Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой

Разработана система оценки и проведено сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L10. Клетки Escherichia coli котрансформируются плазмидами – продуцентами L10 и плазмидой с репортерным геном rplJ¹-lacZ. Регуляторная способность оценивается по эффективности ингибирования белком L10...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	1992
Автори:	Живолуп, А.Н., Крупская, И.В., Вудмаска, М.И., Патон, Е.Б.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 1992
Назва видання:	Биополимеры и клетка
Теми:	Геном и его регуляция
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154319
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой / А.Н. Живолуп, И.В. Крупская, М.И. Вудмаска, Е.Б. Патон // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 3. — С. 39-42. — Бібліогр.: 14 назв. — рос, укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-154319
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1543192025-02-09T15:27:11Z Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой Порівняння in vivo регуляторної здатності рибосомних білків L10 з різною первинною структурою In vivo comparison of the regulatory ability of L10 ribosomal proteins with different primary structures Живолуп, А.Н. Крупская, И.В. Вудмаска, М.И. Патон, Е.Б. Геном и его регуляция Разработана система оценки и проведено сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L10. Клетки Escherichia coli котрансформируются плазмидами – продуцентами L10 и плазмидой с репортерным геном rplJ¹-lacZ. Регуляторная способность оценивается по эффективности ингибирования белком L10 экспрессии репортерного гена. Розроблено систему оцінки та порівняно in vivo регуляторну здатність рибосомних білків L10. Клітини Escherichia coli котрансформуються плазмідами – продуцентами L10 та плазмідою з репортерним геном rplJ¹-IacZ. Регуляторна здатність оцінюється за ефективністю пригнічування білком L10 експресії репортерного гену. A system for estimation and comparison of the regulatory ability of L10 ribosomal proteins was elaborated. pAZ102 plasmid, carrying the reporter rplJ¹-lacZ gene was cointroduced into Echerichia coli cells together with the L10-producing plasmids. The regulatory ability of the assayed L10 proteins was estimated by their efficient inhibition of expression of the reporter gene. 1992 Article Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой / А.Н. Живолуп, И.В. Крупская, М.И. Вудмаска, Е.Б. Патон // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 3. — С. 39-42. — Бібліогр.: 14 назв. — рос, укр. 0233-7657 DOI: http://dx.doi.org/10.7124/bc.000324 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154319 577.21 ru Биополимеры и клетка application/pdf application/pdf Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Геном и его регуляция Геном и его регуляция
spellingShingle	Геном и его регуляция Геном и его регуляция Живолуп, А.Н. Крупская, И.В. Вудмаска, М.И. Патон, Е.Б. Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой Биополимеры и клетка
description	Разработана система оценки и проведено сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L10. Клетки Escherichia coli котрансформируются плазмидами – продуцентами L10 и плазмидой с репортерным геном rplJ¹-lacZ. Регуляторная способность оценивается по эффективности ингибирования белком L10 экспрессии репортерного гена.
format	Article
author	Живолуп, А.Н. Крупская, И.В. Вудмаска, М.И. Патон, Е.Б.
author_facet	Живолуп, А.Н. Крупская, И.В. Вудмаска, М.И. Патон, Е.Б.
author_sort	Живолуп, А.Н.
title	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой
title_short	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой
title_full	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой
title_fullStr	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой
title_full_unstemmed	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой
title_sort	сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков l 10 с различной первичной структурой
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	1992
topic_facet	Геном и его регуляция
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/154319
citation_txt	Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой / А.Н. Живолуп, И.В. Крупская, М.И. Вудмаска, Е.Б. Патон // Биополимеры и клетка. — 1992. — Т. 8, № 3. — С. 39-42. — Бібліогр.: 14 назв. — рос, укр.
