Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью
Из штамма Bacillus nаtto В3364 выделена и очищена до электрофоретической чистоты эндонуклеаза рестрикции II класса ВnaI. Она является изошизомером рестриктазы ВаmНІ. Определены физико-химические характеристики ВnаІ: молекулярная масса, субъединичный состав, зависимость активности от ионного состава...
Збережено в:
| Дата: | 1989 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
1989
|
| Назва видання: | Биополимеры и клетка |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154293 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью / Э.Л. Ким, О.П. Махович, С.С. Малюта // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 86-89. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154293 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1542932025-02-09T09:40:58Z Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью Деякі відмінності між ВamІ- і BnaI- рестриктазами з однаковою специфічністю Some differences between BamHl and Bnal restrictases with the same specifity Ким, Э.Л. Махович, О.П. Малюта, С.С. Краткие сообщения Из штамма Bacillus nаtto В3364 выделена и очищена до электрофоретической чистоты эндонуклеаза рестрикции II класса ВnaI. Она является изошизомером рестриктазы ВаmНІ. Определены физико-химические характеристики ВnаІ: молекулярная масса, субъединичный состав, зависимость активности от ионного состава реакционной смеси, влияние замораживания и глицерина на активность фермента. Показано, что по указанным характеристикам рестриктазы ВnаІ и ВаmНІ отличаются друг от друга, несмотря на то, что обладают одинаковой субстратной специфичностью. Зі штаму Bacillus nаtto В3364 виділено і очищено до електрофоретичної чистоти ендонуклеазу рестрикції II класу ВnaI. Вона є ізошизомером рестриктази ВаmНІ. Визначено фізико-хімічні характеристики ВnаІ: молекулярна маса, субодиничний склад, залежність активності від іонного складу реакційної суміші, вплив заморожування і гліцерину на активність ферменту. Показано, що за вказаними характеристиками рестриктази ВnаІ і ВаmНІ відрізняються одна від одної, незважаючи на те, що мають однакову субстратну специфічність. The restriction endonuclease Bnal, being BamHl true isoshisomer, is isolated from B. natto B3364 strain. Its molecular weight, stability and optimal reaction conditions are studied. Comparative investigations have shown that according to these physicochemical characteristics the BamHl and Bnal enzymes differ from each other in spite of their analogous specificity. 1989 Article Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью / Э.Л. Ким, О.П. Махович, С.С. Малюта // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 86-89. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000099 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154293 577.213:579.852.11 ru Биополимеры и клетка application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Краткие сообщения Краткие сообщения |
| spellingShingle |
Краткие сообщения Краткие сообщения Ким, Э.Л. Махович, О.П. Малюта, С.С. Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью Биополимеры и клетка |
| description |
Из штамма Bacillus nаtto В3364 выделена и очищена до электрофоретической чистоты эндонуклеаза рестрикции II класса ВnaI. Она является изошизомером рестриктазы ВаmНІ. Определены физико-химические характеристики ВnаІ: молекулярная масса, субъединичный состав, зависимость активности от ионного состава реакционной смеси, влияние замораживания и глицерина на активность фермента. Показано, что по указанным характеристикам рестриктазы ВnаІ и ВаmНІ отличаются друг от друга, несмотря на то, что обладают одинаковой субстратной специфичностью. |
| format |
Article |
| author |
Ким, Э.Л. Махович, О.П. Малюта, С.С. |
| author_facet |
Ким, Э.Л. Махович, О.П. Малюта, С.С. |
| author_sort |
Ким, Э.Л. |
| title |
Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью |
| title_short |
Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью |
