Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии
Обзор посвящен состоянию вопроса о недавно открытом новом механизме регуляции генной экспрессии, основанном на РНК: РНК-взаимодействии. Приведены сведения об обнаруженных в природе примерах регуляторной функции антисмысловых РНК, об общих принципах конструирования искусственных антисмысловых регулят...
Saved in:
| Date: | 1987 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1987
|
| Series: | Биополимеры и клетка |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153714 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии / А.Д. Швед, С.Б. Золотухин, Г.Х. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 1. — С. 3-17. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-153714 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1537142025-02-09T20:12:38Z Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии Антисенсові РНК: новий механізм регуляції генної експресії Antisense RNAs: a novel mechanism for the regulation of gene expression Швед, А.Д. Золотухин, С.Б. Мацука, Г.Х. Обзоры Обзор посвящен состоянию вопроса о недавно открытом новом механизме регуляции генной экспрессии, основанном на РНК: РНК-взаимодействии. Приведены сведения об обнаруженных в природе примерах регуляторной функции антисмысловых РНК, об общих принципах конструирования искусственных антисмысловых регуляторных систем, а также представлен анализ работ, посвященных экспериментальной проверке активности различных антисмысловых РНК-транскриптов в репрессии отдельных генов. Огляд присвячено стану питання про нещодавно відкритий новий механізм регулювання генної експресії, заснований на РНК:РНК-взаємодії. Наведено відомості про виявлені в природі приклади регуляторної функції антисенсових РНК, про загальні принципи конструювання штучних антисенсових регуляторних систем, а також представлено аналіз робіт, присвячених експериментальній перевірці активності різних антнсенсових РНК-транскриптів у репресії окремих генів. The data on natural mechanisms for antisense regulation of gene expression are summarized. The examples of experimentally tested regulatory activities of various antisense RNAs are also reviewed. 1987 Article Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии / А.Д. Швед, С.Б. Золотухин, Г.Х. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 1. — С. 3-17. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.0001CD https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153714 577.218 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Обзоры Обзоры |
| spellingShingle |
Обзоры Обзоры Швед, А.Д. Золотухин, С.Б. Мацука, Г.Х. Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии Биополимеры и клетка |
| description |
Обзор посвящен состоянию вопроса о недавно открытом новом механизме регуляции генной экспрессии, основанном на РНК: РНК-взаимодействии. Приведены сведения об обнаруженных в природе примерах регуляторной функции антисмысловых РНК, об общих принципах конструирования искусственных антисмысловых регуляторных систем, а также представлен анализ работ, посвященных экспериментальной проверке активности различных антисмысловых РНК-транскриптов в репрессии отдельных генов. |
| format |
Article |
| author |
Швед, А.Д. Золотухин, С.Б. Мацука, Г.Х. |
| author_facet |
Швед, А.Д. Золотухин, С.Б. Мацука, Г.Х. |
| author_sort |
Швед, А.Д. |
| title |
Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии |
| title_short |
Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии |
| title_full |
Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии |
| title_fullStr |
Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии |
| title_full_unstemmed |
Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии |
| title_sort |
антисмысловые рнк: новый механизм регуляции генной экспрессии |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1987 |
| topic_facet |
Обзоры |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/153714 |
| citation_txt |
Антисмысловые РНК: новый механизм регуляции генной экспрессии / А.Д. Швед, С.Б. Золотухин, Г.Х. Мацука // Биополимеры и клетка. — 1987. — Т. 3, № 1. — С. 3-17. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT švedad antismyslovyernknovyimehanizmregulâciigennoiékspressii AT zolotuhinsb antismyslovyernknovyimehanizmregulâciigennoiékspressii AT macukagh antismyslovyernknovyimehanizmregulâciigennoiékspressii AT švedad antisensovírnknoviimehanízmregulâcíígennoíekspresíí AT zolotuhinsb antisensovírnknoviimehanízmregulâcíígennoíekspresíí AT macukagh antisensovírnknoviimehanízmregulâcíígennoíekspresíí AT švedad antisensernasanovelmechanismfortheregulationofgeneexpression AT zolotuhinsb antisensernasanovelmechanismfortheregulationofgeneexpression AT macukagh antisensernasanovelmechanismfortheregulationofgeneexpression |
| first_indexed |
2025-11-30T09:37:02Z |
| last_indexed |
2025-11-30T09:37:02Z |
| _version_ |
1850207552535527424 |
| fulltext |
Обзоры
УДК 577.218
АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК:
НОВЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ
А. Д. Швед, С. Б. Золотухин, Г. X. Мацука
В последние годы появились сведения о том, что в природе существу-
ют системы регуляции генной экспрессии, где ведущую роль выполняют
особого рода РНК· Накопленные данные, хотя пока и немногочислен-
ные, составили доказательную информацию о причастности Р Н К к регу-
ляции экспрессии генов на уровне трансляции. Обнаруженный меха-
низм регуляции, основанный на взаимодействии молекул Р Н К , в общем
виде состоит в том, что наряду с транскрипцией структурного гена со
смысловой нити Д Н К в некоторых случаях происходит транскрипция
второй, антисмысловой нити, но в обратном направлении (рис. 1). В ре-
зультате такой двунаправленной транскрипции появляются молекулы
мРНК, или смысловые РНК, и комплементарные им антисмысловые
Р Н К (асРНК) . По доминирующему представлению, мРНК, образуя
гибрид с асРНК, теряет способность связываться с рибосомой и участ-
вовать в акте трансляции.
Заманчивая перспектива создания искусственной системы такой
регуляции индуцировала появление ряда экспериментальных работ, по-
казавших, что трансляция действительно может быть подавлена введе-
нием в клетку асРНК, комплементарной м Р Н К какого-то конкретного
белка. Общий принцип построения искусственной системы, продуцирую-
щей ас-транскрипты, заключается в том, что последовательности опре-
деленного гена либо какие-то его участки выделяются с помощью
рестриктаз и затем встраиваются в подходящий вектор под контроль
того же (или другого) промотора, но в обратной, антисмысловой, ори-
ентации (рис. 2). В исходной молекуле промотор направляет тран-
скрипцию смысловой, или мРНК, в реконструированной системе тран-
скрипция идет в том же направлении, но на противоположной, анти-
смысловой нити, что обеспечивает накопление асРНК-транскриптов,
комплементарных мРНК.
Короткий список публикаций о регуляторной роли а с Р Н К быстро
пополняется новыми работами, что свидетельствует о большом интере-
се исследователей к недавно открытому новому механизму регуляции
генной экспрессии.
В представленном обзоре мы попытались суммировать имеющиеся
в литературе сведения об уже известных примерах такой регуляции, а
также об экспериментальном использовании асРНК в качестве ингиби-
торов трансляции.
В работе [1] были представлены доказательства того, что инвер-
тированная последовательность (IS1O-элеиеят) транспозона Тп10 мо-
жет негативно контролировать на уровне трансляции экспрессию своего
собственного белка — транспозазы. Транспозон Тп10 имеет на концах
молекулы инвертированные IS1O-последовательности. Левый IS10-эле-
мент функционально неактивен, правый же ( IS10R ) — обладает рядом
функций, одной из которых является кодирование транспозазы — белка,
обеспечивающего узнавание и разрезание ДНК-мишени. Синтез м Р Н К
транспозазы включает промотор pIN, второй промотор ( p O U T ) распо-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 3
ложен в З'-направлении от первого и обеспечивает транскрипцию в об-
ратном направлении (рис. 1).
Строгий генетический анализ показал, что плазмидные конструк-
ции, содержащие много копий участка наружного конца IS10R длиной
180 пар оснований (п. о.), обеспечивают негативную регуляцию тран-
сляции м Р Н К транспозазы, транскрибированной с соответствующего·
гена транспозона Тn10, присутствующего в бактериальной хромосоме в
Рис. 1. Структура правого ISlO-элемента транспозона ТпЮ [1].
Fig . 1. S t ruc tu re of the r ight IS1O-element of TnlO t r ansposone [1] .
Рис. 2. Схема построения плазмиды, продуцирующей антисмысло-
вые транскрипты ТК-гена вируса герпеса [11].
F ig . 2. The cons t ruc t ion d i a g r a m of recombinant plasmid coding
for an t i sense RNA to H S V TK-gene [11].
единичной копии. Обнаруженный феномен был назван «многокопийным
ингибированием» (МКИ). Кодируемая плазмидой детерминанта, ответ-
ственная за МКИ, представляет собой транскрипт с рOUT-промотора.
