Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations
Aim. To develop diagnostic assays, based on the amplification refractory mutation system (ARMS) principle, for detection of common mutations in the CFTR gene using two approaches: standard PCR with further gel-electrophoresis and Real-Time PCR with SYBR Green. Materials. For this study we have chose...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Вiopolymers and Cell |
|---|---|
| Datum: | 2010 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Englisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2010
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154183 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations / O.O. Soloviov, V.M. Pampukha, L.A. Livshits // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 5. — С. 378-383. — Бібліогр.: 12 назв. — англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859814025972416512 |
|---|---|
| author | Soloviov, O.O. Pampukha, V.M. Livshits, L.A. |
| author_facet | Soloviov, O.O. Pampukha, V.M. Livshits, L.A. |
| citation_txt | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations / O.O. Soloviov, V.M. Pampukha, L.A. Livshits // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 5. — С. 378-383. — Бібліогр.: 12 назв. — англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Вiopolymers and Cell |
| description | Aim. To develop diagnostic assays, based on the amplification refractory mutation system (ARMS) principle, for detection of common mutations in the CFTR gene using two approaches: standard PCR with further gel-electrophoresis and Real-Time PCR with SYBR Green. Materials. For this study we have chosen the following mutations: dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT with the frequencies in Ukraine: dF508 – 43.3 %; 2143delT – 1.38 %; W1282X – 1.1 %; R117H, 621 + 1G > T – < 0.6 %. For the development and validation of the assay we have used control DNA samples with abovementioned mutations, which were previously examined using RFLP and heteroduplex analysis. Results. We have designed the primers and optimized the conditions of ARMS PCR performing for the analysis of dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT mutations. To validate the developed assays we have analyzed control DNA samples with the following mutations: W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). For validation of the dF508 assay we have analyzed 100 heterozygous carriers and 50 homozygous carriers. We have analyzed 48 patients with cystic fibrosis, in which only one mutation was previously detected in combination with unknown mutant variant, using the developed ARMS assay for the 2143delT mutation, and detected 4 heterozygous carriers. No differences were observed in comparison with the standard protocols. Conclusions. It was shown that ARMS is a reliable, rapid and inexpensive method, and the developed assays can be applied in the standard PCR protocol with further gel-electrophoresis as well as using Real-Time PCR with SYBR Green for the molecular genetic diagnostics of cystic fibrosis.
Мета. Мета дослідження полягала у розробці діагностичних методик, основаних на принципі алель-специфічної ПЛР для аналізу розповсюджених мутацій в гені ТРБМ з використанням двох підходів: традиційної ПЛР з подальшим розділенням продуктів у гель-електрофорезі та з використанням ПЛР у реальному часі. Методи. Для дослідження обрано такі мутації – dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT з частотою зустрічальності в Україні: dF508 – 43,3 %; 2143delT – 1,38 %; W1282X – 1,1 %; R117H і 621 + 1G > T – < 0,6 %. Використано контрольні зразки ДНК з відповідними мутаціями, ідентифіковані методами гетеродуплексного аналізу та ПДРФ. Результати. Проведено дизайн та оптимізовано умови алель-специфічної ампліфікації для вивчення мутацій dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. Розроблені методики аналізу підтверджено перевіркою контрольних зразків ДНК з мутаціями W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). Щоб перевірити тест на dF508 нами проаналізовано 100 носіїв даної мутації в гетерозиготному стані та 50 – в гомозиготному. За допомогою створеної методики детекції 2143delT проаналізовано також 48 пацієнтів, хворих на муковісцидоз, у яких первинно виявлено лише по одній мутації разом з невідомим мутантним варіантом. В результаті аналізу серед них визначено ще чотири носії зазначеної делеції в гетерозиготному стані. При цьому не встановлено розбіжностей в даних, отриманих з використанням стандартних протоколів аналізу досліджених мутацій. Висновки. Показано, що метод алель-специфічної ПЛР є швидким та відносно недорогим, його можна застосовувати для детекції відомих мутацій у гені ТРБМ.