| title_full |
Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью |
| title_fullStr |
Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью |
| title_full_unstemmed |
Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью |
| title_sort |
некоторые различия между вamі- и bnai-рестриктазами с одинаковой специфичностью |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
1989 |
| topic_facet |
Краткие сообщения |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154293 |
| citation_txt |
Некоторые различия между ВamІ- и BnaI-рестриктазами с одинаковой специфичностью / Э.Л. Ким, О.П. Махович, С.С. Малюта // Биополимеры и клетка. — 1989. — Т. 5, № 1. — С. 86-89. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. |
| series |
Биополимеры и клетка |
| work_keys_str_mv |
AT kimél nekotoryerazličiâmežduvamíibnairestriktazamisodinakovojspecifičnostʹû AT mahovičop nekotoryerazličiâmežduvamíibnairestriktazamisodinakovojspecifičnostʹû AT malûtass nekotoryerazličiâmežduvamíibnairestriktazamisodinakovojspecifičnostʹû AT kimél deâkívídmínnostímížvamííbnairestriktazamizodnakovoûspecifíčnístû AT mahovičop deâkívídmínnostímížvamííbnairestriktazamizodnakovoûspecifíčnístû AT malûtass deâkívídmínnostímížvamííbnairestriktazamizodnakovoûspecifíčnístû AT kimél somedifferencesbetweenbamhlandbnalrestrictaseswiththesamespecifity AT mahovičop somedifferencesbetweenbamhlandbnalrestrictaseswiththesamespecifity AT malûtass somedifferencesbetweenbamhlandbnalrestrictaseswiththesamespecifity |
| first_indexed |
2025-11-25T10:27:39Z |
| last_indexed |
2025-11-25T10:27:39Z |
| _version_ |
1849757755996372992 |
| fulltext |
4. Morphologic and biochemical changes in autolyzing dog heart muscle / L. C. Armiger,
R. N. Seelye, V. M. Carnell et al. / / Lab. Invest.— 1976.—34, N 4 .—P. 357—362.
5. Changes in ultra structure and Ca2+ distribution in the isolated working rabbit heart
after ischemia / M. Borgers, L. G. Shu, R. Xhonneux et a l . / / A m e r . J. Pathol.— 1987.—
126, N 1.—P. 92—102.
6 Jennings R. B., Ganote С. E. Structural changes in myocardium during acute ische-
m i a / / C i r c . Res.— 1974.—34, Suppl. 1.—P. 156—172.
7. Изучение молекулярных механизмов гипоальбуминемии на модели эксперименталь-
ного инфаркта миокарда / А. В. Лекис, JL Ю. Лукошявичюс, М. И. Коваленко,
О. В. Булдакова / /Биополимеры и клетка.— 1985.—1, № 6.— С. 322—327.
8. Явич М. П., Лерман M. И. Бесклеточная система белкового синтеза из сердечной
мышцы кролика / / В о п р . мед. химии.— 1976.— № 3.— С. 307—311.
9. Лейтин В. Л., Лерман М. И. Методы определения времени синтеза средней полипеп-
тидной цепи / / Соврем, методы в биохимии.— М. : Медицина, 1977.— С. 277—285.
Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН УССР, Киев Получено 23.03.88
Каунас, мед. ин-т МЗ ЛитССР
УДК 577.213:579.852.11
НЕКОТОРЫЕ РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ BamHI-
И BnaI -РЕСТРИКТАЗАМИ С ОДИНАКОВОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ
Э. Л. Ким, О. П. Махович, С. С. Малюта
Введение В настоящее время список обнаруженных эндонуклеаз рестрикции II клас-
са насчитывает более 500 наименований, из которых прототипами, т. е. рестриктаза-
ми с уже определенной специфичностью, является только 1/5 часть. Остальные пред-
ставляют собой изошизомеры уже известных эндонуклеаз [1]. Явление изошизомерии
известно давно, с начала поиска рестриктаз у разных микроорганизмов, ведущегося
активно до настоящего времени, и представляет большой интерес. Однако вследствие
гого, что изучение рестриктаз часто ограничивается лишь определением специфичности
этих ферментов, явление рестрикции-модификации вообще и изошизомерии в част-
ности остается малоизученным до сих пор.
Для эндонуклеазы BamHI1 обнаруженной в клетках Bacillus amyIoliquefaciens
в 1975 году [2], в настоящее время известно 14 изошизомеров, одним из которых яв-
ляется BnaI1 обнаруженный нами в штамме Вас. natto В3364 [3]. Оба фермента спе-
цифически расщепляют последовательность GGATCC между гуаниновыми остатками.
