.
Content of sugars in supernatants was determined by
RI Detector 2,300 refractometric detector (Knauer).
To process and calculate the results the Clarity Chrom
software (Knauer) was applied. There were used glu-
cose, sucrose, fructose, lactose, sorbitol, mannite (all
substances of Sigma production) as standards.
To investigate T. molitor larvae protein hydrophobi-
city by reverse phase high performance liquid chro-
matography we have used a liquid chromatograph
Shimadzu LC-2010 (Shimadzu, Japan) and the
250×4.6 mm column Vydac C4 (The Separations
Group, USA) filled with spherical silica gel having a
pore size of 300 D.
Proteins were gradient eluted from the column with
two mobile phases (MP) reagents of Fluka Chemie
(Switzerland) (MP A – 90% of buffer solution at pH
4.2, 10% of acetonitrile and MP B – 10% of buffer
solution at pH 4.2, 90% of acetonitrile) according to
the following program: first 8 mins elution was
performed with buffer A; from 9 to 35 mins buffer B
amount was increased from 0 to 80%; from 36 to
40 min, the concentration of buffer B was not changed.
To prepare buffer solution we have used 0.026 M
lithium dihydrogenphosphate solution, which was
brought to concentrated phosphoric acid to pH 4.2.
Mobile phase flow rate made 0.75 ml/min, column
temperature was 30°C.
Proteins were identified at 280 nm wavelength with
a UV detector SPD-M6A (Shimadzu).
The experimental data were statistically processed
using the non-parametric Mann-Whitney criterion. The
differences between the samples were considered as
significant at p < 0.05.
Results and discussion
The study of molecular mechanisms, adaptation of
biological objects under conditions of temperature
324 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
элюирование проводили буфером А; с 9 до 35 мин
количество буфера Б увеличивали с 0 до 80%; с
36 до 40 мин концентрацию буфера Б не изменяли.
Для приготовления буферного раствора исполь-
зовали 0,026 М раствор лития дигидрофосфата,
который доводили концентрированной фосфорной
кислотой до рН 4,2. Скорость потока подвижной
фазы составляла 0,75 мл/мин, температура колонки –
30°С.
Идентификацию белков проводили при длине
волны 280 нм с использованием УФ-детектора
«SPD-M6A» («Shimadzu»).
Статистическую обработку эксперименталь-
ных данных выполняли, используя непараметри-
ческий критерий Манна-Уитни. Различия между
выборками считали значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Актуальная задача современной криобиологии –
изучение молекулярных механизмов адаптации
биообъектов в условиях изменения температур-
ного режима. Процессы, происходящие на молеку-
лярном уровне организации при низкотемпературной
адаптации, являются ключевыми для выживания и
сохранения биологического вида.
Адаптация живых организмов к низким темпе-
ратурам – сложный и многоэтапный процесс, при
котором наблюдаются изменения спектра белков,
структурные перестройки некоторых белковых мо-
лекул, а также качественные и количественные
модификации криозащитных веществ, сахаров и
полиолов. В этой связи представлялось интерес-
ным изучить особенности адаптации холодоустой-
чивого биологического вида к действию низких
температур.
Согласно данным литературы удобной моделью
для исследования молекулярных механизмов хо-
лодоустойчивости живых организмов являются
личинки большого мучного хрущака T. molitor
(семейство: Tenebrionidae), которые, как нами
было показано с помощью SDS-электрофореза в
ПААГ [2], способны при двухнедельной холодовой
акклимации продуцировать белки с м. м. 5–10, 30
и 65 кДа. Также были изучены антифризные белки
[5, 14, 17, 18], обеспечивающие переохлаждение
личинок T. molitor в условиях действия низких
температур. Однако изменения всего спектра водо-
растворимых белков и пептидов, их структурные
особенности, а также качественный и количествен-
ный состав сахаров и полиолов при холодовой аккли-
мации изучены недостаточно.