5 /-концы этого транскрипта и м Р Н К транспозазы имеют взаимно комп-
лементарные участки длиной 36 п. о., включающие инициирующий
АУГ-кодон транспозазного гена и последовательность Шайн — Даль-
гарно. Спаривание этих двух транскриптов в комплементарных участ-
ках предотвращает, по представлениям авторов, связывание м Р Н К с
рибосомами и последующую ее трансляцию.
Известны и другие примеры регуляции по механизму взаимодейст-
вия комплементарных РНК, наиболее изученным из которых является
контроль копийности плазмид. Результаты отдельных работ уже анали-
зировались в кратком обзоре [2], в дополнение к которому мы также
кратко рассмотрим некоторые сообщения.
Взаимодействие двух РНК-транскриптов лежит в основе регуляции
репликации Д Н К плазмид из семейства СоІЕІ [3, 4]. Инициация синте-
за одного из этих транскриптов (РНК И) начинается на расстоянии
555 п. о. от точки начала репликации плазмиды. В этом районе Р Н К II
образует гибрид с ДНК-матрицей, который подвергается расщеплению·
РНКазой Η в точке начала репликации. Образовавшийся фрагмент рас-
щепленной Р Н К служит затравкой для ДНК-полимеразы I, синтезиру-
ющей новую цепь ДНК- Другая Р Н К длиной 108 оснований ( Р Н К I)
транскрибируется с противоположной нити Д Н К в области, кодирую-
щей 5'-конец Р Н К II. Комплементарное связывание Р Н К I и Р Н К II
предотвращает гибридизацию последней с ДНК-матрицей, ингибируя
таким путем образование РНК-затравки для репликации Д Н К . Эффек-
тивность ингибирования зависит от скорости гибридизации Р Н К I и
Р Н К II, которая должна состояться раньше, чем произойдет гибридиза-
ция Р Н К II с ДНК- Скорость связывания двух РНК, регулируемая дву-
мя факторами, имеет первостепенное значение для образования затрав-
ки и, следовательно, для репликации плазмиды.
Первый фактор, влияющий на гибридизацию, — пространственная;
структура взаимодействующих молекул. Анализ нуклеотидной последо-
вательности Д Н К , кодирующей Р Н К I и Р Н К II, позволил обнаружить
три палиндрома, благодаря которым эти Р Н К обладают специфической
пространственной структурой, состоящей из трех шпилек [3]. Мутации
в центральных неспаренных областях палиндромов, не приводящие к
4 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 4
изменениям в пространственной структуре, тем не менее приводили к
уменьшению скорости связывания Р Н К I и Р Н К Н. Согласно предло-
женной модели, взаимодействие между молекулами Р Н К I и Р Н К II
происходит вначале в районе неспаренных последовательностей соот-
ветствующих палиндромов. Этот первый контакт, по-видимому, обеспе-
чивает последующее пространственное сближение 5'-конца Р Н К I с со-
ответствующей областью Р Н К И и образование прочного гибрида дли-
ной 108 п. о.
Вторым фактором, влияющим на сродство двух молекул Р Н К , яв-
ляется так называемый Rom-белок [5]. Этот полипептид длиной 63 ами-
нокислотных остатка кодируется областью Д Н К , находящейся между
402 и 708 п. о., в З ' -направлении от точки инициации репликации. В при-
сутствии белка Rom скорость гибридизации Р Н К I и Р Н К II значи-
тельно увеличивается, что в свою очередь приводит к уменьшению син-
теза плазмидной Д Н К .
Регуляция инициации репликации плазмид при участии низкомоле-
кулярных Р Н К у прокариот является, по-видимому, распространенным
механизмом, во всяком случае для плазмид семейств R1 и NR1 Е. coli,
рТ181 Staph, aureus такой способ регуляции можно считать установ-
ленным фактом [2—9]. Показано [6, 7], что низкомолекулярная Р Н К ,
именуемая СорА Р Н К , влияет на способность более длинного тран-
скрипта служить матрицей для синтеза белка RepA, оказывающего
стимулирующее действие на репликацию плазмиды R1. СорА Р Н К так-
же имеет палиндромную структуру, которая, по мнению авторов, при-
нимает участие в узнавании и сближении двух молекул Р Н К , резуль-
татом чего является блок трансляции м Р Н К .
Подобный же механизм регуляции копийности обнаружен и у плаз-
миды NR1 [8]. Участок плазмидной Д Н К , ответственный за контроль
количества копий этой плазмиды, транскрибируется в обоих направле-
н и я х — в п р а в о и влево. Правонаправленный транскрипт представляет
собой м Р Н К для белка RepAl, необходимого для репликации Д Н К .
С противоположной нити влево синтезируется небольшой РНК-тран-
скрипт длиной 91 нуклеотид, комплементарный правонаправленному
транскрипту вблизи его 5'-конца. Генетический анализ, проведенный с
использованием различных плазмидных конструкций, позволил уста-
новить, что избыток левонаправленной Р Н К приводит к ингибированию
in trans экспрессии г ер А 7-гена, обеспечивая тем самым подавление
репликации плазмиды NR1, а точкой ее приложения является компле-
ментарный участок правонаправленной м Р Н К . Аналогичным способом
взаимодействия комплементарных РНК-противотранскриптов контроли-
руется также копийность плазмиды рТ181 Staph, aureus [9], сходные
черты имеет и механизм регуляции синтеза Q-белка — антитермина-
тора, необходимого для экспрессии поздних генов фага λ [10]. Обсуж-
дается регуляторная роль сателлитной Р Н К вируса огуречной мозаики
[11], которая, обладая участком комплементарности с геномной Р Н К
этого вируса, может оказывать влияние на экспрессию гена белка обо-
лочки. Показано [12], что по механизму взаимодействия комплементар-
ных последовательностей регулируется и эффективность трансляции
м Р Н К зеина, в молекуле которой на 5'- и З'-концах имеются инвертиро-
ванные повторы. Спаривание комплементарных участков концевых пов-
торов ведет к блоку трансляции собственной мРНК-
Данные о возможности использования а с Р Н К в эукариотической
системе впервые были представлены [13] на примере экспрессии тими-
динкиназного (ТК) гена, здесь же транскрипты с незначащей цепи
ТК-гена впервые были названы антисмысловыми Р Н К . Из плазмиды
рТК102, включающей функционально активный ген ТК вируса герпеса,
был выделен фрагмент его структурной части длиной 1364 п. о., начи-
ная с 51-го нуклеотида в З '-направлении от АУГ-кодона, и повторно
встроен в плазмиду в обратной ориентации. При совместной микро-
инъекции в ядра Т К - мышиных L-клеток плазмиды, несущей ТК-ген, и
плазмиды с его копией в ас-ориентации в соотношении 1 : 100 частота
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 5
появления ТК+-клеток снижалась в 4—5 раз в сравнении с клетками,
где вместо ас-плазмиды вводили такое же избыточное количество дру-
гой плазмиды, не имевшей анти-ТК-последовательностей. Обнаружен-
ный эффект проявлялся при наличии специфических последовательнос-
тей, так как плазмиды, несущие герпетический анти-ТК-ген, не влияли
на экспрессию ТК-гена цыпленка. И наоборот, анти-ТК-последователь-
ность к ТК-гену цыпленка ингибировала экспрессию ТК цыпленка, но
не вируса герпеса.
Что касается механизма ингибирования экспрессии ТК-гена, то в
цитируемой работе ставится больше вопросов, чем дается на них
ответов. Так, отмечается, что в клеточных линиях, трансформирован-
ных плазмидами с анти-ТК-последовательностями, а с Р Н К содержится
в малых количествах сравнительно с большим количеством интегриро-
ванных анти-ТК-плазмид. Поэтому неясным остается вопрос о стабиль-
ности как асРНК, так и вероятных дуплексов а с Р Н К : мРНК. Ничего
нельзя сказать также ни о локализации, ни о молекулярных механиз-
мах феномена ингибирования. Авторы подчеркивают, что представлен-
ные ими данные не дают возможности разграничить этапы, на которых
осуществляется ингибирование, — происходит ли быстрая деградация
м Р Н К в ядре, нарушается ли ее транспорт в цитоплазму, либо блоки-
руется трансляция. Если основные события происходят на уровне
трансляции, то также ничего нельзя сказать о том, блокируется ли акт
связывания рибосом, процесс инициации или элонгации полипептид-
ной цепи.