Ввиду вышесказанного для нас представляло интерес сравнительное исследова-
ние некоторых физико-химических свойств двух изошизомеров — рестриктаз BamHI
и BnaI.
Материалы и методы. В работе использовали бактериальные штаммы из музея
отдела генетической инженерии Ин-та молекуляр. биологии и генетики АН УССР;
Д Н К фага λ, эндонуклеаза BamHI (НПО «Фермент», Вильнюс); лизоцим («Ашег-
sham», Англия); эндонуклеаза BamHI («Pharmacia», Швеция); ДЭАЭ-целлюлоза
(«Whatman», Англия), бромистый этидий, агароза («Sigma», США); акриламид, ме-
тиленбисакриламид («Віо-Rad», США).
Клетки штаммов Вас. natto или Вас. amyIoliquefaciens выращивали на амино-
пептидной среде до середины логарифмической фазы роста. Для получения бескле-
точного экстракта клетки суспендировали в буфере А (20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ
ЭДТА, 2 мМ 2-меркаптоэтанол), содержащем лизоцим в концентрации 1 мг/мл, ин-
кубировали в течение 20 мин при 0°С и разрушали с помощью ультразвукового де-
зинтегратора в режиме 6—12 Гц 10 раз по 30 с с перерывами по 1 мин между озву-
чиваниями. Клеточную суспензию центрифугировали при 48000 g в течение 60 мин.
Полученный бесклеточный экстракт наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой
(1X45 см) со скоростью 0,5 мл/мин. После отмывки колонки до нулевой оптической
плотности связавшийся материал элюировали 1 л градиента NaCl (0—0,05 М) в бу-
фере А. Фракции, содержащие активность BnaI или BamHI, высаливали 65 % насы-
щения сернокислого аммония. Суспензию хранили при —5 °С в течение месяца без
потери активности.
Электрофорез белков в денатурирующем 12,5 %-ном и градиентном 5—25 %-ном
нативном полиакриламидном геле (ПААГ) проводили по методу [4]. Элюцию белков
из нативного ПААГ после электрофореза осуществляли методом замораживания в
• жидком азоте и последующим размораживанием нарезанных участков геля, измельчен-
ных в буфере А. Элюат, содержащий BnaI-активность, анализировали методом элект-
86 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.—Т. 5, № і
рофореза в денатурирующем и нативном ПААГ с последующей окраской AgNOe в со-
ответствии с [5]. Чистота препарата BnaI составляла не менее 95 % по данным
электрофореза.
Результаты и обсуждение. Рестриктаза BnaI , обнаруженная нами в штамме
Вас. natto В3364, является истинным изошизомером эндонуклеазы рестрикции II клас-
Рис. 1. Влияние ионной силы
на рестрикционную активность
эндонуклеаз: Д Н К фага λ, рас-
щепленная BamHI (1—4) и
BnaI (5—9) при разных кон-
центрациях NaCl: 1—20; 2—50;
3—100; 4—150; 5—350; б'—300:
7—50; 8—100; 9—200 мМ
Fig. 1. The influence of ionic
strength on the restriction acti-
vity of BamHI and BnaI endo-
nucleases: DNA of phage λ di-
gested by BamHI (1-4) and
BnaI (5-9) at various NaCl con-
centrat ions: і—20; 2—50; 3—
100; 4—150; 5—350; 5—300; 7—
SO; 8—100; 9—200 raM
Рис. 2. Влияние глицерина на ферментативную активность эндонуклеаз: Д Н К фага Xy
гидролизованная BamHI до замораживания (1); однократно замороженным фермен-
том BamHI (2)\ замороженным дважды (3); BnaI до замораживания (4); BnaI+5%
глицерина (5); BnaI+25 % глицерина (5); 10-кратно замороженным BnaI
Fig. 2. The influence of glycerol on the enzymic activity of endonucleases: phage λ DNA
hydrolyzed by BamHI before freezing ( / ) ; freezed BamHI (2)\ twice freezed BamHI (3);
BnaI before freezing (4); BnaI + 5 % glycerol (5); BnaI + 25 % glycerol (5); ten-fold
freezed BnaI
Рис. 3. Электрофореграмма Д Н К фага λ, расщепленной ферментом BnaI, элюирован-
ным из ПААГ: BnaI + глицерин (1—4)\ BnaI + сахароза (5—8)\ BnaI до элюции (9)
Fig. 3. Electrophoregramme of phage λ DNA digested by BnaI, eluted from PAAG:
BnaI + glycerol (1-4); BnaI + sucrose (5-8); BnaI before elution (9)
ca BamHI. Однако, несмотря на то, что оба фермента обладают одинаковой специфич-
ностью в отношении узнаваемой последовательности ДНК, они отличаются друг от
друга по ряду свойств.
