Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования
Исследовано влияние факторов криоконсервирования (скорости охлаждения и криопротекторов в различных концентрациях) на сохранность фрагментов печени новорожденных поросят и половозрелых свиней. Показано минимальное повреждение исследуемого биоматериала при криоконсервировании по состоянию перекисных...
Saved in:
| Date: | 2003 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2003
|
| Series: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138478 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования / Б.П. Сандомирский, С.Е. Гальченко, Л.Н. Тыныныка // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 77–84. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138478 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1384782025-02-09T12:31:28Z Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования Integrity of Adult Pig and Newborn Piglets Liver Fragments Under Different Cryopreservation Conditions Сандомирский, Б.П. Гальченко, С.Е. Тыныныка, Л.Н. Криоконсервирование биообъектов Исследовано влияние факторов криоконсервирования (скорости охлаждения и криопротекторов в различных концентрациях) на сохранность фрагментов печени новорожденных поросят и половозрелых свиней. Показано минимальное повреждение исследуемого биоматериала при криоконсервировании по состоянию перекисных процессов и интенсивности эндогенного дыхания при использовании полиэтиленоксидов (ПЭО-400 и ПЭО-1500) в качестве криопротекторов со скоростями охлаждения 1 и 8000°С/мин. Досліджено вплив факторів криіоконсервування (швидкості охолодження і кріопротекторів у різних концентраціях) на збереження фрагментів печінки новонароджених поросят і статевозрілих свиней. Показано мінімальне пошкодження досліджуваного біоматеріала при кріоконсервуванні за станом перекисних процесів та інтенсивності ендогенного дихання при використанні поліетиленоксидів (ПЕО-400 і ПЕО-1500) як кріопротекторів зі швидкостями охолодження 1 и 8000°С/хв. The effect of cryopreservation factors (cooling rates and cryoprotectants in different concentrations) on the integrity of newborn piglet and adult pig liver fragments was investigated. There was demonstrated the minimum damage of studied biomaterial during cryopreservation on the peroxide processes and the intensity of endogenous respiration when using polyethylene oxides (PEO-400 and PEO-1500) as cryoprotectants with 1 and 8000°C/min cooling rates. 2003 Article Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования / Б.П. Сандомирский, С.Е. Гальченко, Л.Н. Тыныныка // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 77–84. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138478 611.36.018:57.043:577.1 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов |
| spellingShingle |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов Сандомирский, Б.П. Гальченко, С.Е. Тыныныка, Л.Н. Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследовано влияние факторов криоконсервирования (скорости охлаждения и криопротекторов в различных концентрациях) на сохранность фрагментов печени новорожденных поросят и половозрелых свиней. Показано минимальное повреждение исследуемого биоматериала при криоконсервировании по состоянию перекисных процессов и интенсивности эндогенного дыхания при использовании полиэтиленоксидов (ПЭО-400 и ПЭО-1500) в качестве криопротекторов со скоростями охлаждения 1 и 8000°С/мин. |
| format |
Article |
| author |
Сандомирский, Б.П. Гальченко, С.Е. Тыныныка, Л.Н. |
| author_facet |
Сандомирский, Б.П. Гальченко, С.Е. Тыныныка, Л.Н. |
| author_sort |
Сандомирский, Б.П. |
| title |
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования |
| title_short |
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования |
| title_full |
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования |
| title_fullStr |
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования |
| title_full_unstemmed |
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования |
| title_sort |
сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2003 |
| topic_facet |
Криоконсервирование биообъектов |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138478 |
| citation_txt |
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования / Б.П. Сандомирский, С.Е. Гальченко, Л.Н. Тыныныка // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 77–84. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT sandomirskijbp sohrannostʹfragmentovpečenipolovozrelyhsvinejinovoroždennyhporosâtpriraznyhusloviâhkriokonservirovaniâ AT galʹčenkose sohrannostʹfragmentovpečenipolovozrelyhsvinejinovoroždennyhporosâtpriraznyhusloviâhkriokonservirovaniâ AT tynynykaln sohrannostʹfragmentovpečenipolovozrelyhsvinejinovoroždennyhporosâtpriraznyhusloviâhkriokonservirovaniâ AT sandomirskijbp integrityofadultpigandnewbornpigletsliverfragmentsunderdifferentcryopreservationconditions AT galʹčenkose integrityofadultpigandnewbornpigletsliverfragmentsunderdifferentcryopreservationconditions AT tynynykaln integrityofadultpigandnewbornpigletsliverfragmentsunderdifferentcryopreservationconditions |
| first_indexed |
2025-11-25T23:54:32Z |
| last_indexed |
2025-11-25T23:54:32Z |
| _version_ |
1849808518114181120 |
| fulltext |
77ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
УДК 611.36.018:57.043:577.1
Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и
новорожденных поросят при разных условиях криоконсервирования
Б.П. САНДОМИРСКИЙ, С.Е. ГАЛЬЧЕНКО, Л.Н. ТЫНЫНЫКА
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Integrity of Adult Pig and Newborn Piglets Liver Fragments Under
Different Cryopreservation Conditions
SANDOMIRSKY B.P., GALCHENKO S.E., TYNYNYKA L.N.
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Исследовано влияние факторов криоконсервирования (скорости охлаждения и криопротекторов в различных
концентрациях) на сохранность фрагментов печени новорожденных поросят и половозрелых свиней. Показано минимальное
повреждение исследуемого биоматериала при криоконсервировании по состоянию перекисных процессов и интенсивности
эндогенного дыхания при использовании полиэтиленоксидов (ПЭО-400 и ПЭО-1500) в качестве криопротекторов со скоростями
охлаждения 1 и 8000°С/мин.