Цель работы состояла в разработке диагностических методик, основанных на принципе аллель-специфической ПЦР для анализа распространенных мутаций в гене ТРБМ с использованием двух подходов: традиционной ПЦР c дальнейшим разделением продуктов в гель-электрофорезе и ПЦР в реальном времени. Методы. Для исследований выбраны следующие мутации – dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT с частотой встречаемости в Украине: dF508 – 43,3 %; 2143delT – 1,38 %; W1282X – 1,1 %; R117H и 621 + 1G > T – < 0,6 %. Использованы контрольные образцы ДНК с соответствующими мутациями, идентифицированные методами гетеродуплексного анализа и ПДРФ-анализа. Результаты. Проведен дизайн и оптимизированы условия аллель-специфической амплификации для анализа мутаций dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. Разработанные методики анализа подтверждены проверкой контрольных образцов ДНК с мутациями W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). Для проверки теста на dF508 проанализированы 100 носителей данной мутации в гетерозиготном состоянии и 50 – в гомозиготном состоянии. С помощью разработанной методики детекции 2143delT проанализированы также 48 пациентов, больных муковисцидозом, у которых первично выявлено лишь по одной мутации вместе с неизвестным мутантным вариантом. В результате анализа среди них определены еще четырее носителя указанной делеции в гетерозиготном состоянии. При этом не найдено отличий в данных, полученных с использованием стандартных протоколов анализа этих мутаций. Выводы. Показано, что метод аллель-специфической ПЦР является быстрым и относительно недорогим, его можно применять для детекции известных мутаций в гене ТРБМ.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:21:08Z |
| format | Article |
| fulltext |
BIOMEDICINE
Development of ARMS PCR tests for detection
of common CFTR gene mutations
O. O. Soloviov, V. M. Pampukha, L. A. Livshits
Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine
150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680
livshits@imbg.org.ua
Aim. To develop diagnostic assays, based on the amplification refractory mutation system (ARMS) prin-
ciple, for detection of common mutations in the CFTR gene using two approaches: standard PCR with fur-
ther gel-electrophoresis and Real-Time PCR with SYBR Green. Materials. For this study we have chosen
the following mutations: dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT with the frequencies in Ukraine:
dF508 – 43.3 %; 2143delT – 1.38 %; W1282X – 1.1 %; R117H, 621 + 1G > T – < 0.6 %. For the deve-
lopment and validation of the assay we have used control DNA samples with abovementioned mutations,
which were previously examined using RFLP and heteroduplex analysis. Results. We have designed the
primers and optimized the conditions of ARMS PCR performing for the analysis of dF508, W1282X, R117H,
621 + 1G > T, 2143delT mutations. To validate the developed assays we have analyzed control DNA
samples with the following mutations: W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n =
= 1). For validation of the dF508 assay we have analyzed 100 heterozygous carriers and 50 homozygous
carriers. We have analyzed 48 patients with cystic fibrosis, in which only one mutation was previously
detected in combination with unknown mutant variant, using the developed ARMS assay for the 2143delT
mutation, and detected 4 heterozygous carriers. No differences were observed in comparison with the
standard protocols. Conclusions. It was shown that ARMS is a reliable, rapid and inexpensive method, and
the developed assays can be applied in the standard PCR protocol with further gel-electrophoresis as well
as using Real-Time PCR with SYBR Green for the molecular genetic diagnostics of cystic fibrosis.
Keywords: ARMS, Real-Time PCR, cystic fibrosis, CFTR gene.
Introduction. Cystic fibrosis (CF) is one of the most
common autosomal-recessive disorders in Caucasians
that occurs with the frequency of 1/2500 newborns and
is caused by mutations in the CFTR gene. More than
1700 mutations were identified in this gene and the
dF508 deletion was described as a causative mutation
[1, 2]. A number of methods are applied for molecular
genetic diagnostics of CF, namely, RFLP, SSCP,
DGGE, dHPLC etc., but they are relatively slow and te-
chnically demanding.
Several independent groups described a PCR-ba-
sed approach for analyzing known point mutations in
DNA and distinguishing between the normal, hetero-
zygous and homozygous mutant genotypes. This me-
thod is commonly referred to as PCR-ARMS or ARMS
(amplification refractory mutation system). ARMS is
based on the observation that PCR amplification is in-
efficient or completely refractory if there is a mismatch
between the 3' terminal nucleotide of a PCR primer and
a corresponding template [3–5].
This approach implies two PCR reactions. Ampli-
fication of the normal allele is accomplished using a
primer complementary to the normal allele. Conver-
sely, only the mutant allele will be amplified if the 3' re-
sidue is complementary to the mutant sequence. Thus,
as a result a normal individual generates PCR product
378
ISSN 0233-7657. Biopolymers and Cell. 2010. Vol. 26. N 5
Ó Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, 2010
only in the normal reaction; a heterozygote gives pro-
ducts in both reactions, and a homozygous mutant in-
dividual gives amplification only in the mutant reaction
[6].
This method has many advantages over the tradi-
tional methods of mutation detection: it is rapid (the
analysis is done in 2–3 hours), inexpensive, reliable
when a positive control sample is used, and it can be
easily visualized not only by electrophoresis in agarose
gel but also by means of Real-Time PCR system. How-
ever, the ARMS method depends on several factors:
proper primers design and optimization of PCR con-
ditions to avoid nonspecific amplification of the nor-
mal/mutant allele that could bring to false positive or
negative results [6, 7].
Our aim was to develop ARMS methods for the
analysis of common mutations causing CF, using both
general PCR with the agarose gel electrophoresis sys-
tem and Real-Time PCR assay as a prototype of the test
kits for molecular genetic diagnostics of CF. For our
study we have chosen the following mutations: dF508,
W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. We have
calculated the frequencies of these mutations in Ukrai-
ne as dF508 – 43.3 %; 2143delT – 1.38 %; W1282X –
1.1 %; R117H, 621 + G > T – < 0,6 %.
Materials and methods. DNA extraction. DNA was
extracted from peripheral blood leukocytes by standard
phenol-chloroform extraction methods [9].
ARMS primers and conditions. ARMS PCR ampli-
fication of the dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T
and 2143delT mutations was performed with using
specific oligonucleotide primers complementary either
to the wild type sequence, or the DNA with mutation
(Table).
The PCR reaction was performed in a final volume
of 15 µl containing 1 ́PCR buffer, 1.5 mM MgCl2,
200 µM of each dNTP, 0.2 units of Taq-DNA poly-
merase (Biolabtech company) and 50–200 ng of the
DNA template.