Дальнейшее развитие исследований отражено в последней работе
тех же авторов [14], где использованы различные гены и подходы к
их ас-ингибированию. Была сконструирована плазмида, обеспечиваю-
щая наработку ас-транскриптов, комплементарных 5'-концу м Р Н К
ТК-гена вируса герпеса и перекрывающих 80 оснований нетранслируе-
мой и 343 основания его структурной областей. Микроинъекция
200-кратного избытка такой 5'-ТК-ас-плазмиды совместно с нормаль-
ной ТК-плазмидой в ядра L-клеток обеспечивала более существенное
снижение частоты появления ТК+-клеток, чем при использовании плаз-
миды, содержащей ас-последовательности, комплементарные только
структурной части ТК-гена [13].
Д л я определения минимальной длины участка комплементарности
между а с Р Н К и мРНК, достаточной для проявления эффекта ингибиро-
вания гена, создана остроумная конструкция, в которой участок, со-
держащий промоторную последовательность и 52 п. о. 5'-нетранслируе-
мой области ТК-гена герпесвируса, был лигирован со структурным ге-
ном ТК цыпленка [14]. Эта химерная конструкция при микроинъекции
в ядра L-клеток обеспечивала нормальную экспрессию ТК цыпленка.
Однако при совместной инъекции этой плазмиды с избытком герпети-
ческой 5'-ТК-ас-плазмиды наблюдали почти полное подавление экспрес-
сии ТК-гена цыпленка. Отмечается, что в данном случае, когда участок
комплементарности составлял 52 нуклеотида в б'-направлении от
АУГ-кодона мРНК, ингибиторный эффект был существенно выше, чем
в экспериментах [13], где использовали ас-вектор, перекрывающий
структурный домен ТК-гена.
В работе [14] аналогичные плазмидные конструкции вместо инъек-
ций вводили в клетки методом трансфекции. При этом ингибирование
экспрессии ТК-гена достигало 20-кратного уровня с введением 10—100-
кратного избытка ас-плазмид, однако при соотношении плазмид 1 : 1
воспроизводимого ингибирования не наблюдалось. На клетках, предва-
рительно трансформированных в ТК+-фенотип, показана возможность
ингибирования также эндогенного герпетического ТК-гена с помощью
зоследующей трансфекции ас-плазмидой. Мышиные L-клетки, тран-
сформированные плазмидой, содержащей ас-фрагмент гена хлорамфе-
никол-ацетилтрансферазы (ХАТ-ген), имели около 20 копий асХАТ-гена
на клетку и конститутивно продуцировали до 500 копий асРНК, что
создавало подобие «молекулярного иммунитета» к последующей эк-
6 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 6
спрессии экзогенного ХАТ-гена. Действительно, при трансфекции таких
клеток ХАТ-плазмидами наблюдалось полное ингибирование синтеза
этого фермента.
Пожалуй, наиболее замечательным результатом цитируемой рабо-
ты [14] является доказательство возможности ингибирования с по-
мощью а с Р Н К экспрессии нормального клеточного гена. При введении
в клетки вектора, способного продуцировать асРНК к гену цитоплаз-
матического β-актина, происходило подавление синтеза этого белка,
что проявлялось в замедлении роста клеток и снижении количества
микрофибриллярных актиновых структур. Разрушение актиновых жгу-
тов в клетках было отмечено и при введении кэпированной актиновой
асРНК, наработанной in vitro на 5'-фрагменте актинового гена длиной
500 п. о. Здесь также была доказана высокая специфичность действия
ас-транскриптов, ибо инъекция в клетки ТК асРНК на синтез актина
влияния не оказывала. Авторы подчеркивают, что наблюдаемые фено-
типические изменения в микроинъецированных клетках свидетельству-
ют о том, что любые механизмы обратной связи, призванные обеспечить
поддержание необходимого уровня актинового пула, не способны ком-
пенсировать снижение содержания актина, обусловленное воздействием
асРНК.
Вопрос о возможности регуляции синтеза ас-транскриптов для ин-
гибирования определенного гена исследовали в той же работе с исполь-
зованием дексаметазон-индуцибельного промотора из LTR вируса мо-
лочной железы мышей, под контроль которого был встроен ТК-ген ви-
руса герпеса в ас-ориентации. Снижение в 5—10 раз ТК-активности в
клетках, трансформированных в ТК+-фенотип, после трансфекции ас-
плазмидой и обработки дексаметазоном авторы приводят как аргумент
в пользу того, что этот реактив может быть использован для регуля-
ции транскрипции а с Р Н К и, следовательно, индуцированного (управля-
емого) ингибирования генной активности. Для этой же цели пригоден,
по их мнению, и промотор гена теплового шока.
Действительно, использование набора генов теплового шока поз-
волило на культурах клеток дрозофилы разработать удобную модель
для изучения феномена ингибирования с помощью а с Р Н К [15]. При
температуре выше 30 °С эти клетки продуцируют шесть белков тепло-
вого шока, которые названы hsp83, hsp70, hsp28, hsp26, hsp23 и hsp22
соответственно их молекулярной массе. Гены этих белков не поддают-
ся классическому генетическому анализу ввиду трудности получения
мутаций генов, экспрессия которых находится в зависимости от регу-
ляторной функции ряда генов развития.
Поэтому осуществление ас-ингибирования данных генов могло бы
открыть новый подход для генетических исследований в подобных си-
стемах. Целью воздействия в данной работе была выбрана м Р Н К бел-
ка hsp26.
Д л я получения ас-транскриптов была создана плазмидная кон-
струкция pDM402y содержащая обратно ориентированный фрагмент
гена hsp26 длиной 682 п. о., кодирующий первые 155 аминокислот и
весь лидерный участок, кроме первых шести нуклеотидов. Транскрип-
ция данного фрагмента находилась под контролем промотора hsp70—
наиболее сильного из термоиндуцибельных промоторов клеток дрозо-
филы. При трансфекции клеток плазмидой pDM402 совместно с плаз-
мидой pHGCO (в соотношении 1 : 1 ) , несущей ген дигидрофолатредук-
тазы (ДГФР) Е. coli, у клонов, устойчивых к метотрексату, наблюдали
стабильную интеграцию pDM402 в клеточные хромосомы. Термоиндук-
ция трансформированных клеток приводила к подавлению синтеза бел-
ка hsp26 на 11—44% в зависимости от количества интегрированных
копий ас-плазмиды на клетку (от 50 до 1000), но ингибирование ни-
когда не было полным, однако было высокоспецифичным, так как син-
тез остальных белков теплового шока протекал обычно. Интересно, что
асРНК к гену hsp26 содержала участок длиной 210 оснований, комп-
лементарный м Р Н К hsp28, однако экспрессия последней протекала
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 7
нормально. Участок гомологии этой м Р Н К соответствовал белоккоди-
рующей части и составлял 72 %.
В цитируемом выше сообщении [14] ас-ингибирование обеспечивал
участок гомологии длиной 52 п. о., ниже будут рассмотрены работы
[24—26], где существенный эффект достигался наличием гомологичных
участков длиной около 80 оснований. Обсуждая различие эксперимен-
тальных данных, авторы [15] предполагают, что ингибиторное дейст-
вие а с Р Н К обеспечивается, по-видимому, не только наличием гомоло-
гичных участков в соответствующей мРНК, но также и какими-то други-
ми факторами. Но в любом случае подход, основанный на применении
асРНК, является высокоспецифичным, благодаря чему может быть ис-
пользован для подавления любого гена, а промотор гена теплового
шока, например промотор hsp70, обладая рядом присущих ему свойств,
вполне подходит для изучения функций генов, делеционные мутации
которых по каким-либо причинам получить невозможно.