С помощью гель-проникающей хроматографии
мы получили молекулярно-массовые распределения
белково-пептидных веществ из супернатантов,
выделенных из акклимированных к холоду и
неакклимированных личинок T. molitor (табл. 1,
changes is an actual task of current cryobiology. The
processes occurring at the molecular level during low
temperature adaptation are a key in understanding of
survival and conservation of species.
Adaptation of living organisms to low temperatures
is complex and multi-step process, accompanied with
the changes in protein spectrum, structural rearrange-
ments in molecules of some proteins, as well as quali-
tative and quantitative modifications of cryoprotectants,
sugars and polyols. Therefore, it is of interest to study
the adaptation features of cold-resistant species to low
temperatures.
As reported widely the mealworm T. molitor larvae
(Tenebrionidae family) is a convenient model to inves-
tigate molecular mechanisms of cold resistance of living
organisms. As we have earlier shown using SDS-PAGE
electrophoresis [13] they were capable to produce the
proteins with MW of 5–10, 30 and 65 kDa during two
weeks of cold acclimation. Antifreeze proteins [3, 12,
16, 17] providing hypothermia of T. molitor larvae
under low temperature conditions wre also studied.
Nevertheless, the information about the changes of
the whole spectrum of watersoluble pro-teins and
peptides, their structural features, as well as qualitative
and quantitative composition of sugars and polyols
during cold acclimation are not comprehesive yet.
Using gel-permeation chromatography, we obtained
molecular weight distributions of proteins and peptides
from supernatants derived from cold-acclimated and
non-acclimated T. molitor larvae (Fig. 1, Table 1).
Substances with MW # 7,000 Da were defined as
peptides and substances with MW $ 12,000 Da were
considered as proteins.
Analysis of the experimental data presented in Fig. 1,
showed that qualitative composition of low-molecular
substances of protein-peptide nature from T. molitor
larvae during cold acclimation was significantly chan-
ged. A decrease in peptide fractions number was
observed in T. mollitor larvae acclimated for three
weeks. A high molecular weight fraction of proteins
with MW $ 12,000 Da and low molecular weight
fractions with MW (2.255 ± 85), (1.525 ± 115), (1.105 ±
115), (825 ± 55) and (540 ± 20) Da were the main
protein-peptide fractions of supernatants derived from
cold-acclimated and non-acclimated T. molitor larvae.
Figure 1 shows that supernatants derived from cold
acclimated T. molitor larvae contain six low molecular
weight peptide fractions with MW (540 ± 20) –
(2.255 ± 85) Da. It should be noted that cold acclima-
tion T. molitor larvae resulted in disapperance of four
high-molecular peptide fractions with MW (6.595 ±
550), (6.040 ± 280), (5.325 ± 195) and (4.675 ± 225) Da
and apperance of low-molecular peptides with MW
(1.295 ± 75) Da.
Moreover it should be noted that compositions of
protein and peptide substances in supernatants, derived
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
325
рис. 1). Вещества с м. м.
# 7 000 Да идентифицирова-
ли как пептиды, а вещества
с м. м. $ 12 000 Да – как белки.
Анализ эксперименталь-
ных данных, представлен-
ных в табл.1 и на рис. 1, пока-
зал, что качественный состав
низкомолекулярных веществ
белково-пептидной природы
из личинок T. molitor в про-
цессе холодовой акклимации
существенно изменяется. У ак-
климированных при 5...7°С в
течение трех недель личинок
T. molitor отмечается умень-
шение количества пептидных
фракций. Основными белково-
пептидными фракциями из су-
пернатантов, полученных из
холодоакклимированных и не-
акклимированных личинок
T. molitor, являются высоко-
молекулярная фракция бел-
ков с м. м. $ 12 000 Да и низ-
комолекулярные пептидные
фракции с м. м. (2255 ± 85),
(1525 ± 115), (1105 ± 115),
(825 ± 55) и (540 ± 20) Да.
