Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli
Изучена фотоаффинная модификация рибосом Е. соli с помощью производного тРНКРhе, несущего арилазидогруппы, статистически распределенные по остаткам гуанина. В модельных условиях связывания производного тРНК он с Е-сайтом 70S рибосом (в отсутствие поли(U) и в присутствии антибиотика эдеина) было обна...
Saved in:
| Date: | 1989 |
|---|---|
| Main Authors: | , , , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Series: | Биополимеры и клетка |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154161 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli / С.Н. Владимиров, Д.М. Грайфер, М.А. Зенкова, Г.Г. Карпова, Л.В. Оленина, С.В. Кириллов, Ε.М. Макаров, В.И. Махно, Ю.П. Семенков // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 35-40. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154161 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1541612025-02-23T19:58:05Z Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli Фотоафінна модифікація Е-сайта рибосом Escherichia coli Photoaffinity modification of E-site of Escherichia coli ribosomes Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Зенкова, М.А. Карпова, Г.Г. Оленина, Л.В. Кириллов, С.В. Макаров, Е.М. Махно, В.И. Семенков, Ю.П. Структура и функции биополимеров Изучена фотоаффинная модификация рибосом Е. соli с помощью производного тРНКРhе, несущего арилазидогруппы, статистически распределенные по остаткам гуанина. В модельных условиях связывания производного тРНК он с Е-сайтом 70S рибосом (в отсутствие поли(U) и в присутствии антибиотика эдеина) было обнаружено, что модифицируются белки S8, S15, S17, S18, S21,L10. В составе комплекса производного тРНКРhе он с 50S субчастицами модифицировались белки L2, L7/L12, L10, L16, L25, L26. Полученные данные указывают на то, что расположение тРНК в Е-сайте 70S рибосомы относительно 50S субчастицы существенно отличается от такового на изолированной 50S субчастице. Вивчено фотоафінну модифікацію рибосом Е. соli за допомогою похідного тРНКРhе, який несе арилазидогрупи, статистично розподілені за залишками гуаніну. У модельних умовах зв’язування похідного тРНК з Е-сайтом 70S рибосом (за відсутності полі(U) і в присутності антибіотика едеїну) виявлено, що модифікуються білки S8, S15, S17, S18, S21, L10. У складі комплексу похідного тРНКРhе з 50S субчастинками модифікувалися білки L2, L7/L12, L10, L16, L25, L26. Отримані дані вказують на те, що розташування тРНК в Е-сайті 70S рибосоми щодо 50S субчастинки істотно відрізняється від такого на ізольованій 50S субчастинці. Photoaffinity modification of E. coli ribosomes with tRNAPhe derivative bearing arylazidogroups statistically scattered over guanine residues was studied under conditions of binding of the deacylated tRNAphe (tRNAPhe) derivative at 70S ribosomal E-site (without template, in the presence of antibiotic edeine). Proteins S8, S15, S17, S18, S21 and L10 were found to be labelled. Another set of proteins — L2, L7/L12, L10, L16, L25 and L26 — was identified as being labelled within the complex of the tRNAPhe derivative with isolated SOS subunits. 1989 Article Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli / С.Н. Владимиров, Д.М. Грайфер, М.А. Зенкова, Г.Г. Карпова, Л.В. Оленина, С.В. Кириллов, Ε.М. Макаров, В.И. Махно, Ю.П. Семенков // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 35-40. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000044 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154161 577.217.34 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров |
| spellingShingle |
Структура и функции биополимеров Структура и функции биополимеров Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Зенкова, М.А. Карпова, Г.Г. Оленина, Л.В. Кириллов, С.В. Макаров, Е.М. Махно, В.И. Семенков, Ю.П. Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli Биополимеры и клетка |
| description |
Изучена фотоаффинная модификация рибосом Е. соli с помощью производного тРНКРhе, несущего арилазидогруппы, статистически распределенные по остаткам гуанина. В модельных условиях связывания производного тРНК он с Е-сайтом 70S рибосом (в отсутствие поли(U) и в присутствии антибиотика эдеина) было обнаружено, что модифицируются белки S8, S15, S17, S18, S21,L10. В составе комплекса производного тРНКРhе он с 50S субчастицами модифицировались белки L2, L7/L12, L10, L16, L25, L26. Полученные данные указывают на то, что расположение тРНК в Е-сайте 70S рибосомы относительно 50S субчастицы существенно отличается от такового на изолированной 50S субчастице. |
| format |
Article |
| author |
Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Зенкова, М.А. Карпова, Г.Г. Оленина, Л.В. Кириллов, С.В. Макаров, Е.М. Махно, В.И. Семенков, Ю.П. |