The Real-Time PCR was performed in a final vo-
lume of 15 µl containing 1 ́ PCR buffer, 1.5 mM
MgCl2, 200 µM of each dNTP, 0.2 units of Taq-DNA
polymerase (Biolabtech company), 1 ml 2 ́ SYBR Gre-
en and 25–50 ng of the DNA template.
The control DNA samples with the dF508,
W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT mutations
379
DEVELOPMENT OF ARMS PCR TESTS FOR DETECTION OF COMMON CFTR GENE MUTATIONS
Mutation Nucleotide sequence Amplicon size, bp
dF508 GCCTGGCACCATTAAAGAA – common 80
GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCACA – wild type
GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCATT – mutant
R117H TTTGTAGGAAGTCACCAAAGCAGT – common 111
CCTATGCCTAGATAAATCGCGATAGAAC – wild type
CCTATGCCTAGATAAATCGCGATAGAAT – mutant
621 + 1G > T TGCCTTCTCTTTATTGTGAGGACACT – common 138
TGCCATGGGGCCTGTGCAAGGAAGTATTCC – wild type
TGCCATGGGGCCTGTGCAAGGAAGTATTCA – mutant
W1282X CCCATCACTTTTACCTTATAGGTGGGCCTC – common 178
CCTGTGGTATCACTCCAAAGGCTTTCCAC – wild type
CCTGTGGTATCACTCCAAAGGCTTTCCAT – mutant
2143delT ATGGGATGTGATTCTTTCGA – common 81
GAGACCTTACACCGTTTCTCATTA – wild type
GAGACCTTACACCGTTTCTCATAG – mutant
Sequences of primers for ARMS tests
were previously analyzed using RFLP and a hetero-
duplex assay [8, 10–13].
Results and discussion. To optimize the PCR
conditions to avoid non-specific amplification of the
alleles we have chosen appropriate concentrations of
primers and annealing temperature. Annealing tempe-
rature was determined using the gradient PCR (data not
shown); the temperature was: for dF508 – 59 °C; for
2143delT – 64 °C and for the mutations R117H,
621 + 1 G > T, W1282X – 67 °C.
It has been shown that the titrating of the concen-
trations of primers and/or Mg2+ can improve the speci-
ficity of the assay [6, 7]. In Fig. 1 the electrophoregram
of ARMS PCR assay for the R117H mutation detec-
tion with different concentrations of primers is shown.
380
SOLOVIOV O. O., PAMPUKHA V. M., LIVSHITS L. A.
wt
mut
wt
mut
A B
P
C
R
B
a
se
L
in
e
S
u
b
tr
a
ct
ed
C
u
rv
e
F
it
R
F
U
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
P
C
R
B
a
se
L
in
e
S
u
b
tr
a
ct
ed
C
u
rv
e
F
it
R
F
U
70
60
50
40
30
20
10
0
–10
0 5 10 15 20 25 30 35
Cycle
0 5 10 15 20 25 30 35
Cycle
Fig. 2. Fluorogram of the R117H mutation (mut) detection in exon 4 of the CFTR gene of the wild type (wt) samples using ARMS Real-Time
PCR with the concentration of primers 5 pM (A) – the sample looks like a heterozygous carrier of R117H mutation. Reducing the
concentration of primers to 2.5 pM (B) eliminates nonspecific amplification of the mutant product
1 2 1 2
111 bp
111 bp
A B
n m n m n m n m
Fig. 1. Electrophoregram for the analysis of a single ARMS assay for the R117H mutation in exon 4 of the CFTR gene of the wild type samp-
les; 1.8 % agarose gel. The first lanes (n) of each sample are the products with normal set of primers and the second lanes (m) – amplification
products with mutant set of primers. The results with the concentration of primers 5 pM (A) show that the sample 1 corresponds to heterozy-
gous carrier of the R117H mutation. Reducing the concentration of primers to 2.5 mM (B) eliminates nonspecific amplification of the mutant
product
1 2 3 4 5 6 7 8
n m n m n m n m n m n m n m
80 bp
Fig. 3. Electrophoregram of the dF508 ARMS detection in 1.8 %
agarose gel:1–3, 6, 7 – normal individuals; 4 – heterozygous carrier
of the dF508; 5 – homozygous carrier of the dF508; 8 – molecular
weight marker (100 bp ladder)
Amplification of the normal samples with the con-
centration of primers 5 mM can lead to the formation of
the PCR product with the mutant pair of primers, while
the reduction of concentration to 2.5 mM prevents from
nonspecific amplification.
The influence of the primers concentration on the
ARMS specificity is more significant when using Real-
Time PCR. In Fig. 2 the same experiment for the
R117H mutation is shown.
We have determined the optimal primers concen-
trations for the developed assay: dF508 – 6 pM of each
primer; R117H – 2.5 pM of each primer; W1282X,
621 + 1 G > T, 2143delT – 10 pM of each primer. The
results of detection of the dF508 deletion using stan-
dard PCR with further agarose gel electrophoresis of
the amplified products and Real-Time PCR assay are
presented in Fig. 3 and Fig. 4 correspondently.