Как видно из рис. 1, в
супернатантах, выделен-ных
из акклимированных к холо-
from cold-acclimated and non-acclimated T. molitor
larvae, have quantitative differences. In particular, the
statistically significant changes were observed in the
fractions with MW (2.255 ± 85), (1.525 ± 115) and
(1.105 ± 115) Da corresponding to A4.2, B1, and C
chromatogram peaks (Fig. 2). During cold acclimation
of T. molitor larvae a decrease was observed in the
number of peptides with MW (2.255 ± 85) and (1.525 ±
115) Da by 8 and 2.3 times, respectively (A4.2 and B1
peaks).
Comparing the chromatograms of protein-peptide
fractions distribution for supernatants derived from
acclimated and non-acclimated T. molitor larvae, we
have revealed that the total contents of all the com-
ponents slightly differed. In particular, the content of
substances absorbing in UV region of spectrum in cold-
acclimated insects was by 1.11 times higher than in
non-acclimated ones.
During acclimation the distribution of protein and pep-
tide components significantly changed. A comparative
analysis of chromatographic data of protein-peptide
fractions from T. molitor larvae showed that the number
of protein fraction (Pr peak) with MW $ 12,000 Da in
non-acclimated larvae was in 2.3 times lower than in
Таблица 1. Параметры белково-пептидных фракций супернатантов
из личинок T. molitor
Table 1. Parameters of protein-peptide fractions of supernatants from T. molitor larvae
Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с неакклимирован-
ными насекомыми, p < 0,05.
Note: * – differences are statistically significant if compared with non-acclimated insects, p < 0.05.
ду личинок T. molitor, присутствуют шесть
низкомолекулярных пептидных фракций с м.м.
(540 ± 20) – (2255 ± 85) Да. Следует отметить, что
после акклимации к холоду у личинок T. molitor
исчезают четыре высокомолекулярные пептидные
фракции с м. м. (6595 ± 550), (6040 ± 280), (5325 ±
195) и (4675 ± 225) Да и появляются низкомо-
лекулярные пептиды с м. м. (1295 ± 75) Да.
Установлено, что состав белково-пептидных ве-
ществ в супернатантах, полученных из акклими-
рованных к холоду и неакклимированных личинок
T. molitor, имеет количественные различия.
В частности, статистически значимые изменения
наблюдаются во фракциях с м. м. (2255 ± 85),
(1525 ± 115) и (1105 ± 115) Да, которые соответ-
ствуют пикам хроматограмм А4.2, В1 и С (рис. 2).
В процессе холодовой акклимации личинок
T. molitor отмечается уменьшение количества
пептидов с м. м. (2255 ± 85) и (1525 ± 115) Да в 8 и
2,3 раза соответственно (пики А4.2 и В1).
Сравнение хроматограмм распределения бел-
ково-пептидных фракций супернатантов, выделен-
ных из акклимированных и неакклимированных к
холоду личинок T. molitor, показало, что общее
326 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
киП
kaeP
яяндерС
яанрялукелом
ассам
аД,иицкарф
egarevA
ralucelom
fothgiew
aD,noitcarf
икничилеыннаворимилккаеН
eavraldetamilcca-noN
икничилеыннаворимилккА
eavraldetamilccA
ьдащолпяяндерС
мм,акип 2
kaepegarevA
mm,aera 2
%,акипьдащолП
%,aerakaeP
ьдащолпяяндерС
мм,акип 2
kaepegarevA
mm,aera 2
%,акипьдащолП
%,aerakaeP
rP ≥ 00021 412±2541 10,5±50,43 845±3233 15,11±08,96
A1 055±5956 12±172 94,0±63,6 – –
А 1.1 082±0406 41±433 23,0±38,7 – –
A2 591±5235 92±384 86,0±33,11 – –
A3 522±5764 13±621 27,0±59,2 – –
А 2.4 58±5522 34±911 00,1±97,2 *8±51 *81,0±53,0
В1 511±5251 82±541 56,0±04,3 *22±36 *15,0±74,1
В2 57±5921 – – 83±331 97,0±97,2
С 511±5011 43±717 97,0±28,61 *02±995 *240±85,21
D 55±528 93±704 19,0±55,9 35±273 11,1±18,7
F 02±045 92±012 76,0±29,4 9±842 81,0±02,5
еинажредосеещбО
втсещев
fotnetnoclatoT
secnatsbus
671±4624 875±3574
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
327
содержание всех компонентов отличается незна-
чительно. В частности, содержание веществ, кото-
рые поглощают в УФ-области спектра, у холодо-
акклимированных насекомых в 1,11 раза больше,
чем у неакклимированных.