| author_facet |
Владимиров, С.Н. Грайфер, Д.М. Зенкова, М.А. Карпова, Г.Г. Оленина, Л.В. Кириллов, С.В. Макаров, Е.М. Махно, В.И. Семенков, Ю.П. |
| author_sort |
Владимиров, С.Н. |
| title |
Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli |
| title_short |
Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli |
| title_full |
Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli |
| title_fullStr |
Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli |
| title_full_unstemmed |
Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli |
| title_sort |
фотоаффинная модификация е-сайта рибосом escherichia coli |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Структура и функции биополимеров |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154161 |
| citation_txt |
Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli / С.Н. Владимиров, Д.М. Грайфер, М.А. Зенкова, Г.Г. Карпова, Л.В. Оленина, С.В. Кириллов, Ε.М. Макаров, В.И. Махно, Ю.П. Семенков // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 35-40. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT vladimirovsn fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT grajferdm fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT zenkovama fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT karpovagg fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT oleninalv fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT kirillovsv fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT makarovem fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT mahnovi fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT semenkovûp fotoaffinnaâmodifikaciâesajtaribosomescherichiacoli AT vladimirovsn fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT grajferdm fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT zenkovama fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT karpovagg fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT oleninalv fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT kirillovsv fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT makarovem fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT mahnovi fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT semenkovûp fotoafínnamodifíkacíâesajtaribosomescherichiacoli AT vladimirovsn photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT grajferdm photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT zenkovama photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT karpovagg photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT oleninalv photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT kirillovsv photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT makarovem photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT mahnovi photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes AT semenkovûp photoaffinitymodificationofesiteofescherichiacoliribosomes |
| first_indexed |
2025-11-24T20:42:45Z |
| last_indexed |
2025-11-24T20:42:45Z |
| _version_ |
1849705853563699200 |
| fulltext |
2 Nierhaus К. H., Rheinberger H.-J. An alternative model for the elongation cycle of
protein biosynthesis/ /Trends Biochem. S c i . - 1984.—9, N 10.—P. 428—432.
3. Nierhaus'К. H. New aspects of the ribosomal elongation cyc le / /Nuc l . and Cell.
Biochem.— 1984.—61, N 1.— P. 63—81.
4. Rheinberger H.-J., Sternbach H., Nierhaus К. H. Three tRNA binding sites on Esche-
richia coli ribosomes / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1981.—78, N 9.—P. 5310—
5314.
5. Rheinberger H.-J., Nierhaus К. H. Simultaneous binding of three tRNA molecules by
the ribosomes of Escherichia coli / / Biochem. Int.— 1980.— 1, N 4.—P. 297—303.
6. Grajevskaja R. A., Jvanov Yu. V., Saminski Ε. M. 70S ribosomes of Escherichia coli
have an additional site for deacylated tRNA binding / / Eur. J. Biochem.— 1982.—
128, N 1.—P. 47—52.
7. Wettstein F. O., Noll H. Binding of transfer ribonucleic acid to ribosomes in protein
synthesis. Number and properties of ribosomal binding sites / / J . Мої. Biol.— 1965.—
11, N 1.—P. 35—53.
8. Kirillov S. V., Makarov E. M., Semenkov Yu. P. Quantitative study of interaction of
deacylated tRNA with Escherichia coli r i bosomes / /FEBS Lett.— 1983.— 157, N 1.—
P. 91—94.
9. Lill R., Robertson J. M., Wintermeyer W. tRNA-ribosome complex formation: equili-
brium and kinetic s tudies/ /Hoppe-Seyler ' s Z. Physiol. C h e m . - 1983.~364, N 9.—
P. 1171—1172.
10. Дорохов Д. Б., Бурд С. Б., Семенков Ю. П. Взаимодействие тРНКРЬе-С-С-А(3'і\Н)*
P h e - а н а л о г а аминоацил-тРНК с 70S рибосомой / / Изв. АН MCCP.— 1985.—
№4.—С. 10—13.