В недавней работе [16] также использовали плазмиды, содержа-
щие различные фрагменты герпетического ТК-гена. Плазмида одного
варианта ( p M D K T l ) содержала фрагмент длиной 1100 п. о., включаю-
щий 53 п. о. 5'-нетранслируемой области ТК м Р Н К и всю кодирующую
область, за исключением последних 23 п. о., кодирующих карбоксиль-
ный конец полип ептидной цепи. Плазмида pMDKT2 включала 5'-фраг-
мент длиной 301 п. о. (сегмент А) и 225 п. о. З'-конца ТК-гена (сегмент
С), pMDKT3 — только сегмент С. При трансфекции ТК + L-клеток плаз-
миды, содержащие сегменты А и С или только С, обеспечивали нара-
ботку в клетках асРНК в количестве (5—10) · 103 молекул на клетку,
что в 300 раз превышало уровень содержавшихся в них молекул ТК
мРНК. В этих же клонах происходило и подавление на 80—90 %
ТК-активности, однако в клетках, трансформированных плазмидой
pMDKTl, содержащей почти всю ас-последовательность ТК-гена, высо-
кого уровня синтеза асРНК и ингибирования ТК-активности не наблю-
далось. Вопрос о том, почему конструкции, содержащие более короткие
вставки ТК-гена, эффективнее транскрибировали асРНК, остается пока
без ответа. Кроме того, не было выявлено разницы в активности ас-
транскриптов, комплементарных 5'- и З'-участкам м Р Н К ТК-гена. Из
представленных данных следует, что наличие в молекуле асРНК-после-
довательностей, комплементарных 5'-участку мРНК, не является обя-
зательным условием их ингибиторной активности, ибо 225 п. о., комп-
лементарных З'-участку мРНК, кодирующему С-конец белка, оказалось
достаточно для подавления ее экспрессии.
В плане выяснения механизма ингибиторного действия асРНК бы-
ло исследовано содержание Р Н К : РНК-дуплексов в изучаемых клетках.
Оказалось, что 95 % двунитевых РНК, имевших ТК-последовательно-
сти, содержалось в ядре, а длина дуплексных участков, защищенных
от нуклеазного расщепления, составляла 225 п. о., т. е. ровно столько,
сколько п. о. содержится в С-сегменте асРНК. Поскольку в исходных
ТК + L-клетках вся ТК м Р Н К обнаруживалась в цитоплазме, а в клет-
ках, продуцирующих ас-транскрипты, ТК-последовательности содержа-
лись преимущественно в ядре, предполагается, что снижение ТК-актив-
ности обусловлено нарушением транспорта ТК м Р Н К в цитоплазму, где
она может быть транслирована.
Активность искусственно синтезированных асРНК в регулирова-
нии экспрессии генов ХАТ и герпетической ТК изучали также на ооци-
тах лягушки [17]. Инъекция в цитоплазму ооцитов 10-кратного избытка
асРНК ХАТ или ТК обеспечивала в разных экспериментах от 8- до 80-
кратного подавления экспрессии соответствующих мРНК, введенных в
ооциты спустя 5—6 ч после введения асРНК. Ингибиторное действие
асРНК проявлялось только по отношению к гомологичной м Р Н К и не
влияло на экспрессию эндогенных белков ооцитов. однако а с Р Н К по-
давляли эндогенную экспрессию соответствующих генов, введенных в
ядра ооцитов в составе плазмид. В последнем случае отмечена резкая
неоднозначность эффекта в четырех разных экспериментах: степень ин-
8 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 8
гибирования плазмидного ХАТ-гена составляла 5, 8, 30 и 140-кратные
значения в сравнении с контролем, где вместо ХАТ а с Р Н К вводили ТК
а с Р Н К . Объяснения столь выраженной вариабельности авторы не на-
ходят, однако предполагают, что наряду с блоком трансляции в цито-
плазме а с Р Н К могут в каких-то случаях проникать и в ядро и там ин-
гибировать некоторые стадии процессинга Р Н К .
В цитируемой работе отмечена также зависимость ингибиторной
активности а с Р Н К от длины транскриптов. Так, если а с Р Н К соответ-
ствовала полной длине ХАТ-гена, степень ингибирования достигала
10-кратного уровня. Молекулы, укороченные до 154 нуклеотидов, комп-
лементарных 5'-концу м Р Н К , включая АУГ-кодон и 37 кодонов струк-
турной последовательности, обеспечивали только трехкратное ингиби-
рование экспрессии ХАТ-гена. Такой же уровень ингибирования заре-
гистрирован и при использовании асРНК, комплементарных З'-концам
м Р Н К обоих изучаемых генов.
На той же экспериментальной модели показано подавление эк-
спрессии м Р Н К β-глобина под влиянием глобиновой а с Р Н К [18]. Блок
трансляции имел четко выраженные черты специфичности, ибо введение
в ооциты только а с Р Н К β-глобина не влияло на общий белковый син-
тез, а предварительное введение гистоновой а с Р Н К не сказывалось на
экспрессии м Р Н К глобина. Кроме того, ни а с Р Н К глобина, ни а с Р Н К
гистона не влияли на трансляцию в ооцитах м Р Н К β-интерферона че-
ловека.
Блок трансляции глобиновых м Р Н К объясняется образованием
дуплексов а с Р Н К : м Р Н К , что подтверждено экспериментально. Мече-
ная глобиновая м Р Н К после инъекции в ооциты, последующего выде-
ления и обработки РНКазой полностью деградировала. Однако в пре-
паратах, выделенных через 5 ч после инъекции в ооциты а с Р Н К и
м Р Н К , обнаруживали материал, устойчивый к РНКазной обработке.
Длина защищенных дуплексов составляла примерно 220 п. о., такие же
дуплексы были получены и при гибридизации этих Р Н К in vitro. Обра-
зование дуплексов зависит от времени, ибо в препаратах, выделенных
сразу после инъекции, молекул, защищенных от РНКазной обработки,
обнаружено не было.
Эффект ингибирования трансляции в данной работе обеспечивали
только а с Р Н К , комплементарные 5'-концу м Р Н К глобина, причем рав-
ноэффективными были как более протяженные ас-транскрипты, охваты-
вающие некодирующую и часть структурной области м Р Н К , так и ко-
роткие, перекрывающие всего 45 нуклеотидов 5'-участка, не доходя
двух оснований до АУГ-кодона. Транскрипты, комплементарные З'-кон-
цу м Р Н К , на синтез глобинового белка влияния не оказывали. Полу-
ченные данные привели авторов к выводу, что ингибиторный эффект
а с Р Н К реализуется на стадии инициации, но не элонгации синтеза по-
липептидной цепи.
Возможность регуляции экспрессии генов in vivo с помощью экзо-
генных а с Р Н К изучали на эмбрионах дрозофилы [19, 20], где мишенью
воздействия был избран Кгирре1-ген (Кr), который выполняет раннюю
зиготную функцию в контролировании сегментации эмбрионов, Kг-ген
удобен для использования в подобной работе тем, что его транскрип-
ция происходит на определенной стадии развития эмбрионов. Это
приводит к накоплению в них специфических поли(А)+ РНК-транскрип-
тов длиной 2500 оснований. Транскрипты переводили в к Д Н К копии и
затем клонировали в плазмиде в обеих ориентациях по отношению к
Sp6-промотору. Использованный подход позволил получать in vitro
в одном случае Кr м Р Н К , в другом — Кг а сРНК. Щелочным гид-
ролизом получали фрагменты а с Р Н К длиной 120—130 оснований, и
этот материал использовали для инъекции эмбрионов. У эмбрионов
дикого типа, инъецированных на стадии синцитиальной бластодермы
(в момент включения Kr-гена) препаратом асРНК, с высокой часто-
той развивались летальные /О-фенокопии, введение же Кr м Р Н К не
оказывало на эмбрионы никакого специфического эффекта. Обращает
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 9
на себя внимание количество вводимого материала. Получение эффекта
в 5 0 % случаев достигалось введением в эмбрионы 5*108 фрагменти-
рованных асРНК-транскриптов, что на три порядка превышает количе-
ство Kr-молекул м Р Н К , содержащихся в эмбрионах дрозофилы дикого
типа. В работах не представлена количественная оценка эффективного
отношения in vivo а с Р Н К к эндогенному мРНК-транскрипту ввиду
отсутствия данных о стабильности асРНК, а т акже о кинетических па-
раметрах образования in vivo дуплексов Р Н К : Р Н К . Отмечается, одна-
ко, что, по-видимому, большинство вводимых незащищенных молекул
а с Р Н К быстро деградирует.
Блок экспрессии специфических генов с помощью эндогенно синте-
зируемых а с Р Н К позволил получить фенокопии мутантов плесневого
гриба Dictyostelium, дефектных по синтезу белка дискоидина I [21].