Существенно изменялось распределение
белково-пептидных компонентов в процессе
акклимации. Сравнительный анализ хроматогра-
фических данных белково-пептидных фракций из
личинок T. molitor показал, что количество
белковой фракции (пик Pr) с м. м. $12 000 Да у
cold-acclimated ones. In non-acclimated T. molitor
insects we have found an increase in the number of
peptides with low MW: (2.255 ± 85) Da in 8; (1.525 ±
115) Da in 2.3; (1.105 ± 115) Da in 1.3, and (825 ± 55) Da
in 1.22 times.
Analysis of the findings enable to assume that the
change in protein-peptide composition of the super-
natants derived from T. molitor larvae, during low-
temperature acclimation is associated either with
synthesis of protein and peptide components de novo,
or structural modifications of existing proteins.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
п
ог
ло
щ
ен
ия
п
ри
2
80
н
м
Ab
so
rp
tio
n
in
te
ns
ity
a
t 2
80
n
m
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
п
ог
ло
щ
ен
ия
п
ри
2
80
н
м
Ab
so
rp
tio
n
in
te
ns
ity
a
t 2
80
n
m
Время, мин
Time, min
Время, мин
Time, min
Рис. 1. Типичные хроматограммы распределения белково-пептидных фракций супернатантов из личинок
T. molitor: A – неакклимированные; B – акклимированные.
Fig. 1. Typical chromatograms for protein and peptide fractions distribution in supernatants of non-acclimated (A) and
acclimated (B) T. molitor larvae.
A1.1
A2 A4.2
A1
A3
B1
Pr
C
F A4.2
Pr
C
DD
F
0
100
200
300
400
500
600
700
800
A A A A A B B C D F
1 1.1 2 3 4.2 1 2
Рис. 2. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций супернатан-
тов из неакклимированных ( ) и акклимированных ( ) личинок T. molitor ; * –
различия значимы по сравнению с неакклимированными личинками, p < 0,05.
Fig. 2. Molecular weight distribution of peptide fractions in supernatants from
non-acclimated ( ) and acclimated ( ) T. molitor larvae; * – differences are sig-
nificant as compared to non-acclimated larvae, p < 0,05.
Фракции пептидов
Peptide fractions
С
ре
дн
яя
п
ло
щ
ад
ь
пи
ка
,
м
м2
Av
er
ag
e
pe
ak
a
re
a,
m
m
2
неакклимированных личинок
в 2,3 раза меньше, чем у
холодоакклимированных. У не-
акклимированных насекомых
T. molitor установлено увели-
чение количества пептидов
с низкой м. м.: (2255 ± 85) Да –
в 8; (1525 ± 115) Да – 2,3;
(1105 ± 115) Да – 1,3 и (825 ±
55) Да – 1,22 раза.
Анализируя полученные
данные, можно предположить,
что изменение белково-пеп-
тидного состава супернатан-
тов, полученых из личинок
T. molitor, в процессе низко-
температурной акклимации
связано либо с синтезом бел-
ково-пептидных компонент de
novo, либо со структурными
модификациями уже сущест-
вующих белков.
Обнаруженные качествен-
ные и количественные измене-
A B
*
*
*
B1
B2
ния состава белково-пептид-
ных веществ супернатантов
из личинок T. molitor могут
свидетельствовать о нали-
чии молекулярных механиз-
мов адаптации холодоустой-
чивых личинок T. molitor к
действию низких температур,
способствующих их выжива-
нию в неблагоприятных усло-
виях среды обитания.
Известно, что в процессе
низкотемпературной адапта-
ции холодоустойчивых орга-
низмов наблюдаются струк-
турные модификации неко-
торых белковых молекул, в
частности ферментов [6].