series	Биополимеры и клетка
work_keys_str_mv	AT živolupan sravnenieinvivoregulâtornojsposobnostiribosomnyhbelkovl10srazličnojpervičnojstrukturoj AT krupskaâiv sravnenieinvivoregulâtornojsposobnostiribosomnyhbelkovl10srazličnojpervičnojstrukturoj AT vudmaskami sravnenieinvivoregulâtornojsposobnostiribosomnyhbelkovl10srazličnojpervičnojstrukturoj AT patoneb sravnenieinvivoregulâtornojsposobnostiribosomnyhbelkovl10srazličnojpervičnojstrukturoj AT živolupan porívnânnâinvivoregulâtornoízdatnostíribosomnihbílkívl10zríznoûpervinnoûstrukturoû AT krupskaâiv porívnânnâinvivoregulâtornoízdatnostíribosomnihbílkívl10zríznoûpervinnoûstrukturoû AT vudmaskami porívnânnâinvivoregulâtornoízdatnostíribosomnihbílkívl10zríznoûpervinnoûstrukturoû AT patoneb porívnânnâinvivoregulâtornoízdatnostíribosomnihbílkívl10zríznoûpervinnoûstrukturoû AT živolupan invivocomparisonoftheregulatoryabilityofl10ribosomalproteinswithdifferentprimarystructures AT krupskaâiv invivocomparisonoftheregulatoryabilityofl10ribosomalproteinswithdifferentprimarystructures AT vudmaskami invivocomparisonoftheregulatoryabilityofl10ribosomalproteinswithdifferentprimarystructures AT patoneb invivocomparisonoftheregulatoryabilityofl10ribosomalproteinswithdifferentprimarystructures
first_indexed	2025-11-27T09:33:59Z
last_indexed	2025-11-27T09:33:59Z
_version_	1849935576097095680
fulltext	S u m m a r y . After introduction of ribosomal protein LIO encoding plasmids into JS. typhimurium cells by refined electroporation technique developed both of host cells growth rate and the plasmid copying1 decreasing effects were observed similar to those -of E. coli cells found in, indicating a possibility of regulation rplJL S. typhimurium ^enes by E. coli LIO proteins. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ -1.' Sor P., Nomura M. Cloning and DNA sequence determination of the LI I ribosomal portein operon of Serratia marcescens and Proteus vulgaris: Translation feedback re- gulation of the Escherichia coli Lll operon by heterologous LI proteins//Mol. and Gen. Genet.— 1987,—210, N 1.—P. 52—59. ' t2. Nucleotide sequence of the rplJL operon and the deduced primary structure of the en- coded LIO and LTjL12 proteins of Salmonella typhimurium compared to that of Es- cherichia coli/A. N. Zhyvoloup, M. I. Woodmaska, I. V. Kroupskaya, E. B. Paton// Nucl. Acids Res.—1990.-18, N 15,—P. 4620. Evidence for the ability of LIO ribosomal proteins of Saltnpnelta typhimurium and , Klebsiella pneumoniae to regulate rplJL geneExpression in Escherichia coli / E. B. Pa- ton, M. I. Woodmaska, I. V. Kroupskaya et a l . / /FEBS Lett.—1990.-! 265, N 2 — P. 129—132. ' 4. Латон E. Б., Крупская И.'В., Живолуп А. Н. Определение минимального сегмента белка L10 Е: coli, сохраняющего регуляторную функцию//Докл. АН СССР.— 1989.-309, № 2.—С. 493—496. , -5. Merrick М. /., Gibbins / . /?., Postgate / . R. A rapid and efficient method for plasmid transformation K. pneumoniae and E. coli // J. Gen. Microbiol.—1987,—133, N 8.— P. 2053—2057. 6. Maniatis T; Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning — a laboratory manual.— New York : Cold Spring Harbor Lab., 1982.-^545 p. 7 . Pfau /., Youderian P. Transferring plasmid DNA between different bacterial species with electroporation//Nucl. Acids Res.—1990.—18, N 20.—P. 6165. -8. Dower W. /., Miller 7. F., Ragsdale C.-W. High efficiency transformation of E. coll by high voltage electroporation // Ibid.—1988,—16, N I3.r-P. 6127—614S. 3 . Патон E. Б. Особенности регуляции экспрессии генов кластера rplKAJL / / Биополи- > меры и клетка.— 1990.—&, Ж 5.