11. Robertson J. M., Lill R., Wintermeyer W. Elongation factor G-induced realised of
tRNA during ribosomal translocation / / 5th Int. symp. metabolism and enzymol. of
nucl. acids.—Bratislava: Publ. Hause Slovak Acad. Sci., 1984.—P. 349—360.
12. Kirillov S. V., Makhno V. /., Semenkov Yu. P. Mechanism of codon-anticodon inte-
raction in ribosomes. Direct functional evidence that isolated 30S subunits contain
two codon-specific binding sites for transfer R N A / / N u c l . Acids Res.— 1980.— 8,
N l . - P . 183—196.
13. Katunin V. I., Semenkov Yu. P., Kirillov S. V. Comparative study of polyuridylic acid
binding with 30S subunits and 70S ribosomes of Escherichia coli // ibid.— N 2.—
P. 403—421.
14. Семенков Ю. П., Макаров Ε. M., Кириллов С. В. Количественное изучение взаимо-
действия деацилированной тРНК с P-, А- и Е-сайтами 70S рибосомы Escherichia
coli / / Биополимеры и клетка.— 1985.— 1, JNTs 4.— С. 183—193.
15. Kirillov S. V., Semenkov Yu. P. Non-exclusion principle of Ac-Phe-tRNA interaction
with tlie donor and acceptor sites of Escherichia coli ribosomes / / FEBS Lett.— 1982.—
148, N 2.— P. 235—238.
16. The mechanism of codon-anticodon interaction m ribosomes. Heterogeneity of tRNA
complexes with 70S ribosomes of Escherichia coli / S. V. Kirillov, V. I. Makhno,
V. B. Odinzov, Yu. P. Semenkov / /Eur . J. Biochem.— 1978.—89, N 3.—P. 305—313.
17. Arai K., Kuwakita M., Kaziro Y. Studies on polypeptide elongation factors from
E. coli U J. Biol. C h e m . - 1972.— 247, N 14.— P. 7029—7037
18. Odinzov V. B., Kirillov S. V. Interaction of N-acetyl-phenylalanyl-tRNA with 70S
ribosomes of Escherichia coli// Nucl. Acids Res.— 1978 —5, N 10.—P. 3871—3879.
Ленинград, ин-т ядер, физики
им. Б. 11. Константинова АН СССР, Гатчина
Ин-т эколог, генетики АН МССР, Кишинев
Получено 12.01.88
У Д К 577.217.34
ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ Е-САЙТА
РИБОСОМ ESCHERICHIA COLl
С. Н. Владимиров, Д. М. Грайфер, М. А. Зенкова, Г. Г. Карпова,
Л. В. Оленина, С. В. Кириллов, Ε. М. Макаров, В. И. Махно,
Ю. П. Семенков
Введение. В последнее время в различных лабораториях было показа-
но, что деацилированная т Р Н К (тРНКон) в отличие от аминоацил-
или пептидил-тРНК может связываться с 70S рибосомами в дополни-
тельном сайте, отличном от классических А- или Р-сайтов [1—4]. Было
сделано предположение о том, что этот сайт играет роль «выходного»
(exit, или Ε-сайт) для тРНКон в цикле элонгации. Однако имеющиеся
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № і 35
доказательства этой гипотезы [5, 6] недостаточно убедительны. Связы-
вание т Р Н К о н в дополнительном сайте является кодон-зависимым со-
гласно данным, полученным в группе Нирхауса [1, 5, 6], три другие
группы авторов наблюдали независимое от матрицы связывание
т Р Н К о н в дополнительном сайте [2—4]. В обоих случаях участок свя-
зывания т Р Н К о н обозначали буквой Е.
Изолированная 30S субчастица имеет только два сайта для связы-
вания т Р Н К в любой функциональной форме; в составе 70S рибосом
они проявляют свойства А- и Р-сайтов [3, 7, 8]. Эти два сайта 30S суб-
частицы вносят основной вклад в энергию связывания т Р Н К с А- и P-
-сайтами 70S рибосом. Третий сайт, специфический для тРНКон , появ-
л я е т с я только в 70S рибосоме [3]. Связывание т Р Н К о н с 50S субчасти-
-цей во многом сходно с таковым в Е-сайте 70S рибосом, а именно: оно
ходон-независимо [2—4, 9—11]; специфично для т Р Н К о н [1—4, 9, 10];
•сродство TPHKpheOH к Ε-сайту и к изолированным 50S субчастицам
почти одинаково [3, 9, 10]. На этом основании было сделано предполо-
жение о том, что сайт связывания т Р Н К о н на 50S субчастице состав-
ляет основу Е-сайта 70S рибосом или идентичен ему [2, 3].