Вероятно, что одним из таких
изменений является сдвиг по
степени гидрофобности, ко-
торый может быть изучен с
помощью метода обращен-
The observed qualitative and quantitative changes
in the composition of proteins and peptides of the
supernatants from T. molitor larvae may indicate the
presence of molecular mechanisms of adaptation of cold-
resistant T. molitor larvae to low temperatures contri-
buting to their survival under adverse habitat conditions.
It is known that low-temperature adaptation of cold-
resistant organisms is accompanied with some structu-
ral modifications of some protein molecules, i. e. enzy-
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 5 10 15 20 25 30 35 40
H
A
Рис. 3. Обращенно-фазовая хроматограмма белков из личинок T. molitor:
неакклимированные (Н); акклимированные (А).
Fig. 3. Reversed-phase chromatogram of proteins from: non-acclimated (N) and
acclimated (A) T. molitor larvae.
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
п
ог
ло
щ
ен
ия
п
ри
2
80
н
м
Ab
so
rp
tio
n
in
te
ns
ity
a
t 2
80
n
m
Время, мин
Time, min
но-фазовой хроматографии, что позволит опреде-
лить распределение белков, выделенных из
холодоакклимированных и неакклимированных
личинок T. molitor (рис. 3).
По времени удерживания белков на колонке,
можно установить, что количество гидрофобных
белков у неакклимированных личинок T. molitor
больше, чем у холодоакклимированных (рис. 3).
Белки, которые удерживались на колонке, заполнен-
ной гидрофобным веществом, максимальное
время являются гидрофобными протеинами, а
белки с мини-мальным временем удерживания –
гидрофильными. У акклимированных насекомых
T. molitor выявлено большее количество гидро-
фильных белков по сравнению с неакклимиро-
ванными. Результаты экспериментальных иссле-
дований согласуются с данными литературы об
уменьшении степени гидрофобности белков холо-
доустойчивых организмов при низкотемпера-
турных адаптациях [6, 16].
Известно, что одним из механизмов естествен-
ной холодовой адаптации у животных и растений
является накопление природных криозащитных
веществ (сахаров и сахароспиртов), поэтому с по-
мощью прямофазной высокоэффективной жидкост-
ной хроматографии нами было изучено содержание
сахаров и сахароспиртов в супернатантах, полу-
ченных из личинок T. molitor (табл. 2).
Как видно из данных табл. 2, у неакклимирован-
ных личинок T. molitor уровень глюкозы в 1,34 раза
выше, чем у акклимированных. Кроме того, у неак-
климированных особей T. molitor обнаружены са-
хароспирты с низкой концентрацией (сорбитол и
Таблица 2. Состав супернатантов, полученных из
личинок T. molitor
Table 2. Composition of supernatants derived from
T. molitor larvae
328 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
овтсещеВ
ecnatsbuS
лм/гм,автсещевяицартнецноK
lm/gm,noitartnecnocecnatsbuS
еыннаворимилккаеН
rotilom.T
detamilcca-noN
rotilom.T eavral
еыннаворимилккА
rotilom.T
detamilccA rotilom.T
eavral
азокюлГ
esoculG 591,0±530,2 501,0±515,1
азоткурФ
esotcurF – –
азорахаС
esorcuS – –
азоткаЛ
esotcaL – –
лотиброС
lotibroS 500,0±520,0 –
лотиннаМ
lotinnaM 500,0±020,0 –
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
329
маннитол), которые отсутствуют у акклимирован-
ных к холоду насекомых. Изменение углеводного
состава в процессе акклимации личинок T. molitor
может свидетельствовать о трансформации мета-
болических процессов образования сахаров и саха-
роспиртов либо о возможном формировании у
насекомых во время акклимации сложных ком-
понентов, например, углеводно-белковых соеди-
нений. Это позволяет сохранить и оптимизировать
функции протеинов и стабилизировать макромоле-
кулы в условиях стресса.