—С. 5—23: Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН Украины, Киев Получено 28.08.91 Ин-т клеточ. биологии и генет. инженерии АН Украины, Киев ' УДК,877.21 • А. Н. Живолуп, И. В. Крупская, М. И. Вудмаека, Е. Б. Патон СРАВНЕНИЕ IN VIVO РЕГУЛЯТОРНОЙ СПОСОБНОСТИ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ L 10 С РАЗЛИЧНОЙ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРОЙ Разработана система оценки и проведено сравнение in vivo регуляторной способности .рибосомных белков L10. Клетки Escherichia coli котрансформируются плазмид ами — продуцентами L10 и плазмидой с репортерным геном rplJ'-lacZ. Регуляторная способ- ность оценивается по эффективности ингибирования белком L10 экспрессии репортер лого гена. Введение. Экспрессия генов практически во всех оперонах рибосомных белков Escherichia coli регулируется на уровне трансляции ключевым регуляторным белком [1]. Рибосомный белок L10 являете» таковым для оперона rplJL [1]. Суперэкспрессия с мноЬжопийной плазмиды гена rplJ, кодирующего рибосомный белок L10, блокирует синтез белка L7/L12, кодируемого хромосомным rplL-геном. 3to препятствует сборке рибосом [2J и является причиной летального или угнетающего рост нормальных клеток Е. coli влияния таких плазмид. Негативный эффект суперпродукции белка L10 можно преодолеть, используя мутантные клетки, например JF3029 [3]. <С А. Н. ЖИВОЛУП. И. В. КРУПСКАЯ, М. И. ВУДМАСКА, Е. Б. ПАТОН, 1898 . ' JSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 3 II По данным Фризена и Эна [4], делеция 20 С-кондевых аминокис- лотных остатков не нарушает регуляторной способности такого бел- ка LW. Наши эксперименты по клонированию [5] показали, что хотя регуляторная способность «усеченного» L10 и сохранялась, она была, ниже по сравнению с нативным. Выявлено также, что благодаря высо- кой гомологии первичной структуры белков L10 Е. coli и Salmonella typhimurium последний способен регулировать экспрессию генов rplJL Е. coli [6]. Поддержание плазмиды pMW12 с геном rplJ S. typhimurium было летальным для нормальных клеток-хозяев Е. coli (JM101) и «без- вредным» для мутантных клеток (JF3029). Нас интересовала количественная оценка in vivo регуляторной спо- собности белков L10 с различными первичными структурами. В основе Схематическое изображение плазмид, использованных для котрансформации (а), ю конструирования ллазмиды с репортерным геном rplJ'-lacZ (б) такой оценки лежало введение в мутантные клетки Е. coli пар плаз- мид, одна из которых являлась продуцентом L10, другая содержала репортерный ген rplL'-lacZf уровень экспрессии которого позволял су- дить о регуляторной эффективности изучаемого белка L10. Сайт вза- имодействия с L10 расположен в лидерной области мРНК L10-L12 [3, 7], поэтому репортерный ген rplJ'-lacZ для тестирования регулятор- ной способности L10-белков был сконструирован с сохранением полной лидерной последовательности. Материалы и методы. Конструирование, выделение и рестрикции онный анализ рекомбинантных ДНК проводили, используя стандарт- ные методы, описанные в [8]. Для совместного поддержания в клетках плазмид — продуцентов L10 и плазмиды с репортерным геном следо- вало обеспечить им наличие различных селективных маркеров. Плаз- миды — продуценты ЬЮ-белков были Сконструированы на основе pUC и несли ген устойчивости к ампициллину. Плазмида с репортерным геном сконструирована на базе рЛС5Р [9], обеспечивающей устойчи- вость к канамицину. ДНК плазмиды pACSP обрабатывали Bglll (кон- цы восполняли при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I) и EcoRI и лигировали с фрагментом EcoRI-Ecol471 (5561 п. о.), полу- ' JSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 3 II ченным.