В данной работе для изучения белкового окружения т Р Н К в кодон-
е з а в и с и м о м Е-сайте 70S рибосомы и в комплексе с 50S субчастицей
шы использовали подход, основанный на фотоаффинной модификации
рибосом реакционноспособными производными T P H K p h e O H - Такие про-
изводные, несущие арилазидогруппы, статистически распределенные по
остаткам гуанина, позволили детально изучить белковое окружение
т Р Н К , связанной в различных функциональных состояниях с А и P-
сайтами [12, 13].
Материалы и методы. 30S и 50S рибосомные субчастицы выделяли из биомассы
Е. coli MRE-600, как описано в [8]. 70S рибосомы, полученные реассоциацией этих суб-
частиц, были полностью активны в связывании тРНК в A-, P- и Ε-участках и в обра-
зовании пептидной связи. Препараты TPHKqh (1450 пмолей/ОЕ2ео), [1 4С]тРНКон е
(1300 пмолей/ОЕ2бо)> Ac[14C] Phe-TPHKphe (1500 пмолей/ОЕ260) и фракционированная
поли (U) (средняя молекулярная масса 30 ООО) получены, как в работах [7, 8].
[14С]азидо-тРНК получали алкилированием тР HKqh6 M n - 2
-хлорэтил-Г^-метиламино)
[14C] бензиламином (370 ГБк/ммоль) в условиях лабильности третичной структуры
тРНК с последующей обработкой алкилированной тРНК 2,4-динитро-5-фторфенилази-
дом по методу [12, 13].
Антибиотики эдеин («Calbiochem», США) и тетрациклин («Serva», ФРГ) исполь-
зовали в конечных концентрациях 3· 10 - 5 М; РНКазы А и Ti фирмы «Sankyo Со» (Япо-
ния), щелочная фосфатаза фирмы «Calbiochem».
Связывание [14C]тРНКон6 и азидо-тРНКон с 7 0 S и л и ^OS рибосомами проводили
в буфере 1 (20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ NH4Cl, 20 мМ MgCl2). В экспериментах
по идентификации белков, сшитых с азидо-тРНК, связанной в Е-участке 70S рибосом,
реакционные смеси содержали 30S и 50S субчастицы (2· 10~6 М), где указано — эдеин
и тетрациклин, и в некоторых случаях — поли (U) (50 мкг/мл). Связывание азидо-
тРНК (1,2· 10~5 М) с 50S субчастицами (3-10—6 М) проводили в буфере 1 при O0C;
время инкубации 2 ч. После инкубации комплексы [14C] азидо-тРНК с рибосомами об-
лучали УФ-светом ( λ > 3 1 0 нм). Распределение радиоактивной метки между рибосом-
ными субчастицами анализировали центрифугированием облученных комплексов в гра-
диенте концентрации сахарозы 10—30 % в условиях диссоциации на субчастицы
(0,5 мМ Mg2+). В экспериментах по идентификации белков, сшитых с азидо-тРНК,
брали 0,8 нмоля 50S или 4 нмоля 70S рибосом. Белки экстрагировали из модифициро-
ванных рибосом 2 M LiCl в 4 M мочевине; ковалентно присоединенную азидо-тРНК
гидролизовали РНКазами А и Ti и щелочной фосфатазой; распределение метки между
рибосомными белками анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле
(ПААГ), как в [12, 13].
Результаты и обсуждение. М о д и ф и к а ц и я 50S с у б ч а с т и ц .
Связывание азидо-тРНК с 50S субчастицами ингибируется избытком
немодифицированной т Р Н К о н (рис. 1). Это свидетельствует в пользу
того, что азидо-тРНК связывается с тем ж е сайтом, что и нативная
36 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № і 36
тРНКон. Рибосомные белки, выделенные из облученного комплекса
азидо-тРНК с 50S субчастицами, анализировали двухмерным электро-
форезом в ПААГ. Распределение метки 14C между белками приведено
на рис. 2, а. Видно, что модификации подвергаются обозначенные белки.