З а в и с и м о с т ь р е с т р и к ц и о н н о й а к т и в н о с т и о т и о н н о й с и л ы
р а с т в о р а . Показано, что оптимальным значением концентрации NaCl для BamHI
является 50 мМ, а для BnaI- 200 мМ. При концентрации NaCl 100 мМ и ниже BnaI
теряет способность специфически расщеплять субстрат, что проявляется в образовании
продуктов неспецифического гидролиза. Если ферментативная активность BamHI по-
87 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.—Т. 5, № і
давляется уже 150 мМ NaCl, то активность BnaI ингибируется при концентрации NaCl
300 мМ и выше (рис. 1).
В л и я н и е г л и ц е р и н а н а ф е р м е н т а т и в н у ю а к т и в н о с т ь . Для
хранения и стабилизации рестрикционных эндонуклеаз используется глицерин, так как
большинство этих ферментов теряет свою активность при замораживании. Не является
исключением и BamHI. Уже однократное замораживание активного препарата этого
фермента после ДЭАЭ-хроматографии вело к практически полной потере рестриктазной
Рис. 4. Электрофореграммы ферментов BamHI и BnaI в 5—15%-ном градиентном
ПААГ (а: 1 — BnaI, элюированный из нативного ПААГ; 2, S — маркерные белки —
669000, 440000, 232000, 140000 и 67000; 4 — BamHl) и в ПААГ в присутствии DS-Na
и 2-меркаптоэтанола (б: 1 — BnaI до элюции; 2 — маркерные белки — 97000, 64000,
43000, 20000, 14400; 3— BamHIi стрелкой указаны субъединицы BamHI; 4, 5 — BnaI,
элюированный из ПААГ)
Fig. 4. 5-15% gradient PAAG electrophoresis of BnaI and BamHI (a: 1 — BnaI eluted
from native PAAG; 2, 5 —molecular weight markers — 669, 440, 232, 140, 67 kDa; 4 —
BamHI) and PAAG electrophoresis in the presence of DS-Na and 2-mercaptoethanol
(б: 1 — BnaI before elution; 2 — molecular weight markers — 97, 64, 43, 20, 14.4 kDa;
8 — BamHI, arrow indicates BamHI subunits; 4, 5 — BtiaI after elution from PAAG)
активности. К такому же результату приводило замораживание BamHIy полученной из
НПО «Фермент» и содержащейся в буфере с 50 % глицерина (рис. 2). Относительна
эндонуклеазы BnaI оказалось, что глицерин сильно ингибирует ее активность — на
50% при концентрации глицерина 5 % , а при концентрации 25%—практически пол-
ностью (рис. 2). Напротив, замораживание этого фермента не приводило к снижению
его активности. Препарат BnaI подвергали 10-кратному замораживанию — оттаиванию
без уменьшения активности
М о л е к у л я р н ы е м а с с ы BamHI и BnaI. Учитывая необычную стабильность
BnaI, нами было осуществлено элюирование активного фермента из нативного ПААГ.