из pIK13 [10]. Продукты лигирования были введены в клетки JM101. Рекомбинанты отбирали по Lac+ Kanr-фенотипу. Конструиро- вание pAZ102 схематически показано на рисунке (б). Рестрикционным анализом по PstI подтверждено встраивание гена rplJ'-lacZ, который, транскрибировался в pAZ102 с Ыа-промотора pACSP [9]. Конструирование плазмид — продуцентов L./0-белков детально опи- сано в [5, 6 ] р Е Р 2 0 кодировала синтез нативного L10-белка Е. coli, рЕР15— LIO Е. coli с делецией 20 С-концевых аминокислотных остат- ков, рЕР14 — LIO Е. coli с делецией 22 аминокислотных остатков в той же области, рЕР22 — LIO Е. coli с мутацией Lysi43Glu144->~Gln, pMW12— нативный LIO S. typhimurium. Как показано ранее [5], L/0-белки, ко- дируемые рЕР14 и рЕР22, регуляторной способностью не обладают^ Р связи с этим данные плазмиды использованы как контрольные. Все плазмиды, использованные для котрансформации с pAZ102, схемати- чески изображены на рисунке (а). Селекцию ионтрансформантов про- водили на среде, содержащей по 50 мкг/мл ампициллина и канамицина». а также 200 мкг/мл X-gal [8]г Выделение и рестриктнъш анализ ДНК из AmpfKanrLac+-MOHOB подтвердили наличие в них искомых пар- плазмид. Влияние различных L10-белков на экспрессию репортерного гена оценивали по активности кодируемой им р-галактозидазЬг, измеряемой по методу Миллера [11] . Оценку уровня экспрессии репортерного гена rplJ'-lacZ проводили на основании анализа пяти независимо отобран- ных клонов. Во избежание спонтанной транскрипции с /ас-промотора, находя- щегося в антиомысловой ориентации к rplJ в рЕР20, рЕР15 и, pMW12y клетки, используемые для измерения р-галактозидазной активности^ растили в минимальной среде М9 [8]. Параллельна с намерением р-га- лактозидазной активности, контролировали стабильность поддержании плазмид каждой пары. Плазмида pACSP и мутантньге клетки Е. coli /£3029 были любез- но предоставлены проф. Дрейпером (США) и Фризеном (Канада). Результаты и обсуждение. Полученные данные о влиянии исследу- емых L10-белков на экспрессию репортерного гена rplJ'-lacZ приведены: в таблице. Как показало сравнение, наибольшим ингйбирующим эф- фектом обладает нативный L10 Е. coli, кодируемый рЕР20. Ингибиру- ющее влияние (регуляторная активность) белка LIO Е. coli с делецией; 20 С-концевых аминокислотных остат- ков была ниже, чем у нативного L10 Е. coli, однако выше, чем у нативного L10 S. typhimurium. Как указано в разделе «Материалы и методы», в ка- честве контрольных использованы плазмиды рЕР14 и рЕР22, поскольку белки L10, кодируемые этими плазми- (Дами, регуляторной способностью не обладали. Очень интересным оказалось то - обстоятельство, что присутствие рЕР22 повышало уровень экспрессии репортерного гена. Наиболее вероят- ным объяснением этого представляется интерференция мутантного L10 с на- тйвным L10 клеточного пула. Логич- но считать, что нативный L10, кодиру- емый хромосомным геном клетки-хозяина, несколько подавляет экс- прессию репортерного гена. Показано [12], что комплекс с L7/L/2 ста» билизирует L10, увеличивая его регуляторную способность. Для комп- лексообразования с L7/L12 необходим С-конец [13], который сохранен у белка, кодируемого рЕР22, в отличие от рЕР14. Синтезирующийся в. большом количестве с рЕР22 мутантный белок L10, по-видимому, от- титровывает L7/L12 из комплекса с нативным, чем снижает стабиль- Сравнение экспрессии репортерного гена rplJ'-lacZ в присутствии плазмид с генами rpU Плазмиды Л Относительная активность Р-галакто- зидазы. % pAZ102 pAZlG2+pEP20 pAZ102+pEP15 pAZl02+pMW12 pAZ102-f-pEP22 100 33,9 37,9 47,5 111,9 П р и м е ч а н и е . Среднее квадратич- ное отклонение не превышало 5 %. ' JSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 3 II иость последнего и его ингибирующее влияние на экспрессию репор- терного гена. Сравнение регуляторной способности белков L10 Е. coli и S. typhi- murium по их влиянию на экспрессию репортерного гена rplJ'-lacZ подтвердило возможность гетерологичной регуляции, обнаруженной нами ранее [5]. Количественная оценка показала меньшую эффектив- ность L10 S. typhimurium по сравнению с