Considering the optimized annealing temperatures
and primers concentrations, the following amplifi-
cation conditions for detection assays of the dF508,
R117H, 621 + 1 G > T, W1282X, 2143delT mutations
were proposed:
– concentration of each primer: dF508 – 6 pM;
R117H – 2.5 pM; W1282X, 621 + 1 G > T, 2143delT –
10 pM.
– the cycling conditions for the dF508 mutation
were: initial denaturation at 95 °C for 5 min, 30 cycles
consisting of denaturation at 95 °C for 30 s, annealing
381
DEVELOPMENT OF ARMS PCR TESTS FOR DETECTION OF COMMON CFTR GENE MUTATIONS
wt
mut
wt
mut
P
C
R
B
a
se
L
in
e
S
u
b
tr
a
ct
ed
C
u
rv
e
F
it
R
F
U
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
–20
–40
140
120
100
80
60
40
20
0
–20
–40
P
C
R
B
a
se
L
in
e
S
u
b
tr
a
ct
ed
C
u
rv
e
F
it
R
F
U
0 5 10 15 20 25 30 35
Cycle
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cycle
mut
wt
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
–10
P
C
R
B
a
se
L
in
e
S
u
b
tr
a
ct
ed
C
u
rv
e
F
it
R
F
U
0 5 10 15 20 25 30 35
Cycle
BA
C
Fig. 4. Fluorogram of the ARMS Real-Time PCR detection of
the dF508 mutation (mut): A – the profile of the normal
individual (only the wild type (wt) sequence amplifies); B –
the profile of the heterozygous carrier (wild type and mutant
sequences amplify with similar effectiveness); C – the profile
of the homozygous mutation carrier (only the mutant sequen-
ce amplifies)
at 59 °C for 30 s, extension at 72 °C for 30 s and a final
elongation step at 72 °C for 3 min.
– the cycling conditions for the 2143dT mutation
were: initial denaturation at 95 °C for 5 min, 30 cycles
consisting of denaturation at 95 °C for 30 s, annealing
at 64 °C for 30 s, extension at 72 °C for 30 s and a final
elongation step at 72 °C for 3 min.
– the cycling conditions for the R117H, 621 + 1 G >
T, W1282X mutations were: initial denaturation at
95 oC for 5 min, 30 cycles consisting of denaturation at
95 °C for 30 s, annealing at 66 °C for 30 s, extension at
72 °C for 30 s, and a final elongation step at 72 °C for
3 min.
– in case of the Real-Time PCR procedure, the cyc-
ling conditions were as follows: initial denaturation at
95 °C for 10 min, 35 two-step cycles consisting of de-
naturation at 95 °C for 20 s and annealing with elonga-
tion at 57 °C (for dF508), 64 °C (for 2143dT) and 67 °C
(R117H, 621 + 1 G > T, W1282X) for 30 s.
To validate the method developed we have analy-
zed the control DNA samples with the W1282X (n = 3),
R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1)
mutations. For validation of the dF508 ARMS test we
have analyzed 100 heterozygous carriers and 50 homo-
zygous carriers of the dF508 mutation. No differences
were observed in the results obtained using the stan-
dard protocols, except for one control DNA sample
with heterozygous dF508 mutation, which as a result of
the detailed analysis using the standard sequenced con-
trol sample, appeared to be the dI507 mutation, that
proves the effectiveness of the developed assay.
For the analysis of 2143delT mutation we have
used the heteroduplex assay to identify the mutant pro-
file for further detection of this deletion with ARMS
PCR (Fig. 5) [12, 13]. Using the heteroduplex analysis
of the exon 13 CFTR gene we have identified the
2143delT and 2184insA mutations in the control DNA
samples. However, application of the heteroduplex
analysis for detection of the single-nucleotide deleti-
ons/insertions is restricted because of impossibility to
detect the mutant homozygote; therefore the ARMS
test is preferable.
We have analyzed 48 CF patients, in which one
mutation was previously detected, using the developed
ARMS assay for the 2143delT mutation and detected
4 heterozygous carriers. The 2184insA mutation was
identified in 12 CF patients using the heteroduplex
analysis.
Conclusions. We have developed and, using the
analysis of the control DNA samples, validated the di-
agnostic assays for the detection of common CF mu-
tations: dF508, R117H, 621 + 1G > T, W1282X and
2143delT with the ARMS PCR approach. It was shown
that the ARMS is a reliable, rapid and inexpensive
method and the developed assays can be applied in the
standard PCR protocol with further gel-electrophoresis
as well as Real-Time PCR with SYBR Green.