Участок гена дискоидина I длиной 320 п. о. был вырезан на удалении
120 п. о. от АУГ-кодона в сторону З'-конца м Р Н К и повторно встроен
в ту ж е плазмиду, но в обратной ориентации. Оставшаяся З'-область
гена была делетирована. В клетках, трансформированных такой плаз-
мидной конструкцией, наблюдалось снижение более чем на 90 % уров-
ня накопления дискоидина и его м Р Н К . Показано, что в этих клетках
транскрипция как м Р Н К дискоидина, так и а с Р Н К происходит нор-
мально, т. е. механизм ингибирования не связан с конкуренцией за
факторы транскрипции. Поскольку в цитоплазме ас-транскриптов ав-
торам выявить не удалось, считается, что процесс образования гибри-
дов м Р Н К : а с Р Н К происходит в ядре, а сформировавшиеся дуплексы
подвергаются быстрой деградации.
Замечательным примером обнаружения и дальнейшей эксперимен-
тальной проверки существующего в природе механизма регуляции ген-
ной экспрессии с помощью а с Р Н К являются работы [22—27], прове-
денные на Е. coli при изучении регуляции синтеза белков наружной
мембраны. Эти белки — OmpF и ОтрС — функционируют в качестве
пор, через которые происходит диффузия малых гидрофильных молекул,
и кодируются структурными генами ompF и отрС, а их экспрессия ре-
гулируется уровнем осмотического давления питательной среды. Повы-
шение последнего приводит к снижению продукции OmpF с одновре-
менным увеличением продукции ОтрС, что обеспечивает постоянное
суммарное количество этих белков. Сиквенс этих генов [22—24] позво-
лил выявить уникальный механизм регуляции генной экспрессии, опо-
средованный новой разновидностью Р Н К , которая была названа
micRNA (mRNA-inter fer ing complementary RNA). Обнаруженная Р Н К
длиной 174 нуклеотида кодируется независимой транскрипционной еди-
ницей, названной micF-геном, который расположен в б '-направлении от
гена отрС, но транскрибируется в обратном направлении. Было пока-
зано [25, 26], что этот РНК-транскрипт содержит участок длиной около
80 оснований, комплементарный 5'-концу м Р Н К белка OmpF в районе,
охватывающем последовательность Шайн-Дальгарно и АУГ-кодон. По
предположениям авторов, эта Р Н К , гибридизуясь с OmpF м Р Н К , бло-
кирует ее трансляцию, т. е. является антисмысловой Р Н К по отноше-
нию к м Р Н К белка OmpF. Продукция этой Р Н К осуществляется про-
порционально продукции м Р Н К белка ОтрС, поэтому параллельно уси-
лению его синтеза происходит нарастание транскрипции асРНК, спо-
собной блокировать экспрессию белка OmpF. В этом состоит механизм
поддержания постоянства суммарного количества белков OmpF и
ОтрС.
В предварительных исследованиях экспериментально была доказа-
на принципиальная возможность ингибирования экспрессии белка
OmpF с помощью а с Р Н К [26]. Д л я этого участок гена отрС длиной
около 300 п. о. был вырезан выше промотора, сшит с геном β-галакто-
зидазы и встроен в плазмиду. В клетках, трансформированных такой
плазмидой, при воздействии изопропил-р-О-тиогалактозидом (ИПТГ) —
индуктором лактозного оперона — наблюдали почти полное подавление
синтеза белка OmpF. В препаратах Р Н К , выделенных из таких кле-
ю БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 8
ток, были обнаружены молекулы около 6S, которые гибридизовались с
встроенными в плазмиду ДНК-фрагментами гена отрС, в контрольных
клетках подобной Р Н К выявлено не было. Кроме того, было показано,
что в клетках, несущих плазмиду с информацией для а с Р Н К , содержит-
ся существенно меньшее количество м Р Н К белка OtnpF. Когда вместо
участка гена отрС встраивали последовательность длиной 430 п. о. из
аналогичной области гена ompF, ингибирующего эффекта не наблюда-
лось. То есть здесь также продемонстрирована специфичность действия
асРНК, которая определяется нуклеотидной последовательностью и ре-
ализуется только на м Р Н К , содержащих комплементарные участки.
Обнаружение у прокариот асРНК-регуляторной системы побудило
исследователей опробовать привлекательную возможность подавления
экспрессии определенных (или любых) генов с помощью искусственно
созданных конструкций, продуцирующих а с Р Н К , комплементарные вы-
бранным генам [27]. Р я д таких генов составляли м Р Н К белков наруж-
ной мембраны Е. coli: липопротеина (Ірр), отрА и отрС. С этой целью
были сконструированы плазмиды, несущие ДНК-фрагменты указанных
генов, встроенных в количестве одной — трех копий в обратной ориен-
тации под контроль промотора лактозного оперона. Индукция таких
плазмид с помощью И П Т Г стимулировала синтез в клетках а с Р Н К -
транскриптов, комплементарных м Р Н К соответствующих белков.
Ac-фрагмент гена 1рр содержал 112 п. о., соответствующих б'-кон-
цу м Р Н К и охватывающих последовательность Шайн—Дальгарно и
участок, кодирующий первые 29 аминокислот с N-конца липопротеина.
Клетки, несущие такую плазмиду, после индукции И П Т Г синтезировали
в 16 раз меньше белка, чем контрольные клетки, не имевшие ее либо
содержавшие исходную плазмиду без вставки ас-фрагмента. В клетках,
содержавших плазмиду с двумя копиями ас-гена 1рру продукция липо-
протеина снижалась в 31 раз.
Сходные результаты были получены авторами и на клетках, тран-
сформированных плазмидой, несущей ас-фрагмент ompC-гена. Среди
вариантов этой плазмиды были конструкции, содержащие по 100 п. о.,
комплементарных кодирующему б'-участку м Р Н К отрС, а из некодиру-
ющего (в б '-направлении от А У Г - к о д о н а ) — о д н и содержали 20, дру-
г и е — 72 п. о. Оказалось, что более длинные ас-транскрипты эффектив-
нее ингибируют экспрессию гена-мишени. Увеличение числа копий
ас-гена отрС, как и в опытах с lрр-геном, усиливает эффект ингибиро-
вания. Интересно, что плазмиды с ас-1рр и ас -отрС перекрестно инги-
бировали экспрессию как «своего», так и «чужого» белка. Оказалось,
что м Р Н К для 1рр и ОтрС имеют неожиданно высокую степень гомо-
логии б'-концов, что объясняет перекрестную активность соответствую-
щих а с Р Н К , а т акже подтверждает зависящую от последовательности
специфичность их действия.
Д л я решения вопроса о том, какой из фрагментов а с Р Н К способен
обеспечить наиболее выраженный эффект подавления экспрессии соот-
ветствующей м Р Н К , был сконструирован ряд плазмид, несущих
ас-вставки, комплементарные различным участкам м Р Н К белка ОтрА.
Результаты экспериментов показали, что гибридизация а с Р Н К с сайтом
инициации белкового синтеза и/или с 5'-лидерным участком м Р Н К бел-
ка ОтрА не имеет решающего значения для проявления ее ингибирую-
щей активности. Так, фрагмент длиной 185 п. о., комплементарный
только структурной части гена отрА, по активности д а ж е несколько
превосходил фрагмент длиной 258 п. о., содержащий как структурную
часть этого гена, так и участок связывания с рибосомой. Не существен-
на как будто и длина ас-фрагментов, ибо вставки длиной 258 и 73 п. о.
были равны по эффективности ингибирования продукции клетками бел-
ка А в отличие от гена отрС, где длина ас-транскриптов играла важ-
ную роль.
С другой стороны, на примере липопротеина была обнаружена
иная закономерность. Д в е плазмиды со вставками ас-фрагментов, комп-
лементарных участкам 1рр м Р Н К , кодирующим аминокислотные остат-
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 11
ки с 3-го по 29-й и с 43-го по 63-й, обеспечивали только двукратное
снижение синтеза продукта, в то время как фрагменты, перекрывающие
сайт инициации трансляции мРНК, приводили к 16-кратному подавле-
нию продукции липопротеина. То есть в данном случае наибольший
эффект ингибирования прямо зависел от наличия в составе а с Р Н К по-
следовательности, перекрывающей участок связывания с рибосомой.