М о д и ф и к а ц и я Е - с а й т а 70S р и б о с о м . Связывание азидо-
тРНКон с Ε-сайтом проводили в различных условиях: а) в отсутствие
Рис. 1. Профили гель-фильтрации на сефадексе G-200 (колонка 5,4X130 мм) комплек-
сов [14C] азидо-тРНК-50S, полученных в отсутствие (а) или в присутствии (б) 30-крат-
ного молярного избытка тРНКон по отношению к азидо-тРНК: 1 — 50S; 2 — тРНК.
Элюцию вели буфером 1 при IO0C
Fig. 1. Gel-filtration profiles of complexes [14C] azido-tRNA-50S obtained in the absence
(a) or presence (6) of 30-fold molar excess of unmodified bulk tRNA over azido-tRNA.
Column with Sephadex G-200 was used (5.4X130 mm); elution was with buffer 1 at
IO0C. (—) A260; (...) cpm. / — 60S, 2 — tRNA
Рис. 2. Распределение радиоактивной метки между рибосомными белками после облу-
чения комплексов [14C]азидо-тРНК-50S (а) и [14С]азидо-тРНК-705, полученного в от-
сутствие матрицы и в присутствии эдеина (б, в)
Fig. 2. Distribution of the radioactive label among the ribosomal proteins after irradia-
tion of complexes [14C]50S azido-tRNA (a) and [I4C]70S azido-tRNA (obtained in the
absence of a template and in the presence of edeine) (б, в)
матрицы и при Р-сайте, блокированном AcPhe-TPHK p h e (таблица, экс-
перименты 1 и 2) ; б) в отсутствие матрицы, в присутствии эдеина (таб-
лица, эксперимент 3), ингибирующего связывание любых форм т Р Н К
с Р-сайтом [3, 14]; в) в присутствии поли (U) и одновременно тетра-
циклина и эдеина (таблица, эксперимент 4), блокирующих связывание
тРНК соответственно с А- и Р-сайтами. В отсутствие матрицы т Р Н К о н
может связываться как с P-, так и с Ε-сайтом, в то время как AcPhe-
тРНК — только с Р-сайтом. Д л я того чтобы блокировать Р-сайт (таб-
лица, эксперименты 1 и 2), 70S рибосомы инкубировали с 2,5-кратным
молярным избытком Ac[1 4C]Phe-TPHKP h e . Уровень связывания послед-
ней тестировали с помощью нитроцеллюлозных фильтров [3, 7, 8]; он
составлял не менее 0,8 моля AcPhe-TPHK p h e на моль 70S рибосом.
Эдеин понижает константу ассоциации т Р Н К с Р-сайтом на два
порядка величины и значительно понижает скорость связывания [14].
Кинетические кривые связывания [14С]тРHKpheOH с комплексом 7 0 S X
Xполи (U) в присутствии или в отсутствие эдеина и тетрациклина при-
ведены на рис. 3. т Р Н К брали в насыщающей концентрации так, что
в отсутствие антибиотиков все активные участки рибосом были запол-
нены (рис. 3, кривая 1). Тетрациклин ингибирует связывание одной
38 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № і 37
Распределение ковалентно связанной \иС]азидо-тРНК между 30S и 50S
субчастицами после облучения комплексов азидо-тРНК с 70S рибосомой,
полученных в различных условиях
Distribution of covalently linked \uC]azido-tRNA between 30S and 50S subunits after
irradiation of the complexes of azido-tRNA with 70S ribosomes
Номер экс-
перимента Поли(и)
Преинкубация
рибосом с
AcPhe-
T P H K p h e
Эдеин Тетрацик-
лин
100-кратный
избыток
т Р Н К о н п о
отношению к
азидо-тРНК
Азидо-тРНК/субчас-
тицы, моль/моль
Номер экс-
перимента Поли(и)
Преинкубация
рибосом с
AcPhe-
T P H K p h e
Эдеин Тетрацик-
лин
100-кратный
избыток
т Р Н К о н п о
отношению к
азидо-тРНК 30S 50S
* Концентрации 70S рибосом и азидо-тРНК были соответственно 1,5· 10~6 и 4,5· 10-6 М.
молекулы тРНКр } 1 еон, очевидно, с Α-сайтом (рис. 3, кривая 2). В при-
сутствии обоих антибиотиков (рис. 3, кривая 3) наблюдается быстрое
(около одной минуты) связывание одной молекулы TPHKpheOH с Е-уча-
стком, нечувствительное к антибиотикам [14]; связывание с P (или с P
и А) сайтом в этом случае происходит очень медленно (часы) [14].