Î. Î. Ñî ëîâé îâ, Â. Ì. Ïàì ïó õà, Ë. À. ˳âøèöü
Ðîç ðîá êà òåñò³â íà îñíîâ³ àëåëü-ñïå öèô³÷íî¿ ÏËÐ äëÿ
äå òåêö³¿ ðîç ïîâ ñþä æå íèõ ìó òàö³é ó ãåí³ òðàíñ ìåá ðàí íî ãî
ðå ãó ëÿ òîð íî ãî á³ëêà ìó êîâ³ñöè äî çó
Ðå çþ ìå
Ìåòà. Ìåòà äîñë³äæåí íÿ ïî ëÿ ãà ëà ó ðîç ðîáö³ ä³àã íîñ òè÷ íèõ
ìå òî äèê, îñíî âà íèõ íà ïðè íöèï³ àëåëü-ñïå öèô³÷íî¿ ÏËÐ äëÿ
àíàë³çó ðîç ïîâ ñþä æå íèõ ìó òàö³é â ãåí³ ÒÐÁÌ ç âè êî ðèñ òàí íÿì
äâîõ ï³äõîä³â: òðà äèö³éíî¿ ÏËÐ ç ïîä àëü øèì ðîçä³ëåí íÿì ïðî -
äóêò³â ó ãåëü-åëåê òðî ôî ðåç³ òà ç âè êî ðèñ òàí íÿì ÏËÐ ó ðå àëü -
íî ìó ÷àñ³. Ìå òî äè. Äëÿ äîñë³äæåí íÿ îáðàíî òàê³ ìó òàö³¿ –
dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT ç ÷àñ òî òîþ
çóñòð³÷àëü íîñò³ â Óêðà¿í³: dF508 – 43,3 %; 2143delT – 1,38 %;
W1282X – 1,1 %; R117H ³ 621 + 1G > T – < 0,6 %. Âè êî ðèñ òà íî
êîí òðîëüí³ çðàç êè ÄÍÊ ç â³äïîâ³äíè ìè ìó òàö³ÿìè, ³äåí òèô³êî -
âàí³ ìå òî äà ìè ãå òå ðî äóï ëåê ñíî ãî àíàë³çó òà ÏÄÐÔ. Ðå çóëü-
òàòè. Ïðî âå äå íî äèç àéí òà îïòèì³çî âà íî óìî âè àëåëü-ñïå -
öèô³÷íî¿ àìïë³ô³êàö³¿ äëÿ âèâ ÷åí íÿ ìó òàö³é dF508, W1282X,
R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. Ðîç ðîá ëåí³ ìå òî äè êè àíàë³çó
ï³äòâåð äæå íî ïå ðåâ³ðêîþ êîí òðîëü íèõ çðàçê³â ÄÍÊ ç ìóòà-
ö³ÿìè W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1),
382
SOLOVIOV O. O., PAMPUKHA V. M., LIVSHITS L. A.
195 bp
1 2 3 4 5
Fig. 5. Electrophoregram of the heteroduplex analysis of exon 13 of
the CFTR gene, 10 % PAGE: 1 – molecular weight marker (50 bp
ladder); 2, 3 – normal individuals; 4 – heterozygous carriers of
2143delT (n = 1). Ùîá ïå ðåâ³ðèòè òåñò íà dF508 íàìè ïðî à íà-
ë³çî âà íî 100 íîñ³¿â äà íî¿ ìó òàö³¿ â ãå òå ðî çè ãîò íî ìó ñòàí³ òà
50 – â ãî ìî çè ãîò íî ìó. Çà äî ïî ìî ãîþ ñòâî ðå íî¿ ìå òî äè êè äå -
òåêö³¿ 2143delT ïðî à íàë³çî âà íî òà êîæ 48 ïàö³ºíò³â, õâî ðèõ íà
ìó êîâ³ñöè äîç, ó ÿêèõ ïåð âèí íî âè ÿâ ëå íî ëèøå ïî îäí³é ìó òàö³¿
ðàç îì ç íåâ³äî ìèì ìó òàí òíèì âàð³àí òîì.  ðå çóëü òàò³ àíà-
ë³çó ñå ðåä íèõ âèç íà ÷å íî ùå ÷î òè ðè íîñ³¿ çà çíà ÷å íî¿ äå ëåö³¿ â ãå -
òå ðî çè ãîò íî ìó ñòàí³. Ïðè öüî ìó íå âñòà íîâ ëå íî ðîçá³æíîñ -
òåé â äà íèõ, îò ðè ìà íèõ ç âè êî ðèñ òàí íÿì ñòàí äàð òíèõ
ïðî òî êîë³â àíàë³çó äîñë³äæå íèõ ìó òàö³é. Âèñ íîâ êè. Ïî êà çà -
íî, ùî ìå òîä àëåëü-ñïå öèô³÷íî¿ ÏËÐ º øâèä êèì òà â³äíîñ íî
íå äî ðî ãèì, éîãî ìîæ íà çà ñòî ñî âó âà òè äëÿ äå òåêö³¿ â³äî ìèõ
ìó òàö³é ó ãåí³ ÒÐÁÌ.
Êëþ ÷îâ³ ñëî âà: àëåëü-ñïå öèô³÷íà ÏËÐ, ÏËÐ ó ðå àëü íî ìó
÷àñ³, ìó êîâ³ñöè äîç, ãåí ÒÐÁÌ.