Как нетрудно заметить, в работе [27] наряду с убедительными фак-
тами о высокой активности асРНК имеются свидетельства об умерен-
ной эффективности их действия. А именно, на примере гена 1рр наб-
людали снижение синтеза продукта в 16 раз, а экспрессия гена отрА
подавлялась максимально только на 54 %. Плазмиды, содержащие две
копии асРНК /рр-гена снижали экспрессию липопротеина в 31 раз, а
двойной набор ас-генов отрА — только на 69 %. То есть возможности
ингибирования разных генов с помощью асРНК-транскриптов сильно
различаются. В обеспечении ингибиторной активности асРНК авторы
цитируемой работы придают значение вторичной структуре этих моле-
кул в виде двух стебле-петлевых образований. Однако конкретная их
функция пока не выяснена.
Возможность использования асРНК, которую авторы, как и в преж-
них работах [25—27], именуют micRNA, для подавления репродукции
вирусов была реализована в исследовании [28], где в качестве объекта
служил колифаг SP — плюс-геномный вирус, содержащий однонитевую
РНК, кодирующую четыре вирусных белка. В качестве мишеней были
избраны гены белка оболочки и репликазы. Фрагменты А и В этих ге-
нов длиной 247 и 159 п. о. соответственно охватывали участок, вклю-
чающий последовательность Шайн — Дальгарно и инициирующий ко-
дон. Третий, С-фрагмент, представлял собой З'-концевой участок гено-
ма, кодирующий С-конец репликазы. Названные фрагменты в виде
к Д Н К были встроены в ас-ориентации в плазмиду pIDC404 под конт-
роль лактозного промотора-оператора. Рекомбинантные плазмиды со-
держали различные варианты вставок: рМІС-А, рМІС-В и рМІС-С, не-
сущие фрагменты А, В и С соответственно, а также рМІС-А : А,
рМІС-к : В и рМІС-А : В : С, содержащие различные комбинации фраг-
ментов в одной плазмиде.
Исследования показали, что в трансформированных плазмидами
клетках, обработанных перед инфицированием ИПТГ, происходит по-
давление репродукции фага SP. Наиболее выраженный эффект (95 %-
ное ингибирование) наблюдался на клетках, несущих плазмиду рМІС-
А : В : С. Ингибиторный эффект плазмид pMIC-A : А и рМІС-к : В со-
ставлял 91 %, а единичные копии фрагментов А, В и С обеспечивали
эффект подавления на 61, 64 и 38 % соответственно. Полученные дан-
ные свидетельствуют, что существенной активностью обладают асРНК,
имеющие последовательности, комплементарные м Р Н К в участке,
охватывающем последовательность Шайн — Дальгарно и инициирую-
щий кодон.
Механизм ингибиторного действия асРНК, по крайней мере частич-
но, объясняется подавлением синтеза белка, что было показано по
снижению включения метки. Заслуживает, однако, внимания то обстоя-
тельство, что эффект подавления репродукции фага вызывал С-фраг-
мент, не имеющий последовательности, перекрывающей участок связы-
вания с рибосомой и АУГ-кодон. Обсуждая данный факт, авторы пред-
полагают, что эта а с Р Н К может препятствовать репликазе в процессе
транскрипции плюс-нити геномной Р Н К в минус-нить образованием
гибрида на З'-конце фагового генома. Если ингибиторные свойства
а с Р Н К могут проявляться и на этапе транскрипции, то поиск стратеги-
чески важных геномных «мишеней» может открыть заманчивую пер-
спективу воздействия на этот процесс хотя бы применительно к виру-
сам с однонитевым геномом.
Систему регуляции с помощью асРНК в качестве инструмента про-
тивовирусной защиты авторы называют «новой иммунной системой».
Не вдаваясь в сравнения и поиски аналогий в устоявшихся представле-
12 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 13* 12
ниях об иммунитете, можно согласиться с тем, что, если иммунная си-
стема на уровне полинуклеотидных макромолекул и не существует в
природе, ее можно искусственно сконструировать и привести в дейст-
вие. Самым убедительным аргументом в пользу обсуждаемого явления
как иммунной системы служит факт высокой специфичности действия
асРНК: они регулируют функцию только тех молекул, которые содер-
жат комплементарные им последовательности, что является важным
свойством в применении их для контроля вирусных инфекций или эк-
спрессии определенных генов.
Если для прокариот наличие механизма генной регуляции с учас-
тием асРНК является установленным фактом, то на эукариотах доказа-
тельной информации на этот счет пока не получено, хотя имеются не-
которые сведения, позволяющие предположить наличие подобного меха-
низма и у высших организмов. Так, в пользу его существования у эука-
риот свидетельствуют данные [29], полученные в процессе изучения
транскрипции гена Д Г Ф Р в мышиных клетках. Синтез этого фермента
строго регулируется в процессе клеточного цикла и его резкое воз-
растание на определенной стадии развития клеток происходит бла-
годаря усилению транскрипции с конститутивного промотора. Однако
механизм, регулирующий пиковое повышение и снижение интенсивности
транскрипции гена ДГФР, неизвестен. Проведенные исследования пока-
зали, что процесс транскрипции Д Г Ф Р сопровождается появлением в
ядре серии поли (А)" РНК-транскриптов длиной 180—240 п. о., которые
синтезируются в обратном направлении на нити Д Н К , противополож-
ной гену Д Г Ф Р .
Авторы не имеют оснований утверждать, есть ли у обнаруженных
небольших Р Н К какое-либо функциональное назначение или они пред-
ставляют собой случайные транскрипты, синтез которых идет с необыч-
ного промоторного участка, однако приводят ряд экспериментальных и
логических доводов в пользу того, что их происхождение не связано с
деградацией продуктов сплайсинга. Поскольку эти РНК-транскрипты
имеют последовательность, комплементарную 10 нуклеотидам м Р Н К
Д Г Ф Р в участке, прилежащем к стоп-кодону транскрипции, высказыва-
ется предположение, что спаривание комплементарных последователь-
ностей этих транскриптов может оказывать регуляторное влияние на
функционирование гена ДГФР. Следует отметить, что м Р Н К Д Г Ф Р бы-
ла обнаружена как в ядре, так и в цитоплазме, в то время как малень-
кие поли (А)~ РНК-транскрипты — только в ядре.
В контексте данного обзора обсуждаемые маленькие Р Н К вряд ли
можно рассматривать как ас-ингибиторы трансляции мРНК. Их регуля-
торная роль, если она существует, вероятнее может касаться уровня
транскрипции, возможность чего была показана на вирусной мо-
дели [28].
Возможность создания искусственной системы антикомплементар-
ной регуляции экспрессии специфических транскриптов изучали также
с использованием lacZ-гена Е. coli как в про- [30, 31], так и эукариоти-
ческой системах [32]. Фрагмент этого гена, кодирующий N-конец β-га-
лактозидазы, начиная с 6-й аминокислоты, длиной с 19-го по 440-й
нуклеотид, встраивали в плазмиду в ас-ориентации под контроль про-
мотора PL фага λ [30]. Регуляция продукции а с Р Н К обеспечивалась
другой плазмидой, синтезирующей термолабильный репрессор, который
при 30 °С выключает синтез lacZ ас-транскрипта связыванием λ-опера-
тора. При 42 °С репрессор инактивируется, что ведет к запуску тран-
скрипции асРНК. Исследование проводили на клетках Е. coli, несущих
плазмиду pRC23 с встроенным лактозным опероном. Под влиянием
ИПТГ при 42 °С в клетках происходило быстрое нарастание синтеза
β-галактозидазы. Однако при наличии в клетках плазмиды, несущей
анти-/ас2-последовательности, при тех же условиях синтез фермента
подавлялся на 98 %. Более того, синтез тиогалактозид-трансацетилазы
и лактозной пермеазы тоже снижался на 80 и 55 % соответственно. Все
три фермента синтезируются на одной полицистронной мРНК, причем
Б И О П О Л И М Е Р Ы II КЛЕТКА, 1987, т. 3, № l· 3 — 6-837 13
трансляция начинается с цистрона β-галактозидазы. Дистальнее рас-
положены области для трансацетилазы и пермеазы. Интересно, что чем
дальше на полицистронной матрице расположены участки инициации
трансляции соответствующих ферментов, тем менее чувствителен их
синтез К ингибирующему влиянию асРНК. Авторы рассматриваемой ра-
боты объясняют это тем, что в клетке может происходить реинициация
трансляции на соответствующих АУГ-кодонах, в то время как трансля-
ция β-галактозидазы, последовательности которой в м Р Н К блокирова-
ны комплементарным ас-транскриптом, подавляется почти полностью.