Следовательно, связывание преимущественно с Ε-сайтом может быть
реализовано при использовании коротких времен инкубации соответ-
ствующего комплекса. В данном случае при связывании азидо-тРНК
с Е-еайтом в присутствии антибиотиков инкубацию вели 5 мин.
Полученные комплексы облучали, затем проводили деление рибо-
сом на субчастицы, как описано в разделе «Материалы и методы». Рас-
пределение радиоактивной метки между рибосомными субчастицами
приведено в таблице. Видно, что во всех случаях модифицируется пре-
имущественно 30S субчастица. Фотосшивки специфичны (не наблюда-
ются вне комплекса), поскольку они ингибируются избытком немоди-
фицированной т Р Н К (таблица, эксперимент 2) . Факт преимуществен-
ной модификации 30S субчастиц следует обсудить подробнее, посколь-
ку такая модификация наблюдалась ранее при локализации азидо-
т Р Н К в Р-сайте [12, 13, 15]. В первом типе экспериментов (таблица,
эксперименты 1, 2) нельзя исключить некоторого «паразитического»
связывания азидо-тРНКон с Р-сайтом за счет обмена с AcPhe-TPHK p h e
(либо со свободным Р-сайтом), так как сродство TPHKpheOH к Р-сайту
заметно выше, чем AcPhe-TPHK p h e при 20 мМ Mg2+ и O0C [16]. Воз-
можность связывания т Р Н К о н с Р-сайтом была исключена в присут-
ствии эдеина (таблица, эксперименты 3, 4) и за счет коротких времен
инкубации — 5 мин (рис. 3) . Однако и в этих экспериментах наблюда-
лась преимущественная модификация 30S субчастицы. Этот факт мо-
жет объясняться двояко: либо Ε-сайт вносится в рибосому не 50S суб-
частицей, как таковой, а путем конформационных изменений, вызван-
ных ассоциацией субчастиц в 70S рибосому, либо Ε-сайт все ж е посту-
пает с 50S субчастицей, но расположение этого сайта в 70S рибосоме
предполагает более вероятный контакт т Р Н К с 30S субчастицей.
И д е н т и ф и к а ц и я 70S р и б о с о м н ы х б е л к о в , п о д в е р -
г а ю щ и х с я м о д и ф и к а ц и и а з и д о - т Р Н К . Белки, «сшитые» с
азидо-тРНК, анализировали для комплекса азидо-тРНК с 70S рибосо-
мами в отсутствие матрицы и в присутствии эдеина (таблица, экспе-
римент 3) . Это условия наиболее точной фиксации азидо-тРНК в E-
сайте. Из рис. 2 (б, в) видно, какие белки подвергаются модификации
в этом случае. Азидо-тРНК, связанная с изолированными 50S субчас-
тицами, модифицирует белки, указанные на рис. 2, а. Единственный
белок большой субчастицы, модифицируемый азидо-тРНК в Е-сайте
70S рибосом, — LlO — сшивается с производным т Р Н К и в составе
комплекса с изолированными 50S субчастицами. Набор белков,
модифицируемых азидо-тРНК в Е-сайте 70S рибосом, существенно ότ-
38 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № і 38
личается от наборов белков, сшивающихся с а зидо-тРНК в А- и Р-сай-
тах в различных функциональных состояниях [12, 13, 15] (рис. 4 ) . Сле-
довательно, белковое окружение т Р Н К о н в Е-сайте отличается от окру-
жения т Р Н К в А- или Р-сайтах; это свидетельствует в пользу физичес-
кой индивидуальности дополнительного участка связывания т Р Н К о н
(см. также рис. 4) . Только белок S21 модифицируется азидо-тРНК,
антибиотиков (1), в присутствии 2-Ю - 5 M тетрациклина (2)\ одновременно тетрацик-
лина и 5· Ю -6 M эдеина (3). Реакционные смеси содержали в 100 мкл буфера 1
10 пмолей 70S рибосом, 10 мкг поли(U) и 100 пмолей активной [14C]тРНКон* v ^ —
число молекул тРНК, связанных с одной рибосомой
Fig. 3. Kinetics of [14C] tRNA он binding to the complex 70S-poly (U) in the absence of
antibiotics (/), in the presence of 2-Ю - 5 M tetracycline (2) and in the presence of both
2· 10~5 M tetracycline and 5·10~6 M edeine (5). Reaction mixtures contained Ы 0 pmo-