Ключевые слова: фрагменты печени, скорости охлаждения, криопротекторы, эндогенное дыхание, перекисные процессы.
Досліджено вплив факторів криіоконсервування (швидкості охолодження і кріопротекторів у різних концентраціях) на
збереження фрагментів печінки новонароджених поросят і статевозрілих свиней. Показано мінімальне пошкодження
досліджуваного біоматеріала при кріоконсервуванні за станом перекисних процесів та інтенсивності ендогенного дихання при
використанні поліетиленоксидів (ПЕО-400 і ПЕО-1500) як кріопротекторів зі швидкостями охолодження 1 и 8000°С/хв.
Ключові слова: фрагменти печінки, швидкості охолодження, кріопротектори, ендогенне дихання, перекисні процеси.
The effect of cryopreservation factors (cooling rates and cryoprotectants in different concentrations) on the integrity of newborn
piglet and adult pig liver fragments was investigated. There was demonstrated the minimum damage of studied biomaterial during
cryopreservation on the peroxide processes and the intensity of endogenous respiration when using polyethylene oxides (PEO-400
and PEO-1500) as cryoprotectants with 1 and 8000°C/min cooling rates.
Key-words: liver fragmrnts, cooling rates, cryoprotectant, endogenous respiration, peroxide processes.
UDC 611.36.018:57.043:577.1
Адрес для корреспонденции: Сандомирский Б.П. Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины,ул. Переяславская, 23,
г. Харьков, Украина , 61015; тел.:+38 (057) 770-29-35, факс: +38 (057)
772-00-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Sandomirsky B.P., Institute for Problems
of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine,
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.: +38 (057)
7702935, fax: +38 (057) 7720084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
В настоящее время широкое распространение
получают методы клеточной и тканевой терапии,
в частности, при лечении печеночной недоста-
точности используют изолированные клетки
печени, в научных исследованиях – при изучении
биофизических и биохимических процессов,
которые происходят в печени in vivo [9, 11].
Выделять изолированные клетки печени, которые
бы сохранили все функции, присущие гепатоциту,
очень сложно. Например, при коллагеназном
методе выделения клеток их функционально-
метаболические показатели зависят от типа и
чистоты ферментативного препарата [3]. В
последнее время в научных исследованиях все
шире используются срезы или фрагменты печени.
В многоклеточных фрагментах печени сохра-
няются межклеточные контакты и ориентация
клеток поддерживается на уровне печени in vivo.
Сохраняются также межклеточные взаимо-
действия, которые принимают участие в кон-
тактном ингибировании, трансформации сигнала,
гормональном и ионном транспорте [7,8]. В связи
с этим можно предположить, что фрагменты
Nowadays the methods of cellular and tissue
therapy are getting widely spread. In particular, when
treating a liver insufficiency there are used hepatic
isolated cells, in scientific investigations: when studying
biophysical and biochemical processes, occurring in
liver in vivo [9, 11]. It is very complicated to isolate
liver cells, which would keep all functions, inherent to
hepatocyte. For example, in a collagenase method of
cell isolation their functional and metabolic indices
depend on the type and purity of enzyme preparation
[3]. Recently in scientific investigations the sections
or liver fragments are getting the wider usage. In
polycellular liver fragments there are preserved the
intercellular contacts and the cell orientation is
maintained at the liver level in vivo. The intercellular
interactions, participating in a contact inhibition, signal
transformation, hormonal and ion transport are kept
as well [7, 8]. In this connection we can suppose, that
the liver fragments are efficient as the hepatocytes
are when using them in contours for hemoperfusion at
liver insufficiency. In practice, in addition to liver
fragments of adult pigs, those of newborn piglets can
be also applied as the material for stimulating the
78ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
печени эффективны как и гепатоциты при их
использовании в контурах для гемоперфузии при
печеночной недостаточности. В практике, кроме
фрагментов печени половозрелых свиней, могут
применяться также фрагменты печени ново-
рожденных поросят как материал для стимуляции
регенеративных процессов в печени, но это
возможно только при его наличии в достаточном
количестве. Эта проблема может быть решена с
помощью криоконсервирования. Но если в
отношении гепатоцитов она исследована доста-
точно [3, 5, 11, 12], то вопросам криоконсер-
вирования срезов, фрагментов или органов
посвящены единичные работы [6-8].
Целью нашей работы было изучение влияния
факторов криоконсервирования на сохранность
фрагментов печени половозрелых свиней и
новорожденных поросят. Было исследовано
влияние таких факторов криоконсервирования, как
скорость охлаждения, включая сверхбыстрые
скорости, а также эффективность различных
криопротекторов в зависимости от их концент-
рации. Показателями, которые характеризуют
состояние фрагментов печени после криокон-
сервирования, были выбраны интенсивность
дыхания, связанная с биоэнергетическими
процессами в тканях, и характер перекисных
процессов в фрагментах, являющийся неспеци-
фическим ответом на повреждения биологических
мембран [3,5].
Материалы и методы
Фрагменты печени получали продавливанием
ее кусочков через решетку с отверстиями
диаметром 0,8 мм. После этого их трижды
отмывали физиологическим раствором (рН 7,4) и
добавляли растворы криопротекторов в соот-
ношении 1:1. В работе были использованы
глицерин, ДМСО, ПЭО-400 и ПЭО-1500 в конечных
концентрациях 10 и 20%. Материал расфасовывали
в пластиковые контейнеры по 1 мл для замора-
живания с малыми скоростями и по 0,5 мл в
контейнеры из алюминиевой фольги для замора-
живания с большими скоростями.