Анализируя полученные экспериментальные
данные, можно предположить, что в механизме
сложного и многоэтапного явления холодовой адап-
тации ключевую роль играют перестройки в мета-
болизме белков, включая энзимы, белки холо-
дового шока, а также регуляторные белки и пептиды.
Для подтверждения данной гипотезы необходимы
дополнительные исследования с использованием
ингибитора синтеза белков (например, циклогек-
симида), что является целью последующей экспе-
риментальной работы.
Выводы
Показано, что во время низкотемпературной
адап-тации личинок T. molitor происходят измения
спектра белково-пептидных веществ в их тканях:
увеличение объема белковой фракции с м. м.
12 000 Да, уменьшение объема пептидов с м. м.
(2255 ± 85) и (1525 ± 115) Да в 8 и 2,3 раза
соответственно, а также структурные модифика-
ции белков, характеризующиеся снижением их
гидрофобности.
Установлено, что в процессе холодовой адаптации
личинок T. molitor уменьшается содержание глю-
козы, исчезают сахароспирты (сорбитол и маннитол).
mes are observed [4]. One of these changes is likely
hydrophobicity degree shift which can be studied using
the method of reversed-phase chromatography. It will
enable to determine the distribution of proteins derived
from cold-acclimated and non-acclimated T. molitor
larvae (Fig. 3).
Retention time of proteins in a column allowed to
establish, that the amount of hydrophobic proteins in
non-acclimated T. molitor larvae was higher than in
cold-acclimated ones (Fig. 3). Proteins retained in the
column filled with hydrophobic substance during
maximum time were hydrophobic proteins and the pro-
teins with a minimal retention time were hydrophilic.
A larger amount of hydrophilic proteins in acclimated
T. molitor insects compared to non-acclimated ones
was revealed. The findings were consistent with the
reported data on diminishing the degree of protein
hydrophobicity in cold-resistant organisms following
low temperature adaptations [4, 15].
Accumulation of natural cryoprotective agents
(sugars and sugar alcohols) had been known to be one
of the mechanisms of cold adaptation in animals and
plants, therefore we investigated the content of sugars
and sugar alcohols in supernatants, derived from T. mo-
litor larvae using high-performance liquid chroma-
tography (Table 2).
Table 2 demonstrates, that in non-acclimated T.mo-
litor larvae the glucose level is 1.34 times higher than
in acclimated ones. Moreover, low concentrations of
sugar alcohols (sorbitol and mannite) were observed
in non-acclimated T. molitor larvae, and absent in cold-
acclimated insects. Change in the carbohydrate compo-
sition during acclimation of T. molitor larvae may
indicate to either transformation of metabolic processes
of sugars and sugar alcohols formation or possible for-
mation of complex components such as carbohydrate-
protein compounds in insects during acclimation. It
allows preservation and optimizations of protein func-
tions, as well as stabilization of macromolecules under
stress conditions.
The analysis of experimental data enabled us to
assume that in the mechanism of the complex and
multistep cold adaptation a key role was played by the
rearrangements in protein exchange, including
enzymes, cold shock proteins, as well as regulatory
proteins and peptides. To confirm this hypothesis there
is a need in additional studies using protein synthesis
inhibitor (e. g., cycloheximide), which will be the goal
of further experiments.
Conclusions
It has been shown that low-temperature adaptation of
T. molitor larvae was accompanied with the changes
within spectrum of protein and peptide substances in their
tissues occurred. There was an in increase in the amount
of protein fractions with MW of 12.000 Da, a reduced
Литература
1. Бидлингмейер Б. Препаративная жидкостная хромато-
графия. – М.: Мир, 1990. – 360 с.
2. Гулевский А.К., Рязанцев В.В., Грищенкова Е.А., Релина Л.И.
Изменения в спектре белков личинок большого мучного хру-
щака (Tenebrio molitor) в период холодовой акклимации //
Проблемы криобиологии. – 1995. – №4.– C. 29–32.
3. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. проф.
В.К. Антонова. – М.: Мир, 1985. – 358 с.