À. À. Ñî ëîâü åâ, Â. Í. Ïàì ïó õà, Ë. À. Ëèâ øèö
Ðà çà ðà áîò êà òåñ òîâ íà îñíî âå àë ëåëü-ñïå öè ôè ÷åñ êîé ÏÖÐ äëÿ
äå òåê öèè ðàñ ïðîñ òðà íåí íûõ ìó òà öèé â ãåíå òðàíñ ìåá ðàí íî ãî
ðå ãó ëÿ òîð íî ãî áåë êà ìó êî âèñ öè äî çà
Ðå çþ ìå
Öåëü. Öåëü ðà áî òû ñî ñòî ÿ ëà â ðàç ðà áîò êå äè àã íîñ òè ÷åñ êèõ
ìå òî äèê, îñíî âàí íûõ íà ïðè íöè ïå àë ëåëü-ñïå öè ôè ÷åñ êîé ÏÖÐ
äëÿ àíà ëè çà ðàñ ïðîñ òðà íåí íûõ ìó òà öèé â ãåíå ÒÐÁÌ ñ èñ ïîëü -
çî âà íè åì äâóõ ïîä õî äîâ: òðà äè öè îí íîé ÏÖÐ c äàëü íåé øèì ðàç -
äå ëå íè åì ïðî äóê òîâ â ãåëü-ýëåê òðî ôî ðå çå è ÏÖÐ â ðå àëü íîì
âðå ìå íè. Ìå òî äû. Äëÿ èñ ñëå äî âà íèé âû áðà íû ñëå äó þ ùèå ìó -
òà öèè – dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT ñ ÷àñ -
òî òîé âñòðå ÷à å ìîñ òè â Óêðà è íå: dF508 – 43,3 %; 2143delT –
1,38 %; W1282X – 1,1 %; R117H è 621 + 1G > T – < 0,6 %.
Èñïîëü çî âà íû êîí òðîëü íûå îá ðàç öû ÄÍÊ ñ ñî îò âå òñòâó þ ùè -
ìè ìó òà öè ÿ ìè, èäåí òè ôè öè ðî âàí íûå ìå òî äà ìè ãå òå ðî äóï -
ëåê ñíî ãî àíà ëè çà è ÏÄÐÔ-àíà ëè çà. Ðå çóëü òà òû. Ïðî âå äåí
äèç àéí è îïòè ìè çè ðî âà íû óñëî âèÿ àë ëåëü-ñïå öè ôè ÷åñ êîé àì -
ïëè ôè êà öèè äëÿ àíà ëè çà ìó òà öèé dF508, W1282X, R117H,
621 + 1G > T, 2143delT. Ðàç ðà áî òàí íûå ìå òî äè êè àíà ëè çà ïîä -
òâåð æäå íû ïðî âåð êîé êîí òðîëü íûõ îá ðàç öîâ ÄÍÊ ñ ìó òà öè ÿ -
ìè W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT
(n = 1). Äëÿ ïðî âåð êè òåñ òà íà dF508 ïðî à íà ëè çè ðî âà íû 100
íî ñè òå ëåé äàí íîé ìó òà öèè â ãå òå ðî çè ãîò íîì ñî ñòî ÿ íèè è 50 –
â ãî ìî çè ãîò íîì ñî ñòî ÿ íèè. Ñ ïî ìîùüþ ðàç ðà áî òàí íîé ìå òî -
äèêè äå òåê öèè 2143delT ïðî à íà ëè çè ðî âà íû òàê æå 48 ïà öè åí -
òîâ, áîëü íûõ ìó êî âèñ öè äî çîì, ó êî òî ðûõ ïåð âè÷ íî âû ÿâ ëå íî
ëèøü ïî îä íîé ìó òà öèè âìåñ òå ñ íå èç âåñ òíûì ìó òàí òíûì âà-
ðè àí òîì.  ðå çóëü òà òå àíà ëè çà ñðå äè íèõ îïðå äå ëå íû åùå ÷å-
òû ðåå íî ñè òå ëÿ óêàçàííîé äå ëå öèè â ãå òå ðî çè ãîò íîì ñî ñòî-
ÿíèè. Ïðè ýòîì íå íà é äå íî îò ëè ÷èé â äàí íûõ, ïî ëó ÷åí íûõ ñ èñ-
ïî ëüçî âà íè åì ñòàí äàð òíûõ ïðî òî êî ëîâ àíà ëè çà ýòèõ ìó òà -
öèé. Âû âî äû. Ïî êà çà íî, ÷òî ìå òîä àë ëåëü-ñïå öè ôè ÷åñ êîé
ÏÖÐ ÿâ ëÿ åò ñÿ áûñ òðûì è îò íî ñè òåëü íî íå äî ðî ãèì, åãî ìîæ-
íî ïðè ìå íÿòü äëÿ äå òåê öèè èç âåñ òíûõ ìó òà öèé â ãåíå ÒÐÁÌ.
Êëþ ÷å âûå ñëî âà: àë ëåëü-ñïå öè ôè ÷åñ êàÿ ÏÖÐ, ÏÖÐ â ðå àëü -
íîì âðå ìå íè, ìó êî âèñ öè äîç, ãåí ÒÐÁÌ.
REFERENCES
1. Kerem B.-S., Rommens J. M., Buchanan D. M., Cox T. K.,
Chakravarti A., Buchwald M., Tsui L.-C. Identification of the
cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science.–1989.– 245,
N 4922.–P. 1073–1080.
2. Tsui L. C. Cystic fibrosis mutation database: www.genet.si-
ckkids.com.ca.
3. Newton C. R., Graham A., Heptinstall L. E., Powell S. J.,
Summers C., Kalsheker N., Smith J. C., Markham A. F. Ana-
lysis of any point mutation in DNA. The amplification refrac-
tory mutation system (ARMS) // Nucl. Acids Res.–1989.–17,
N 7.–P. 2503–2516.