Для замораживания материала использовали:
программный замораживатель УОП-6 произ-
водства СКТБ с ОП ИПКи К НАН Украины (1,
10 и 100°С/мин), устройство для замораживания
биологических объектов с большими скоростями
(1000, 8000 и 80000°С/мин) [2, 13]. Отогревали на
водяной бане при температуре 37oС. Проникающие
криопротекторы отмывали растворами сахарозы с
заменой их на среду 199, в которой инкубировали
фрагменты печени на протяжении 30 мин. Для
биоматериала, криоконсервированного в присутствии
20%-го раствора глицерина, использовали кон-
regenerative processes in liver, but this is only possible
under its presence in a sufficient amount. This problem
can be solved by means of cryopreservation. But if in
respect to hepatocytes it is investigated in a sufficient
extent [3, 5, 11, 12], only single papers are devoted to
the questions of sections, fragments or organs
cryopreservation [6-8].
The aim of our work was to study the effect of
cryopreservation factors on the preservation of liver
fragments of adult pigs and newborn piglets. The effect
of such cryopreservation factors, as cooling rate,
including ultrarapid ones, as well as the efficiency of
different cryoprotectants depending on their con-
centration were investigated. The respiration intensity,
related to the bioenergetic processes in tissues, and
the character of peroxide processes in fragments, being
a non-specific response to the damage of biological
membranes were chosen as the indices, characterising
the liver fragment state after cryopreservation [3, 5].
Materials and methods
The liver fragments were obtained by pressing its
pieces through a grid with 0.8 mm’s holes. Afterwards
they were thrice washed-out with physiological solution
(pH 7.4) and the cryoprotectants solutions in 1:1 ratio
were added. DMSO, PEO-400 and PEO-1500 under
final 10 and 20% concentrations were used in the work.
The material was packed into 1 ml plastic containers
for freezing with low rates and by 0.5 ml into the
containers from aluminium foil to be frozen with high
rates.
UOP-6 programmable freezer, produced by Special
Design and Technical Bureau with Experimental Unit
of the Institute for Problems of Cryobiology and
Cryomedicine of the National Academy of Sciences
of the Ukraine (1, 10 and 100°C/min), a device for
freezing biological objects with high rates (1000, 8000
and 80000°C/min) were used for material freezing [2,
13]. Thawing was performed on a water bath at 37°C.
The penetrating cryoprotectants were washed-out
using sucrose solution with their replacement by the
medium 199, where the liver fragments were
incubated for 30 min. For biomaterial, cryopreserved
under the presence of 20% glycerol solution one used
the following concentrations of sucrose solution: 2.2;
1.1; 0.55; 1.15M with physiological solution, for 10%
glycerol solution: 1.1; 0.55; 0.15M. For biomaterial,
cryopreserved under 20% DMSO solution presence
there were used the concentrations of sucrose solutions
as follows: 2.6; 1.3; 0.65; 0.15 M, for 10% DMSO
solution: 1.3; 0.65; 0.15M. The respiration intensity was
measured with polarograph (“Radelkis” company). In
a polarograph cell with 1 ml of Krebs-Ringer medium
there were added 10-20 mg of liver fragments and the
respiration dynamics were registered with recorder.
The respiration rate was presented in nM O2/min of
79ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
центрации растворов сахарозы 2,2; 1,1; 0,55; 0,15М на
физиологическом растворе, для 10%-го раствора
глицерина – 1,1; 0,55; 0,15М соответственно. Для
биоматериала, криоконсервированного в присутствии
20%-го раствора ДМСО, использовали кон-
центрации растворов сахарозы 2,6; 1,3; 0,65; 0,15М,
для 10%-го раствора ДМСО – 1,3; 0,65; 0,15М.
Интенсивность дыхания измеряли на полярографе
фирмы Radelkis. В ячейку полярографа, со-
держащую 1 мл среды Кребса-Рингера, добавляли
10-20 мг фрагментов печени и динамику дыхания
регистрировали на самописце. Скорость дыхания
выражали в нмоль О2/мин мг ткани. Интенсивность
перекисных процессов определяли хемилюми-
несцентным методом по светосумме хемилю-
минесценции (ХЛ), индуцированной Fе++ или Н2О2,
а также по концентрации продуктов, которые дают
цветную реакцию с тиобарбитуровой кислотой
(ТБК). При хемилюминесцентном методе в ячейку
хемилюминометра, в которой находились 1 мл
физиологического раствора (рН 7,4) и 100 мкл
гомогената ткани, добавляли 100 мкл раствора
соли Мора или перекиси водорода. Концентрация Fе++ в
ячейке составляла 10-3ммоль, а перекиси водорода –
0,5%. Хемилюминометр работал в режиме счета
фотонов. Динамику свечения регистрировали на
самописце и с помощью частотомера. Результаты
выражали в условных единицах (усл. ед.).
Концентрацию ТБК-активных продуктов (ТБКАП),
которые дают цветную реакцию с ТБК, определяли
по стандартной методике при длине волны 532 нм
на спектрофотометре Spektromom-204 [1]. Реакти-
вы, использованные в работе, были квалификации
не ниже “х. ч.”, а для ХЛ – не ниже “ч. д. а.”.