его аналогом из Е. coli. Воз- можно, что белок L10 S. typhimurium обладает меньшим сродством к тетерологйчному сайту-мйшени, имеющему отличия в первичной [14] и редуцированной вторичной структуре [10]. Сравнение эффективно- сти L10 S. typhimurium и Е. coli в аналогичной системе с репортерным геном на основе rplJ S. typhimurium позволит сделать более опреде- ленные выводы. Р е з ю м е ; Розроблено систему оцшки та пор1вняно in vivo регуляторну здаттсть ри- •босомних б1лшв LW. Кликни Escherichia coli котрансформуються плазмщами— про- дуцентами L10 та плазмщою з репортерним геном rplJ' lacZ. Регуляторна здаттсть ОЩНЮЕТЬСЯ по ефективност1 пригшчування б1лком L10 excnpecii репортерного гену. S u m m a r y ; A system for estimation and comparison of the regulatory ability of L10 ribosomal proteins was elaborated. pAZ102 plasmid, carrying the reporter rpU'-lacZ ge- ne was cointroduced into Echerichia coli cells together with the L/0-producing plasmids. The regulatory ability of the assayed L10 proteins was estimated by their efficient inhi- bition of expression of the reporter gene. • • СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Lindahl L., Zenget J. M. Ribosomal genes in Escherichia coli // Ann. Rev. Genet.— 1986.—20.—P. 297-326. 2. Post-transcriptidnat regulatory mutants in ribosomal protein-RNA polymerase ope- ron of E. coli I N. Fill, J. D. Friesen, W. L. Downing, P. P. Dennis // Cell.—1980,— 19, N 3.—P. 837—844. 3. Friesen J. D., Tropak M., An. G. Mutations in the rplJ leader of Escherichia coli that abolisch feedback regulation//Ibid.—1983.—32, N 2.—P. 361—369. 4. Friesen J. D„ An. G. The lethal effect of a plasmid resulting from transcriptional readthrough of rpll from the rplKA operon in Escherichia coli ft Mol. and Gen. Ge- net—1983,—189.—P. 275—281. 5. Патон E. Б., Крупская И. В., Живолуп А. Н. Определение минимального сегмента рибосомного белка L10 Е. coli, сохраняющего регуляторную функцию//Докл. АН СССР,—1989,— 309, № 2,—С. 493— 496. €. Evidenbe for the ability of L10 ribosomal proteins of Salmonella typhimurium and Klebsiella pneumoniae to regulate rpUL gehe expression in Escherichia coli / E. B. Pa- ton, M. I. Woodmaska, I. V. Kroupskaya et al . / /FEBS Lett.—1990.—265.—P. 129— 132. , 7. Draper D. E. How do proteins recognize specific RNA sites? New clues from auto- genously regulated ribosomal porteins III Trends Biochem. Sci. — 1989,—14, N 8 . — P. 335—338. ' 8. Maniatis Т., Fritsch E, F., Sambrook J. Molecular cloning — a laboratory manual.— New York: Cold Spring Harbor Lab., 1982,—545 p. 9. Tang С. К-, Draper D. E. Unusual mRNA pseudoknot structure is recognized by a protein translational repressor// Cell.—/1989,—57,—P. 531—536. 10. Патон E. Б. Особенности регуляции экспрессии генов кластёра rplKAIL / / Биопо- лимеры и клетка.— 1990,— 6, №'5,— С. 5—23. 11. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной , генетике.— М.: Мир, 1976.— 395 с. 12. Petersen С. Escherichia coli ribosomal protein L10 is rapidly degraded when synthe- sized in excess of ribosomal protein L7/L12 // J. Bacteriol.— 1990.— 172, N 1,— P. 431—436. ' . ' 13. Liljas A. Structural studies of ribosomes//Progr. Biophys. and Mol. Biol.— 1982.— 40,—P. 161—228. 14. Nucleotide sequence of the rpUL operon and the deduced primary structure of the encoded L10 and L7/L12 proteins of Salmonella typhimurium compared to that of Escherichia coli / A. N. Znyvoloup, M. I. Woodwaska, I. V. Kroupskaya, E. B. Pa- ton / / Nucl; Acids Res.— 1990,— 18, N 15J— P. 4620. Ин-т молекуляр. биологии и генетики АН Украины, Киев Получено 28.08.91 42 ' JSSN 0233-7657. БИОПОЛИМЕРЫ И КЛЕТКА. 1992. Т. 8. № 3 II

Сравнение in vivo регуляторной способности рибосомных белков L 10 с различной первичной структурой

Репозитарії

Схожі ресурси