4. Okayama H., Curiel D. T., Brantly M. L., Holmes M. D.,
Crystal R. D. Rapid nonradioactive detection of mutations in
the human genome by allele-specific amplification // J. Lab.
Clin. Med.–1989.–114, N 2.–P. 105–113.
5. Sommer S. S., Groszbach A. R., Bottema C. D. PCR amp-
lification of specific alleles (PASA) is a general method for
rapidly detecting known singlt-base changes // Biotechni-
ques.–1992.–12, N 1.–P. 82–87.
6. Patrinos G. P., Ansorge W. Molecular diagnostics.–Amster-
dam: Elsevier, 2005.–461 p.
7. Ferrie R. M., Schwarz M. J., Robertson N. H., Vaudin S., Su-
per M., Malone G., Little S. Development, multiplexing and
application of ARMS tests for common mutations in the
CFTR gene // Amer. J. Hum. Genet.–1992.–51, N 2.–P. 251–
262.
8. Livshits L. A., Kravchenko S. A., Mikhaylets L. P., Sopko N. I.
Mutation screening results // Eur. Com. Concer. Act. Cystic
Fibrosis Newsletter.–1996.–3, N 2.–P. 3–4.
9. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning: A
laboratory manual.–New York: Cold Spring Harbor Lab.
publ., 1982.–545 p.
10. Livshyts L. A. A molecular genetic analysis of the mutations
in the exons of the CFTR gene in cystic fibrosis patients in
Ukraine // Cytology and Genetics.–2000.–34, N 4.–P. 6–9.
11. Livshits L. A., Kravchenko S. A., Grishko V. I., Musienko S.
I., Ekshyyan O. Yu., Sopko N. I. Prenatal diagnosis of the most
common monogenic hereditary diseases in Ukraine // Cyto-
genet. Cell. Genet.–1997.–77.–P. 157.
12. Ivaschenko T. E., Baranov V. S. Biochemical and molecular-
genetic basics of cystic fibrosis pathogenesis.–St.-Peters-
burg: Intermedika, 2002 – 256 p.
13. Petrova N. V., Kapranov N. I., Ginter E. K. Detection of fre-
quent mutations of the CFTR gene in cystic fibrosis patients
from Central Russia // Genetika.–1997.–33, N 1.–P. 106–
109.
UDC 575.11 + 577.21
Recieved 12.04.10
383
DEVELOPMENT OF ARMS PCR TESTS FOR DETECTION OF COMMON CFTR GENE MUTATIONS
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154183 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7657 |
| language | English |
| last_indexed | 2025-12-07T15:21:08Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Soloviov, O.O. Pampukha, V.M. Livshits, L.A. 2019-06-15T09:38:55Z 2019-06-15T09:38:55Z 2010 Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations / O.O. Soloviov, V.M. Pampukha, L.A. Livshits // Вiopolymers and Cell. — 2010. — Т. 26, № 5. — С. 378-383. — Бібліогр.: 12 назв. — англ. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.00016C https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154183 575.11 + 577.21 Aim. To develop diagnostic assays, based on the amplification refractory mutation system (ARMS) principle, for detection of common mutations in the CFTR gene using two approaches: standard PCR with further gel-electrophoresis and Real-Time PCR with SYBR Green. Materials. For this study we have chosen the following mutations: dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT with the frequencies in Ukraine: dF508 – 43.3 %; 2143delT – 1.38 %; W1282X – 1.1 %; R117H, 621 + 1G > T – < 0.6 %. For the development and validation of the assay we have used control DNA samples with abovementioned mutations, which were previously examined using RFLP and heteroduplex analysis. Results. We have designed the primers and optimized the conditions of ARMS PCR performing for the analysis of dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT mutations. To validate the developed assays we have analyzed control DNA samples with the following mutations: W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). For validation of the dF508 assay we have analyzed 100 heterozygous carriers and 50 homozygous carriers. We have analyzed 48 patients with cystic fibrosis, in which only one mutation was previously detected in combination with unknown mutant variant, using the developed ARMS assay for the 2143delT mutation, and detected 4 heterozygous carriers. No differences were observed in comparison with the standard protocols. Conclusions. It was shown that ARMS is a reliable, rapid and inexpensive method, and the developed assays can be applied in the standard PCR protocol with further gel-electrophoresis as well as using Real-Time PCR with SYBR Green for the molecular genetic diagnostics of cystic fibrosis. Мета. Мета дослідження полягала у розробці діагностичних методик, основаних на принципі алель-специфічної ПЛР для аналізу розповсюджених мутацій в гені ТРБМ з використанням двох підходів: традиційної ПЛР з подальшим розділенням продуктів у гель-електрофорезі та з використанням ПЛР у реальному часі. Методи. Для дослідження обрано такі мутації – dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT з частотою зустрічальності в Україні: dF508 – 43,3 %; 2143delT – 1,38 %; W1282X – 1,1 %; R117H і 621 + 1G > T – < 0,6 %. Використано контрольні зразки ДНК з відповідними мутаціями, ідентифіковані методами гетеродуплексного аналізу та ПДРФ. Результати. Проведено дизайн та оптимізовано умови алель-специфічної ампліфікації для вивчення мутацій dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. Розроблені методики аналізу