Статистическая обработка результатов проводи-
лась по методу Стьюдента-Фишера.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 представлены результаты, харак-
теризующие интенсивность дыхания фрагментов
печени половозрелых свиней в зависимости от
скоростей охлаждения, криопротекторов и их
концентрации. Наблюдалось два максимума
интенсивности дыхания при скоростях охлаждения
1 и 8000°С/мин. Подобная тенденция просле-
живалась и в отношении сохранности некоторых
других биологических объектов [2]. Максимальное
сохранение интенсивности эндогенного дыхания,
при котором полученные результаты достоверно
не отличаются от контроля, наблюдается при
использовании в качестве криопротекторов ПЭО.
В тех случаях, когда применяли ДМСО или
глицерин, интенсивность дыхания была понижена
приблизительно в 1,8 раза по сравнению с
результатами, полученными при использовании
ПЭО. Если при использовании ПЭО интенсивность
tissue mg. The intensity of peroxide processes was
determined by chemoluminescent method by the
chemoluminescence (CL) light sum, induced by Fe++
or H2O2, as well as by the product concentration,
providing a colour reaction with thiobarbituric acid
(TBA). At a chemoluminescent method into a cell of
chemoluminometer, with 1ml of physiological solution
(pH 7.4) and 100 µl of tissue homogenate, there were
added 100 µl of Mohr’s salt solution and hydrogen
peroxide. Fe++ concentration in a cell made 10-3 mM,
and 0.5% for hydrogen peroxide. Chemoluminometer
operated as the photon counter. The glow dynamics
was registered with recorder by means of the
frequency meter. The results were presented in relative
units (rel. units). The concentration of TBA-active
products (TBAAP), providing a colour reaction with
TBA, was detected according to the standard method
at 532 nm wavelength in the Spektromom-204
spectrophotometer [1]. The reagents, used in the work,
had the qualification not lower than “chemically pure”,
and not lower than “pure for analyses” for CL.
Statistical processing of the esults was performed using
the Student-Fisher method.
Results and discussion
The Table 1 demonstrates the results, characterising
the respiration intensity of the adult pig’s liver fragments
depending on cooling rates, cryoprotectants and their
concentration. There were observed two maxima of
respiration intensity at cooling rates of 1 and 8000°C/min.
The similar tendency was traced in respect of certain
biological object preservation as well [2]. The maximum
preservation of the endogenous respiration intensity,
when the obtained results do not statistically and truly
differ from the control, is observed when using PEO
as a cryoprotectant. In those cases, when DMSO or
glycerol were applied, the respiration intensity was
decreased approximately in 1.8 times in comparison
with the results, obtained when using PEO.
If during PEO usage the respiration intensity at 1 and
8000°C/min cooling rates is quite the same, the maximum
during glycerol and DMSO usage at 8000°C/min cooling
rate makes approximately 76 and 71% of the control,
correspondingly. At the 1°C/min cooling rate the
maximum indices are 59 and 45% of the control
correspondingly (20% concentration of cryo-
protectant).
The respiration intensity of liver fragments does
not practically depend on a cryoprotectant con-
centration. Although glycerol and DMSO lower activity
in comparison with PEO can be related not only to the
fact, that they are less efficient cryoprotectants for
this biological object, but they penetrate into a cell and
at their washing-out it is possible to an additional
damage of biological structures, especially at the
background of the effect of cryopreservation negative
80ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
роткеторпоирК
tnatcetorpoyrC
%,яицартнецноК
%,noitartnecnoC
,яинеджалхоьтсорокС ним/C°
nim/C°,etargnilooC
1 01 001 0001 0008 00008
ароткеторпоиркзеБ
tnatcetorpoyrctuohtiW 10,0±11,0 10,0±80,0 10,0±60,0 10,0±80,0 30,0±21,0 10,0±80,0
нирецилГ
lorecylG
01 20,0±72,0 10,0±22,0 10,0±61,0 20,0±12,0 30,0±63,0 10,0±11,0
02 30,0±3,0 10,0±22,0 10,0±91,0 20,0±52,0 30,0±93,0 10,0±90,0
ОСМД
OSMD
01 20,0±42,0 20,0±91,0 10,0±31,0 30,0±3,0 30,0±63,0 10,0±90,0
02 20,0±32,0 20,0±42,0 30,0±51,0 20,0±52,0 30,0±63,0 10,0±90,0
004-ОЭП
004-OEP
01 *40,0±74,0 20,0±22,0 2,0±91,0 30,0±24,0 *40,0±54,0 10,0±71,0
02 *40,0±84,0 20,0±42,0 20,0±42,0 40,0±44,0 *50,0±74,0 30,0±51,0
0051-ОЭП
0051-OEP
01 *30,0±14,0 20,0±42,0 10,0±31,0 30,0±93,0 *40,0±04,0 10,0±31,0
02 *30,0±14,0 20,0±2,0 10,0±61,0 30,0±63,0 30,0±93,0 10,0±41,0
Таблица 1. Интенсивность дыхания (нмоль О2/мин мг ткани) фрагментов печени половозрелых свиней
в зависимости от скоростей охлаждения криопротекторов и их концентрации, n=10
Table 1. Respiration intensity (nM O2/min mg of tissue ) of adult pigs’ liver fragments depending on cooling rates,
cryoprotectants and their concentration, n=10
Примечание: * – показатель достоверно не отличается от контроля (р>0,05).
Note: * – the index statistically and significantly differs from the control (р>0.05).
дыхания при скоростях охлаждения 1 и 8000°С/мин
практически одинакова, то при использовании
глицерина и ДМСО максимум при скорости
охлаждения 8000oС/мин составляет примерно 76
и 71% от контроля соответственно. При скорости
охлаждения 1°С/мин максимальные показатели
соответственно 59 и 45% от контроля (концентра-
ция криопротектора 20%).