Ies of 70S ribosomes, 10 μ£ poly (U) and 100 pmoles of an active [ 14C] tRNA Q^e in
100 μΐ of buffer; at 0 °С. v 2 — number of tRNA molecules bound per ribosome
Рис. 4. Наборы рибосомных белков, модифицируемых азидо-тРНК в процессе прохож-
дения ее через различные модельные состояния цикла элонгации: А\— Phe-азидо-тРНК
связана энзиматически в Α-участке до гидролиза GTP («R»-y4acTOK) [13]; A2 — то же,
но после гидролиза GTP перед транспептидацией [13]; Л3 — то же после транспепти-
дации [13]; P1—(РЬе)п-азидо-тРНК в Р-участке (посттранслокационное состояние)
[12]; P2— азидо-тРНК в Р-участке, (Phe)n+i-TPHK в Α-участке (претранслокационное
состояние следующего цикла) [12]; £70 — Е-участок 70S рибосомы; B50 — участок свя-
зывания тРНКоне н а изолированной 50S субчастице
Fig. 4. The sets of ribosomal proteins which were identified to be cross-linked with azido-
tRNA in the course of its passage through different model states of elongation cycle:
Ai — Phe-azido-tRNA located enzymatically at Α-site before GTP hydrolysis (R-site)
[13]; A2- the same but after GTP hydrolysis before transpeptidation [13]; A3- the
same but after transpeptidation [13]; P i — (Phe)n-azido-tRNA at P-site (posttransloca-
tional state) [12], P2 — azido-tRNAPhe at P-site, (Phe)n+i-tRNA at Α-site (pretransloca-
tional state of the next cycle) [12]; £70 — 70S ribosomal Ε-site; E5O — a site for tRNAoH
binding on isolated 50S subunit
локализованной как в Ε-, так и в А- или Р-сайтах в некоторых функ-
циональных состояниях [12, 13, 15] (см. т а к ж е рис. 4 ) . Можно пола-
гать, что в процессе перехода А-^Р-^Е7о (если Ε-сайт действительно
играет роль выходного) положение т Р Н К относительно белка S21 наи-
более консервативно. Факт отсутствия большинства сшивок азидо-
TPHK-50S в Е-сайте 70S рибосомы подтверждает вывод о том, что
положение т Р Н К о н относительно 50S субчастицы в Е-сайте 70S рибо-
сомы существенно отличается от такового в составе комплекса с изо-
лированной 50S субчастицей. Только белок LlO способен модифициро-
ваться азидо-тРНК как в составе комплекса с изолированными 50S
субчастицами, так и в Е-сайте 70S рибосом. Таким образом, если
Ε-сайт и вносится в 70S рибосому ее 50S субчастицей, расположение
тРНК в Е-сайте 70S рибосомы относительно 50S субчастицы сущест-
венно отличается от такового на изолированной 50S субчастице.
БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № і 39
PHOTOAFFINITY MODIFICATION OF E-SITE
of Escherichia coli RIBOSOMES
S. Ν. Vladimirov, D. M. Graifer, Μ. A. Zenkova, G. Y. Karpova,
L. V. Olenina, S. V. Kirillov *, E. M. Makarov *, V. I. Makhno *, Yu. P. Semenkov *
Institute of Bioorganic Chemistry,
Siberian Branch of the Academy of Sciences of the USSR, Novosibirsk;
* B. P. Konstantinov Institute of Nuclear Physics,
the Academy of Sciences of the USSR, Gatchina, Leningrad Region
S u m m a r y
Photoaffinity modification of E. coli ribosomes with tRNAP h e derivative bearing aryla-
zidogroups statistically scattered over guanine residues was studied under conditions of
binding of the deacylated tRNAp h e (tRNAoS) derivative at 70S ribosomal Ε-site (with-
out template, in the presence of antibiotic edeine). Proteins S8, S15, S17, S18, S21 and
LlO were found to be labelled. Another set of proteins — L2, L1/L12, LlO1 L16, L25 and
L26 — was identified as being labelled within the complex of the tRNAPhe
OH derivative
with isolated 50S subunits.
1. Rheinberger H.-J., Sternbach H., Nierhaus К. H. Three tRNA binding sites on Esche-
richia coli r ibosomes/ /Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1981.—78, N 9.—P. 5310—5314.