підтверджено перевіркою контрольних зразків ДНК з мутаціями W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). Щоб перевірити тест на dF508 нами проаналізовано 100 носіїв даної мутації в гетерозиготному стані та 50 – в гомозиготному. За допомогою створеної методики детекції 2143delT проаналізовано також 48 пацієнтів, хворих на муковісцидоз, у яких первинно виявлено лише по одній мутації разом з невідомим мутантним варіантом. В результаті аналізу серед них визначено ще чотири носії зазначеної делеції в гетерозиготному стані. При цьому не встановлено розбіжностей в даних, отриманих з використанням стандартних протоколів аналізу досліджених мутацій. Висновки. Показано, що метод алель-специфічної ПЛР є швидким та відносно недорогим, його можна застосовувати для детекції відомих мутацій у гені ТРБМ. Цель работы состояла в разработке диагностических методик, основанных на принципе аллель-специфической ПЦР для анализа распространенных мутаций в гене ТРБМ с использованием двух подходов: традиционной ПЦР c дальнейшим разделением продуктов в гель-электрофорезе и ПЦР в реальном времени. Методы. Для исследований выбраны следующие мутации – dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT с частотой встречаемости в Украине: dF508 – 43,3 %; 2143delT – 1,38 %; W1282X – 1,1 %; R117H и 621 + 1G > T – < 0,6 %. Использованы контрольные образцы ДНК с соответствующими мутациями, идентифицированные методами гетеродуплексного анализа и ПДРФ-анализа. Результаты. Проведен дизайн и оптимизированы условия аллель-специфической амплификации для анализа мутаций dF508, W1282X, R117H, 621 + 1G > T, 2143delT. Разработанные методики анализа подтверждены проверкой контрольных образцов ДНК с мутациями W1282X (n = 3), R117H (n = 2), 621 + 1G > T (n = 1), 2143delT (n = 1). Для проверки теста на dF508 проанализированы 100 носителей данной мутации в гетерозиготном состоянии и 50 – в гомозиготном состоянии. С помощью разработанной методики детекции 2143delT проанализированы также 48 пациентов, больных муковисцидозом, у которых первично выявлено лишь по одной мутации вместе с неизвестным мутантным вариантом. В результате анализа среди них определены еще четырее носителя указанной делеции в гетерозиготном состоянии. При этом не найдено отличий в данных, полученных с использованием стандартных протоколов анализа этих мутаций. Выводы. Показано, что метод аллель-специфической ПЦР является быстрым и относительно недорогим, его можно применять для детекции известных мутаций в гене ТРБМ. en Інститут молекулярної біології і генетики НАН України Вiopolymers and Cell Biomedicine Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations Розробка тестів на основі алель-специфічної ПЛР для детекції розповсюджених мутацій у гені трансмебранного регуляторного білка муковісцидозу Разработка тестов на основе аллель-специфической ПЦР для детекции распространенных мутаций в гене трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза Article published earlier |
| spellingShingle | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations Soloviov, O.O. Pampukha, V.M. Livshits, L.A. Biomedicine |
| title | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations |
| title_alt | Розробка тестів на основі алель-специфічної ПЛР для детекції розповсюджених мутацій у гені трансмебранного регуляторного білка муковісцидозу Разработка тестов на основе аллель-специфической ПЦР для детекции распространенных мутаций в гене трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза |
| title_full | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations |
| title_fullStr | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations |
| title_full_unstemmed | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations |
| title_short | Development of ARMS PCR tests for detection of common CFTR gene mutations |
| title_sort | development of arms pcr tests for detection of common cftr gene mutations |
| topic | Biomedicine |
| topic_facet | Biomedicine |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154183 |
| work_keys_str_mv | AT soloviovoo developmentofarmspcrtestsfordetectionofcommoncftrgenemutations AT pampukhavm developmentofarmspcrtestsfordetectionofcommoncftrgenemutations AT livshitsla developmentofarmspcrtestsfordetectionofcommoncftrgenemutations AT soloviovoo rozrobkatestívnaosnovíalelʹspecifíčnoíplrdlâdetekcíírozpovsûdženihmutacíiugenítransmebrannogoregulâtornogobílkamukovíscidozu AT pampukhavm rozrobkatestívnaosnovíalelʹspecifíčnoíplrdlâdetekcíírozpovsûdženihmutacíiugenítransmebrannogoregulâtornogobílkamukovíscidozu AT livshitsla rozrobkatestívnaosnovíalelʹspecifíčnoíplrdlâdetekcíírozpovsûdženihmutacíiugenítransmebrannogoregulâtornogobílkamukovíscidozu AT soloviovoo razrabotkatestovnaosnoveallelʹspecifičeskoipcrdlâdetekciirasprostranennyhmutaciivgenetransmembrannogoregulâtornogobelkamukoviscidoza AT pampukhavm razrabotkatestovnaosnoveallelʹspecifičeskoipcrdlâdetekciirasprostranennyhmutaciivgenetransmembrannogoregulâtornogobelkamukoviscidoza AT livshitsla razrabotkatestovnaosnoveallelʹspecifičeskoipcrdlâdetekciirasprostranennyhmutaciivgenetransmembrannogoregulâtornogobelkamukoviscidoza |