Интенсивность дыхания фрагментов печени
почти не зависит от концентрации криопротектора.
Хотя при этом меньшая эффективность глицерина
и ДМСО по сравнению с ПЭО может быть связана
не только с тем, что они являются менее
эффективными криопротекторами для данного
биологического объекта, но и с тем, что они
проникают в клетку и при их отмывании возможно
дополнительное повреждение биологических
структур, особенно на фоне влияния отрицательных
факторов криоконсервирования. При этом клетки
могут иметь не только явные, но и латентные
повреждения [3], которые усугубляются и
проявляются во время отмывания, а также при
инкубировании после отогрева.
Аналогичные данные для фрагментов печени
новорожденных поросят представлены в табл. 2.
Эндогенное дыхание свежевыделенных фрагментов
печени поросят (0,57±0,05 нмоль О2/мин мг тка-
ни)несколько выше, чем фрагментов печени свиней
(0,51±0,03 нмоль О2/мин мг ткани). Это может
factors of. At the same time the cells can have not
only evident, but latent damages as well [3], which are
aggravated and manifested during washing-out, as well
as at the incubation following thawing.
The similar data for liver fragments of newborn
piglets are presented in the Table 2. An endogenous
respiration of freshly isolated fragments of piglet’s liver
(0.57±0.05 nM O2/min mg of tissue) is slightly higher,
than the liver fragments of pigs (0.51±0.03 nM O2/min
mg of tissue). This can be related to a higher level of
metabolism in newborn piglets. But the character of
the dependency of endogenous respiration intensity on
cryopreservation factors is similar to that, presented
in the Table 1. The studied index when using pene-
trating cryoprotectants (glycerol under 10 and 20%
concentration and DMSO under 10% concentration)
in the piglet’s liver fragments is twice less comparing
with those, obtained in the pig’s liver fragments. In the
case of PEO use at the piglet’s liver fragment cryopre-
servation the respiration intensity at the presence of 10%
PEO-400, 10% and 20% PEO-1500 at cooling rates of 1
and 8000°C/min does not statistically and significantly
differ from the control. At the same time PEO-400
has slightly higher cryoprotective efficiency, than PEO-
1500. Probably, this can be explained by the fact, that
during PEO interaction with water there are formed
an continuous network of hydrogen bonds in the water-
PEO system or the intermolecular associates with a
high rate of decay. With an increase in the PEO poly-
81ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
роткеторпоирК
tnatcetorpoyrC
%,яицартнецноК
%,noitartnecnoC
ним/С°,яинеджалхоьтсорокС
nim/C°,etargnilooC
1 01 001 0001 0008 00008
ароткеторпоиркзеБ
tnatcetorpoyrctuohtiW 20,0±21,0 20,0±90,0 10,0±80,0 10,0±11,0 40,0±41,0 10,0±80,0
нирецилГ
lorecylG
01 10,0±31,0 10,0±51,0 10,0±31,0 10,0±31,0 20,0±43,0 10,0±90,0
02 10,0±2,0 10,0±71,0 10,0±61,0 10,0±71,0 10,0±63,0 10,0±1,0
ОСМД
OSMD
01 10,0±21,0 10,0±31,0 10,0±11,0 10,0±51,0 30,0±73,0 10,0±31,0
02 10,0±21,0 10,0±71,0 10,0±51,0 10,0±2,0 30,0±83,0 10,0±21,0
004-ОЭП
004-OEP
01 30,0±94,0 20,0±72,0 2,0±22,0 20,0±92,0 *40,0±25,0 10,0±91,0
02 *50,0±25,0 30,0±82,0 20,0±32,0 30,0±33,0 *50,0±35,0 20,0±2,0
0051-ОЭП
0051-OEP
01 30,0±44,0 20,0±52,0 20,0±2,0 20,0±52,0 30,0±24,0 10,0±61,0
02 *50,0±94,0 20,0±3,0 20,0±32,0 30,0±92,0 *40,0±15,0 10,0±31,0
Таблица 2. Интенсивность дыхания (нмоль О2/мин мг ткани) фрагментов печени новорожденных поросят в
зависимости от скоростей охлаждения криопротекторов и их концентрации, n=10
Table 2. Respiration intensity (nM O2/min mg of tissue) of newborn piglets’ liver fragments depending on
cooling rates, cryoprotectants and their concentration, n=10
Примечание: * – показатель достоверно не отличается от контроля (р>0,05).
Note: * – the index statistically and significantly differs from the control (р>0.05).
быть связано с более высоким уровнем ме-
таболизма у новорожденных поросят. Но характер
зависимости интенсивности эндогенного их ды-
хания от факторов криоконсервирования подобный
представленному в табл. 1. Исследуемый пока-
затель при использовании проникающих криопро-
текторов (глицерин в концентрации 10 и 20% и
ДМСО в концентрации 10%) на фрагментах печени
поросят в 2 раза меньший по сравнению с пока-
зателями, полученными на фрагментах печени
свиней. В случае использования ПЭО при криокон-
сервировании фрагментов печени поросят интен-
сивность дыхания в присутствии 10%-го ПЭО-400,
10% - и 20%-го ПЭО-1500 при скоростях охлаж-
дения 1 и 8000oС/мин достоверно не отличается
от контроля. При этом ПЭО-400 обладает несколь-
ко большей криопротекторной эффективностью,
чем ПЭО-1500. Это можно объяснить, возможно,
тем, что при взаимодействии ПЭО с водой обра-
зуется непрерывная сеть водородных связей в
системе вода-ПЭО либо межмолекулярные ассо-
циаты с быстрой скоростью распада. С увеличе-
нием степени полимеризации ПЭО возрастает
количество молекул воды, что может изменять
характер кристаллизации водного раствора с обра-
зованием аморфного льда. В процессе взаимо-
действия ПЭО с мембраной биообъекта (фрагмен-
ты печени), очевидно, происходит формирование
сольватной оболочки из молекул криопротектора,
merisation degree there is the augmentation of water
molecule number, what can change the crystallisation
character of an aqueous solution with th e amorphous
ice formation. During the process of PEO interaction
with the bioobject membrane (liver fragment), it is
evident, that the solvate membrane formation from the
cryoprotectant mole-cules occurs, affecting the process
of cell dehydration during cooling [8].