4. Bennett V.A., Sformo T., Walters K. et al. Comparative overwin-
tering physiology of Alaska and Indiana populations of the
beetle Cucujus clavipes (Fabricius): roles of antifreeze
proteins, polyols, dehydration and diapauses // J. Exp. Biol. –
2005. – Vol. 208, №23. – P. 446–477.
5. Celik Y., Drori R., Pertaya-Braun N. et al. Microfluidic experiments
reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to
prevent their growth // PNAS. – 2013. – Vol. 110, №4. –
P. 1309–1314.
6. D'Amico S., Marx J.C., Gerday C. et al. Activity-stability
relationships in extremophilic enzymes // J. Biol. Chem. – 2003. –
Vol. 278, №10. – P. 7891–7896.
330 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 4, 2016
7. Davies P.L., Hew C.L. Biochemistry of fish antifreeze proteins //
The FASEB J. – 1990. – Vol. 4, №8. – Р. 2460–2468.
8. Duman J.G. Environmental effects on antifreeze levels in larvae
of the darkling beetle, Meracantha contracta // J. Exp. Zool. –
1977. – Vol. 201, №2. – P. 333–337.
9. Duman J.G. Factors involved in overwintering survival of the
freeze tolerant beetle, Dendroides Canadensis // J. Comp.
Physiol. – 1980. – Vol. 136, №1. – P. 52–59.
10.Franks F. Protein destabilization at low temperatures //
Adv. Prot. Chem. – 1995. – Vol. 46. – P. 105–139.
11.Garnham C.P., Natarajan A., Middleton A.J. et al. Compound
ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutage-
nesis and fluorescent tagging // Biochemistry. – 2010. – Vol. 49,
№42. – P. 9063–9071.
12.Gilbert J.A., Hill P.J., Dodd C.E. et al. Demonstration of antifreeze
protein activity in Antarctic lake bacteria // Microbiology. –
2004. – Vol. 150, №1. – P. 171–180.
13.Graether S.P., Kuiper M.J., Gagnе S.M. et al. Beta-helix structure
and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein
from an insect // Nature. – 2000. – Vol. 406, №6793. – P. 325–
328.
14.Graham L.A., Walker V.K., Davies P.L. Developmental and
environmental regulation of antifreeze proteins in the mealworm
beetle Tenebrio molitor // Eur. J. Biochem. – 2000. – Vol. 267,
№21. – P. 6452–6458.
15.Jaenicke R., Bohm G. The stability of proteins in extreme
environments // Curr. Opin. Struct. Biol. – 1998. – Vol. 8, №6. –
P. 738–748.
16.Kahlke T., Thorvaldsen S. Molecular characterization of cold
adaptation of membrane proteins in the Vibrionaceae core-
genome // PLOS One. – 2012. – Vol. 7, №12. – e51761.
17.Liou Y.C., Thibault P., Walker V.K. et al. A complex family of
highly heterogeneous and internally repetitive hyperactive
antifreeze proteins from the beetle Tenebrio molitor // Bioche-
mistry. – 1999. – Vol. 38, №35. – P. 11415–11424.
18.Patterson J.L., Duman J.G. Purification and composition of
protein antifreezes with high cysteine contents from larvae
of the beetle, Tenebrio molitor // J. Exp. Zool. – 1982. – Vol. 219,
№3. – P. 381–384.
19.Posner M. Functional validation of hydrophobic adaptation to
physiological temperature in the small heat shock protein αA-
crystallin // PLOS One. – 2012. – Vol. 7, №3. – e34438.
20.Singh P., Hanada Y., Singh S.M. et al. Antifreeze protein activity
in Arctic cryoconite bacteria // FEMS Microbiol. Lett. – 2014. –
Vol. 351, №1. – P. 14–22.
21.Wohrmann A.P.A. Antifreeze glycopeptides and peptides in
Antarctic fish species from the Weddell Sea and the Lazarev
Sea // Mar. Ecol. Prog. Ser. – 1996. – Vol. 130. – P. 47–59.