Специфичность ингибиторного эффекта а с Р Н К по отношению к опре-
деленной первичной структуре подтверждается тем, что в использован-
ной системе на уровень синтеза щелочной фосфатазы, транслируемой
на другой м Р Н К , анти-/ас2-конструкции влияния не оказывали.
Зависимость ингибиторного эффекта ас-транскриптов от длины их
молекул изучали в другой работе [31] на модели того ж е гена. Экспе-
риментальная система включала ряд плазмид, содержащих разные уча-
стки кодирующей области ZacZ-гена £ . coli, встроенные в ас-ориента-
ции под контроль оператора и промотора фага λ. Регуляция продук-
ции а с Р Н К , как и в предыдущей работе [30], обеспечивалась другой
плазмидой, синтезирующей термолабильный репрессор.
Плазмида pRK6 содержала вставку длиной 2990 п. о., комплемен-
тарную почти всей кодирующей области /acZ-гена, за исключением
22 п. о., кодирующих N-конец фермента, и 48 п. о., кодирующих его
С-конец [31]. Плазмида pRK7 была получена из предыдущей и содер-
ж а л а 815 п. о. с N-кодирующего конца. Плазмида pRK8 включала толь-
ко 367 п. о. из участка плазмиды pRK6, кодирующего карбоксильный
конец полипептидной цепи. Эксперименты проводили на культуре Е. co-
li, содержащей плазмиду pRLC2833 со вставкой /acZ-гена.
В условиях, способствующих транскрипции м Р Н К фермента и его
а с Р Н К , в присутствии плазмиды pRK6 активность β-галактозидазы со-
ставляла 20 % уровня ее активности в контрольной культуре, не со-
держащей плазмиды с ас-информацией. В культурах, несущих плазми-
ды pRK7 и pRK8, эти показатели составляли 43 и 75 % соответственно.
При этом авторы особо отмечают, что, хотя копийность плазмид для
каждого из бактериальных штаммов была сравнима, они не могут ис-
ключить возможности того, что вариации в уровнях β-галактозида-
зы для каждого из четырех штаммов объясняются, по крайней мере
частично, различиями в количестве плазмидных копий среди этих
штаммов.
Полученные результаты свидетельствуют, что более длинные ас-
транскрипты эффективнее блокируют синтез β-галактозидазы, хотя
остается неясным, какие их участки в большей степени ответственны
за проявление ингибиторного эффекта. В большинстве исследований по
ас-ингибированию непременное условие эффекта составляло наличие
комплементарности а с Р Н К участку связывания с рибосомой мРНК-ми-
шени. В данной же работе ни один из трех ас-транскриптов не содер-
ж а л такого участка, поэтому механизм их ингибиторного действия
объясняется не предотвращением связывания м Р Н К с рибосомой, а
блокированием процесса элонгации полипептидной цепи как следствием
образования Р Н К : РНК-дуплекса .
Логика дискуссии подсказывает предположение, что, если бы ав-
торы сконструировали систему, продуцирующую асРНК, комплементар-
ную 5'-концу м Р Н К β-галактозидазы с перекрыванием последовательно-
сти Шайн — Дальгарно и инициирующего кодона, можно было бы ожи-
дать большего ингибирующего эффекта при меньшей длине ас-тран-
скрипта. Однако правомочность стратегии блока трансляции, основан-
ной на использовании асРНК, комплементарных 5'-концу определенной
м Р Н К , подвергается сомнению на том основании, что в случае поли-
цистронных матриц эффект ингибирования не будет распространяться
на рамки считывания, выходящие за пределы Р Н К : РНК-гибридных
участков. Данное обстоятельство, по мнению авторов, диктует необхо-
14 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 1 2 — 6-837 14
димость конструирования систем, продуцирующих протяженные ас-
транскрипты, комплементарные только кодирующим последователь-
ностям м Р Н К . Обсуждается и еще один аргумент в пользу более длин-
ных асРНК- Согласно одному из представлений о механизме действия
а с Р Н К , дуплексы последних с м Р Н К подвергаются быстрой деградации
в клетке, что предотвращает синтез полипептида. Отсюда более длин-
ные Р Н К : РНК-гибриды должны представлять собой более уязвимые
мишени для деградирующих ферментов, что обеспечит надежное инги-
бирование нежелательной экспрессии.
Возможность ас-регуляции lacZ-гена Е. coli была продемонстри-
рована также в клетках эукариот [32]. Из гибридной плазмиды
pCH11O, содержащей ген β-галактозидазы, был выделен его Б'-фраг-
мент длиной 2566 п. о., включая инициирующий кодон, и встроен в ту
же плазмиду в обратной ориентации. При последующей совместной
трансфекции (в соотношении 1 : 1 ) этими плазмидами культуры мы-
шиных фибробластов наблюдали 10-кратное снижение β-галактозидаз-
ной активности в сравнении с культурами, не имевшими плазмид с
ас-вставками. В отличие от других подобных исследований в данной
работе не отмечено усиления ингибирующего эффекта в ответ на уве-
личение числа вводимых ас-плазмид. При добавлении в трансфекцион-
ную смесь третьей плазмиды, содержащей ген фосфотрансферазы, на-
блюдалось ингибирование экспрессии только β-галактозидазного гена,
фосфотрансферазная активность оставалась неизменной, что пополняет
сведения о высокой специфичности действия асРНК.
Вряд ли правомочно сравнение результатов данной работы с ци-
тированной выше [31] ввиду большого различия клеток-хозяев, одна-
ко можно предположить, что более выраженный эффект ингибирования
того же гена [32] обусловлен наличием в ас-транскриптах 5'-области,
перекрывающей сайт инициации трансляции lacZ м Р Н К .
Таким образом, рассмотренные публикации свидетельствуют о том,
что в природе существует механизм регуляции генной экспрессии, ис-
полнительным звеном которого являются малые РНК-транскрипты,
комплементарные определенным м Р Н К , а данные экспериментов под-
тверждают возможность эффективного их использования в искусствен-
ных системах ингибирования экспрессии определенных генов.
Краткое заключение по рассмотренным публикациям можно изло-
жить в нескольких пунктах.
1. Основанное на спаривании комплементарных участков ингиби-
торное действие а с Р Н К носит характер высокой специфичности.
2. Высокая специфичность дает возможность выключать экспрес-
сию отдельных генов, что позволяет в принципе получать аналоги ген-
ных мутаций как у прокариот, так и у высших организмов.
3. Путем подбора подходящих промоторных последовательностей
возможно создание систем, продуцирующих ас-транскрипты как в кон-
ститутивном, так и индуцибельном, управляемом режиме.
4. Четкое ограничение области реального применения ас-регуляции
в настоящее время не представляется осуществимым, однако задачу
выведения сингенных животных (либо регенерации растений из про-
топластов), несущих в себе ас-систему «молекулярного иммунитетам
против неопределенно широкого круга вирусов, в свете существующих
данных уже сейчас можно рассматривать оптимистично.
5. Аппарат ас-ингибиторов применим также в изучении функций
неизвестных генов, репрессии «вредных», а также для регуляции генов,
определяющих дифференцировку и развитие.
6. Существующая пока неоднозначность в выборе конкретного
участка м Р Н К , определяющего наибольшую ее уязвимость для ингиби-
рования, диктует необходимость в каждом конкретном случае подби-
рать оптимальные детали ас-конструкции.
7. Основанные на экспериментальном материале, сформировались
представления о механизме ас-репрессии, которые в общем виде сво-
дятся к следующему. Образуя дуплексный гибрид с м Р Н К , а с Р Н К
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 13* 15
предотвращает ее транспорт в цитоплазму и дальнейшую трансляцию.
Альтернативно, дуплексы не в состоянии связаться с рибосомой, что
также исключает трансляцию. Обсуждается и возможность быстрой
деградации двунитевых гибридов в цитоплазме под действием нуклеаз.
Авторы цитированных в обзоре работ с разных позиций обсужда-
ют всевозможные детали предполагаемых механизмов ас-регуляции,
вопросы образования и стабильности Р Н К : РНК-дуплексов, смысл и
значение отмеченной в большинстве экспериментов остаточной актив-
ности репрессированных генов и другие аспекты проблемы. Разнообра-
зие эффектов и некоторая неоднозначность их толкований свидетель-
ствуют о недостатке фактического экспериментального материала для
четких и конкретных формулировок. Однако, судя по интенсивности
накопления новых публикаций, недостающие сведения по механизму
ас-репрессии вскоре будут получены.