Thus, when cryopreserving liver fragment of adult
pigs and newborn piglets the maximums of the integrity
of endogenous respiration intensity are determined at
the cooling rates of 1 and 8000°C/min. Namely these
rates are efficient for the liver fragment cryopreser-
vation. In addition to the respiration intensity, one more
factor, reflecting the state of biological object after
cryopreservation is the lipid peroxidation (LPO) inten-
sity of biomembranes. A decrease in the fragment
resistance to LPO is related to the fact, that when
preparing the material to cryopreservation and during
its washing-out after thawing there are possible the
loss of both water-soluble and binding to the mem-
branes antioxidants, as well as the induction of peroxi-
dation as a result of shifting of metabolic balance in
cells [1, 4, 10], because under physiological conditions
the LPO rate is regulated along with other systems by
that of glutation. This system uses NADPH as the
recovery equivalents and depends on the intensity of
their regeneration and consumption. Thus, the LPO
intensity is closely related to the metabolic state of
82ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
cells, which depends on its intensity and damage of
cellular structures due to this process.
The Table 3 and 4 demonstrate the indices,
reflecting the character of peroxide processes in tissue.
The cooling rate made 1 and 8000°C/min. DMSO and
PEO-400 in 10% concentration were used as the
cryoprotectants. The light sum of CL, induced by a
bivalent iron is proportional to the concentration of free
radicals and reflects the peroxidation intensity in the
moment of measurement. The light sum of CL, induced
by hydrogen peroxide shows the membrane resistance
to the LPO. The lower is the resistance, the higher is
the light sum. The TBAAP concentration provides the
information on the number of final LPO products.
As it is seen from the Table 3, 4 the TBAAP
concentration after freeze-thawing does not consi-
derably and truly differ from the control, although the
results, obtained at the cooling rate of 1°C/min, have
the tendency to the augmentation in the liver fragments
of both pig and piglets. The CL intensity, induced by
Fe++ at the cooling rate of 1°C/min, statistically and
truly differs from the control independently on a
biological material and cryoprotectant. At the cooling
rate of 8000°C/min the activation of lipid peroxidation
is less manifested (the differences in comparison with
the control are not statistically true). These tables
demonstrate, that the resistance of studied biological
material to peroxidation remains at a quite high level,
although in some cases does not statistically and truly
differ from the control. The presented data characterise
the LPO stage in liver fragments in 30 min after
thawing. During further normothermic incubation
depending on the material initial state, as well as on
the incubation medium composition these indices can
be changed, but this requires following investigations.
которая влияет на процесс дегидратации клетки
при охлаждении [8].
Таким образом, при криоконсервировании
фрагментов печени половозрелых свиней и ново-
рожденных поросят максимумы сохранности ин-
тенсивности эндогенного дыхания определяются
при скоростях охлаждения 1 и 8000°С/мин. Именно
эти скорости являются эффективными для крио-
консервирования фрагментов печени. Кроме интен-
сивности дыхания, еще одним фактором, который
отражает состояние биологического объекта после
криоконсервирования, является интенсивность
перекисного окисления липидов (ПОЛ) биомем-
бран. Понижение устойчивости фрагментов к ПОЛ
связано с тем, что при подготовке материала к
криоконсервированию и при его отмывании после
отогревания возможны потеря антиоксидантов как
водорастворимых, так и связанных с мембранами,
а также индукция пероксидации в результате
смещения метаболического равновесия в клетках
[1, 4, 10], так как в физиологических условиях ско-
рость ПОЛ регулируется, наряду с остальными
системами, системой глутатиона. Эта система ис-
пользует в качестве восстановительных эквива-
лентов NADPH и зависит от интенсивности их
генерации и потребления. Таким образом, интен-
сивность ПОЛ тесно связана с метаболическим
состоянием клеток, которое зависит от его интен-
сивности и повреждения клеточных структур
вследствие этого процесса.
В табл. 3 и 4 приведены показатели, которые
отражают характер перекисных процессов в ткани.
Скорость охлаждения составляла 1 и 8000°С/мин.
В качестве криопротекторов использовали ДМСО
и ПЭО- 400 в концентрации 10%. Светосумма ХЛ,
Таблица 3. Интенсивность перекисных процессов в фрагментах печени
новорожденных поросят и половозрелых свиней в зависимости от скоростей
охлаждения. Криопротектор ДМСО, концентрация 10%, n=10
Table 3. Intensity of peroxidation processes in liver fragment of newborn piglets and adult
pigs depending on cooling rates. Cryoprotectant: DMSO, 10% concentration, n=10
Примечание: * – показатель достоверно не отличается от контроля (р>0,05).
Note: * – the index statistically and significantly differs from the control (р>0.05).