References
1. Bennett V.A., Sformo T., Walters K. et al. Comparative overwintering
physiology of Alaska and Indiana populations of the beetle Cucujus
clavipes (Fabricius): roles of antifreeze proteins, polyols, dehydra-
tion and diapauses. J Exp Biol 2005; 208(23): 4467–4477.
2. Bidlingmayer B. Preparative liquid chromatography. Moscow:
Mir, 1990.
3. Celik Y., Drori R., Pertaya-Braun N. et al. Microfluidic experiments
reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to
prevent their growth. PNAS 2013; 110(4): 1309–1314.
4. D'Amico S., Marx J.C., Gerday C. et al. Activity-stability relationships
in extremophilic enzymes. J Biol Chem 2003; 278(10): 7891–7896.
5. Davies P.L., Hew C.L. Biochemistry of fish antifreeze proteins.
FASEB J. 1990; 4(8): 2460–2468.
6. Duman J.G. Environmental effects on antifreeze levels in larvae
of the darkling beetle, Meracantha contracta. J Exp Zool 1977;
201(2): 333–337.
7. Duman J.G. Factors involved in overwintering survival of the freeze
tolerant beetle, Dendroides Canadensis. J Comp Physiol 1980;
136(1): 52–59.
8. Franks F. Protein destabilization at low temperatures. Adv Prot
Chem 1995; 46: 105–139.
9. Garnham C.P., Natarajan A., Middleton A.J. et al. Compound ice-
binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis
and fluorescent tagging. Biochemistry 2010; 49(42): 9063–9071.
10.Gilbert J.A., Hill P.J., Dodd C.E. et al. Demonstration of antifreeze
protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology 2004;
150(1): 171–180.
11.Graether S.P., Kuiper M.J., Gagnе S.M. et al. Beta-helix structure
and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein
from an insect. Nature 2000; 406(6793): 325–328.
12.Graham L.A., Walker V.K., Davies P.L. Developmental and envi-
ronmental regulation of antifreeze proteins in the mealworm beetle
Tenebrio molitor. Eur J Biochem 2000; 267(21): 6452–6458.
13.Gulevsky A.K., Ryazantsev V.V., Grischenkova Ye.A., Relina L.I.
Changes in protein composition of mealworms (Tenebrio molitor)
during cold acclimation. Problems of Cryobiology 1995; (4): 29–32.
14.Jaenicke R., Bohm G. The stability of proteins in extreme environ-
ments. Curr Opin Struct Biol 1998; 8(6): 738–748.
15.Kahlke T., Thorvaldsen S. Molecular characterization of cold
adaptation of membrane proteins in the Vibrionaceae coregenome.
PLOS One 2012; 7(12): e51761.
16.Liou Y.C., Thibault P., Walker V.K. et al. A complex family of highly
heterogeneous and internally repetitive hyperactive antifreeze
proteins from the beetle Tenebrio molitor. Biochemistry 1999;
38(35): 11415–11424.
17.Patterson J.L., Duman J.G. Purification and composition of protein
antifreezes with high cysteine contents from larvae of the beetle,
Tenebrio molitor. J Exp Zool 1982; 219(3): 381–384.
18.Posner M. Functional validation of hydrophobic adaptation to phy-
siological temperature in the small heat shock protein αA-crystallin.
PLOS One 2012; 7(3): e34438.
19.Scopes R. Methods of protein purification. Moscow: Mir; 1985.
20.Singh P., Hanada Y., Singh S.M. et al. Antifreeze protein activity in
Arctic cryoconite bacteria. FEMS Microbiol Lett 2014; 351(1):
14–22.
21.Wohrmann A.P.A. Antifreeze glycopeptides and peptides in
Antarctic fish species from the Weddell Sea and the Lazarev
Sea. Mar Ecol Prog Ser 1996; 130: 47–59.
volume of peptides with MW (2,255 ± 85) and (1,525 ±
115) Da by 8 and 2.3 times, respectively, structural modi-
fications of proteins, characterized by the decrease in
their hydrophobicity as well.
It has been found that during cold adaptation of
T. molitor larvae the glucose content was decreased, and
the sugar alcohols (sorbitol and mannite) disappeared.
|