A N T I S E N S E RNAS: A N O V E L M E C H A N I S M
FOR THE REGULATION OF G E N E E X P R E S S I O N
A. D. Shved, S. B. Zolotukhin, G. Kh. Matsuka
Ins t i tu te of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukra in ian SSR, Kiev
S u m пі a г у
The data on na tu ra l mechanisms for ant isense regu la t ion of gene expression are summa-
rized. The examples of exper imenta l ly tested regu la to ry activities of var ious ant i sense
RNAs arc also reviewed.
1. Simons R. W, Kleckner N. Transnational control of IS 10 t ransposi t ion/ /Cel l .—
1983.—34, N 3 . — P . 683—691.
2. Cesaritii G., Banner D. W. Regula t ion of plasmid copy number by complementary
RNAs / / T r e n d s Biochem. Sci.— 1985.—10, N 8 . — P . 303—306.
3. Inhibition of ColEI RNA primer fo rmat ion by a plasmid-specif ied smal l RNA /
J. I. Tomizawa, T. Itoh, G. Selzer, T. S o m / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.— 1981.—
78, N 3 — P . 1421 — 1425.
4. Toniizaua J.-I. Control of ColEI plasmid replication: initial in teract ion of RNAI and
the primer t ranscr ip t is reversible / / Cell.— 1985,—40, N 3 — P. 527—535.
5. Tomizava I.-I., Som T. Control of ColEI plasmid replication: enhancement of bin-
ding of RNAI to the primer t ranscr ip t by the Rom protein / / Ibid — 1984.—38, N 3 —
P. 871—878.,
6. Light /., Molin S. The sites of action of the two copy number control func t ions of
plasmid Rl / / М о ї . and Gen. Genet.— 1982,—187, N 3 . — P . 486—493.
7. Liqht I., Molin S. Pos t - t ranscr ip t iona l control of expression of the repA gene of plas-
mid Rl mediated by a small RNA m o l e c u l e / / E M B O J.— 1983.—2, N 1 ,—P. 93—98.
8. IncFll p lasmid incompatibi l i ty product and its t a rge t are both RNA t ranscr ip t s /
D. D. Womble, X. Dong, R. P. Wu et a l . / / J . Bacteriol .— 1984.—160, N 1 .—P. 28—
35.
9. Kumar С. C., Novick R. P. P lasmid pi 181 replication is regula ted by two counter-
t ranscr ip t s / / Proc. Nat . Acad. Sci. USA.— 1985.—82, N 3.— P. 638—642.
10. Hoones В. C., McClure W. R A ell-dependent promoter is located within the Q gene
of bac ter iophage λ / / I b id .—N 10 .—P. 3134—3138.
11. Rezaian Μ. Α., Symons R. H. Ant i -sense regions in satel l i te RNA of cucumber mo-
saic virus f rom s table complexes with the viral coat protein gene / / N u c l . Acids Res.—
1986,—14, N 8 , — P . 3229—3239.
12. Spena Α., Krause E., Dobberstein B. Translation efficiency of zein mRNA is reduced
bv hybrid fo rmat ion between the 5'- and З ' -un t rans la ted region / / E M B O J.— 1985.—
4/ N 9.— P. 2153—2158.
13. Izant J. G., Weintraub II. Inhibit ion of thymidine kinase gene expression by anti-
sense RNA: a molccular approach to genetic a n a l y s i s / / C e l l . — 1984.—36, N 4.—
P. 1007—1015.
14. Izant /. G., Weintraub II. Const i tu t ive and condit ional suppress ion of exogenous ge-
nes by ant i -sense RNA / / Science.— 1985.—229, N 4711.— P. 345—352.
15. McGarri) T. J., Lindquist S. Inhibit ion of heat shock protein synthesis bv heat- indu-
cible ant i -sense R N A / / P r o c . Nat . Acad. Sci. USA.—1986.—83, N 2 . — P . 399—403.
16. Kim S. K., Wold B. J. S table reduction of thymidine kinase activity in cells expres-
s ing high levels of ant i -sense R N A / / C e l l . — 1985.—42, N 1 ,—P. 129—138.
17. Iiarland R., Weintraub II. Trans la t ion of mRNA injected into Xenopus oocytes is
specifically inhibited bv ant i -sense R N A / / J . Cell. B io l—1985.—101, N 3 . — P . 1094—
1100.
16 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1987, т. 3, № 13* 16
18. Mellon D. A. Injected ant i-sense RNAs specifically block messenger RNA t rans la t ion
in vivo / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1985—82, N 1.— P. 144—148.
19. Molecular genetics of Kriippel, a gene required for segmenta t ion of the Drosophila
e m b r y o / / A . Preiss , U. B. Rosenberg, A. Kienlin et al. / / Nature.— 1985.—313,
N 5997.— P. 27—32.
20. Production of phenocopies by Kriippel ant i-sense RNA injection into Drosophila
e m b r y o s / U . В. Rosenberg, A. Preiss, E. Seifert et al. / / Ibid.— N 6004.—P. 703—
706.
21. Phenocopy of discoidin 1-minus m u t a n t s by ant i-sense t r ans fo rmat ion in dictyoste-
l i u m / T . E. Crowley, W. Nellen, R. H. Garner, R. A. Firtel / / Cell.— 1986,—43,
N 3 . — P . 633 - 6 4 1 .
22. Mizutio ΤWurtzel E. Т., Inouye Μ. Osmoregula t ion of gene expression. II. DNA
sequence of the enuZ gene of the ompB operon of Escherichia coli and character iza-
tion of its gene p r o d u c t / / J . Biol. Chem.—1982.—257, N 22 .—P. 13692—13698.
23. Primary s t ruc ture of the ompF gene that codes for a ma jo r outer membrane protein
of Escherichia coli K-12 / M. Inokuchi, N. Mutch, S. Ma t suyama , S. M i z u s h i m a / /
Nucl. Acids Res.— 1982.— 10, N 21.— P. 6957—6968.
24. Mizutio Т., Chou M.-J., Inouye M. A comparat ive s tudy on the genes for three pro-
teins of the Escherichia coli outer membrane. DNA sequence of the osmoregula ted
ompC gene / / J . Biol. Chem.— 1983,—258, N 11.—P. 6932—6940.
25. Mizuno Т., Chou M.-J., Inouye M. Regulat ion of gene expression by small RNA
transcr ipt (micRNA) in Escherichia coli K - 1 2 / / P r o c . Jap . Acad. Sci.— 1983.—59,
N 10.—P. 335—338.
26. Mizuno T, Chou M.-J., Inouye M. A unique mechanism regu la t ing gene expression:
t rans la t iona l inhibition by a complementary RNA transcr ipt (micRNA) / / P r o c . Nat.
Acad. Sci. USA.— 1984.—81, N 7 . — P . 1966—1970.
27. Coleman J., Green P. J., Inouye M. The use of RNAs complementary to specific
mRNAs to regula te the expression of individual bacterial g e n e s / / C e l l . — 1984.—37,
N 2.— P. 429—436.
28. A novel immune system agains t bacter iophage infection us ing complementarv RNA
( m i c R N A ) / J . Coleman, A. Hirashima, Y. Inokuchi et a l . / / N a t u r e . — 1 9 8 5 — 3 1 5 ,
N 6020 .—P. 601—603.
29. Farnham P. J., Abrams J. M., Schimke R. T. Opposi te-s t rand RNAs f rom the 5 ' - f lan-
king region of the mouse dihydrofola te reductase gene / / Proc. Nat . Acad. Sci. USA.—
1985.—82, N 12.—P. 3978—3982.
30. Anti-mRNA: specific inhibition of t rans la t ion of s ingle mRNA molecules / S. Pes tka ,
B. L. Daugher ty , V. J u n g et al. / / Ibid.— 1984.—81, N 2 3 . — P . 7525—7528.
31. Ellison M. J., Kelleher R. J., Rich A. Thermal regula t ion of β -ga lac tos idase synthesis
us ing anti-sense RNA directed aga ins t the coding portion of the m R N A / / J . Biol.
Chem.— 1985,—260, N 16,—P. 9085—9087.
32. Rubenstein J. L. R., Nicolas J.-F., Jacob F. L 'ARN non sense (nsARN) : un outil
pour inactiver specifiquement l 'expression d 'un gene donne in vivo / / C. r. Acad sci.
C.— 1984,—299, N 8.— P. 271—274.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 11.03.86
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА, 1937, т. 3, № ι 17
|