кинчотсИ
вотнемгарф
инечеп
stnemgarfreviL
ecruos
ьтсорокС
,яинеджалхо
ним/С°
,etargnilooC
nim/C°
яинелсикоогонсикерепилетазакоП
secidninoitadixoreP
гм/ьломн,ПАКБТ
gm/Mn,PAABT
яаннаворицудни,ЛХ
eF ++ .де.лсу,
eF ++ LCdecudni-
)stinu.ler(
яаннаворицудни,ЛХ
H
2
O
2
.де.лсу,
H
2
O
2
.ler(LCdecudni-
)stinu
йенивС
sgiP
ьлортноК
lortnoC
1
0008
4,0±8,7
6,0±5,8
7,0±0,8
8±801
*01±641
9±521
211±8021
321±3141
311±3721
тясороП
stelgiP
К ьлортно
lortnoC
1
0008
7,0±0,8
8,0±0,9
6,0±6,8
21±131
*31±371
51±551
131±6041
841±3551
231±1941
индуцированной двух-
валентным железом,
пропорциональна кон-
центрации свободных
радикалов и отражает
интенсивность перок-
сидации в момент из-
мерения. Светосумма
ХЛ, индуцированной
перекисью водорода,
показывает устойчи-
вость мембран к ПОЛ.
Чем меньше устойчи-
вость, тем больше све-
тосумма. Концентрация
ТБКАП дает инфор-
мацию о количестве
конечных продуктов
ПОЛ.
Как видно из табл.
3, 4, концентрация
83ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
ТБКАП после замора-
живания- отогревания
достоверно не отли-
чается от контроля,
хотя результаты, полу-
ченные при скорости
охлаждения 1oС/мин,
имеют тенденцию к
повышению в фраг-
ментах печени как
свиней, так и поросят.
Интенсивность ХЛ,
индуцированной Fe++
при скорости охлаж-
дения 1oС/мин, досто-
верно отличается от
контроля независимо
от биологического
материала и криопро-
тектора. При скорости
кинчотсИ
вотнемгарф
инечеп
stnemgarfreviL
ecruos
ьтсорокС
,яинеджалхо
ним/С°
,etargnilooC
nim/C°
яинелсикоогонсикерепилетазакоП
secidninoitadixoreP
гм/ьломн,ПАКБТ
PAABT
gm/Mn
яаннаворицудни,ЛХ
eF ++ .де.лсу,
eF ++ LCdecudni-
)stinu.ler(
яаннаворицудни,ЛХ
H
2
O
,2
.де.лсу
H
2
O
2
LCdecudni-
)stinu.ler(
йенивС
sgiP
ьлортноК
lortnoC
1
0008
6,0±6,7
7,0±3,8
5,0±8,7
7±69
*21±531
9±811
701±5441
121±6041
311±3021
тясороП
stelgiP
ьлортноК
lortnoC
1
0008
5,0±1,8
4,0±8,8
6,0±3,8
11±321
*31±241
11±131
321±573
431±3151
721±2241
Таблица 4. Интенсивность перекисных процессов в фрагментах печени половозрелых
свиней и новорожденных поросят в зависимости от скоростей охлаждения.
Криопротектор – ПЭО-400, концентрация 10%, n=10
Table 4. Intensity of peroxidation processes in liver fragment of adult pigs and newborn
piglets depending on cooling rates. Cryoprotectant: PEO-400, 10% concentration, n=10
Примечание: * – показатель достоверно не отличается от контроля (р>0,05)
Note: * – the index statistically and significantly differs from the control (р>0.05)
охлаждения 8000oС/мин активация перекисного
окисления менее выражена (различия по срав-
нению с контролем не достоверны). Из этих же
таблиц видно, что устойчивость исследуемого
биологического материала к перекисному окис-
лению остается на достаточно высоком уровне,
хотя в некоторых случаях и достоверно отличается
от контроля. Приведенные данные характеризуют
этап ПОЛ в фрагментах печени через 30 мин после
отогревания. В процессе дальнейшей нормотер-
мической инкубации в зависимости от начального
состояния материала, а также состава среды
инкубации эти показатели могут изменяться, но это
требует дальнейшего исследования.
Выводы
При криоконсервировании фрагментов печени
половозрелых свиней и новорожденных поросят
максимумы сохранности интенсивности эндо-
генного дыхания определяются при скоростях
охлаждения 1 и 8000°С/мин.
Подбором криопротекторов и скоростей охлаж-
дения при криоконсервировании фрагментов печени
половозрелых свиней и новорожденных поросят
можно сохранить интенсивность эндогенного
дыхания и уровень ПОЛ в мембранах клеток на
уровне, близком к контролю.
Полученные результаты позволят перейти к
исследованию функциональной активности фраг-
ментов органов после криоконсервирования, так
как сохранение этой активности является важным
фактором при использовании материала в кли-
нической практике или в научных исследованиях.
Conclusions
When cryopreserving the liver fragments of adult
pigs and newborn piglets the integrity maxima of
endogenous respiration are determined at 1 and
8000°C/min cooling rates.
Using the selection of cryoprotectants and cooling
rates when cryopreserving liver fragments of adult pigs
and newborn piglets we can preserve the intensity of
endogenous respiration and the LPO level in cell
membranes at the level, close to the control.
The results obtained will permit to go over to the
investigation of functional activity of the organ frag-
ments after cryopreservation, because the preserving
of this activity is an important factor when using the
material in clinical practice or in scientific investiga-
tions.
References
Vladimirov Yu.A., Archakov A.I. Lipid peroxidation in biological
membranes.– Moscow: Meditsina, 1972.– 16 p.