Принимая во внимание ингибирующее действие глицерина на рестрикционную актив-
ность, для нанесения на гель образцов использовали как глицерин, так и сахарозу в
концентрации 5 %. Как видно из рис. 3, BnaI сохраняет активность после элюции в
обоих случаях. Фракции, содержащие активный фермент, были анализированы электро-
форезом в ПААГ в денатурирующих и нативных условиях градиентного геля (рис. 4),
из чего следовало, что BnaI представляет собой белок с молекулярной массой 140000,
состоящий из четырех субъединиц с молекулярной массой 35000 каждая. По данным
гель-фильтрации и электрофоретического анализа коммерческого препарата BamHI
8 8 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.—Т. 5, № і
(«Pharmacia») фермент BamHI имеет молекулярную массу 66000 и состоит из четырех
субъединиц с молекулярной массой 16500 каждая.
Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ре-
стрикционные эндонуклеазы BamHI и BnaI, обладающие одинаковой специфичностью,
отличаются друг от друга по ряду физико-химических свойств. Эти белки имеют разные
молекулярные массы, отличны по стабильности и требуют различной ионной силы для
гидролиза субстрата. Дальнейшее сравнительное изучение рестриктаз с одинаковой суб-
стратной специфичностью позволит расширить наши представления о явлении изоши-
зомерии.
SOME DIFFERENCES BETWEEN BAMHI AND B N A I ,
THE RESTRICTASES WITH THE SAME SPECIFICITY
E. L. Kim, O. P. Makhovich, S. S. Maliuta
Insti tute of Molecular Biology and Genetics,
Academy of Sciences of the Ukrainian SSR, Kiev
S u m m a r y
The restriction endonuclease BnaI , being BamHI t rue isoshisomer, is isolated from Вас.
natto B3364 strain. Its molecular weight, stability and optimal reaction conditions are
studied. Comparative investigations have shown that according to these physicochemical
characteristics the BamHI and BnaI enzymes differ from each other in spite of their ana-
logous specificity.
1. Kessler Ch., Neumaier P. S., Wolf W. Recognition sequences of restriction endonuclea-
ses and methylases — a review / / G e n e . — 1986.—33, N 1.—P. 1—101.
2. Wilson G. A., Young F. E. Isolation of a sequence-specific endonuclease (BamHI) f rom
Bacillus amy loliquefaciens H . / / J . Мої. Biol.— 1975.—97, N 1—P. 123—125.
3. Ким Э. JI., Малюта С. С. BnaI — новый изошизомер рестриктазы BamHI / / Биотех-
нология.— 1986.— № 4.—С. 24—27.
4. Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 / / Nature.— 1970.—227, N 5259.—P. 680—685.
5. Gooderman K., Clifton N. / . High-sensitivity silver staining of proteins following
PAAG e lec t rophores i s / /Meth . MoL Biol.— 1084.—1.—P. 113—118.
Ин-т молекуляр биологии Получено 07.08.87
и генетики АН УССР, Киев
УДК 577 15/17
МОЖНО ЛИ «ПРИВИТЬ» К БЕЛКОВОЙ ГЛОБУЛЕ
«ЧУЖОЙ» АКТИВНЫЙ ЦЕНТР?
А. В. Финкелыытейн
Известно, что белки с совсем разной первичной структурой и различной пространствен-
ной организацией могут иметь одинаковые или сходные биохимические функции [1].
Классическим примером являются сериновые протеазы— белки с различающейся ар-
хитектурой (рис. 1), но одинаковой конфигурацией ключевых боковых групп в ката-
литическом центре (рис. 2).
Можно ли белковую молекулу уподобить каркасу с закрепленным на нем актив-
ным центром [5] или в катализе активно участвует вся белковая глобула [6]? Ответ
на этот вопрос имел бы большое значение не только для искусственного «конструиро-
вания» белковых молекул, но и для проблемы возникновения функционирующих бел-
ков в природе.
С появлением белковой инженерии [7] наметилась возможность эксперименталь-
ного подхода к таким, прежде сугубо теоретическим, вопросам [8].
89 БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА.— 1989.—Т. 5, № і
|