2. Grajevskaja R. A., Jvanov Yu. V., Saminsky E. M. 70S ribosomes of Escherichia coli
have an additional site for deacylated tRNA b ind ing / /Eur . J. Biochem.— 1982.—
128, N 1.—P. 47—52.
3. Kirillov S. V., Makarov E. M., Semenkov Yu. P. Quantitative study of interaction of
deacylated tRNA with Escherichia coli ribosomes. Role of 50S subunits in formation
of the E s i t e / / F E B S Lett.— 1983.—157, N 1.—P. 91—94.
4. Lill R., Robertson J. M., Wintermeyer W: The tRNA binding sites of ribosomes from
Escherichia coli / / Biochemistry.— 1984.—23, N 26.—P. 6710—6717.
5. Rheinberger H.-J., Nierhaus K. H. Testing an alternative model for the ribosomal
peptide elongation cycle / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1983.—80, N 14.—P. 4213—
4217.
6. Rheinberger H.-J., Nierhaus K. H. Allosteric interactions between the ribosomal transfer
RNA-binding sites A and E / / J . Biol. C h e m . - 1986.—261, N 20.—P. 9133—9139.
7. Семенков Ю. П., Макаров Ε. M., Кириллов С. В. Количественное изучение взаимо-
действия деацилированной тРНК с P-, А- и Ε-сайтами рибосом Escherichia coli//
Биополимеры и клетка.— 1985.— 1, № 4.— С. 183—193.
8. Kirillov S. V., Makhno V. /., Semenkov Yu. P. Mechanism of codon-anticodon interac-
tion in ribosomes. Direct functional evidence that isolated 30S subunits contain two
codon-specific binding sites for transfer RNA/ /Nuc l . Acids Res— 1980.—8, N 1 —
P. 183—196.
9. Grajevskaja R. A., Saminsky E. M., Bresler S. E. Interaction of transfer RNA with
ribosomes in the absence of messenger / / Biochem. and Biophys. Res. Communs —
1972.—46, N 3.—P. 1106—1112.
10. Парфенов Д. В., Саминский Ε. Μ. Дезацилированная тРНК связывается с 50S суб-
частицей рибосом Escherichia coli на специальный участок, не совпадающий с участ-
ком P / /Молекуляр. биология.— 1985.— 19, № 5.—С. 1378—1385.
11. Изучение взаимодействия транспортной РНК с 50S субчастицами рибосом Escheri-
chia coli в отсутствие матриц / С. Е. Бреслер, Р. А. Граевская, Ю. В. Иванов,
Ε. М. Саминский / / Там же.— 1976.— 10, № 4.— С. 777—784.
12. The effect of aminoacyl or peptidyl-tRNA at the Α-site on the arrangement of deacy-
lated tRNA at the ribosomal P-site / G. T. Babkina, Ε. V. Bausk, D. M. Graifer et
al. / / FEBS Lett.— 1984,— 170, N 2.— P. 290—294.
13. The effect of GTP hydrolysis and transpeptidation on the arrangement of aminoacyl-
tRNA at the Α-site of Escherichia coU 70S ribosome / S. N. Vladimirov, D. M. Grai-
fer, G. G. Karpova et al. / / Ibid.— 1985.— 181, N 2.— P. 367—372.
14. Особенности влияния антибиотика эдеина на взаимодействие тРНК с участками А,
P и E 70S рибосом Escherichia coli / Ю. П. Семенков, В. И. Махно, Ε. М. Макаров,
С. В. Кириллов / / Молекуляр. биология.— 1984.—18, № 5.—С. 1348—1351.
15. Vladimirov S. N., Graifer D. M., Karpova G. G. The effect of poly(U) on the arran-
gement of tRNAphe in donor tRNA-binding site of Escherichia coli ribosomes / / FEBS
Lett.— 1982.— 144, N 2.—P. 332—336.
16. Kirillov S. V., Katunin V. I., Semenkov Yu. P. Mechanism of codon-anticodon inte-
ractions in ribosomes. Comparative study of interaction of Phe-tRNAPhe and
AcPhe-tRNAPhe with the donor site of Escherichia coli r ibosomes//Ibid — N 1.—
P. 15—19.
Ин-т биоорг. химии Сиб. отд-ния АН СССР, Новосибирск Получено 18.06.87
Ленинград, ин-т ядер, физики
им. Б. П. Константинова АН СССР, Гатчина
40 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.— Т. 5, № і 40
|