Galchenko S.E. Peculiarities of biological object cryopre-
servation with applying high cooling rates: Authors’ abstract
of thesis of the candidate of biological sciences.– Moscow,
1990.– 16 p.
Hepatocyte: functional and metabolic properties/ Ed. by L.D.
Lukyanova.– Moscow: Nauka, 1985.– 272 p.
Kuzmenko A.I. Characteristics of H2O2: initiated lipid oxidation
of blood serum by kinetic parameters of chemoluminescence //
Ukr. Biokhim. Zhurn.– 1999.– Vol.71, N4.– P. 63-67.
Petrenko A.Yu. Energetic state and metabolism of xenobiotics
in isolated hepatocytes depending on conditions of cell
isolation and cryopreservation: Authors’ abstract of thesis
of the candidate of biological sciences.– Moscow, 1993.– 30 p.
Ekins S. Vitrification of precision-cut liver slices // Cryo-
Letters.– 1996.– Vol.17, N7.– P.7-12
1.
2.
3.
4.
5.
6.
84ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
Литература
Владимиров Ю.А. Арчаков А.И. Перекисное окисление
липидов в биологических мембранах.– М.: Медицина,
1972.– 16 с.
Гальченко С.Е. Особенности криоконсервирования
биологических объектов с применением больших
скоростей охлаждения: Автореф. дис. …канд. биол.
наук.– М., 1990.– 16 с.
Гепатоцит: Функционально-метаболические свойства /
Под ред. Л.Д. Лукьяновой.– М.: Наука,1985.– 272 с.
Кузьменко А.И. Характеристика Н2О2 – инициированного
окисления липидов сыворотки крови по кинетическим
параметрам хемилюминесценции // Укр.биохим.журн.–
1999.– Т.71, №4.– С. 63-67
Петренко А.Ю. Энергетитческое состояние и мета-
болизм ксенобиотиков в изолированных гепатоцитах в
зависимости от условий выделения и криоконсер-
вирования клеток: Автореф. дис. …канд. биол. наук.–
М., 1993.– 30 с.
Ekins S. Vitrification of precision-cut liver slices // Cryo-
Letters.– 1996.– Vol.17, N7.– P.7-12
Fuller B.J., Busza A.L. Proton NMR studies on permiation of
tissue fragments by dimethyl sylphoxide: liver as a model for
compact tissue // Cryo-Letters.– 1994.– Vol.15, № 7.– P. 131-
134.
Graaf I.A., Koster H.J. Water Crystallization within Rat
Precision-Cut Liver Slices in Relation to Their Viability//
Cryobiology.– 2001.– Vol.43, №3.– P. 224-37.
Imamura H., Brault A., Huet P.M. Effect of extended cold
preservation and transplantation on rat liver micro-circulation //
Hepatology.– 1997.– Vol.25, №3.– P. 664-671.
Keizo S.M., Kiyohiro D.M., Kazuo Y.D. et al. The role of lipid
peroxidation in endotoxin-induced hepatic damage and
protective effect of antioxidants // Surgery.–1987.–Vol.101,
№6.– P. 746-751.
Lin C., Hou K.Y., Zhang W.X. Studies of long-term
cryopreservation of hepatocytes and their transplantation
treating acute hepatic failure in Wistar rats // Chung Hua Wai
Ko Tsa Chin.– 1994.– Vol.32, №10.– P. 178-185.
Mc Kay G.S., Henderson C., Holdie E. et al. Cryo-
preservation of rat hepatocyte monolayers: cell viability and
cytochrome P450 content in post-thaw cultures // Toxicol In
Vitro. 2002.– Vol.16, №1.– P. 71-79.
Pat.4.817.397.USA, F25B 19/00. Device for refrigeration and
freezing of biological objects/ Grischenko V.I., Tarasov V.F.,
Galchenko S.E., et al. / Publ.apr.4.89.(USSR)
Поступила 24.12.2002
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Fuller B.J., Busza A.L. Proton NMR studies on permiation of
tissue fragments by dimethyl sylphoxide: liver as a model for
compact tissue // Cryo-Letters.– 1994.– Vol.15, № 7.– P. 131-
134.
Graaf I.A., Koster H.J. Water Crystallization within Rat
Precision-Cut Liver Slices in Relation to Their Viability //
Cryobiology.– 2001.– Vol.43, №3.– P. 224-37.
Imamura H., Brault A., Huet P.M. Effect of extended cold
preservation and transplantation on rat liver micro-circulation //
Hepatology.– 1997.– Vol.25, №3.– P. 664-671.
Keizo S.M., Kiyohiro D.M., Kazuo Y.D. et al. The role of lipid
peroxidation in endotoxin-induced hepatic damage and
protective effect of antioxidants // Surgery.–1987.–Vol.101,
№6.– P. 746-751.
Lin C., Hou K.Y., Zhang W.X. Studies of long-term
cryopreservation of hepatocytes and their transplantation
treating acute hepatic failure in Wistar rats // Chung Hua Wai
Ko Tsa Chin.– 1994.– Vol.32, №10.– P. 178-185.
Mc Kay G.S., Henderson C., Holdie E. et al. Cryo-
preservation of rat hepatocyte monolayers: cell viability and
cytochrome P450 content in post-thaw cultures // Toxicol In
Vitro. 2002.– Vol.16, №1.– P. 71-79.
Pat.4.817.397.USA, F25B 19/00. Device for refrigeration and
freezing of biological objects/ Grischenko V.I., Tarasov V.F.,
Galchenko S.E., et al. / Publ.apr.4.89.(USSR)
Accepted in 24.12.2002
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
|